CN107090494A

CN107090494A - 与谷子码粒数性状相关的分子标记及其检测引物和应用

Info

Publication number: CN107090494A
Application number: CN201710184039.7A
Authority: CN
Inventors: 赵治海; 赵芳; 范光宇; 魏玮; 史高雷; 张耕耘; 张晓磊; 邱凤仓; 苏旭
Original assignee: ZHANGJIAKOU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: ZHANGJIAKOU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2037-03-24
Also published as: CN107090494B

Abstract

本发明公开了一种与谷子码粒数性状相关的分子标记及其检测引物和应用，所述分子标记是CGN‑06‑168，其位于谷子第6号染色体的序列第5236168bp位置，碱基为C/T。本发明可以预测谷子码粒数，为实现谷子码粒数性状的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持。

Description

与谷子码粒数性状相关的分子标记及其检测引物和应用

技术领域

本发明涉及谷子育种技术领域，尤其涉及与谷子码粒数性状相关的分子标记及其检测引物和应用。

背景技术

我国是谷子的原产地和世界上栽培面积最大、产量最高的国家，产量约占全世界总量的80％。同时，我国也是谷子遗传资源数量最多、多样性最丰富的国家。

谷穗由穗轴和众多谷码组成，码数和码粒数等是影响谷子产量的重要因子，研究与控制谷子码数、码粒数等产量性状相关的基因位置及其功能等，对于指导谷子遗传育种具有重要的意义。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是基因组水平上由单个核苷酸碱基的变异引起的DNA序列多态性，其在基因组中数量多，分布广泛，遗传稳定性好。随着基因测序技术的发展和成本的降低，对不同个体同一基因或基因片段进行直接测序和序列比较，可以确定碱基是否存在变异。因此，SNP检测有利于基因分型，适用于快速和规模化筛查未知或已知SNP与某遗传性状的关系。

目前关于谷子数量性状相关的QTL(quantitative trait locus)定位和SNP标记研究主要集中于SSR标记的开发利用等途经，而利用群体自交系基因组测序检测单核苷酸多态性(SNP)分子标记的开发应用研究尚未有报道。因此，开展谷子数量性状SNP分子标记的开发，并建立辅助选育体系，对于提高谷子产量，节约育种成本具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种与谷子码粒数性状相关的分子标记及其检测引物和应用，可以预测谷子码粒数，为实现谷子码粒数性状的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种与谷子码粒数性状相关的SNP标记，该SNP标记是CGN-06-168，其位于谷子第6号染色体的序列第5236168bp位置，碱基为C/T。

进一步地，上述CGN-06-168位点所在的序列如SEQ ID NO：3所示，上述CGN-06-168位点是SEQ ID NO：3所示序列自5’端起第56位碱基。

进一步地，对上述SNP标记，利用复合区间作图法，采用5％的总体显著水平，QTL检测的LOD值为4.0754，表型变异解释率为4.09％。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种用于检测如第一方面的SNP标记的引物对，包括：

上游引物23_2F：5’-GTAGCAATGTACTTGCCTTAA-3’(SEQ ID NO：1)和

下游引物23_2R：5’-TTGGTGGAGTGACTGTGAA-3’(SEQ ID NO：2)。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种用于检测如第一方面的SNP标记的试剂盒，包括如第二方面的引物对，以及任选的用于PCR扩增的试剂成分，这些试剂成分可以包括PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶等。

根据本发明的第四方面，本发明提供一种检测如第一方面的SNP标记的方法，采用如第二方面的引物对，对待检测的谷子基因组DNA进行PCR扩增，并通过测序扩增产物来分析CGN-06-168位点的碱基情况。

根据本发明的第五方面，本发明提供如第二方面的引物对在检测如第一方面的SNP标记中的应用。

根据本发明的第六方面，本发明提供一种谷子码粒数预测方法，采用如第二方面的引物对，对谷子基因组DNA进行PCR扩增，并通过测序扩增产物来分析CGN-06-168位点的碱基情况，进而预测谷子码粒数。

