CN110184373A

CN110184373A - 一种与油菜千粒重关联的分子标记及应用

Info

Publication number: CN110184373A
Application number: CN201910305789.4A
Authority: CN
Inventors: 王汉中; 师家勤; 宋东霁; 王新发; 刘贵华; 詹杰鹏
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-08-30
Anticipated expiration: 2039-04-16
Also published as: CN110184373B

Abstract

本发明公开了一种与油菜千粒重关联的分子标记及应用。本发明获得了一个与油菜千粒重显著关联的SNP（单核苷酸多态性）标记，位于油菜A09染色体的第27,766,971碱基处，可解释平均8.4%的表型变异，平均加性效应为‑0.28，说明理论上两种纯合等位基因型的油菜千粒重之间有0.56g的差异。根据该分子标记设计的引物为snpA9‑4F：GTGGTGCCATTGCACTAGAAA，snpA9‑4R：CCAATGCAGGAACAGAACAGC。通过检查与油菜千粒重显著关联的分子标记snpA9‑4，即可预测油菜千粒重大小，进而快速准确筛选千粒重较大的优良单株。

Description

一种与油菜千粒重关联的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与甘蓝型油菜千粒重显著关联的分子标记及其应用。

背景技术

菜籽油是国产食用植物油的第一大来源，占比为我国植物油生产总量的55％以上(王汉中，2018)。然而我国国产植物油自给率不足35％，严重威胁其供给安全。为了保障我国国产植物油的有效供给，在种植面积增长乏力的情况下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是唯一出路。近年来，我国油菜高油分育种取得突破(傅廷栋，2014)而单产仍然低于世界平均水平(http://apps.fas.usda.gov/psdonline/)且增加十分缓慢，这严重影响了油菜产业的国际竞争力。因此，我国油菜单产亟待提高(殷艳和王汉中，2012)。

千粒重、每角粒数和全株角果数作为油菜产量的三个构成因子，对油菜最终产量起决定性作用。根据Gupta等(2006)的研究，油菜产量的三个构成因子之间虽然呈现一定程度的相互制约，但是三者之间的相关系数不大，因此可以通过提高产量构成因子来增加总产量。2005-2013年国家冬油菜登记品种产量特征数据显示，油菜产量从2005年的2490.99kg/公顷到2013年的2861.25kg/公顷，增长了14.9％；千粒重从3.46g增加为3.85g，增幅为11.2％，每角粒数从20.08粒到21.13粒，增幅为5.2％；而全株角果数则呈现显著减少趋势(从平均每株387.45角降到280.52角)，下降了27.6％(Hu et al.,2017)。由此可见在三个油菜产量构成因子中，主要由于千粒重的不断增加导致油菜产量的提高，其次是每角粒数。但是，多年来油菜区域试验的品种中，千粒重一般都低于4g，而根据油菜种质资源的各性状统计结果显示，最大千粒重甚至超过8克(陈苇等，2011)，说明油菜的千粒重仍有很大提升空间。

随着分子标记技术的不断发展，其在作物中的应用越来越广泛。Grodzicker等(1974)创立了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记技术。RFLP是第一代分子标记，具有数量丰富、稳定遗传、专一性、重复性好、共显性等特点。但是，该标记对DNA要求量比较大；且操作程序繁琐、耗时费力、周期长；还需要使用放射性同位素对探针进行标记，这些因素都局限了RFLP标记的广泛使用。AFLP标记结合了PCR和RFLP标记技术，在作物遗传多样性研究、细胞学研究、品种纯度鉴定和抗病等研究中得到广泛的应用(宋顺华等，2006；袁素霞，2009；王雪，2004)。但AFLP标记也存在一些缺点：成本较高，过程复杂，技术难度大；标记大多为显性标记；对DNA质量和限制性内切酶质量要求较高。SSR标记，也叫微卫星DNA标记(microsatellite DNA)，已经被广泛应用于作物的基因定位、分子标记辅助选择、DNA指纹图谱、品种纯度鉴定、种质资源的保存及利用和遗传多样性分析等研究中(陈烨丽，2010；缪体云，2007；荆赞革，2010；王冬梅，2011)。SSR标记具有数量丰富、多态性高、操作简单、成本较低等优点，长期以来被广泛引用于分子标记辅助选择。近十年来，随着测序技术的持续进步，使得基于基因组序列信息的分子标记开发成为可能，如SNP标记和InDel标记(Hyten et al.，2010)。目前，全基因组选择育种芯片还只在水稻中开始尝试(Yu et al.,2014)，油菜等其他作物仍以分子标记辅助选择为主。

