CN107365873B - 与谷子叶鞘色性状连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与谷子叶鞘色性状连锁的SNP标记及其应用，属于分子生物学领域。所述与谷子叶鞘色紧密连锁SNP标记PL‑07‑106，其位于第七染色体的27238106bp位，其第七染色体的27238106bp位的核苷酸为C/T。本发明还进一步地提供了检测SNP标记PL‑07‑106的引物对、试剂盒以及其在分子辅助育种中的应用。

Description

与谷子叶鞘色性状连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种与谷子叶鞘色性状连锁的SNP标记及其应用，属于分子生物学领域。

背景技术

谷子(学名：Setaria italica)属禾本科的一种植物。古称稷、粟，亦称粱。原产于中国北方黄河流域；粟耐旱，适合在干旱而缺乏灌溉的地区生长。我国是谷子栽培面积最大、产量最高的国家，产量约占全世界总量的80％。同时，我国也是谷子遗传资源数量最多、多样性最丰富的国家。

叶鞘色、叶色等是谷子重要的颜色性状，研究与控制谷子叶鞘色等性状相关的基因及其位置功能等，对于创制颜色丰富的谷子新品种，加快谷子育种进程具有重要的意义。

当前，在国内外的育种中，分子标记的使用越来越广泛。分子标记有很多不同的种类，包括RFLP标记(限制性片段长度多态性)，RAPD标记(DNA随机扩增多态性)，SSR标记(微卫星标记)，AFLP标记(扩增片段长度多态性)，SNP分子标记(单核苷酸多态性)等。

SNP是最近发展起来的新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。不同谷子品种全基因组的序列测定及比较表明，SNP在水稻基因组上的分布极其丰富，相比于目前谷子育种中常用的SSR标记要广泛得多。目前SSR在分子标记辅助育种及基因定位等研究中的应用较多，但由于基因组中SSR存在不稳定性，分布的密度相对较低，基因分型较难实现自动化等问题，其应用有着很大的局限性。SNP的突变率低，尤其处于编码区的SNP是高度稳定的，其遗传稳定性要比SSR等遗传标记高得多，遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性都优于SSR。绝大部分SNP具有二态性，非此即彼，不像SSR标记经常具有多种DNA片段的长度可能性，有利于自动化的检测。尽管SNP只有两种等位基因型，单个位点上的多态性信息量比SSR等多等位基因型的信息量少，但SNP高频率的特性使其提供的总信息量很高。SNP易于开展高通量检测的特性，注定了它更适于复杂性状的遗传分析。

发明内容

本发明的第一方面是提供一种与谷子叶鞘色紧密连锁SNP标记PL-07-106，其位于第七染色体的27238106bp位。

在一个实施方案中，所述SNP标记PL-07-106，其第七染色体的27238106bp位的核苷酸为C/T。进一步地，当SNP标记PL-07-106的核苷酸为C时，包含该SNP标记的谷子材料的叶鞘色为紫色；而当SNP标记PL-07-106的核苷酸为T时，包含该SNP标记的谷子材料的叶鞘色为绿色。

本发明的第二方面是提供可扩增所述SNP标记PL-07-106的引物对，具体如下：

正向引物：5’-GTAATCGAAGACCCTATCC-3’；

反向引物：5’-CTAAGTTGTTCAATGCTCC-3’。

本发明的第三方面是提供一种检测SNP标记PL-07-106的试剂盒，其包含DNA提取试剂、所述可扩增SNP标记PL-07-106的引物对和PCR反应必要的试剂。

本发明的第四方面是提供一种检测SNP标记PL-07-106的方法，其包括以下步骤：

1)从待测试谷子样本中制备DNA，

2)扩增包含SNP标记PL-07-106的DNA序列，

3)上样测序，判定SNP标记PL-07-106的具体核苷酸类型。

在一个实施方案中，步骤2中扩增所使用的引物对序列如下：

正向引物：5’-GTAATCGAAGACCCTATCC-3’；

反向引物：5’-CTAAGTTGTTCAATGCTCC-3’。

在又一个实施方案中，在步骤3中，当SNP标记PL-07-106的核苷酸为C时，包含该SNP标记的谷子样本的叶鞘色为紫色；而当SNP标记PL-07-106的核苷酸为T时，包含该SNP标记的谷子样本的叶鞘色为绿色。

