CN113197089B - 一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种便于早代籽粒硬度选择的软质弱筋小麦育种方法，该方法通过普通小麦‑簇毛麦5VS易位系与高产多抗弱筋小麦品种杂交(包括：单交、回交、复交等)，在F₂代通过小麦第5同源群短臂InDel分子标记检测，或F₂、F₃代白粉病抗性鉴定，获得抗白粉病、低籽粒硬度的5VS纯合易位单株，在后续世代进行农艺性状选择、产量鉴定，培育软质弱筋小麦新品系；该发明便于在育种早代、不破损籽粒的情况下对硬度进行高效选择，当选材料籽粒硬度显著降低，同时拓宽了白粉病的遗传基础，可被用于软质弱筋小麦常规育种或分子标记辅助选择育种中。

Description

一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法

技术领域

本发明涉及农作物遗传育种领域，特别是一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法。

背景技术

软质弱筋小麦，制粉时淀粉粒破损小，面粉细腻，面团吸水率较低，适合制作糕点、饼干等食品，随着人民生活水平的提高，优质弱筋小麦的需求量在持续增加。长江中下游麦区是我国弱筋小麦生产的优势产区，近年来本地区育成的弱筋小麦品种推动了弱筋小麦产业的发展，但在品质稳定性、综合抗病性等方面还函待进一步改良。

目前弱筋小麦品质改良主要建立在利用各种仪器设备分析高代品系籽粒品质的育种体系，该体系需要的仪器设备(如：粉质仪、近红外谷物分析仪、单籽粒硬度测定仪等)和人力成本较高，由于被检测样品所需的籽粒量较多、绝大部分品质性状检测需要用面粉，因而不适合对早代材料进行检测选择。

影响弱筋小麦的遗传因素主要包括籽粒硬度、蛋白质含量和组成等，其中籽粒硬度与弱筋小麦的加工品质呈极显著相关(吴宏亚等，小麦籽粒硬度及其对面粉加工品质影响的研究进展，江苏农业学报，2014，30(2)：437-441)。因此，软质小麦是筛选优质的弱筋小麦的重要标准。

小麦籽粒硬度是小麦品质育种和品质研究的一个重要性状，也是小麦分类、分级和定价的重要评价指标。根据籽粒硬度大小，普通小麦分为硬质小麦和软质小麦。何中虎等(中国小麦育种进展与展望，作物学报，2011，37(2)：202-215)建议饼干弱筋小麦应该首先考虑籽粒硬度，其次为蛋白质含量、吸水率和溶剂保持力。张勇等(中国弱筋小麦与美国软麦溶剂保持力等品质比较，江苏农业学报，2013，29(2)：247-253)从硬度比较情况来看，中国低硬度值的小麦品种数与美国软麦品种数相比略显不足，特别是硬度值在20以下的品种较少。

普通小麦籽粒硬度受2个主效基因(Pina D 1a/Pinb D 1a)和一些修饰基因控制，主基因位于5DS上，软质(PinaD1a/PinbD1a)对硬质为显性，Pinb基因的单碱基突变或Pina基因表达产物的缺失造成籽粒质地变硬(陈锋等，中国小麦历史品种puroindoline等位变异检测，麦类作物学报，2011，31(3)：389-394)，同时含有Pina D 1a、Pinb D 1a两个基因的小麦表现为软质。

硬度遗传力较高，受环境因素影响较小(袁翠平等，基因型和环境效应对小麦籽粒物理特性的影响，中国粮油学报，2004，19(4)：13-16；杨延兵等，不同品质类型冬小麦籽粒产量和品质性状对氮肥的响应，麦类作物学报，2004，24(2)：97-102)，可以在早代进行选择。目前应用较广泛的硬度测定仪器为单粒谷物特性测定仪(SKCS)和近红外谷物品质分析仪(NIR)，但硬度仪测定籽粒硬度通常需要较多籽粒且对籽粒有破损，近红外分析仪测定籽粒硬度准确度较低(吴连连等，谷物硬度测量技术的现状和发展趋势，安徽农业科学，2007，35(9):2535-2536)，因而对早代籽粒硬度选择目前还较为困难。

