CN104673924B - 调控玉米百粒重主效qtl的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控玉米百粒重的主效QTL的分子标记，以玉米总DNA为模板，对SSR引物Sym035和Sym119进行PCR扩增，经凝胶电泳得到长度分别为165bp和147bp的DNA片段，在第五染色体上Bin5.06区段位于SSR分子标记Sym035与Sym119之间存在一个调控玉米百粒重大小的QTL。利用同样的F2:3群体，对粒长、粒宽和粒厚的QTL分析表明，在分子标记Sym024和Sym128之间定位一个粒宽的QTL，遗传距离为13.1cM。分离群体内百粒重与粒长、粒宽和粒厚的相关系数分别是0.532、0.726、0.187。单片段代换系SSSL‑Z22百粒重的减少主要由粒宽的变窄引起的。

Description

调控玉米百粒重主效QTL的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种与玉米百粒重主效QTL连锁的SSR分子标记及在玉米百粒重主效QTL分子标记辅助育种中的应用。属于基因工程技术领域。
背景技术
作为粮食、饲料和工业原料作物，玉米在世界农业中占有重要的角色。人们对玉米的需求预计将在2020年超过对小麦和水稻的需求(Ping PL&Pandey S2001)。然而，在大多数发展中国家，玉米的单位面积产量仍然很低。研究玉米产量性状的遗传控制机制，对于进一步提高玉米单产具有重要意义。
早期遗传群体多为F2、F2:3、BC1、DH和RIL等初级群体，只能对作物性状进行QTL分析，且微效的QTL一般检测不出来，其遗传背景较复杂，影响试验结果的准确性，不利于主效QTL精细定位和克隆等进一步的研究。随着研究的逐渐深入，IL、BCRIL、NIL、CSSL等次级作图群体得到了广泛的应用。理想的代换系是指在轮回亲本的遗传背景上只含有单个供体染色体片段，即染色体单片段代换系(Single Segment Substitution Line,SSSL)。SSSL可打破优良基因和不量基因间的连锁，有效检测出供体亲本的有利基因。每个SSSL纯合体与轮回亲本在基因组上仅有一个染色体片段的差异，其表型在产量性状上的任何显著的差异均与这唯一的代换片段有关。
分子标记是DNA水平上的遗传差异的直接反映。第一代是以分子杂交为基础的标记技术，主要是限制性片段长度多态性(RFLP)，利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性。随着分子生物学的发展，产生了第二代以PCR技术为核心的分子标记，如简单序列重复标记(SSR)技术、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、表达序列标签(EST)技术、扩增片段长度多态性(AFLP)等。第三代分子标记主要是单核苷酸多态(SNP)，指单个核苷酸变异而引起的DNA序列多态性。利用分子标记技术进行基因定位研究时，工作者要根据自己要解决的问题和研究的作物的遗传背景选择理想的分子标记。
郑58和昌7-2是中国的骨干玉米自交系，已经完成基因组测序，有大量的SNP、IDP标记和保守序列可用于SSSL群体功能性鉴定以及主效QTL的精确定位和克隆。
作物的性状分为数量性状和质量性状，质量性状是由单基因控制的，而由多基因进行控制的称数量性状基因座位(QTL)。运用于定位的作图群体主要是初级作图群体、次级作图群体和高级作图群体，次级群体的遗传背景很相似，消除大部分的遗传背景干扰，多用于QTL的精细定位。单片段代换系是在受体遗传背景上只含有一个供体染色体片段的材料，消除了遗传背景的干扰，适用于复杂性状的基因初步定位、精细定位、基因克隆和遗传机制等研究。
发明内容
本课题组以玉米骨干自交系郑58为受体，昌7-2为供体，通过回交和SSR分子标记辅助选择构建郑58遗传背景上昌7-2的单片段代换系，共获得108份纯合的单片段代换系，其中有46个不重复的代换片段。以其中的一份单片段代换系SSSL-Z22(代换片段为bnlg278…umc1680…bnlg1306)作为基础材料，通过构建SSSL-Z22和郑58的F2:3群体，使用SSR分子标记和作图软件winQTLcart2.5等方法对玉米的百粒重及相关性状进行了基因定位。
本发明的技术方案是：一种调控玉米百粒重主效QTL的分子标记，其特征在于：以玉米总DNA为模板，对SSR引物Sym035和Sym119进行PCR扩增，经凝胶电泳得到长度分别为165bp和147bp的DNA片段，在第五染色体上Bin5.06区段位于SSR分子标记Sym035与Sym119之间存在一个调控玉米百粒重大小的QTL；
