CN110106278B - 玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域,公开了与控制玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记开发及应用,根据该分子标记设计的引物为:L1‑F:GCCGGAGTGAGCTGGCAGAA和L1‑R:GGGAACGGCGAGATATTTTG。申请人鉴定并开发了与玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记,具有潜在的育种价值;通过该标记进行分子育种辅助选择能够显著地增加玉米百粒重及粒长产量性状,从而达到增产的效果;该分子标记可用于分子标记辅助选择育种。

Description

玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
玉米产量主要是由玉米单位面积株数、单株粒数和百粒重组成,其中百粒重(Hundred-KernelWeigh,HKW)能够显著的影响玉米产量,而粒重又是由籽粒的粒长(KernelLength,KL)、粒宽(Kernel Width,KW)与粒厚(Kernel Thickness,KT)共同决定的。相关研究表明,玉米籽粒粒长性状与玉米产量呈现显著的正相关关系(李永祥,2009;李波,2014)。深入的挖掘与玉米籽粒粒型性状紧密连锁的分子标记对于育种家通过粒型相关性状来提高玉米产量具有极其重要的意义。
玉米籽粒粒型性状是典型的复杂数量性状,由多个基因共同调控,其遗传机理相对复杂。尽管如此,研究人员还是通过不同的群体对与籽粒粒型性状相关的QTL位点进行了鉴定和挖掘。大量的研究表明第九染色体9.04bin是产量相关性状QTL热点区域,王邦太等(2009) 通过生物信息学的方法整合了来自不同试验研究得到的400个玉米产量相关的QTL位点,构建了玉米产量性状相关QTL位点图谱,在第九染色体9.04bin鉴定到了3个与百粒重性状相关的QTL位点;张伟强等(2013)以豫82×沈137杂交发展了229个F2:3家系材料,通过3 个环境进行了百粒重QTL的定位分析,在9号染色体9.04bin的位置鉴定到了控制百粒重的 QTL位点,可以解释11.7%的表型变异。Liu等(2014)利用Mc(小粒)×V671(大粒)组配的270 个F2:3家系材料,对5个环境下玉米籽粒粒型性状进行了QTL鉴定,在9号染色体9.03-9.04bin 的位置鉴定到了与百粒重、穗行数、轴粗等产量相关性状共定位位点,并且该位点在四个环境中是稳定存在的。
相比较于连锁分析,关联分析有着它独特的优点:关联分析通过标记与QTL之间的连锁不平衡关系对QTL进行挖掘,关联分析不需要作图群体的构建,效率更高时间更短。候选区段的关联分析是对某一目标区段利用标记扫描,来进行遗传变异与目标表型变异的相关性分析,更快速的进行候选基因的挖掘。王明等(2012)通过候选区段关联分析的方法对bin2.09进行分析,成功的找到了玉米抗丝黑穗病的候选基因。Li等(2014a)以连锁分析的结果为基础,结合候选区段的关联分析成功的鉴定除了与油菜粒重及角果长度相关的QTL。
玉米籽粒粒型性状包括粒长、粒宽、粒厚,属于典型的复杂数量性状。但是由于籽粒粒型性状受环境因素影响较大,导致其性状考察困难,最终使得玉米粒型相关性状QTL位点鉴定处于初定位阶段,精细定位困难,很难找到与产量性状紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择育种,虽然有学者通过大量的研究发现了第九染色体9.03-9.04bin是产量相关性状QTL热点区域,但目前仍无与产量紧密连锁的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于提供了一对与玉米百粒重及粒长紧密连锁的分子标记引物:L1-F: GCCGGAGTGAGCTGGCAGAA和L1-R:GGGAACGGCGAGATATTTTG。
本发明的另一个目的在于提供了与玉米百粒重及粒长紧密连锁的分子标记引物的应用,该标记可用于玉米百粒重及粒长的分子育种。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术措施:
本试验利用拥有广泛遗传变异的368份优良玉米自交系材料,结合高质量的SNP标记及多年多点的籽粒表型数据对9号染色体9.03-9.04bin进行了候选区段的关联分析,鉴定到了与百粒重显著关联的SNP位点,并开发了一对与该位点紧密连锁的分子标记。