粒重作为重要的产量构成之一，是由微效多基因控制的数量性状。它的遗传加性效应为主，显性和上位性较弱，因而其杂种优势很弱，具体表现为杂种的粒重一般都介于双亲之间。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci,QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前，定位的方法主要有两种连锁作图(linkagemapping)和关联作图(association mapping)。油菜千粒重的QTL定位研究也有一些报道(Quijada et al.,2006；Udall et al.,2006；Radoev et al.,2008；Shi et al.,2009；王峰等，2010；Basunanda et al.,2010；Fan et al.,2010；Zhang et al.,2011；赵卫国等，2017)，但通常检测出的QTL效应值较小且重复性不好，较难在油菜育种中应用。本发明通过对油菜千粒重性状的全基因组关联分析，旨在找到对油菜千粒重具有改良效应的SNP位点，并基于此开发实用的分子标记，用于油菜根系育种改良的标记辅助选择。

发明内容

本发明的目的是在于提供了油菜A09染色体上位于该区域第27,766,971个碱基在油菜千粒重筛选育种上的应用。

本发明另一个目的在于提供了针对油菜A09染色体上位于该区域第27,766,971个碱基序列设计的引物在油菜千粒重筛选育种中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了一种油菜千粒重筛选育种试剂盒。

本发明的最后一个目的在于提供了一种油菜千粒重筛选育种试剂盒的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

(1)收集331份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜核心关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用油菜60K SNP芯片对每个样本进行基因型分析。

(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。

(3)将关联群体的331个株系分别在六个环境种植，成熟期挑选关联群体的各个株系中长势均匀的10个单株进行收获，按单株分别脱粒后将种子晒干进行千粒重的考察，计算各株系平均值。

(4)结合关联群体的千粒重表型数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 4.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析。最终在A09染色体上第27,766,971个碱基处检测到与千粒重显著关联的1个SNP标记Bn-A09-p29953651，可以在W13、W14、W15、W16四个环境中重复检测，显著水平P＝3.1E-06，可解释平均8.4％的表型变异，平均加性效应为-0.28，说明理论上两种纯合等位基因型的油菜千粒重之间有0.56g的差异，所述A09染色体上第27,766,971位碱基为A/T或C/G。

同时在A09染色体上第28,260,725个碱基处检测到与千粒重显著关联的1个SNP标记Bn-A09-p30466030，可以在W13、W14、W15三个环境中重复检测，显著水平P＝6.7E-05，可解释平均6.1％的表型变异，平均加性效应为0.18，说明理论上两种纯合等位基因型的油菜千粒重之间有0.36g的差异，所述A09染色体上第28,260,725位碱基为A/T或G/C。

(5)提取油菜A09染色体第27,766,971个碱基上下游各100bp的序列，按照引物设计原则，开发SNP标记引物snpA9-4，正向引物为snpA9-4F：GTGGTGCCATTGCACTAGAAA，反向引物为snpA9-4R：CCAATGCAGGAACAGAACAGC，扩增大小为133bp。

提取油菜A09染色体第28,260,725个碱基上下游各100bp的序列，按照引物设计原则，开发SNP标记引物snpA9-5，正向引物为snpA9-5F：ATGGGATTCACAAGTTTTACCAAA，反向引物为snpA9-5R：GCTTGGTGTTGTGTTTCTCTGA，扩增大小为82bp。

以上所述的应用，可利用现有技术，对甘蓝型油菜A09染色体上第27,766,971处的变异进行检测，实现选育较大千粒重油菜品种的目的。

利用本领域的常规技术，设计的检测油菜A09染色体第27,766,971个碱基的引物，其用于甘蓝型油菜千粒重筛选育种，也属于本发明的保护范围。

检测包含有油菜A09染色体上第27,766,971个碱基的油菜序列的试剂在甘蓝型油菜千粒重筛选育种上的应用也属于本发明的保护范围。

利用检测snpA9-4和snpA9-5的引物联合对甘蓝型油菜的千粒重进行筛选育种，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明获得了与油菜千粒重显著关联的分子标记，可解释平均6.1％的表型变异，平均加性效应为0.18，且在多个环境中均可重复检测，可有效应用于油菜的粒重遗传改良。

(2)本发明获得了与油菜千粒重显著关联的分子标记，可解释平均6.1％的表型变异，平均加性效应为0.18，且在多个环境中均可重复检测，可有效应用于油菜的粒重遗传改良。