所述SSR标记Sym035的序列为：
F：5＇-TAAGGAGCAACAATGGCGGA-3＇
R：5＇-CATCCGCAGCAAATACCACG-3＇；
所述SSR标记Sym119的序列为：
F：5＇-ATCAGCGTCGTCGGCATTA-3＇
R：5＇-TGGGACCTCGGACTACACTAT-3＇。
如权利要求1所述的调控玉米百粒重主效QTL的分子标记在控制玉米籽粒大小中的应用。
如权利要求1所述的调控玉米百粒重主效QTL的分子标记在控制玉米产量中的应用。
以含有301个SSSL-Z22×郑58的F2:3家系为材料，在玉米第5号染色体Bin5.06区域内开发标记，使用34对SSR分子标记构建了目标染色体区段内的高密度遗传图谱，区段内遗传距离总长为25.9cM。利用winQTLcart2.5软件中的复合区间作图法，将qhkw5-3定位在SSR分子标记Sym035与Sym119之间，其遗传区间为9.7cM。
利用同样的F2:3群体，对粒长、粒宽和粒厚的QTL分析表明，在分子标记Sym024和Sym128之间定位一个粒宽的QTL，遗传距离为13.1cM。分离群体内百粒重与粒长、粒宽和粒厚的相关系数分别是0.532、0.726、0.187。单片段代换系SSSL-Z22百粒重的减少主要由粒宽的变窄引起的。
附图说明
图1SSSL-Z22的片段，白色部分为郑58遗传背景，黑色部分为昌7-2染色体片段；
图2分离群体内单株百粒重的次数分布；
图3分子标记间的遗传距离；
图4百粒重QTL定位图；
图5 34对SSR标记的连锁图谱；
图6百粒重QTL定位图；
图7百粒重QTL的定位图，柱形黑色部分为定位到的百粒重QTL区间；
图8粒长(A)、粒宽(B)和粒厚(C)表型次数分布图；
图9百粒重与粒长(A)、粒宽(B)和粒厚(C)的相关散点图；
图10粒宽QTL定位图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
1.SSR引物设计
按照引物设计原则，利用软件Primer 6.0得到引物序列，再将序列送至公司进行合成。
2.采用SDS法提取叶片DNA
(1)于玉米3展叶时，在每区取长势一致的叶片5片，放置-80℃冰箱内保存。
(2)将每区的5片鲜叶整齐叠放，均匀取下约5g鲜叶放入盛有液氮的研钵中迅速磨成粉末，倒入2.0mL的Beckman离心管中；
(3)加入600μL预热到65℃的SDS提取液；
(4)再加入20μL从-20℃中取出的β-巯基乙醇(1％体积比)混匀，轻缓搅拌
(5)65℃水浴30～60min，其间摇动3～5次，至底层溶液变黑；
(6)取出，冷却至室温，加200μL KAC，冰水浴10min；
(7)取出，加600μL的氯仿：异戊醇(24:1)，充分混合，轻摇30～60min至底部呈墨绿色，室温静置10min；
(8)12000r/min，离心10min(注意平衡)；
(9)取上清液于1.5mL离心管中，加入(预冷-20℃)无水乙醇800μL，置于4℃冰箱中，DNA缓慢析出；
(10)12000rpm，离心3min；倒掉上清液，口朝下于纸巾上风干；
(11)加入50μL TE，4℃保存。
3.SDS法提取DNA所需溶液及其配置方法
所需溶液：SDS提取液，1M Tris·HCl(PH8.0)，5M NaCl，0.5M EDTA(PH8.0)，SDS(10％)，1M HCL(1mol/L)，10倍的TE，5M KAC，10M NaOH，3M NaAc(PH5.2)，0.1M Tris·Hcl(PH8.0)，TE储藏液，10倍的TBE，1M NH4AC溶液，含10mM NH4AC的76％酒精溶液。各溶液的配置方法如下：
SDS提取液配置方法
1M Tris·HCl(PH8.0)配置方法
5M NaCl配置方法
0.5M EDTA(PH8.0)配置方法
SDS(10％)配置方法
1M HCL(1mol/L)配置方法
10倍的TE配置方法
5M KAC配置方法
10M NaOH 200mL配置方法
3M NaAc(PH5.2)500mL配置方法
0.1M Tris·Hcl(PH8.0)100mL配置方法
TE储藏液100mL配置方法
10倍的TBE 1000mL配置方法
1M NH4AC溶液100mL/500mL配置方法：38.54g NH4AC定容至500mL或7.708g NH4AC定容至100mL。
含10mM NH4AC的76％酒精溶液配置方法：95％乙醇，1M NH4AC与无菌水的配置体积为80：1：19。
