CN109468315B - 水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用 - Google Patents

水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用。所述分子标记包括一个SNP标记和一个InDel标记,分别位于水稻9号染色体基因Sub1A和Sub1C上。其中,所述SNP标记在Sub1A基因上的多态性位点为G/C,所述InDel标记在Sub1C基因上的多态性位点为5’‑GCCGTCG‑3’/5’‑CA‑3’。针对所述分子标记设计特异性扩增引物,通过PCR扩增进行Sub1基因型的检测。本发明提供的Sub1的分子标记及其扩增引物可用于鉴定水稻Sub1的基因型,选育耐淹水稻资源,具有鉴定准确性高,操作简单,成本低廉等优点,能够缩短耐淹水稻的育种周期,降低育种成本。

Description

水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学及植物分子育种领域,具体地说,涉及水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一,世界上有一半以上的人口以稻米为主食。水稻生长过程中可能会遇到多种逆境,影响到其产量以及品质,包括寒冷、水淹、干旱、病虫害等逆境都会对水稻生长造成严重的影响,因此研究提高抗逆性是水稻高产稳产的重要途径与手段。中国水稻种植几乎遍布全国,分布很广,但具有南方多而集中,北方少而分散的特点。而南方地区降雨由于受到全球气候变暖的影响,部分地区的暴雨显著增多,水稻洪涝灾害时常发生,导致水稻严重减产。因此,水稻耐淹性的深入研究以及水稻耐淹品种的培育,对于加强水稻抗洪涝灾害、提高洪涝区域水稻种植产量和保证洪涝稻区粮食安全生产有着十分重要的意义。
籼稻材料FR13A在经历14天没顶淹水后仍能存活,表现出较强的耐淹能力,对FR13A或其后裔材料中耐淹能力进行基因定位克隆,在9号染色体上克隆了一个耐淹主效位点Sub1,Sub1位于182kb基因组区间,序列分析表明其包含3个编码隶属于植物AP2/ERF转录因子家族ERF亚家族蛋白基因Sub1A、Sub1B、Sub1C,目前已知Sub1A、Sub1B、Sub1C分别有2个(或缺失)、9个和7个等位基因:SubA1~2(或缺失)、Sub1B1~9、Sub1C1~7。目前利用MAS培育耐淹水稻品种的报道较少,并且大多都是利用与Sub1连锁、显性或酶切标记进行筛选,限制了耐淹水稻品种的选育效率,因此基于Sub1功能等位基因开发适于高效筛选的功能性共显性标记对培育耐淹水稻品种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用。
本发明构思如下:水稻耐淹性状主要由Sub1A-1等位基因控制,且发明人首次发现Sub1A-1仅出现在与Sub1C-1的组合中。进一步地,通过对已知的Sub1A的2个等位基因以及Sub1C的7个等位基因之间序列进行比对分析,在Sub1A中发现一个SNP(G/C),其中耐淹等位基因Sub1A-1为G,不耐淹等位基因Sub1A-2为C,此外该位点还存在缺失型,(如水稻‘日本晴’、‘M202’等中不含有等位基因Sub1A);在Sub1C中发现一段特异序列seq(5’-GCCGTCG-3’/5’-CA-3’),其中Sub1C-1为5’-GCCGTCG-3’,Sub1C其余等位基因为5’-CA-3’。鉴于现已开发的Sub1基因分子标记均难以有效鉴别出携带耐淹等位基因Sub1A-1杂合基因型的水稻,由此提出本发明。
本发明中,耐淹品种基因Sub1A、Sub1C在GenBank中的编号为DQ011597-DQ011607,不耐淹品种基因Sub1A、Sub1C在GenBank中的编号为DQ453964-DQ453966。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记,其为SNP标记,所述标记位于水稻9号染色体基因Sub1A上;所述SNP标记的核苷酸序列如SEQID NO:1所示,其中第53位碱基为多态性位点,该处碱基为G或C。
第二方面,本发明提供水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记,其为InDel标记,所述标记位于水稻9号染色体基因Sub1C上;所述InDel标记的核苷酸序列为5’-GCCGTCG-3’或5’-CA-3’。