同时根据关联分析的结果,选取了大粒自交系材料V671,对小粒自交系Mc进行了遗传改良,利用小粒的Mc为轮回亲本结合分子标记辅助选择,经过多次回交,获得了百粒重及粒长显著增加的改良系McR,接着利用自交系Mc以及McR进行了准确的育种效应评价。为该分子标记在玉米分子育种中的应用奠定了良好基础。
玉米百粒重及粒长紧密连锁的分子标记的获得:
本发明首先利用368份关联群体材料多年多点的粒型数据对玉米9号染色体9.03-9.04bin的位置进行了候选区段的关联分析,找到了与百粒重性状显著关联的SNP位点,显著性P值为4.13×10-5,可解释的表型变异为2.20%;并通过两个玉米自交系材料Mc(小粒) 和V671(大粒)之间的序列多态性进行了标记的开发,申请人利用候选区段的关联分析,开发了与玉米百粒重及粒长紧密连锁的标记可用于后续利用该分子标记进行玉米百粒重及粒长的分子育种。针对该标记,申请人设计引物如下:
L1-F:GCCGGAGTGAGCTGGCAGAA和L1-R:GGGAACGGCGAGATATTTTG。
与玉米百粒重及粒长紧密连锁的分子标记引物的应用,包括利用该分子标记引物用于玉米的育种,优良性状筛选。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明鉴定并开发了一对与玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记,并利用该分子标记将百粒重小、粒长短的优良自交系Mc通过杂交、回交及分子标记辅助选择方法,获得百粒重及粒长显著增加的改良系McR;将两个自交系Mc和McR分别与多个优良玉米自交系杂交配制F1组合,经过F1组合鉴定,与Mc相比,结果表明McR能够在籽粒粒宽不变的情况下,通过增加籽粒粒长使得F1玉米籽粒的百粒重增加,从而达到增产的效果;证明开发的与百粒重及粒长紧密连锁的分子标记可用于分子标记辅助选择育种。
现有已发表的控制籽粒粒型的QTL大多处于初级定位阶段,QTL的真实性和可靠性还需要进一步验证,并且进行精细定位鉴定开发与QTL紧密连锁的分子标记困难。而我们不仅通过候选区段关联分析快速鉴定并开发了与玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记,并证实了利用该分子标记可有效的用于玉米百粒重及粒长的遗传改良;即明确了其育种价值及在玉米产量育种中的应用潜力。
附图说明
图1为候选区段关联分析结果;
其中:散点代表关联分析,虚线代表两个标记的位置,实线代表关联分析阈值 (-LOG10(0.05/368))。
图2分子标记辅助选择改良Mc的流程的示意图;
其中:MAS代表分子标记辅助选择;McR为获得的Mc的改良系。
图3为Mc及Mc改良系McR表型示意图;
其中:a:改良系McR籽粒粒长,McR(上)、Mc(下),bar=1cm;
b:改良系McR籽粒粒宽,McR(上)、Mc(下),bar=1cm;
c:改良系McR籽粒粒长统计比较,KL代表粒长;
d:改良系McR籽粒粒宽统计比较,KW代表粒宽;
e:改良系McR籽粒百粒重统计比较,HKW代表百粒重;t-test用于显著性检验。
*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著,NS代表不显著。
图4为Mc和McR的育种效应评价示意图;
其中,a:籽粒粒长在7个自交系分别与Mc及Mc改良系McR构建的杂交组合的成对比较;
b:籽粒粒宽在7个自交系分别与Mc及Mc改良系McR构建的杂交组合的成对比较;
c:籽粒百粒重在7个自交系分别与Mc及Mc改良系McR构建的杂交组合的成对比较,KL代表粒长,KW代表粒宽,HKW代表百粒重。t-test用于显著性检验。*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著,NS代表不显著。
具体实施方式
本发明所述技术方案,如未特别说明,均为本领域的常规方案;所述试剂或材料,如未特别说明,均来源于商业渠道,或已公开的材料。
实施例1:与玉米百粒重及粒长紧密连锁的分子标记开发
1材料与方法
1.1试验材料
来源广泛、遗传变异丰富的368份玉米自交系构成的自然群体及优良的玉米自交系Mc与V 671(Liu et al,2014)。
1.2试验方法
1.2.1田间试验及基因型鉴定
关联群体材料田间试验于2011年至2012年分别在中国湖北、重庆、河南、云南和海南5 个地点进行,采用完全随机区组设计,单行区,行长3m,行距0.6m,每行定苗12株。关联分析群体基因型数据为全基因组125万个SNP标记信息(Liu et al.,2017).