4.引物处理方法
(1)从-20℃取出干粉态引物，12000r/min，1min离心后才可开盖；
(2)根据引物管上显示的Add值加入10倍Add值的水量；
(3)在混合振荡器上，充分混匀约5min，放入-20℃冰箱内备用。
5.PCR扩增体系及程序
(1)PCR反应体系
PCR反应体系表
所用到的dNTPs(10mM/Ml)，Taq(2.5U/μL)均为TianGen公司产品。
(2)PCR反应程序
本实验中引物的退火温度范围是50～60℃，退火温度一般选常用58℃，但不同的引物有不同的退火温度，可根据引物合成回执单中显示的温度上下调整。
程序如下：
(3)扩增产物检测
扩增产物变性：在扩增产物中加入6μL loading Buffer,95℃变性5min，放入4℃冰箱内备用。
Loading Buffer配置方法
6.聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中各种胶的配制：
(1)40％丙烯酰胺
丙烯酰胺380g+甲叉20g+重蒸馏水，定容至1000mL，4℃保存。
(2)6％丙烯酰胺
150mL 40％丙烯酰胺+100mL 10倍的TBE+尿素420g，定容至1000mL
(3)亲和硅烷—涂于大板
硅烷5μL+5μL醋酸+1mL乙醇
(4)剥离硅烷—涂于耳板
10％剥离硅烷，用氯仿稀释
(5)灌胶
6％PA：先加入70μL TEMED，再加入210μL 20％APS。
20％APS：称0.2gAPS于1.5mL离心管中，加重蒸馏水1mL，4℃保存。
(6)电泳缓冲液
用10倍的TBE稀释：取100mL 10倍的TBE加900mL蒸馏水中混匀。
凝胶灌制：
(1)玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用酒精擦净，晾干，备用。
(2)在通风橱内用酒精擦洗一大一小两块玻璃板，待干后大板涂上0.5％的亲和硅烷，小板涂上2％剥离硅烷，然后再用酒精擦洗干燥。(操作过程中，防止两块玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶)。
(3)玻璃板的组装：将亲和板平放，剥离板压放到亲和板上(涂有硅烷的两面向里)，中间用压条隔开，放好后用大夹子夹紧固定。
(4)将配置好的聚丙烯酰胺凝胶缓缓的灌入两板间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并注意防止梳子底部产生气泡。用一个有力的大夹子将梳子夹紧，使其固定，以避免产生胶膜，影响点样。若有漏出，应及时补加聚丙烯酰胺溶夜。置室温让其聚合30min以上才可用。
电泳实验步骤：
(1)待凝胶聚合完后，将胶板装入电泳槽内，在电泳槽中加1倍的TBE电泳缓冲液。
(2)将梳子轻轻拔出，60V恒定功率(100W)预电泳5～10min。
(3)用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔中(3～5μL)，尽量操作时间。
(4)接上电源(注意：正负极不要接错)，电泳。参数为恒定电压60V，电泳1～1.5h(视DNA分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间)。
(5)电泳结束后，切断电源，放去上层电泳缓冲液，卸下玻璃板，揭去剥离板准备染色。
银染显色：
(1)将亲和板放进含有乙醇和醋酸的固定液内进行固定，约15min，水洗。
(2)再放进已经配好的充分溶解的银染液(5g硝酸银，2000mL的蒸馏水)盆里，银染15～30min，取出水洗。
(3)将银染后的亲和板放进预显影液(15g氢氧化钠，10mL甲醛，2000mL蒸馏水)内预显影约1min。
(4)拿出后再放入显影液(15g氢氧化钠，10mL甲醛，2000mL蒸馏水)内显影约10min，可清晰的看到条带。
(5)将板拿出后在流动的清水下冲洗胶面约5min。
(6)将板放置灯箱上读带，统计带型，并照相或扫描。
7.分析软件的运行程序
使用JoinMap4.0软件(Van Ooijen,J.W.2011)对分离群体中的基因型进行分析，得到各个分子标记的连锁情况，利用Kosambi函数把重组率转换成为遗传图距，运行步骤如下：
(1)New Project；
(2)Load data；
(3)LOD groupings(trees)；
(4)选择LOD分组数据；
(5)Population—Create Groups for mapping；
(6)选择Group运行.