同时，虽然普通小麦已开发了籽粒硬度相关基因的分子标记，但由于位于5DS上的主效基因位点包含多个关键基因且在不同品种间变异丰富(陈锋等，中国小麦历史品种puroindoline等位变异检测，麦类作物学报，2011，31(3)：389-394；王雪玲等，青海小麦籽粒硬度等位变异研究，麦类作物学报，2014，34(1)：23-27)，育种工作者需要了解亲本的基因型，相对来说技术要求和成本较高，难以在早代对籽粒硬度性状开展分子标记辅助选择。因而，在目前软质弱筋小麦品种籽粒硬度改良研究中，还缺乏便于早代选择、不破损籽粒的高效选择方法。

InDel分子标记是基于基因组中插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，InDel广泛存在不同的植物个体内，随着部分重要农作物的全基因组测序完成，利用生物信息学方法，可以在不同基因型中挖掘出大量的可用于发展分子标记的InDel。InDel标记不仅具有分布广、重复性好、开发成本低、结果准确等优点，而且基因型判别简单快速(刘丹等，InDel分子标记及其在水稻研究中的应用，种子，2017，36(9)：47-52)，已被应用于水稻、玉米、棉花等作物的连锁图谱构建和品种鉴定(张体付等，玉米功能性Insertion/Deletiion(InDel)分子标记的挖掘及其在杂交种纯度鉴定中的应用，玉米科学，2012，20(2)：64-68；陆海燕等，基于高通量测序的棉花InDel标记开发及其应用，棉花学报，2019，31(4):297-306)。普通小麦为异源六倍体(2n＝42,AABBDD),包含3个染色体组、7个同源群，发展InDel标记应用于普通小麦同源群染色体臂的检测，目前尚未见研究报道。

此外，小麦的近缘物种簇毛麦5VS上含有籽粒硬度基因Dina/Dinb(Zhang R,etal.Development and characterization of a Triticum aestivum-H.villosa T5VS.5DLtranslocation line with soft grain texture,Journal of Cereal Science,2010,51:220-225)，该基因可以降低籽粒硬度，同时5VS上携有白粉病抗病基因Pm55(Zhang R,etal.Pm55,a developmental-stage and tissue-specific powdery mildew resistancegene introgressed from Dasypyrum villosum into common wheat,Theor Appl Genet,2016,129:1975-1984)；目前，利用簇毛麦5VS早代选择软质的弱筋小麦的育种方法尚未见报道。

发明内容

针对一些弱筋小麦硬度较高、弱筋小麦软质性状不稳定、小麦籽粒硬度在早代选择效率低、且硬度检测需破坏籽粒的问题，本申请一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法，该方法在杂交F₂代可以对籽粒硬度进行高效关联选择，且不破损籽粒，具体而言，本申请是通过如下方法实现的：

一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法，其具体步骤如下：

3)以普通小麦-簇毛麦5VS易位系为供体亲本(简称为A，可以作为父本或母本)，待筛选弱筋小麦品种为受体亲本(简称为亲本B)杂交，杂交种子种成F₁代植株，将F₁收获的种子稀播或点播种成F₂代分离世代；

进一步，普通小麦-簇毛麦5VS易位系依据基因型不同分为两种，T5VS.5AL易位系类型简称为A1，T5VS.5DL易位系类型简称为A2，二者均含有籽粒硬度基因Din a/Din b和白粉病抗病基因Pm55；

在具体实施中，待筛选的受体亲本可以选择本地区高产多抗的弱筋小麦品种；将含有Pina D 1a/Pinb D 1a硬度基因的亲本简称为B1(如：宁麦9号、扬麦15、扬麦20)；将不含基因Pina D 1a/Pinb D 1a的突变型简称为B2(如：宁麦13)。

4)通过对F₂代小麦抗白粉病鉴定，选择携带1对5VS染色体臂的抗白粉病单株(5VS纯合易位单株)，则认为该单株弱筋小麦的硬度低于其他F₂代弱筋小麦(包括5VS/5DL杂合易位单株和无5VS单株)。