第三方面,本发明提供水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记组合,由所述SNP标记和InDel标记组成。
第四方面,本发明提供用于检测所述SNP标记的ARMS-PCR引物,包括Sub1A-F和Sub1A-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示。
第五方面,本发明提供用于检测所述InDel标记的ARMS-PCR引物,包括Sub1C-F和Sub1C-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4-5所示。
第六方面,本发明提供含有所述引物Sub1A-F/Sub1A-R和/或所述引物Sub1C-F/Sub1C-R的检测试剂或试剂盒。
第七方面,本发明提供所述SNP标记、所述InDel标记、所述分子标记组合、引物Sub1A-F/Sub1A-R、引物Sub1C-F/Sub1C-R或含有所述引物的检测试剂或试剂盒的以下任一应用:
1)在水稻耐淹基因Sub1的基因型鉴定中的应用;
2)在鉴定水稻耐淹性状中的应用;
3)在鉴定及筛选耐淹水稻种质资源中的应用;
4)在水稻耐淹品种分子标记辅助育种中的应用。
第八方面,本发明提供水稻耐淹基因Sub1的基因分型方法,包括如下步骤:
(1)提取待测水稻的基因组DNA;
(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板,利用引物Sub1A-F/Sub1A-R以及引物Sub1C-F/Sub1C-R进行PCR扩增;
(3)分析扩增产物。
优选地,采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。根据电泳检测扩增产物条带类型进行判断。
前述的方法,步骤(3)具体为:如果扩增产物出现586bp的特征条带,则判定待测水稻为Sub1耐淹等位基因纯合型;如果扩增产物出现304bp的特征条带,则判定待测水稻为Sub1不耐淹等位基因纯合型或Sub1基因缺失;如果扩增产物出现586bp和304bp两种带型,则判定待测水稻为杂合基因型。
进一步地,可以根据Sub1的基因型判断水稻的耐淹表型:若Sub1A序列在SEQ IDNO:1所示序列的第53位碱基为G,则为耐淹等位,若此处碱基为C,则为非耐淹等位;若Sub1C在SEQ ID NO:6所示序列的第8-15位碱基为5’-GCCGTCG-3’,则为耐淹等位,若此处碱基为5’-CA-3’,则为不耐淹等位。
前述的方法,步骤(2)PCR反应条件为:94℃~98℃预变性3~10分钟;94℃~98℃变性10~30秒,52℃~60℃退火10~30秒,72℃延伸30~60秒,共25~35个循环;72℃延伸3~10分钟。优选地,PCR反应条件为:95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸45秒,共35个循环;72℃延伸8分钟。
PCR反应体系(10μL):10×PCR反应缓冲液1μL,10mM dNTP 0.8μL,4条引物(10μM)均为0.15μL,0.1μL Taq DNA聚合酶(2.5U/ul);2μL DNA模板,双蒸水补足余量。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
(一)目前针对Sub1基因开发的分子标记均为连锁标记,或基于Sub1A位点开发的显性标记,一方面连锁标记检测特异性不好、存在重组分离等不利因素,另一方面由于Sub1A存在Sub1A-1、Sub1A-2以及缺失3种等位基因,现有显性标记无法区分Sub1A-1与Sub1A-2两种等位型,从而使标记检测效率低、准确性不高;基于耐淹水稻品种中Sub1A-1仅与Sub1C-1组合出现,本发明分别针对Sub1A、Sub1C开发两对特异性显性检测引物,其中一对可以特异性扩增耐淹Sub1A-1等位基因,而Sub1A-2或Sub1A缺失型等位基因无带,从而实现耐淹品种的检测;另外一对引物可以特异性扩增除Sub1C-1以外的等位型,Sub1C-1等位扩增无带,用于特异性检测非耐淹品种,组合使用两组显性引物,可以实现共显性检测Sub1基因型,预测水稻是否耐淹,同时标记位于基因内功能区,检测准确性高。
(二)本发明提供的分子标记的扩增产物的不同条带大小差异较大,可通过琼脂糖凝胶电泳判定待测水稻材料的基因型,成本低廉、无需酶切,检测程序方便快捷,能够缩短耐淹水稻的育种周期,降低育种成本。