1.2.2表型鉴定
每个环境中每份自交系行内中间单株选取结实优良的果穗用于粒形性状及百粒重的考察(HKW,100-Kernel weight)。每个自交系三次生物学重复。
1.2.3候选区段关联分析
依据全基因组SNP标记信息筛选出区段内1万个高质量的SNP标记,结合这些标记在368 份关联分析群体中的基因型鉴定结果以及该群体在多年多点的百粒重表型鉴定数据,利用T ASSEL V5的GLM模型进行区域性关联分析(Li et al.,2014a),显著水平为-LOG10(0.05/36 8)。
1.2.4分子标记开发
根据B73基因组,下载候选区段显著位点位置序列,利用MaizeGDB网站进行特异性引物的设计,然后在自交系材料V671与Mc中进行扩增,通过毛细管电泳进行多态性分析,选取有多态性、条带清晰的标记进行分子标记辅助选择进行近等基因系的构建。
1.2.5基因型分析
基因型分析涉及到DNA的提取以及PCR扩增。单株DNA的提取采用CTAB法。
2结果与分析
2.19.03-9.04bin候选区段关联分析
在9.03-9.04bin的20Mb区间内,利用1万个SNP标记信息并结合368份关联群体多年多点的籽粒百粒重性状进行了候选区段的关联分析。其中最显著的SNP S848290在2011年和201 2年的每个环境中都检测到与百粒重显著关联,利用BLUP综合两年10个环境数据分析结果,显著性P值为4.13×10-5,可解释的表型变异为2.20%(图1,表1)。这为后期分子标记的开发及近等基因系的构建提供了依据。
表1关联分析检测到的显著的SNPs
Figure BDA0002060927170000051
2.2标记开发
根据候选区段关联分析得到的显著性最高的SNP位置,选取了关联群体材料中大粒的优良玉米自交系材料V671及小粒自交系Mc,扩增了两个材料中在SNP位置上下游5Kb的DNA序列信息,根据两个材料的DNA序列信息开发了与该SNP位点紧密连锁的分子标记L1。针对该分子标记设计引物,如下:
L1-F:GCCGGAGTGAGCTGGCAGAA和L1-R:GGGAACGGCGAGATATTTTG。
在V671中扩增得到的基因片段是:GGGAACGGCGAGATATTTTGTCGCTATGATCGCA GCTGTGTTGCTTTATAGTGGACTCTCTTATCTGTGTCTTGCTTCGCGAGGAAGGACAGG AAGGAAGCTTCCTCGTTCCTGGCAGAGTGGCAGTTTAGTGGGTGGTGCCGTGGCCTGG CCAATAGGAGAGGCGGGTTCTGCCAGCTCACTCCGGC
在Mc中扩增得到的基因片段是:GGGAACGGCGAGATATTTTGTCGCTGTGATCGCAG CTGTGTTGCTTTATAGTGGACTCTCTTAGAGCATCTCCAACAACGTGACCTATAAAAAT GCCCTATAATTTGAAAATAAGTATATTTTATAGAATTTAGGGCACCAACAAAACACCTCG CTCCAACAGTAAAGCCTCAAATCTAGATTATAGGGCAGCCCACTACGGTGTAGTATATT TGAGTCACTTGAGAGGGTGCCCCATAGTTTTTTGACAAAAATTTATGAAATAGGACACT GTTGGAGTAGTTTTTCCTGTGTAGAGCCCCATATTTCAATTTGAGACACTAATTTGAGG CATTGTTGGAGATGCTCTTATCTCTGTCTTGCTTCGCGAGGAAGGACAGGAAGGAAGC TTCCTCGTTCCTGGCAGAGTGGCAGTTTAGTGGGTGGTGCCGTGGCCTGGCCAATAGG AGAGGCGGGTTCTGCCAGCTCACTCCGGC
实施例2:利用实施例1中开发的标记对玉米自交系Mc进行遗传改良
1材料与方法
1.1试验材料
优良的玉米自交系Mc与V671。
1.2试验方法
1.2.1田间试验
2015-2018年利用杂交及分子标记辅助选择回交方法开展Mc自交系的遗传改良;各个世代的回交及选择鉴定分别在中国湖北武汉和海南2个地点开展。
1.2.2表型鉴定
每行12株,在每行中间选择5个授粉良好的果穗,测量5个果穗中部籽粒大小和百粒重(H KW,100-Kernel weight)性状。所测性状测三次取平均值。
1.2.3基因型分析
基因型分析涉及到DNA的提取以及PCR扩增。单株DNA的提取采用CTAB法。
2结果与分析
2.1Mc遗传改良
以大粒的V671为供体亲本,小粒自交系Mc为轮回亲本,进行了多代回交与自交,回交过程中以实施例1得到的分子标记进行分子标记辅助选择(MAS,Molecular markerassisted s election),保留与V671扩增得到相同条带的自交系。结合田间农艺性状的考察及标记鉴定,最终在BC4F2世代获得百粒重及粒长显著增加的改良版McR自交系(自交系Mc为对照)。