使用Windows QTL Cartographer version2.5软件(Wang et al.2005)中的复合区间作图方法对分离群体中各个个体的表型和基因型连锁分析并制图。运算模型采用复合区间作图法中的Zmapqtl程序模块Model6，窗口大小设置为10.0cM，每隔0.5cM对性状进行基因组扫描，以LOD值>3.0为阈值，作为QTL定位的参数。
8.QTL命名方法
QTL命名参考Mc Couch et al.(1997)的命名规则：
(1)以“q”开头代表QTL，加上性状英文字母缩写；
(2)用“-”连接QTL所在的染色体编号；
(3)用“-”连接QTL在此染色体的序号。
格式为：q+性状英文字母缩写+“-”+序号，QTL的全名要用斜体表示。
9.田间试验设计和性状调查
2010年郑州、濮阳、三亚3个试验环境为单行区，2011年郑州、濮阳、漯河3个试验环境为双行区，单次重复，以郑58为田间对照，行距0.60m，行长4.00m，株距0.25m，田间常规管理。成熟后收获每个小区内的全部果实，晾干后备室内考种。
2011年冬天在海南省三亚(18°26′N，108°55′E)种植SSSL-Z22和郑58的F2:3群体。F2:3分离群体试验材料在田间单行区，单次重复，以郑58为田间对照，同时种植亲本SSSL-Z22和昌7-2。行距0.60m，行长4.00m，株距0.20m，密度为5000/亩，田间常规管理。成熟后收获每个小区内的全部果实，晾干后备室内考种。
玉米籽粒产量及相关性状的调查：参考国家标准(GB/T19557.1—2007)：植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南-玉米(Zea mays L.)。
10.室内考种工作流程
(1)选穗：每区选取大小均匀、形态和类型相近的10个果穗；10个果穗依次编号1-10，每个果穗对应准备2个种子袋；分别为“5粒”袋和“余粒”袋，标注在袋子的右上角。区号及果穗编号写在袋子中部。
(2)数穗行数：依次数每穗的穗行数，标注在对应的“余粒”袋子上。
(3)量穗周长和10粒厚度：用软尺量玉米果穗中部的穗周长，标注在“余粒”袋子上；在穗中部顺行数10粒量其厚度，将结果标注在“余粒”袋子上。
(4)籽粒取样：从果穗的中部，用螺丝刀顺行取5粒种子，装入标有区号、穗号的“5粒”袋中。所取的5粒种子要求外形规范、结构完整、无破损，胚部带尖、黑色层不裸露；操作中如有落粒装入对应的“余粒”袋。
(5)脱粒与量穗轴周长：将剩余种子脱粒，筛理后放入另一个标有同样编号的袋子内。该袋为“余粒”袋。用软尺量玉米穗轴中部的穗轴周长，将结果写在袋子上；
(6)数籽粒数：数“余粒”袋内的种子的粒数并将籽粒数写在袋子上。数粒时剔除霉烂、破碎和特别小的籽粒，对种子做进一步的筛理后装入原袋子中；
(7)风干：自然状态下对脱粒过的种子进行风干5-10d至籽粒水分13％左右；
(8)称重：对“余粒”袋内的种子进行称重。称重时只称籽粒，电子秤的感量至少为1％，单位为克，至少保留2位小数；称重时籽粒含水量要求在13％左右，各区的籽粒要含水量基本一样。形态上，胚部凹陷，指甲掐不动。
(9)籽粒大小测量：逐粒手工测量粒长、粒宽和粒厚；粒长：胚朝上，沿胚方向的最大长度；粒宽：胚朝上，垂直胚方向的最大宽度；粒厚：籽粒顶部的最大厚度；
(10)数据输入：提前设计好表格，输入区号、株号、果穗、籽粒编号等信息，输入时对号入座。2人1组，1读1输。输入后至少校对一遍。对每区的数据做初步统计分析：最大值、最小值、方差等。对异常数字要认真校对，查找原因及时矫正。
实验结果