(三)利用本发明提供的分子标记进行辅助育种时,能够实现子代Sub1基因型的准确、简单、高效检测,同时实现水稻生长早期的非破坏性检测,适于商业化大规模育种中对Sub1基因型的大量筛选以及对水稻种质资源中Sub1等位基因型的鉴定。
(四)本发明提供的分子标记引物适于在水稻育种中对Sub1基因型的大量筛选以及从水稻种质资源中筛选新的Sub1基因型耐淹亲本。
附图说明
图1为本发明实施例1中耐淹亲本FR13A与不耐淹亲本分别在Sub1A以及Sub1C基因之间的序列比对图。其中,A图中为FR13A与特青(Teqing)在Sub1A等位区间的部分序列比对结果;B图为FR13A与Bio226、Nipponbare以及蜀恢498(SHUHUI498)在Sub1等位区间的部分序列比对结果。
图2为本发明实施例4中水稻育种亲本的检测电泳图。其中,M:DL1000 DNAmarker,其中泳道1-23依次对应为FR13A,Nipponbare,华占,9311,特青,玉针香,辽盐287,华润2号,成恢19,绵恢3728,徽粳208,沪粳6,华恢284,越粳0618,龙5,IR64,Fukuniski,IR29,盐稻531,华恢272,龙稻9号(糯),沪粳5,农垦31。
图3为实施例5中对FR13A与9311杂交构建的BC1F2群体检测的电泳图。其中,M:DL1000DNA marker,泳道P1、P2分别为耐淹亲本FR13A和不耐淹亲本9311,泳道1-32为利用FR13A与9311构建的BC1F2群体单株,各材料所属基因型标注与对应泳道上方,“-”代表不耐淹等位基因类型,“+”代表耐淹等位基因类型,H代表杂合类型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1Sub1基因共显性分子标记的开发
水稻Sub1基因位于9号染色体,是由Sub1A、Sub1B以及Sub1C 3个基因组成的基因簇,目前已知Sub1A、Sub1B、Sub1C分别有2个(或缺失)、9个和7个等位基因:SubA1~2、Sub1B1~9、Sub1C1~7,水稻耐淹性状主要由Sub1A-1控制,且Sub1A-1仅出现在与Sub1C-1的组合中,因此,通过对Sub1A以及Sub1C在不同水稻材料中的序列进行扩增和测序,采用DNAMAN等软件以及NCBI数据库等序列分析工具进行本地及在线进行序列比对分析,在Sub1A基因区间获得一个SNP位点,其中耐淹等位基因Sub1A-1为G,不耐淹等位Sub1A-2为C(如图1A);在Sub1C基因区间内发现一特异核苷酸序列,其中Sub1C-1等位为5’-GCCGTCG-3’,Sub1C其余等位为5’-CA-3’(如图1B)。针对这两处Sub1基因内部特异核苷酸序列开发分子标记,可以实现Sub1等位基因的鉴定。
实施例2Sub1基因共显性分子标记的检测引物(ARMS-PCR引物)设计
针对实施例1开发的两个Sub1基因特异性分子引物设计ARMS-PCR检测引物,引物设计原理如下:
首先,针对Sub1A基因内特异SNP位点设计特异扩增Sub1A-1等位型的引物,以SNP中G碱基互补的C碱基作为引物3’端设计反向引物Sub1A-R,并将3’端第二位碱基改为G,再在其上游设计与之配对的正向引物Sub1A-F,引物Sub1A-R与Sub1A-F(SEQ ID NO:2-3)只能特异性扩增Sub1A-1等位基因型,产生一条586bp的条带,而Sub1A-2等位基因型以及Sub1A基因缺失型则扩增无带。
其次,针对Sub1C中特异核苷酸序列设计特异扩增不耐淹等位引物,以特异核苷酸序列5’-CA-3’作为引物3’端设计正向引物Sub1C-F,并将3’端第三位碱基改成T,再在其下游设计与之匹配的反向引物Sub1C-R,Sub1C-F与Sub1C-R(SEQ ID NO:4-5)只能特异性扩增除Sub1C-1等位之外的其他等位,获得一条304bp的条带,而在扩增Sub1C-1等位时无条带。
具体引物序列如表1所示,四条引物混合使用组成Sub1的功能性共显性分子标记检测引物组,当扩增产物只有586bp时,待测水稻携带Sub1耐淹等位基因;当扩增产物只有304bp条带时,待测水稻不含耐淹等位基因;当扩增产物有586bp和304bp两种带型时,待测水稻为Sub1杂合基因型水稻。
表1Sub1特异性分子标记引物序列及相关参数
Figure BDA0001896483440000051
实施例3水稻耐淹基因Sub1特异性分子标记检测方法的建立
根据实施例2设计的Sub1两个分子标记的检测引物,设计PCR的反应程序和反应体系,经过不断优化,确定如下反应程序和体系:
PCR反应体系(10μL):10×PCR反应缓冲液1μL,10mM dNTP 0.8μL,4条引物(10μM)均为0.15μL,0.1μL Taq DNA聚合酶(2.5U/ul);2μL DNA模板,双蒸水补足余量。
PCR反应条件为:95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸45秒,共35个循环;72℃延伸8分钟。
实施例4Sub1特异性分子标记在检测水稻种质亲本资源中的应用
1、水稻材料
Sub1供体材料FR13A,以及22份育种亲本材料或市售水稻品种,具体包括:Nipponbare,华占,9311,特青,玉针香,辽盐287,华润2号,成恢19,绵恢3728,徽粳208,沪粳6,华恢284,越粳0618,龙5,IR64,Fukuniski,IR29,盐稻531,华恢272,龙稻9号(糯),沪粳5,农垦31。
2、水稻基因组DNA提取及引物合成
采用TPS法提取上述水稻材料的基因组DNA并合成表1所示的引物序列。
3、PCR检测
PCR的反应体系和反应程序如实施例3所述。扩增产物在1~2%琼脂糖凝胶中电泳,用凝胶成像仪扫描记录结果。
4、结果分析
PCR扩增产物的电泳结果如图2所示,1泳道Sub1耐淹供体材料FR13A特异性扩增出586bp条带,2-23泳道对应的亲本材料均扩增出304bp条带。为了验证PCR检测结果的准确性,将FR13A以及其余22个亲本材料对应的分子标记区域进行了测序比对,结果表明,分子标记检测结果与测序结果一致,证明本发明提供的引物能准确的鉴定Sub1基因型,可实现准确高效的水稻品种资源的筛选。
实施例5水稻耐淹基因Sub1在BC1F2群体的单基因分离的检测
1、水稻材料
耐淹亲本FR13A与不耐淹亲本9311以及两亲本构建的BC1F2群体。
2、水稻基因组DNA的提取和PCR检测
水稻基因组DNA提取和PCR检测的引物、反应程序和体系如实施例4所述。
3、结果分析
耐淹亲本FR13A与9311以及两亲本杂交的BC1F2群体100株材料部分电泳结果如图3所示,泳道p1、p2分别为耐淹亲本FR13A以及9311,泳道1-30为BC1F2群体部分单株基因型检测情况,各材料所属基因型标注于对应泳道的上方,其中“+”代表含Sub1耐淹等位基因Sub1A-1,“-”代表不含耐淹等位基因Sub1A-1,“H”代表杂合基因型。结果表明,对100株BC1F2材料进行检测,3种不同基因型的分离比为22“-”:54H:25“+”,经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ2=0.72小于χ2 0.05=5.99),因此,该标记为共显性标记,可以将两种不同纯合子以及杂合子基因型进行区分,检测位点同时表现为单基因分离。
本发明提供的Sub1共显性分子标记及其检测引物,能够实现耐淹基因Sub1的基因型高效、准确鉴定,可以用于水稻资源的筛选鉴定,也可用于水稻耐淹基因Sub1的分子遗传育种。
Sub1基因位于水稻9号染色体上182kb基因组区间,其序列由Sub1A、Sub1B以及SubC三个位点共同组成,其中Sub1A位点存在Sub1A-1、Sub1A-2以及该位点缺失3种类型;Sub1B存在SubB1~9等9种类型;Sub1C存在Sub1C1~7等7种类型,其中仅Sub1A-1为具有耐淹功能型等位。Sub1A、Sub1B、SubC不同等位型相互组合形成不同类型的Sub1基因,而其中Sub1耐淹等位仅包含Sub1A-1与Sub1C-1一种组合(Sub1B无特异规律),而且Sub1C-1也仅出现在耐淹等位组合中。基于以上情况,本发明针对Sub1A以及Sub1C两位点开发了两个分子标记,并分别针对两个分子标记设计特异检测引物,其中引物对Sub1A-F与Sub1A-R可以特异性检测Sub1A位点,区分Sub1A-1与Sub1A-2或缺失型,含有Sub1A-1的样本可以扩增出586bp条带,否则无扩增条带,从而可以检测出耐淹等位;引物对Sub1C-R与Sub1C-F可以特异性区分Sub1C位点不同等位型,其中Sub1C-1扩增无条带,否则扩增出304bp条带,由于Sub1C-1仅出现在耐淹等位中,从而该对引物可以特异检测出非耐淹等位;组合使用两组引物,即可同时检测出耐淹和非耐淹基因型,实现共显性检测,如为耐淹纯合品种则可以扩增出586bp条带,如为非耐淹纯合品种则可以扩增出304bp条带,如为杂合则可同时扩增出586bp和304bp两种条带。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司 湖南隆平高科种业科学研究院有限公司湖南亚华种业科学研究院