上述F₂代小麦抗白粉病鉴定是指：(不论受体亲本B为抗白粉病类型小麦或感白粉病类型小麦)，均可以利用普通小麦第5同源群短臂InDel分子标记WC656(申请人从265个第5同源群短臂InDel分子标记中筛选获得)引物，对F₂代单株DNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，选择379bp条带或422bp条带缺失的单株，即为5VS染色体臂的抗白粉病单株(5VS纯合易位单株)；具体来说，PCR扩增产物若显示379bp的5AS条带缺失，表明该F₂代单株为5VS/5AL纯合易位单株；若422bp的5DS条带缺失，表明该F₂代单株为5VS/5DL纯合易位单株。

进一步而言，如果受体亲本B为感白粉病类型小麦，也可以通过诱发白粉病的方法进行白粉病抗性表型鉴定，即在选择F₂代白粉病抗病单株(可能为5VS纯合或杂合易位系)，若F₃代不同单株均抗白粉病，表明对应的F₂代单株为5VS纯合易位单株；若F₃代不同单株白粉病抗性发生分离(有抗病单株和感病单株)，表明对应的F₂代单株为5VS杂合易位单株，此时可以继续在F₃代选择抗病单株，直至下一世代不同单株均抗白粉病，即对应的上一世代单株为5VS纯合易位单株。表型鉴定中，诱发白粉病是用白粉病混合菌种，感染白粉病感病品种幼苗，然后将有白粉病菌的幼苗移栽于感白粉病品种(如：苏麦3号或宁麦9号等)的诱发行(育种试验田四周或中间种植的感白粉病小麦材料)，诱发行白粉病发病后，感染分离世代育种材料。上述表型鉴定方法为本领域常规简单方法，具体也可以参见文献：《大麦品种抗病性鉴定技术规程第2部分：抗白粉病》(NY/T3060.2-2016)中公开的内容。

本申请中，术语“抗白粉病类型小麦”、“感白粉病类型小麦”是依据小麦品种审定公告/说明确定；术语“弱筋小麦”根据现行《主要农作物品种审定标准(国家级)》确定。

在上述育种方法中，如果受体亲本B含有PinaD1a/PinbD1a硬度基因(B1)，根据目标单株籽粒硬度的期望值，选用供体亲本A1或A2进行杂交；如果受体亲本为突变型B2，建议用A2(T5VS.5DL纯合易位系)进行杂交，使受体亲本中位于5DS上硬度基因被替代。

本发明中第5同源群短臂InDel分子标记WC656，是申请人通过生物信息学方法对普通小麦品种中国春测序序列进行分析，获得265对标记引物，本发明中利用其中的WC656标记引物来检测第5同源群的短臂，在普通小麦5BS、5DS、5AS上可以分别扩增出471bp、422bp、379bp条带，对这3个短臂进行鉴定，易于鉴别T5VS.5AL、T5VS.5DL纯合易位系。若目标小麦PCR电泳扩增产物显示379bp的5AS条带缺失，表明其为5VS/5AL纯合易位单株；若422bp的5DS条带缺失，表明其为5VS/5DL纯合易位单株，若471bp条带缺失，则说明其6BS被替换。由于白粉病抗病基因Pm55和籽粒软质基因Dina/Dinb均位于5VS上，5VS与小麦第5同源群短臂难以发生交换，因而这2个基因呈连锁遗传。小麦第5同源群短臂上的InDel标记引物，便于鉴别5AS、5BS、5DS是否被代换，可以用于5VS纯合易位系的鉴定。

本申请通过InDel位点发展的分子标记WC656具有稳定性好、容易被检测等优点，可被用于大规模的分子标记辅助选择育种中。

上述“对F₂代单株DNA进行PCR扩增”是以被检测F₂代单株DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：2为引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测是否含有大小为379bp、422bp的特异性条带，如对应特异条带缺失，则被测材料分别为T5VS.5AL、T5VS.5DL纯合易位系。