本课题组利用玉米骨干自交系郑58和昌7-2，构建了一套在郑58遗传背景上的昌7-2的单片段代换系(Single segment substitution lines，SSSL)，前期利用59份SSSL纯合体对玉米的产量及产量相关性状进行了QTL分析，确定玉米第5号染色体上控制百粒重的QTL qhkw5-3为主效数量性状遗传座位。
通过对59份SSSL进行产量性状的表型鉴定，鉴定出1份单片段代换系SSSL-Z22与亲本郑58在百粒重性状上有明显差异(表1)，其系谱为Z958-1-0-13-11-b-15-4。SSSL-Z22的供体片段位于玉米第5号染色体上的Bin5.06区的SSR标记umc1680附近，两端SSR分子标记分别为bnlg278和bnlg1306，用SSR分子标记来表示的代换片段为bnlg278…umc1680…bnlg1306(图1)。
SSSL-Z22纯合体在籽粒产量上有明显的负效应，且在地点间稳定表达。
2010年在河南省的郑州、濮阳和海南省的三亚和2011年在河南省的郑州、濮阳、漯河6个试验环境使用SSSL-Z22纯合体进行玉米籽粒相关性状QTL鉴定试验。
2010年夏播在郑州试验点配制SSSL-Z22×郑58杂交组合，2010年冬天在海南育种基地对F1进行自交，2011年夏在郑州河南农业大学科教园区种植SSSL-Z22×郑58的F2分离群体，叶片提取DNA用于分子标记基因型分析，单株自交后保存种子，于2011年冬天在海南省三亚(18°26′N，108°55′E)种植SSSL-Z22×郑58的F2:3代分离群体。
在两年六个环境中对SSSL-Z22百粒重表型的鉴定结果(表1)表明，单片段代换系纯合体SSSL-Z22的百粒重均低于其轮回亲本郑58的百粒重。经双尾t-检验显示，SSSL-Z22的百粒重与轮回亲本郑58相比较差异显著，并且对应的百粒重的QTL加性效应百分率均为负值，说明在代换片段为bnlg278…umc1680…bnlg1306之上有来源于昌7-2的、稳定表达且控制百粒重的QTL，这一QTL使百粒重变小，这个控制玉米百粒重的QTL位于玉米的第5号染色体上的Bin5.06区，命名为qhkw5-3。
表1在6个不同的环境中SSSL-Z22和受体亲本之间百粒重的差异
注：P值表示SSSL-Z22与郑58之间t检验的结果；A％＝(100kwSSSL-Z22－100kwzheng58)/(2×100kwzheng58)×100％。
F2:3群体的表型分析
由SSSL-Z22和郑58构建的F2:3群体，其百粒重的表型值(图2)的变化区间为25.01g～36.99g，基本呈现正态分布。
基因定位分析
1.初步连锁分析
使用20对MaizeGDB上公布的公共SSR引物在玉米自交系郑58和SSSL-Z22进行多态性筛选，利用6对多态性引物对SSSL-Z22×郑58的F2进行分子标记检测。分子标记检测结果(表2)中，其三种基因型的分离比例为1:2:1。
表2百粒重主效QTL区段内的SSR标记基因型的分离情况
使用表2中的6对SSR分子标记对F2群体进行分子标记基因型检测，通过JoinMap4.0软件对其进行连锁分析，得到6个SSR标记的排列顺序是P12-mmc0481-umc1680-phi087-P9-umc2201(图3)。
利用winQTLcart2.5软件复合区间作图法，对F2:3群体中的301株单株进行表型和分子标记的连锁分析(图4)，将百粒重QTL定位在SSR标记mmc0481和P9之间，其置信区间为12.7cM。该QTL使百粒重减少0.61g～1.35g(表3)，该QTL的表型贡献率为19.12％，加性效应值均为负值，说明SSSL-Z22中来自昌7-2染色体片段的QTL起减效作用。
表3使用F2:3群体检测百粒重QTL
2.目标染色体区段内的引物开发