<120> 水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用
<130> KHP181117463.2
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taaatatatt tttatgtata catatgattt tacatatttc acagaagttt ttnaataaga 60
cgaacggtga accatgttta aaaaaagtca acggc 95
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcaacatc ttgctggctt tc 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggttcacc gttcgtctta tgc 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgacgccgat gacgatca 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaacagttg aaagcaccga 20
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgacgacnnn nnnnncggag gactccggcg actcgcgcat actcatcgag t 51

Claims (10)

1.水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记,其特征在于,其为SNP标记,所述标记位于水稻9号染色体基因Sub1A上;
所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其中第53位碱基为多态性位点,该处碱基为G或C。
2.水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记,其特征在于,所述标记位于水稻9号染色体基因Sub1C上,若Sub1C在SEQ ID NO:6所示序列的第8-15位碱基为5’-GCCGTCG-3’,则为耐淹等位,若此处碱基为5’-CA-3’,则为不耐淹等位。
3.水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记组合,其特征在于,由权利要求1和2所述分子标记组成。
4.用于检测权利要求1所述分子标记的ARMS-PCR引物,其特征在于,包括Sub1A-F和Sub1A-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示。
5.用于检测权利要求2所述分子标记的ARMS-PCR引物,其特征在于,包括Sub1C-F和Sub1C-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4-5所示。
6.含有权利要求4和/或5所述引物的检测试剂或试剂盒。
7.权利要求1或2所述分子标记、权利要求3所述分子标记组合、权利要求4或5所述引物或权利要求6所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用:
1)在水稻耐淹基因Sub1的基因型鉴定中的应用;
2)在鉴定水稻耐淹性状中的应用;
3)在鉴定及筛选耐淹水稻种质资源中的应用;
4)在水稻耐淹品种分子标记辅助育种中的应用。
8.水稻耐淹基因Sub1的基因分型方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取待测水稻的基因组DNA;
(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板,利用权利要求4和5所述引物进行PCR扩增;
(3)分析扩增产物。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,步骤(3)具体为:如果扩增产物出现586bp的特征条带,则判定待测水稻为Sub1耐淹等位基因纯合型;如果扩增产物出现304bp的特征条带,则判定待测水稻为Sub1不耐淹等位基因纯合型或Sub1基因缺失;如果扩增产物出现586bp和304bp两种带型,则判定待测水稻为杂合基因型。
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