具体而言，PCR反应体系为20μL：DNA模板1μL(浓度40ng/μL)，引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各1μL(浓度10μM)，2×Taq Plus Master MixⅡ(Vazyme)10.0μL，ddH₂O 7μL；PCR反应循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸70s，34个循环；72℃延伸10min；所述电泳检测是指：以质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳后检测，电泳电压100v，电泳时间1.5h。

本申请中，术语“软质小麦”是指硬度值小于40的小麦。

本发明利用在普通小麦背景中，簇毛麦5VS与普通小麦5AS、5BS、5DS难以发生交换重组，5VS上携带的白粉病抗病基因Pm55和籽粒软质基因Dina/Dinb连锁遗传的特点，以普通小麦-簇毛麦5VS易位系为供体亲本、本地区高产多抗弱筋小麦主推品种为受体亲本进行杂交(包括单交、回交、复交等)，通过F₂代第5同源染色体短臂分子标记鉴定，以及F₂、F₃代单株白粉病抗性鉴定，选择5VS纯合易位单株，其籽粒硬度显著降低，与5VS杂合单株或无5VS单株相比，硬度更低。

以上方法一方面降低了受体弱筋小麦亲本的籽粒硬度，在早代(如F₂代单株，种子量一般较少)不需要检测硬度值，以免破损籽粒；同时，在F₂、F₃代可以通过白粉病表型鉴定、第5同源群染色体短臂检测，实现在较早分离世代对籽粒硬度的高效选择。

相对于其他籽粒硬度选择方法，本发明具有以下优点：(1)在F₂代可以对籽粒硬度进行高效关联选择；(2)不破损籽粒；(3)当选单株同时携带白粉病抗性基因，拓宽了白粉病抗性的遗传基础；(4)第5同源群短臂InDel分子标记WC656引物，其PCR扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测，相对于扩增产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)电泳检测的标记引物，更加简单、便捷；(5)若受体亲本感白粉病，可以通过白粉病表型鉴定进行选择，无需进行分子标记检测。

附图说明

图1为实施例1中WC656标记在中国春、zrq5V-2(T5VS.5AL)、NAU415-2(T5VS.5DL)、江苏淮南地区推广小麦品种中PCR扩增产物电泳图谱；

图中，M：100bp DNA Ladder；1：中国春(CS)；2：zrq5V-2(T5VS/5AL纯合易位系)；3：NAU415-2(T5VS/5DL纯合易位系)；4：宁麦9号；5：宁麦13；6：宁麦18；7：宁紫麦1号；8：扬麦13；9：扬麦15；10：扬麦16；11：扬麦20；12：扬麦25；13：扬麦29；14：扬辐麦4号；15：镇麦168；16：镇麦9号；17：镇麦10号；18：镇麦12；19：泰麦901；20：华麦1092；21：盐麦1号；22：农麦88；23：瑞华麦596；24：宁麦资166。

图2为实施例2中白粉病田间诱发照片。

图2A中箭头表示黄线示诱发行及单株发病情况，图2B中，R：抗病，S：感病。

图3为实施例3育种流程示意图。

图4为实施例3中WC656标记在zrq5V-2与宁麦9号回交F₂代植株中PCR扩增产物电泳图谱；

图5为实施例4中WC656标记在NAU415-2与宁麦13回交F₂代植株中PCR扩增产物电泳图谱；

图6为实施例5中WC656标记在5VS纯合高代品系中PCR扩增产物电泳图谱。

具体实施方式

以下实施例中涉及的小麦品种，均为常见小麦品种，由申请人实验室保藏。

其中；

zrq5V-2是以NAU421(T5VS.5AL易位系，Zhang R,et al.Pm55,a developmental-stage and tissue-specific powdery mildew resistance gene introgressed fromDasypyrumvillosum into common wheat,Theor Appl Genet,2016,129:1975-1984)与扬麦15杂交，采用系谱法，结合分子标记检测和白粉病抗性鉴定，获得的5VS.5AL易位系高代品系；

NAU415-2为NAU415(T5VS.5DL易位系，Zhang R,et al.Development andcharacterization of a Triticum aestivum-H.villosa T5VS.5DL translocation linewith soft grain texture,Journal ofCereal Science,2010,51:220-225)的一个株系。