由于各标记间的遗传距离较大，定位不精密，需在目标区段内增加标记。
利用软件Primer6.0设计了149对新的引物(表4)，参数设置为：引物长度是20个核苷酸左右，GC含量是40％～60％左右，无二级结构，碱基随机分布。这些引物被用来检测双亲之间的相关片段。这些引物检测双亲的多态性，被用来精确定位这个主效QTL qhkw5-3。
表4目标区段内开发的引物
3.进一步连锁分析
利用149对新设计的SSR引物对双亲进行多态性筛选，其中有28对有多态性。利用这28对有多态的新SSR引物在F2分离群体中进行了标记基因型检测，与郑58带型一致的记作郑58/郑58，与昌7-2带型一致的记作昌7-2/昌7-2，杂合带型记作郑58/昌7-2，三种基因型(郑58：郑58/昌7-2：昌7-2)均呈现1:2:1的分离比例。使用JoinMap4.0软件对34个分子标记进行连锁分析，构建目标区域内的高密度遗传连锁图谱(图5)。目标区段内的遗传图谱总长为25.9cM，SSR标记之间的平均遗传距离为0.8cM。
利用winQTLcart2.5软件对F2:3群体的表型和F2的基因型进行连锁分析。数据显示百粒重QTL qhkw-5-3被定位于玉米第5号染色体Bin5.06区域的SSR标记Sym035和Sym119之间(图6、图7)，两标记的遗传距离为9.7cM，其置信区间约为8.6cM。qhkw5-3可以使百粒重减少0.96g～1.34g(表5)，QTL的表型贡献率为17.10％。
表5使用F2:3群体检测百粒重QTL
玉米粒长、粒宽和粒厚的QTL分析
1.表型分析
进一步分析SSSL-Z22和郑58构建的301个F2:3家系的粒长、粒宽和粒厚的表型分布(图8ABC)。粒长的表型值区间为9.21mm～11.60mm，粒宽的表型值区间为7.98mm～9.72mm，粒厚的表型值区间为4.67mm～6.87mm，都基本呈现正态分布。
2.相关分析
301个F2:3家系的百粒重与粒长、粒宽和粒厚的相关系数分别为0.532、0.726、0.187。绘出散点图(图9ABC)，经试验统计检验，百粒重与粒长、粒宽和粒厚的3个r值均大于r0.01(300)＝0.148，即百粒重与粒长、粒宽和粒厚均呈显著相关。
3.基因定位分析
分别对粒长、粒宽和粒厚进行QTL分析，在这一区段内没有定位到粒长和粒厚的QTL，检测到一个粒宽的QTL qgw5-3(图10)。
数据显示粒宽QTL qgw5-3被定位于玉米第5号染色体Bin5.06区域内的SSR标记Sym024和Sym128之间，两标记之间的遗传距离为13.1cM，qgw5-3的置信区间为12.1cM。qgw5-3可使粒宽减小2.0mm～2.3mm，其表型贡献率为29.9％，且均为负效应(表6)，说明来自昌7-2的基因有减效作用。
表6使用F2:3群体检测粒宽QTL
本研究通过对郑58遗传背景上的昌7-2的单代换片段SSSL-Z22和郑58杂交后代F2的基因型和F2:3的表型数据进行连锁分析，将百粒重主效QTL qhkw5-3定位在Sym035和Sym119之间，该百粒重主效QTL qhkw5-3可以使籽粒变小从而引起百粒重减少。进一步分析表明，在与百粒重QTL相同的区间定位到一个控制粒宽的QTL qgw5-3，说明粒宽对百粒重的影响比较大，推测百粒重的减小主要是由于粒宽的变窄引起的。