与自交系Mc相比,McR在籽粒粒宽上无显著差异,而在籽粒粒长及百粒重性状上存在显著差异(P>0.01);改良系McR籽粒单粒平均增加0.3mm、百粒重平均增加1.47g(图2-3),表明我们所开发的与百粒重和粒长性状显著关联的分子标记L1可以有效的用于玉米自交系的遗传改良。
实施例3:与玉米粒长及百粒重紧密连锁的分子标记在玉米育种中的应用:
1、材料与方法
1.1试验材料
玉米自交系Mc以及其改良系McR,7个优良玉米自交系:郑58、昌7-2、6WC、ZZ01、4CV、掖478和B73(Li et al.,2013)。
1.2试验方法
1.2.1Mc和McR分别与7个优良自交系组配F1组合
郑58、昌7-2、6WC、ZZ01、4CV、掖478和B73分别与含优良基因型改良系McR(采用分子标记L1进行辅助选择,扩增条带大小为188bp)以及含有非增效位点的Mc(采用分子标记L1进行辅助选择,扩增条带大小分别为476bp)杂交,得到14个F1组合;种植14个F1组合并对各组合籽粒的粒长(KL)、粒宽(KW)和百粒重(HKW)进行考察。
利用分子标记L1扩增条带大小为188bp时表示携带该位点的优良基因型;分子标记L1扩增条带大小为476bp时表示携带该位点的不利基因型。
1.2.2籽粒性状考察
获得的14个F1组合种植于2018四川成都(30°N,104°E),采取随机区组,三次重复,行长3m,宽0.6m,每行种植12株。待玉米完全成熟后,单株全部按第一穗收获并自然风干,选取每个玉米果穗中间三分之一脱粒并去掉麸皮以及坏掉或有破损的籽粒。用万深考种及千粒重自动分析仪测量粒长(kernallength,KL)(mm)、粒宽(kernalwidth,KW)(mm)和百粒重(hundred kernel weight)(g),每个性状均重复测量两次取平均值,利用t-test检验差异显著性。
2、结果与分析
2.1、改良系McR能够有效的提高自交系杂交组合产量。
基于14个杂交组合的表型统计表明,在郑58、昌7-2、6WC、ZZ01(Li et al2013)、4CV、掖478和B73背景下均能有效增加粒长并提高百粒重(图4,表2),根据此结果,可以指导该分子标记在育种过程中进行应用,以有效的提高玉米产量。
表2杂交组合籽粒表型数据统计
Figure BDA0002060927170000071
序列表
<110> 湖北康农种业股份有限公司
<120> 玉米百粒重及粒长性状紧密连锁的分子标记及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccggagtga gctggcagaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggaacggcg agatattttg 20
<210> 3
<211> 188
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggaacggcg agatattttg tcgctatgat cgcagctgtg ttgctttata gtggactctc 60
ttatctgtgt cttgcttcgc gaggaaggac aggaaggaag cttcctcgtt cctggcagag 120
tggcagttta gtgggtggtg ccgtggcctg gccaatagga gaggcgggtt ctgccagctc 180
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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ttagagcatc tccaacaacg tgacctataa aaatgcccta taatttgaaa ataagtatat 120
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ccatatttca atttgagaca ctaatttgag gcattgttgg agatgctctt atctctgtct 360
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gggtggtgcc gtggcctggc caataggaga ggcgggttct gccagctcac tccggc 476

Claims (2)

1.与玉米籽粒百粒重及粒长紧密连锁的分子标记引物在玉米籽粒百粒重筛选育种中的应用,所述的分子标记引物为L1-F:GCCGGAGTGAGCTGGCAGAA和L1-R:GGGAACGGCGAGATATTTTG。
2.与玉米籽粒百粒重及粒长紧密连锁的分子标记引物在玉米粒长筛选育种中的应用,所述的分子标记引物为L1-F:GCCGGAGTGAGCTGGCAGAA和L1-R:GGGAACGGCGAGATATTTTG。
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