宁麦9号，中感白粉病(姚金保等，小麦优良亲本宁麦9号的研究与利用，核农学报，2012，26(1)：17-21)；

宁麦13，中感白粉病(钱存鸣等，优质高产小麦新品种宁麦13的选育与应用，江苏农业科学，2006，5：36-37)；

扬麦15，中感白粉病(章玉琴等，优质弱筋小麦扬麦15高产栽培技术，现代农业科技，2007，19：164)；

扬麦20，中感白粉病(陆成彬等，国审小麦新品种扬麦20的选育与高产栽培技术，江苏农业科学，2013，41(10):90-91,187)；

宁紫麦1号、泰麦901、盐麦1号、宁麦资166(江苏省农业农村厅公告，第20号，2020年12月25日)

宁麦9号、宁麦13、扬麦15、扬麦20等小麦品种硬度基因型(王化敦等，长江中下游麦区小麦品种籽粒硬度及puroindoline基因等位变异的分子检测，麦类作物学报，2017，37(4)：438-444)。

以下实施例涉及的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1:GAGCACCAGCAGAGCAAGATG；

SEQ ID NO.2:ACCAACAGCACCTAGACAACAC；

SEQ ID NO.3:GTTTATCAGGCGGTGCCATA；

SEQ ID NO.4:GGACTTCTTGCTCCCCTTTC。

实施例1不同小麦遗传材料的标记引物WC656分析以及白粉病抗性鉴定

以普通小麦中国春，T5VS.5AL易位系zrq5V-2，T5VS.5DL易位系NAU415-2，弱筋小麦品种宁麦9号、宁麦13(Pinb-D1b硬度基因突变)、宁麦18、扬麦13、扬麦15、扬麦20，其他育成及推广小麦品种宁紫麦1号、扬麦16、扬麦25、扬麦29、扬辐麦4号、镇麦168、镇麦9号、镇麦10号、镇麦12、泰麦901、华麦1092、盐麦1号、农麦88、瑞华麦596、宁麦资166的DNA(K2304Karroten植物基因组DNA提取试剂盒提取)为模板，以WC656标记引物(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)引物进行PCR扩增。

PCR反应体系为20μL：DNA模板1μL(浓度40ng/μL)，引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各1μL(浓度10μM)，2×Taq Plus Master MixⅡ(Vazyme)10.0μL，ddH₂O 7μL；

PCR反应循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸70s，34个循环；72℃延伸10min；

PCR反应产物经电泳检测：质量百分数为1％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压100V，电泳时间1.5h。

结果如图1所示，zrq5V-2(泳道2)中扩增出5BS(471bp)、5DS(422bp)条带，NAU415-2(泳道3)中扩增出5BS(471bp)、5AS(379bp)条带，中国春及其他小麦品种均扩增出5BS(471bp)、5DS(422bp)、5AS(379bp)条带。

对上述遗传材料以常规方法进行白粉病接种鉴定，表现为抗病的有zrq5V-2、NAU415-2、扬麦29、镇麦9号、镇麦10号、农麦88、宁麦资166，其余材料感白粉病。

实施例2普通小麦-簇毛麦5VS易位系回交F₂代分离群体5EST-237标记引物分析、白粉病接种鉴定和籽粒硬度检测

以zrq5V-2zrq5V-2(T5VS.5AL易位系)为供体亲本，分别与宁麦9号、扬麦15、扬麦20杂交、回交；

以NAU415-2(T5VS.5DL易位系)为供体亲本，分别与宁麦9号、宁麦13、宁麦18杂交、回交；构建了6个BC₄F₂群体。以这6个群体的单株DNA为模板，以5EST-237为引物分别进行PCR扩增、电泳检测。

5EST-237标记引物参见文献(Zhang RQ，et al.,Molecular and cytogeneticcharacterization of a small alien-segment translocation line carrying thesoftness genes of Haynaldia villosa.Genome 55:639–646)；引物PCR反应体系为20μL：DNA模板1μL(40ng/μL)，引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4各1μL(浓度10μM)，2×Taq PlusMaster MixⅡ(Vazyme)10.0μL，ddH₂O7μL；