经检索文献发现，Austin&Lee(1998)、向道权等(2001)、兰进好等(2005)、Lu etal.(2006)、Yan et al.(2006)、彭勃等(2010)和Li et al.(2011)利用不同的定位群体在玉米第5号染色体上的Bin5.06区bnlg278-umc1680-bnlg1306这个基因组的区段内均检测到百粒重QTL。Neuffer et al.(1978，1995)列出了458个已经定位的玉米籽粒性状突变体基因，其中控制玉米籽粒变小的基因smk*-N1160与本研究的百粒重QTL qhkw5-3及定位的粒宽QTL qgw5-3位于相同的基因组区域，且此基因组区域内的QTL均为负效应。在玉米遗传与基因组网站(http://www.maizegdb.org/cgi-bin/qtl_loci_summary_table.cgi)上公布的、已经定位的玉米产量性状QTL共有887个，其中与百粒重有关的QTL分布在整个玉米基因组上的QTL有78个，其中在qhkw5-3附近的产量性状QTL有15个，没有查询到关于粒宽的定位结果，在作物重要性状比较定位上应用的比较基因组学和生物信息学理论和方法，为整合来自不同试验中的QTL提供了依据。Rudner et al.(2002)指出对不同的研究中的结果数据进行合并和统计分析可以使用图谱映射和元分析的方法，并且这种方法可以对实际数据进行全面的检验，在整合QTL基础上使用这种方法，建立数学模型可优化QTL，缩小置信区间，提高复杂性状QTL定位准确性和有效性(Goffinet&Gerber，2000)。王帮太等(2009)使用生物信息学方法，整合了不同试验定位到的400个玉米产量及产量相关性状的QTL，发掘出96个玉米产量及相关性状的“一致性”QTL，其中玉米粒重“一致性”QTL qkw31位于本研究定位的百粒重QTL qhkw5-3附近。本研究以一份玉米骨干自交系郑58遗传背景上昌7-2染色体单片段代换系SSSL-Z22为基础材料，通过对SSSL-Z22和郑58再杂交得到仅在目标区域内有遗传分离的F2:3代群体进行基因定位，将百粒重QTL qhkw5-3和粒宽QTL qgw5-3定位在8.6cM和12.1cM的区间内。本研究定位到的粒宽QTL qgw5-3可能是一个新的QTL。
百粒重与玉米的籽粒产量相关，是玉米籽粒产量的重要影响因素之一，受玉米籽粒粒宽、粒厚等因素的影响。Kai et al.(2009)通过构建Minghui63(轮回亲本)和Chuan7的近等基因系，将与粒重性状相关的QTL GS3定位在水稻第3号染色体的着丝粒周围的区域。宋献军等(2007)以粒重性状上有显著差异的品种“丰矮占1号”(籼稻)和“WY3”(粳稻)为亲本，构建了近等基因系(丰矮占1号为背景)，使用分子标记辅助选择的方法将亲本WY3携带的GW2位点的片段长度缩短至1.4cM，并对其进行了克隆，研究表明相对于丰矮占1号，NIL的粒重明显增加，引起单株产量增加，同时检测到该基因控制粒宽性状，说明了控制粒宽/粒重的基因GW2在水稻分子育种中有很好的应用前景。本研究通过对百粒重QTL qhkw5-3进行定位，研究了粒长、粒宽和粒厚与百粒重的相关性，结果显示在百粒重QTL区域内定位到控制粒宽的QTL，且效应一致，说明百粒重的减少是由粒宽的变窄引起的，控制百粒重的QTL和控制粒宽的QTL是否为同一基因尚有待于进一步验证。
有关数量性状QTL主基因化的研究有很多，例如在水稻上，Shomura et al.(2008)利用BC3F3群体将控制粒宽和粒重的QTL qSW5进行了精细定位。Wan et al.(2008)利用染色体片段代换系CSSLs对控制粒重和粒宽的基因GW5进行了精细定位和克隆；小麦上，Su etal.(2011)使用RIL群体对控制粒重和粒宽的QTL TaGW2-6A进行了精细定位。玉米上，Geoffrey etal.