本发明的第五方面是提供所述SNP标记PL-07-106在谷子分子辅助育种中的应用。

本发明的第六方面是提供所述引物对在谷子分子辅助育种中的应用。

本发明涉及特异性引物可以对谷子叶鞘色进行良好分型，检测SNP多态性表达的差异。本发明提供的谷子叶鞘色性状SNP标记可以用于谷子叶鞘色性状的分子标记辅助育种，对于加快谷子品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

附图说明

图1不同叶鞘色谷子基因组DNA电泳图，其中，M:D15000marker,A:叶鞘色紫色材料DNA；B：叶鞘色绿色材料DNA。

图2本发明所使用的引物对的扩增产物电泳图，其中，A：以叶鞘色紫色材料DNA为模板，Y7F1Y7R1为引物的PCR产物，B：以叶鞘色绿色材料DNA为模板Y7F1Y7R1为引物的PCR产物,M：marker的片段大小从下至上依次为100，250，500，750，1k，2k。

图3本发明所使用的引物对的扩增产物的测序结果示意图。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

通常，基因组DNA由互补的双链DNA组成。因此，即使为了描述的目的而在此公开一个链的DNA序列，应自然地假定其互补的序列(核苷酸)也是公开的。当一个链的DNA序列(核苷酸)已知，其互补序列(核苷酸)对本领域的技术人员来说是显而易见的。

在此，“判定核苷酸的类型”通常指确定在待鉴别品种的谷子的基因组上所描述位置的核苷酸序列。

在获得本发明所公开的SNP位点后，通过确定该具体SNP位点所在的基因或与该基因连锁的SNP位点后，通过PCR检测、探针杂交、芯片检测和试剂盒等设计和应用检测的方法，都在本发明保护范围之内。

本发明所获得的SNP位点，可以应用于任何能够检测出SNP基因型的实验平台，例如Illumina、Affimetrix、Sequenom等公司的基因分型平台。这些公司的分型平台的技术手段各不同，但原理是类似的。通过合成检测SNP标记的寡核苷酸探针的芯片或试剂盒，然后在相应的基因分型设备上用相应的SNP分型技术进行基因分型。

在本发明公开了SNP位点在染色体上的物理位置后，可以通过公共渠道获得该位点两侧的侧翼序列，并通过相关软件进行探针设计，从而获得可以检测该SNP位点的有效探针。

实施例1遗传群体的构建

从山西省农业科学院农作物品种资源研究所5572份谷子种质中选取494份表型多样且具代表性的地方品种，分别于2015年和2016年种植于山西省农业科学院东阳试验基地(coordinates:112.7°E，37.6°N)，每份材料种2行，行长2.5m，并按标准调查主要的21个农艺性状和产量性状，并记录和整理叶鞘色等性状数据。

实施例2谷子资源群体建库测序

针对实施例1中获得的谷子RIL群体，用CTAB法分别提取父母本及RIL群体单株的基因组DNA并建库测序，具体方法如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：

CTAB	15g
		1mol/L的Tris.Cl(pH为8.0)	75mL
0.5mol/L的EDTA	30mL
		NaCl	61.4g

加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入50μL TE溶解DNA。

(5)检测DNA的浓度，并用水调整为20ng/ul。

(6)采用PstI酶进行酶切，打断基因组DNA。

(7)进行连接反应。

(8)每个样品各取1ul反应产物，加入在一个新的离心管中，总体积12ul。每12个样品一组

(9)用3％回收胶电泳1h，EB染色后切取300-700bp大小片段。用QIAquick Kit进行胶纯化回收，回收产物溶于30ul EB solution。

(10)进行PCR反应。

PCR反应体系如下：

无菌水	1μl
		10*Buffer(含Mg<sup>2+</sup>)	2.5μl
dNTPs(25mM)	0.25μl
		高保真酶(5U/μl)	0.25μl
正向引物(10μmol/L)	0.5μl
		反向引物(10μmol/L)	0.5μl
模板	20μl
		总体积	25μl