根据本发明的第七方面，本发明提供如第一方面的SNP标记在谷子码粒数预测、或谷子码粒数性状的早期鉴定、或谷子分子辅助育种中的应用。

根据本发明的第八方面，本发明提供如第二方面的引物对在谷子码粒数预测、或谷子码粒数性状的早期鉴定、或谷子分子辅助育种中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供的与谷子码粒数性状相关的SNP标记可以用于谷子码粒数性状的分子标记辅助育种，通过该SNP标记可以预测谷子码粒数，为实现谷子码粒数性状的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持，对于加快谷子品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。本发明的特异性引物可以对谷子码粒数进行良好分型，检测SNP表达的差异。

附图说明

图1为本发明实施例中谷子父母本基因组DNA电泳胶图，其中M泳道表示DL2000marker；1泳道表示张谷三号基因组DNA；2泳道表示A2基因组DNA。

图2为本发明实施例中谷子父母本基因组PCR产物电泳胶图，其中A23-2表示以A2DNA为模板、23_2为引物的PCR产物，323-2表示以张谷三号DNA为模板、23_2为引物的PCR产物，M表示DNA marker的片段大小，从下至上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

图3为本发明实施例中母本和父本SNP标记CGN-06-168所在的序列的比对结果图，SNP标记CGN-06-168位于第6号染色体，第5236168bp位置，母本碱基为C，父本碱基为T。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例提供与谷子码粒数性状相关分子标记、引物及其应用。本发明实施例的谷子码粒数紧密连锁SNP标记是CGN-06-168，其位于谷子第6号染色体的序列第5236168bp位置(参考基因组——Yugu基因组上的碱基编号)。

值得说明的是，本发明中bin是指Bin作图(Bin map)中，利用作图群体中全部的重组位点信息，获得构成重组事件的最小单位(Recombination bin)。利用得到的bin作为标记用于后续的连锁图谱构建和QTL定位。

在本发明实施例中，遗传图谱(genetic map或linkage map)是指以遗传标记间重组率为基础构建的标记之间相对位置的线性排列图。基于高通量重测序技术通过对作图群体亲本和子代群体进行测序，将一定数量的连续SNP作为判断子代重组位点的依据，得到每个子代的全基因组物理重组图谱。利用作图群体中全部的重组位点信息，获得构成重组事件的最小单位(Recombination bin)和Bin图(Bin map)，并利用得到的bin作为标记用于后续的连锁图谱构建和QTL定位。

本发明实施例提供谷子父本“张谷三号”和母本“A2”材料(用谷子不育系1066A与谷子光温敏不育系821杂交后，经多代选育而成)、二者杂交的F1代材料及自交13代的F2群体441份材料。将各份材料在河北张家口种植，并记录和整理码粒数等性状数据。将各份材料进行简并基因组重测序后，比对参考基因组拼接完成，获得SNP标记。通过分析码粒数性状数据，获得与之相关的SNP标记，并通过克隆测序验证该SNP标记。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和技术效果，应当理解，实施例仅是示例性的，用于说明本发明的可行性以及得到的结果，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1：高通量测序和SNP标记信息分析

本实施例利用谷子父本“张谷三号”和母本“A2”材料、二者杂交获得的F1代材料及F1代自交13代后得到的F2群体441份材料，即重组自交系(Recombinant inbred lines，RILs)。将各份材料在河北张家口种植，并记录和整理码粒数等性状数据。将各份材料进行简并基因组重测序后，比对参考基因组拼接完成，获得SNP标记。通过分析码粒数性状数据，获得与之相关的SNP标记，并通过克隆测序验证该SNP标记。

本实施例利用RADseq方法，提取每个样本个体(其中441个RILs、2个亲本、1个F1个体)的基因组DNA并进行DNA质量检测，对合格的DNA进行酶切，电泳回收DNA片段，并加上接头进行簇(cluster)制备，最后上机测序。

本实施例的具体步骤如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方(1L)如下表1：

表1

成分	用量
		CTAB	15g
1mol/L Tris.Cl(pH为8.0)	75mL
		0.5mol/L EDTA	30mL
NaCl	61.4g

加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min；于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入50μL TE溶解DNA。