(1997)通过对B73×Mo17的后代群体的分析发现了一个籽粒产量或与产量相关性状的一个位于5号染色体上的主效QTL，为了对这个QTL(AMP3)进行精细定位，构建了一个以Mo17背景上的B73片段的BC2S1群体，利用RFLP分子标记，将AMP3定位在NPI275和NPI449之间，与NPI449的距离为1.6cM。Liu et al.(2012)发现一个影响行粒数的主效QTLqKNPR6，并构建SL57-6和Ye478杂交后的分离群体，使用SSR分子标记技术最终将qKNPR6定位在6号染色体上的N6M19和umc1257之间，两个标记的距离为0.91cM。Zhang et al.(2013)构建了178×5003(107)杂交的NILs，利用SSR分子标记，将行粒数主效QTL qKN定位在10号染色体上的SSR15和SSR19之间，其间的遗传距离约为480kb。陈欢庆(2009)以高油玉米GY220为轮回亲本，构建了8622、8984与GY220的近等基因系，将百粒重qGW1和qGW3分别定位在5.096Mb和5.3cM的区间内。申炳涛(2012)以大粒普通玉米自交系丹232和小粒爆裂玉米自交系N04构建近等基因系，其中N04为遗传背景，使用indel标记在玉米第1、5、7号染色体上定位到粒重的QTL qnpGW1、qnpGW5、qnpGW7。Lu et al.(2006)和Austin&Lee(1998)的研究表明，在玉米第5号染色体上Bin5.06区SSR标记bnlg278-umc1680-bnlg1306所在的基因组区段内均检测到百粒重QTL为主效。本研究以108份玉米染色体单片段代换系为基础，对其中一份单片段代换系SSSL-Z22进行了研究，定位到玉米百粒重QTL qhkw5-3和粒宽QTLqgw5-3，结果可用于进一步精细定位、图位克隆和籽粒产量相关性状遗传机制的研究，有助于籽粒产量相关性状的遗传机制研究。
关于玉米百粒重和粒宽的研究为玉米产量性状基因的定位和克隆奠定了基础。相信随着定位群体、分子标记技术和基因芯片技术的不断完善，定位克隆玉米产量QTL的速度将会越来越快，随籽粒大小基因的大量定位和克隆，玉米的产量性状的研究将会再上一个新台阶。

Claims (2)

1.一种调控玉米百粒重主效QTL的分子标记，其特征在于：以玉米总DNA为模板，对SSR引物Sym035和Sym119进行PCR扩增，经凝胶电泳得到长度分别为165bp和147bp的DNA片段，在第5染色体上Bin5.06区段位于SSR分子标记Sym035与Sym119之间存在一个调控玉米百粒重主效QTL，可以使籽粒变小从而引起百粒重减少，在与所述调控玉米百粒重主效QTL相同的区间定位到一个控制粒宽的QTL qgw5-3，定位于玉米第5号染色体Bin5.06区段位于SSR分子标记Sym024与Sym128之间，所述百粒重的重量的减小是由于粒宽变窄引起的；
所述SSR标记Sym035的序列为：
F：5＇-TAAGGAGCAACAATGGCGGA-3＇
R：5＇-CATCCGCAGCAAATACCACG-3＇；
所述SSR标记Sym119的序列为：
F：5＇-ATCAGCGTCGTCGGCATTA-3＇
R：5＇-TGGGACCTCGGACTACACTAT-3＇；
所述SSR标记Sym024的序列为：
F：5＇- CGGTCGGTCGTGGTTTCATA -3＇
R：5＇- GGGATGTCGTTCATGCATGC -3＇；
所述SSR标记Sym128的序列为：
F：5＇- GTCCAGTTCGTTGAGCAGAATA -3＇
R：5＇- TGGTGATGAAGTGGCGTGTA -3＇。
2.如权利要求1所述的调控玉米百粒重主效QTL的分子标记在控制玉米籽粒大小中的应用。
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