PCR反应程序如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行10个循环；最后72℃延伸3分钟。

(11)磁珠纯化，完成建库。具体纯化方法为：

首先PCR后加入1.2倍体积磁珠，静置10min。然后，置于磁力架上吸附，去除上清。然后，加入500ul 70％酒精洗涤两次。之后，干热仪上蒸干后，加入15ul EB溶解，5min。最后，磁力架上吸附，转移上清于1.5ml离心管中。

(12)利用RADseq方法，提取每个样本个体的基因组DNA并进行DNA质量检测，对合格的DNA进行酶切，电泳回收的DNA片段，并加上接头进行cluster制备，最后上机测序。

对样本进行酶切建库测序，得到80.87Gb原始数据，平均每个个体163.69Mb。将测序序列比对到参考基因组上，再根据最小等位基因频率、缺失率、杂合率等各项参数进行数据过滤后，共鉴定出了群体中244,033个SNP位点。这些SNP覆盖全染色体，其中以6,7,8号染色体最为密集。根据窗口滑动的方法，选取若干个SNP为一个窗口，每次滑动一个SNP确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点。最后生成bin基因型和bin图。准备好的bin基因型数据，用MSTMap软件构建遗传图谱，再将遗传图谱数据导入到MapChart软件，整合一张基因组连锁图谱。

实施例3分子标记的获得

对实施例2获得父母本及RIL群体单株的基因组DNA进行PCR扩增，具体方法如下：

分别以提取的叶鞘色绿色材料和叶鞘色紫色材料的基因组DNA为模板，利用Y7F1:5’-GTAATCGAAGACCCTATCC-3’和Y7R1:5’-CTAAGTTGTTCAATGCTCC-3’以及扩增引物进行PCR扩增，其中，

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物经纯化后于4℃下保存。

接着，将各PCR扩增产物取部分进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。

利用所构建的谷子高密度遗传图谱，采用复合区间作图分析(CIM)，对谷子叶鞘色性状表型进行QTL分析。QTL检测采用5％的总体显著水平，根据500次排列检验结果，来确定叶鞘色性状表型数据QTL分析的临界LOD值。分析得到与叶鞘色相关的预测bin区间和SNP位点信息。

根据预测的bin区间和SNP位点，比对参考基因组，得到相关区域基因序列，选取SNP位点前后300bp左右，设计开发SNP标记引物，以叶鞘色有差异的两个材料DNA为模板进行PCR扩增。选择引物扩增正常，PCR产物符合预测大小的扩增产物，回收产物并进行测序，选择扩增基因序列有SNP位点差异的标记引物。两种叶鞘色的材料随机选择24份为模版，进行SNP标记引物PCR扩增和结果测序，选择符合基因分型和与表型性状相关的标记引物。最终获得与谷子叶鞘色连锁的一个SNP标记，所述SNP标记PL-07-106，其第七染色体的27238106bp位的核苷酸为C/T。

实施例4与谷子叶鞘色连锁的SNP标记PL-07-106的验证

取50份的不同地方谷子品种样本，按照实施例2和3方法进行基因组DNA提取、建库、特定引物扩增和测序，确定谷子第七染色体的27238106bp位的核苷酸类型，具体结果如下：

结果表明，当SNP标记PL-07-106的核苷酸为C时，包含该SNP标记的谷子材料的叶鞘色为紫色；而当SNP标记PL-07-106的核苷酸为T时，包含该SNP标记的谷子材料的叶鞘色为绿色。

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (3)

1.一对引物在检测辨别谷子叶鞘色SNP标记PL-07-106中的应用，所述引物序列为：

正向引物：5’-GTAATCGAAGACCCTATCC-3’；

反向引物：5’-CTAAGTTGTTCAATGCTCC-3’；

所述SNP标记PL-07-106其位于序列CTATCTTGCTTAGAATCATGTTCTGTGTCAATTTCCTCTAC/TGAATGTTGG第41位，所述SNP标记PL-07-106的核苷酸为C/T。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物辨别谷子叶鞘色的方法包括以下步骤：

1)从待测试谷子样本中制备DNA，

2)采用引物扩增包含SNP标记PL-07-106的DNA序列，

3)上样测序，判定SNP标记PL-07-106的具体核苷酸类型。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤3中，当所述SNP标记PL-07-106为C时，该谷子样本的叶鞘色为紫色；而当所述SNP标记PL-07-106为T时，该谷子样本的叶鞘色为绿色。