(5)检测DNA的浓度，并用水调整为20ng/μL。

(6)采用PstI酶进行酶切，打断基因组DNA，反应体系如下表2：

表2

(7)进行连接反应，反应体系如下表3：

表3

(8)每个样品各取1μL反应产物，加入一个新的离心管中，总体积12μL。每12个样品一组。

(9)用3％回收胶电泳1h，EB染色后切取300-700bp大小片段。用QIAquick Kit进行胶纯化回收，回收产物溶于30μL EB溶液。

(10)进行PCR反应，PCR反应体系如下表4：

表4

试剂	用量
		无菌水	1μL
10×缓冲液(含Mg²⁺)	2.5μL
		dNTPs(25mM)	0.25μL
高保真酶(5U/μL)	0.25μL
		正向引物(10μmol/L)	0.5μL
反向引物(10μmol/L)	0.5μL
		模板DNA	20μL
总体积	25μL

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行10个循环；最后72℃延伸3分钟。

(11)磁珠纯化，完成建库。具体纯化方法为：首先，PCR后加入1.2倍体积磁珠，静置10min。然后，置于磁力架上吸附，去除上清。然后，加入500μL 70％乙醇洗涤两次。干热仪上蒸干后，加入15μL EB溶液溶解5min。最后，磁力架上吸附，转移上清于1.5ml离心管中。

(12)检测达到上机标准后上机测序。

结果：对444个样本(其中441个RILs、2个亲本、1个F1个体)进行酶切建库测序，得到75.99Gb原始数据，平均每个个体171.54Mb。将测序序列比对到参考基因组(即Yugu基因组，可以从下列网址获取Yugu基因组的序列：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝Setaria+italica+(foxtail+millet))上，平均比对率86.326％，平均覆盖率8.226％，平均测序深度3.655X。

通过测序和信息分析，获得亲本间有多态性的33771个SNP标记。根据窗口滑动的方法，选取若干个SNP为一个窗口，每次滑动一个SNP确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点。最后生成bin基因型。根据bin基因型数据，用MSTMap软件构建遗传图谱，2022个bin定位到9条染色体上，再将遗传图谱数据导入到MapChart软件，整合一张基因组遗传连锁图谱。

利用所构建的谷子高密度遗传图谱，采用复合区间作图分析(CIM)，对谷子码粒数性状表型进行QTL分析。QTL检测采用5％的总体显著水平，根据500次排列检验结果，确定码粒数性状表型数据QTL分析的临界LOD值，分析得到与码粒数相关的预测bin区间和SNP位点信息。

结果显示，与谷子码粒数性状相关的分子标记CGN-06-168位于遗传连锁图谱第6号染色体41.07厘摩(cM)，第32个bin至第33个bin(chr6_bin32-chr6_bin33)，利用复合区间作图法，采用5％的总体显著水平，QTL检测的LOD值为4.0754，表型变异解释率为4.09％，加性效应值(Additive effect，A)为-12.432。

实施例2：SNP标记验证

根据预测的bin区间和SNP位点，比对参考基因组，得到相关区域基因序列，选取SNP位点前后300bp左右，设计开发SNP标记引物，以父本和母本材料DNA为模板进行PCR扩增。选择引物扩增正常、PCR产物符合预测大小的扩增产物，回收产物并进行测序，选择父本和母本材料扩增基因序列有SNP位点差异的标记引物。

预测的bin标记中包含多个SNP位点，根据PCR结果对这些位点进行筛选。

首先，根据PCR产物回收后的测序结果，选择父本和母本材料扩增基因序列有SNP位点差异的标记。具体步骤如下：

(1)按照实施例1中步骤(1)至(4)，用CTAB法分别提取父母本基因组DNA。

(2)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA，谷子父母本基因组DNA电泳胶图如图1所示。

(3)将得到的父母本基因组DNA存于-20℃备用。

(4)分别以提取的父本和母本的基因组DNA为模板，利用23_2F：5’-GTAGCAATGTACTTGCCTTAA-3’(SEQ ID NO：1)和23_2R：5’-TTGGTGGAGTGACTGTGAA-3’(SEQ IDNO：2)扩增引物进行PCR扩增。