PCR反应循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，66℃退火90s，72℃延伸80s，28个循环；72℃延伸10min；所述电泳检测检测是指：8％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)电泳后检测，电泳电压220V，电泳时间100min；

电泳完成后进行核酸染料染色，首先ddH₂O清洗一遍，之后在配好的核酸染色液(将150ul核酸染料和50ml 1M NaCl加入到450ml H₂O)中染色30min。各分离群体5VS纯合单株、5VS杂合单株以及无5VS单株的数量列于表1，符合1:2:1基因自由组合定律。

表1不同遗传背景回交F₂代5EST-237标记引物分析

χ² _0.05,2＝5.99

利用Perten 4100型单籽粒谷物特性测试仪(Single Kernel CharacterizationSystem，SKCS)测定表1中分析的单株收获籽粒硬度，各分离群体中5VS纯合单株、5VS杂合单株、无5VS单株籽粒硬度差异均达极显著水平(表2)。以上结果说明，5VS纯合易位单株，相对于无5VS单株，籽粒硬度显著降低。

表2不同遗传背景回交F₂代单株籽粒硬度分析

#：大写字母表示差异达极显著

此外，2019-2020年度，在江苏省农业科学院院部试验基地，进行感白粉病的品种苏麦3号进行田间诱发实验；被测试材料为本实施例中6个回交群体F₂代植株，检测结果如图2所示。

图2A中，诱发行种植的品种为苏麦3号，种植方式为在被测材料(F₂代)的四周种植，在2月初用感白粉病(用白粉病混合菌种感染)的幼苗种于苏麦3号诱发行中，使苏麦3号发生白粉病；图2B显示了F₂代某一个回交群体中部分植株发病情况，有的表现为抗病，有的表现为感病。接种鉴定结果为，各分离群体5VS纯合单株和杂合单株均抗白粉病，无5VS单株均感白粉病。

上述结果表明，5VS纯合易位单株均抗白粉病，相对于无5VS单株，籽粒硬度显著降低。

实施例3 zrq5V-2/4*宁麦9号BC₄F₂单株的标记引物WC656分析，白粉病表型鉴定

本实施例涉及的育种流程如图3所示。

本实施例用5VS与宁麦9号杂交获得杂交F₁代植株，再用宁麦9号杂交，获得回交1次(BC₁)的F₁代植株；筛选抗白粉病的5VS杂合易位单株(BC₁F₁代植株包括5VS杂合易位单株和无5VS单株)，再用宁麦9号杂交，获得回交2次(BC₂)的F1代植株；依次类推，在回交4次(BC₄)的F₁植株中，选择含有5VS的单株，将收获的种子种成F₂代(即BC₄F₂)。

在zrq5V-2/4*宁麦9号BC₄F₂总计98个单株中(表1)，随机选取24个单株(样品编号为1-24)的DNA为模板，以WC656标记引物进行PCR扩增后电泳检测。

WC656引物PCR反应体系、电泳检测方式同实施例1，电泳检测结果如图4a所示，泳道(样品)1、4、5、9、11、18、19的5AS条带缺失，表明这7个单株的5VS代换了5AS，为T5VS.5AL纯合易位系单株。

白粉病田间接种(接种方式同实施例2)部分结果如图4b所示，其显示F₂代zrq5V-2/4*宁麦9号回交群体中部分植株发病情况,其中，R：抗病，S：感病。24个单株中的抗病单株，样品1、4、5、9、11、18、19的F₃单株均抗白粉病，为T5VS.5AL纯合易位单株，与WC656标记检测一致；其余样品的F₃单株白粉病抗感分离，为T5VS.5AL杂合易位单株。

对zrq5V-2/4*宁麦9号BC₄F₂单株籽粒硬度进行检测，5VS纯合单株硬度值最低，与5VS杂合单株、无5VS单株籽粒硬度差异达极显著水平(表2)。

实施例4宁麦13*4/NAU415-2 BC₄F₂单株的标记引物WC656分析，白粉病表型鉴定以及籽粒硬度测定

在宁麦13*4/NAU415-2 BC₄F₂(回交方式同实施例3)总计253个单株中(表1)，随机选取的24个单株(样品编号为1-24)的DNA为模板，以WC656标记引物进行PCR扩增后电泳检测。