(3)研究发现了与油菜千粒重显著关联的分子标记snpA9-5，为油菜千粒重的预先选择提供了可靠的分子标记来源。

(4)利用分子标记snpA9-5可在油菜幼苗生长期快捷地对油菜品种或品系中与千粒重显著关联的基因组单倍型区域进行选择，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快油菜粒重改良的育种进程。

(5)两种分子标记进行联合筛选，能够更好的提高筛选效率和准确率。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

油菜千粒重显著关联的SNP标记的获得：

(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜基因组中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得24,508个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。利用SPAGeDi软件计算331份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。

(3)将关联群体的331个株系分别于2012年(W12)、2013年(W13)、2014年(W14)、2015年(W15)、2016年(W16)和2017年(W17)共六个环境种植在中国农业科学院油料作物研究所武昌试验田，成熟期挑选关联群体的各个株系中长势均匀的10个单株进行收获，按单株分别脱粒后将种子晒干进行千粒重的考察，计算各株系平均值。

(4)结合关联群体的千粒重表型数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 4.0软件(Bradbury et al.2007)进行关联分析。最终在A09染色体上第27,766,971个碱基处检测到与千粒重显著关联的1个SNP标记Bn-A09-p29953651，可以在W13、W14、W15、W16四个环境中重复检测，显著水平P＝3.1E-06，可解释平均8.4％的表型变异，平均加性效应为-0.28，说明理论上两种纯合等位基因型的油菜千粒重之间有0.56g的差异，所述A09染色体上第27,766,971位碱基为A/T或C/G；同时在A09染色体上第28,260,725个碱基处检测到与千粒重显著关联的1个SNP标记Bn-A09-p30466030，可以在W13、W14、W15三个环境中重复检测，显著水平P＝6.7E-05，可解释平均6.1％的表型变异，平均加性效应为0.18，说明理论上两种纯合等位基因型的油菜千粒重之间有0.36g的差异，所述A09染色体上第28,260,725位碱基为A/T或G/C。

实施例2：

一种与千粒重显著关联的分子标记引物的获得：

(1)提取油菜A09染色体第27,766,971个碱基上下游各100bp的序列，按照引物设计原则，开发SNP标记引物snpA9-4，正向引物为snpA9-4F：GTGGTGCCATTGCACTAGAAA，反向引物为snpA9-4R：CCAATGCAGGAACAGAACAGC，扩增大小为133bp。

在甘蓝型油菜小粒材料Tapidor(千粒重平均值为2.86g)中扩增的序列为AA基因型，序列如下所示：

CCAATGCAGGAACAGAACAGCAACAGCTTGTGACAAGGCACTTTGTTTTAAGATTTTGTCTATCTTGTACAGTTTCACTGCCACTGCAAAGGTCAAAGATCTCTAGTTGACCTTTCTAGTGCAATGGCACCAC

在甘蓝型油菜大粒材料Qing613(千粒重平均值为5.02g)扩增的序列为CC基因型，序列如下所示：

CCAATGCAGGAACAGAACAGCAACAGCTTGTGACAAGGCCCTTTGTTTTAAGATTTTGTCTATCTTGTACAGTTTCACTGCCACTGCAAAGGTCAAAGATCTCTAGTTGACCTTTCTAGTGCAATGGCACCAC

(2)提取油菜A09染色体第28,260,725个碱基上下游各100bp的序列，按照引物设计原则，开发SNP标记引物snpA9-5，正向引物为snpA9-5F：ATGGGATTCACAAGTTTTACCAAA，反向引物为snpA9-5R：GCTTGGTGTTGTGTTTCTCTGA，扩增大小为82bp。

在甘蓝型油菜小粒材料Tapidor(千粒重平均值为2.86g)中扩增的序列为GG基因型，序列如下所示：

GCTTGGTGTTGTGTTTCTCTGATTTCTCTGTTTGAAGCCCTGATTTAGTTTCTACCAATTTGGTAAAACTTGTGAATCCCAT

在甘蓝型油菜大粒材料No.93237(千粒重平均值为5.72g)中扩增的序列为AA基因型，序列如下所示：

GCTTGGTGTTGTGTTTCTCTGATTTCTCTGTTTGAAGCCCTAATTTAGTTTCTACCAATTTGGTAAAACTTGTGAATCCCAT

(2)对该标记采用高分辨率溶解曲线(HRM)技术在油菜关联群体中进行基因型分型，再次利用Tassel 4.0软件进行关联分析，确定该标记是与油菜千粒重显著关联的标记位点。