PCR反应体系如下表5：

表5

试剂	用量
		无菌水	20.2μL
10×缓冲液(含Mg²⁺)	2.5μL
		dNTPs(25mM)	0.15μL
Taq酶(5U/μl)	0.15μL
		正向引物(10μmol/L)	0.5μL
反向引物(10μmol/L)	0.5μL
		模板	1.0μL
总体积	25μL

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物经纯化后于4℃下保存。各PCR扩增产物取部分进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

通过对PCR扩增产物测序可知，引物23_2F和23_2R扩增得到的母本扩增产物的测序序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，CGN-06-168位点是SEQ ID NO：3所示序列自5’端起第56位碱基。母本扩增产物和父本扩增产物的测序序列比对结果如图3所示，其中标灰的碱基表示CGN-06-168位点的碱基。

然后，根据样品码粒数数据筛选：父本码粒数为124粒，母本码粒数为41粒，441份样品中，最小值6粒，最大值336粒，码粒数最少的50个样品中，与母本SNP相同的样品数多于60％，码粒数最多的50个样品中，与父本SNP相同的样品数多于80％。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 张家口市农业科学院

<120> 与谷子码粒数性状相关的分子标记及其检测引物和应用

<130> 16I23504

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 用于检测CGN-06-168的上游引物

<400> 1

gtagcaatgt acttgcctta a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 用于检测CGN-06-168的下游引物

<400> 2

ttggtggagt gactgtgaa 19

<210> 3

<211> 275

<212> DNA

<213> CGN-06-168位点所在的序列

<220>

<221> SNP位点

<222> (56)..(56)

<223> n是C或T

<400> 3

tgccttaatg cctgctgctg aagctcttgc accgattgca ccaccccggt acctcngcct 60

gggcgctttg gctcaacgga cacatatcac tggctactct tgctgcgcgc atccaggggg 120

cgcacttcga cgacctgaag aagatgctac ttgtctatcg tgccataatg acctccacgg 180

ttgggaatag acattccacc tcattctggt tcgataactg gctgtaggtt gggcagctcg 240

cagacactat gcccgctctt cacagtcact ccacc 275

Claims

1.与谷子码粒数性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记是CGN-06-168，其位于谷子第6号染色体的序列第5236168bp位置，碱基为C/T。

2. 根据权利要求1所述的与谷子码粒数性状相关的SNP标记，其特征在于，所述CGN-06-168位点所在的序列如SEQ ID NO：3所示，所述CGN-06-168位点是SEQ ID NO：3所示序列自5’端起第56位碱基。

3.根据权利要求1或2所述的与谷子码粒数性状相关的SNP标记，其特征在于，对所述SNP标记，利用复合区间作图法，采用5%的总体显著水平，QTL检测的LOD值为4.0754，表型变异解释率为4.09%。

4. 一种用于检测如权利要求1-3任一项所述的SNP标记的引物对，其特征在于，包括：

上游引物23_2F：5’-GTAGCAATGTACTTGCCTTAA-3’（SEQ ID NO：1）和

下游引物23_2R：5’-TTGGTGGAGTGACTGTGAA-3’（SEQ ID NO：2）。

5.一种用于检测如权利要求1-3任一项所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的引物对，以及任选的用于PCR扩增的试剂成分。

6.一种检测如权利要求1-3任一项所述的SNP标记的方法，其特征在于，采用如权利要求4所述的引物对，对待检测的谷子基因组DNA进行PCR扩增，并通过测序扩增产物来分析CGN-06-168位点的碱基情况。

7.如权利要求4所述的引物对在检测如权利要求1-3任一项所述的SNP标记中的应用。

8.一种谷子码粒数预测方法，其特征在于，采用如权利要求4所述的引物对，对谷子基因组DNA进行PCR扩增，并通过测序扩增产物来分析CGN-06-168位点的碱基情况，进而预测谷子码粒数。

9.如权利要求1-3任一项所述的SNP标记在谷子码粒数预测、或谷子码粒数性状的早期鉴定、或谷子分子辅助育种中的应用。

10.如权利要求4所述的引物对在谷子码粒数预测、或谷子码粒数性状的早期鉴定、或谷子分子辅助育种中的应用。