WC656引物PCR反应体系、电泳检测方式同实施例1，结果如图5a所示，泳道(样品)1、7、9、12、15、20的5DS条带缺失，表明这6个单株的5VS代换了5DS，为T5VS.5DL纯合易位系单株。

白粉病田间接种结果如图5b所示,其显示F₂代宁麦13*4/NAU415-2回交群体中部分植株发病情况，其中，R：抗病，S：感病。24个单株中的抗病单株，样品1、7、9、12、15、20的F₃单株均抗白粉病，为T5VS.5DL纯合易位单株，与WC656引物检测结果一致；其余样品的F₃单株白粉病抗感分离，为T5VS.5DL杂合易位单株。

对宁麦13*4/NAU415-2 BC₄F₂单株籽粒硬度进行检测，5VS纯合单株硬度值最低，与5VS杂合单株、无5VS单株籽粒硬度差异达极显著水平(表2)。

实施例5育成的5VS纯合易位系的标记引物WC656分析，白粉病表型鉴定以及籽粒硬度测定

以T5VS.5AL、T5VS.5DL为供体亲本，与本地区宁麦9号、宁麦13、扬麦13、扬麦15、扬麦16等小麦品种杂交，采用实施例3、实施例4中在F₂、F₃等早代对籽粒硬度进行选择，后续世代对粉质、农艺性状、产量等进行选择与鉴定，育成的携有5VS的22个高代品系。以这些品系的DNA为模板，以WC656为引物分别进行PCR扩增后电泳检测(同实施例1)，检测结果如图6所示。

泳道1为中国春。泳道(样品)2-18的5DS条带缺失，表明这17个品系的5VS代换了5DS，为T5VS.5DL纯合易位系。泳道(样品)19-23的5AS条带缺失，表明这5个品系的5VS代换了5AS，为T5VS.5AL纯合易位系。

22个品系的白粉病接种鉴定结果均为抗病；用Perten 4100型单籽粒谷物特性测试仪(SKCS)测定其硬度，籽粒硬度值在9.8-25.0之间。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法

<141> 2021-06-09

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagcaccagc agagcaagat g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accaacagca cctagacaac ac 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtttatcagg cggtgccata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggacttcttg ctcccctttc 20

Claims (4)

1.一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法，其特征在于，具体步骤如下：

以普通小麦-簇毛麦5VS易位系为供体亲本，弱筋小麦品种为受体亲本，进行杂交，杂交种子种成F₁代植株，将F₁收获的种子稀播或点播种成F₂代；

选择F₂代中的5VS纯合易位单株，则认为该单株小麦的硬度低于其他F₂代小麦；

选择F₂代中的5VS纯合易位单株的方法包括：以F₂代小麦DNA为模板，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，选择379bp 条带或422bp 条带缺失的单株，即为5VS纯合易位单株。

2.根据权利要求1所述便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：浓度为40 ng/µL的DNA模板1µL，浓度为10µM的引物I1µL，浓度为10µM的引物II1µL，2× Taq Plus Master Mix Ⅱ10µL，ddH₂O 补足至20µL；

所述引物I核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物II核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

PCR反应循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸70s，34个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法，其特征在于，所述电泳检测是指：以琼脂糖凝胶电泳后检测，电泳电压100v，电泳时间1.5h。

4.根据权利要求1所述便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法，其特征在于，选择F₂代中的5VS纯合易位单株的方法还包括：若受体亲本为感白粉病类型小麦，则通过诱发白粉病的方法进行白粉病抗性表型鉴定：选择F₂代白粉病抗病单株，若F₃代不同单株均抗白粉病，表明对应的F₂代单株为5VS纯合易位单株；若F₃代不同单株白粉病抗性发生分离，表明对应的F₂代单株为5VS杂合易位单株，此时继续在F₃代选择抗病单株，直至下一世代不同单株均抗白粉病，即对应的上一世代单株为5VS纯合易位单株。

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