实施例3：

基于油菜A09染色体第27,766,971个碱基设计的引物在油菜千粒重筛选育种中的应用，其步骤如下：

(1)挑选出331份材料中经过多代自交已纯合的千粒重小的材料20份(Li et al.,2014)和千粒重大的材料19份(Li et al.,2014)。

(2)检查了与千粒重显著关联分子标记snpA9-4的两种基因型在20份千粒重小的材料和19份千粒重大的材料的分布情况。结果表明，分子标记snpA9-4的基因型在20份千粒重小的材料中就有19份为AA基因型，而在19份千粒重大的材料中仅有6份为AA(表1)。另外，在331份关联群体中，分子标记snpA9-4检测出基因型为AA的材料有228份，千粒重平均值为3.74g；基因型CC的材料有49份，千粒重平均值为4.40g。T测验结果表明AA和CC两类基因型在油菜千粒重性状上存在极其显著的差异(P＝3.10E-11)。

以上的结果足以说明我们制备的分子标记snpA9-4与油菜的千粒重是高度关联的，因而可用于千粒重的分子标记辅助选择。

表1分子标记snpA9-4在千粒重极端材料中的基因型

实施例4：

基于油菜A09染色体第27,766,971个碱基设计的引物和A09染色体第28,260,725个碱基设计的引物，二者在油菜千粒重筛选育种中的联合应用，其步骤如下：

(2)检查了与千粒重显著关联的两个分子标记snpA9-4与snpA9-5的不同基因型在20份千粒重小的材料和19份千粒重大的材料的分布情况。结果表明，在20份千粒重小的材料中，分子标记snpA9-4的基因型为AA、同时分子标记snpA9-5的基因型为GG的材料达到12份，而分子标记snpA9-4的基因型为CC、同时分子标记snpA9-5的基因型为AA的材料为0份；在19份千粒重大的材料中，分子标记snpA9-4的基因型为CC、同时分子标记snpA9-5的基因型为AA的材料有7份，而分子标记snpA9-4的基因型为AA、同时分子标记snpA9-5的基因型为GG的材料仅有2份(表2)。

另外，在331份关联群体中，检测出分子标记snpA9-4为基因型AA、同时分子标记snpA9-5为基因型GG的材料有104份，千粒重平均值为3.59g；分子标记snpA9-4为基因型CC、同时分子标记snpA9-5为基因型AA的材料有39份，千粒重平均值为4.55g。T测验结果表明这两种不同的基因型组合在油菜千粒重性状上存在极其显著的差异(P＝4.07E-15)。

以上的结果足以说明我们制备的分子标记snpA9-4与snpA9-5可以同时应用于油菜的千粒重的分子标记辅助选择，以提高选择的准确度。

表2分子标记snpA9-4和snpA9-5在千粒重极端材料中的基因型

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种与油菜千粒重关联的分子标记及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtggtgccat tgcactagaa a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaatgcagg aacagaacag c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggattca caagttttac caaa 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcttggtgtt gtgtttctct ga 22

<210> 5

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaatgcagg aacagaacag caacagcttg tgacaaggca ctttgtttta agattttgtc 60

tatcttgtac agtttcactg ccactgcaaa ggtcaaagat ctctagttga cctttctagt 120

gcaatggcac cac 133

<210> 6

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaatgcagg aacagaacag caacagcttg tgacaaggcc ctttgtttta agattttgtc 60

tatcttgtac agtttcactg ccactgcaaa ggtcaaagat ctctagttga cctttctagt 120

gcaatggcac cac 133

<210> 7

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttggtgtt gtgtttctct gatttctctg tttgaagccc tgatttagtt tctaccaatt 60

tggtaaaact tgtgaatccc at 82

<210> 8

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcttggtgtt gtgtttctct gatttctctg tttgaagccc taatttagtt tctaccaatt 60

tggtaaaact tgtgaatccc at 82

Claims

1.针对检测包含有油菜A09染色体第27,766,971个碱基的序列的试剂在油菜千粒重筛选育种上的应用。

2.针对检测油菜A09染色体第27,766,971个碱基设计的引物在油菜千粒重筛选育种上的应用。

3.根据权利要求2所述应用，所述的引物为：snpA9-4F：GTGGTGCCATTGCACTAGAAA和snpA9-4R：CCAATGCAGGAACAGAACAGC。

4.一种油菜千粒重筛选育种筛选试剂盒，包括引物组：

snpA9-4F：GTGGTGCCATTGCACTAGAAA、snpA9-4R：CCAATGCAGGAACAGAACAGC和snpA9-5F：ATGGGATTCACAAGTTTTACCAAA、snpA9-5R：GCTTGGTGTTGTGTTTCTCTGA。

5.权利要求4所述的试剂盒在油菜千粒重育种中的应用。