CN110199871B - 一种高赖氨酸玉米自交系的选育方法 - Google Patents

一种高赖氨酸玉米自交系的选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高赖氨酸玉米自交系的选育方法。本发明提供了一种选育高赖氨酸含量的玉米自交系的方法，利用OE2‑4标记进行高赖氨酸o2基因的分子标记辅助选择，可以在回交转育过程的回交群体中鉴定筛选到基因型为O2o2的个体，在自交分离群体中鉴定筛选到基因型为o2o2的个体，比利用常规化学分析法进行高赖氨酸表型数据检测成本低、速度快，且不需要对等到适采期籽粒灌浆结束以后剥取籽粒，避免对果穗产生破坏。

Description

一种高赖氨酸玉米自交系的选育方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高赖氨酸玉米自交系的选育方法。
背景技术
普通玉米籽粒中蛋白质含量一般为10％左右，并且其中50-60％是营养价值极低的醇溶胶蛋白，这种蛋白缺乏人体和单胃动物营养所必需的氨基酸，特别是赖氨酸(lysine)和色氨酸。赖氨酸是防癌抗癌、增强免疫功能，促进人体正常发育的关键物质，但是不能自身合成，只能从体外摄入。鲜食玉米风味独特，营养丰富，是一种作为水果和蔬菜直接进行食用的玉米类型。因此，利用opaque-2基因(o2基因)改良鲜食玉米蛋白质品质，改善和提高玉米籽粒营养成分的含量和质量，对于提高其食用和加工价值具有重要意义。
利用回交转育的方法，可以实现高赖氨酸性状o2基因的定向改良。利用传统的育种方法把高赖氨酸o2基因导入到轮回亲本选育自交系时，由于该性状是隐性单基因控制，需要对回交1代自交，在分离的自交后代中选择籽粒赖氨酸含量高的植株继续回交，然后自交、回交、再自交，直至回交多代遗传背景与轮回亲本基本一致，再自交2代，才能获得性状稳定的高赖氨酸自交系。而且籽粒赖氨酸含量的测定方法复杂，成本高。可见，利用常规回交转育方法，对于隐性单基因控制的性状来说，需要使用回交、自交交替的方法，同时依赖表型鉴定才能将目标性状准确的选择出来，选系时间长、成本高、效率低。
分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。SNP标记作为第三代分子标记，与SSR标记相比具有以下优势：一是在基因组中密度更高分布更均匀；二是易实现数据整合比较；三是多数SNP变异与基因功能密切相关；四是易实现数据统计的自动化。因此，开发相应的SNP分子标记，利用分子标记对玉米高赖氨酸性状进行选择，对高赖氨酸鲜食玉米自交系选育有着独特的优势。
发明内容
为了选育高赖氨酸含量的玉米自交系，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种选育高赖氨酸含量的玉米自交系的方法，包括如下步骤：
1)以高赖氨酸玉米自交系作为非轮回亲本，非高赖氨酸玉米自交系作为轮回亲本，杂交后进行第一次回交，得到BC1代群体；
再将所述BC1代群体按照如下1)-a至1)-c的步骤鉴定：
1)-a、检测所述BC1代群体的SNP位点OE2-4基因型为TT、GG还是TG，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株；
所述SNP位点OE2-4为玉米基因组中o2基因的第五外显子区域第2137位；
1)-b、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株进行第一次SSR扩增，得到SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株的SSR扩增图谱；
所述第一次SSR扩增的SSR引物对为表3所示的40对SSR引物对中对所述非轮回亲本和所述轮回亲本存在差异扩增图谱的SSR引物对；
1)-c、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株的SSR扩增图谱和采用所述第一次SSR扩增的SSR引物对扩增所述轮回亲本的SSR扩增图谱进行比较，选取与所述轮回亲本的差异等位基因数按照从小到大排列后前10个单株作为下一步回交的母本，记作BC1代-A单株；
所述差异等位基因数为SSR扩增图谱谱带不一致的等位基因数目；
2)以所述BC1代-A单株作母本，和所述轮回亲本进行第二次回交，得到BC2代群体；
再将所述BC2代群体按照如下2)-a至2)-c的步骤鉴定：
2)-a、检测所述BC2代群体的SNP位点OE2-4基因型为TT、GG还是TG，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株；
2)-b、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株进行第二次SSR扩增，得到SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株的SSR扩增图谱；
所述第二次SSR扩增的SSR引物对为表3所示的40对SSR引物对中对所述轮回亲本和所述BC1代-A单株存在差异扩增图谱的SSR引物对；
2)-c、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株的SSR扩增图谱和采用所述第二次SSR扩增的SSR引物对扩增所述轮回亲本的SSR扩增图谱进行比较，选取与所述轮回亲本无差异等位基因的单株作为下一步回交的母本，记作BC2代-A单株；
3)以所述BC2代-A单株作母本，和所述轮回亲本进行第三次回交，得到BC3F1代群体；再将所述BC3代群体按照如下3)-a至3)-b的步骤培育：
3)-a、检测所述BC3F1代群体的SNP位点OE2-4基因型为TT、GG还是TG，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC3F1代单株；
3)-b、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC3F1代单株自交，得到BC3F2代；检测所述BC3F2代群体的SNP位点OE2-4基因型，选取SNP位点OE2-4基因型为TT的BC3F2代单株；
3)-c、所述SNP位点OE2-4基因型为TT的BC3F2代单株自交，得到高赖氨酸的玉米自交系。
上述方法中，所述高赖氨酸的玉米自交系为携带o2基因且赖氨酸含量高于所述轮回亲本。
上述方法中，所述检测各个单株SNP位点OE2-4基因型的方法为如下A)或B)：
A)直接测序；
B)对待测玉米基因组DNA进行KASP检测，实现基因分型。
上述方法中，所述KASP检测采用如下1)或2)所示的物质进行：
1)KASP成套引物，
所述KASP成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物组成；
2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
上述方法中，所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为如下1)或2)：
1)序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列或荧光基团；
2)序列1所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子的5'端连接一种荧光序列或荧光基团；
所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为如下3)或4)：
3)序列2所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列或荧光基团；
4)序列2所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子的5'端连接另一种荧光序列或荧光基团；
所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物为序列3所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，所述荧光基团为FAM或HEX。
上述方法中，所述非轮回亲本为高赖氨酸玉米自交系CML166；
所述轮回亲本为玉米自交系京糯6。
上述中的所述物质在选育高赖氨酸含量的玉米自交系中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，利用OE2-4标记进行高赖氨酸o2基因的分子标记辅助选择，一是可以在回交转育过程的回交群体中鉴定筛选到基因型为O2o2的个体，而利用化学分析法检测表型则无法筛选出基因型杂合的个体，因为o2基因为隐性突变，只有基因型为o2o2时才表现为高赖氨酸；二是可以在自交分离群体中鉴定筛选到基因型为o2o2的个体，比利用常规化学分析法进行高赖氨酸表型数据检测成本低、速度快；三是利用OE2-4标记直接对o2基因进行检测，可以在鲜食玉米植株生长的早期提取叶片DNA，不需要等到适采期籽粒灌浆结束以后；四是利用常规化学法对玉米籽粒进行高赖氨酸表型检测，需要剥取籽粒，对果穗产生破坏；而利用OE2-4标记检测o2基因，可以利用叶片提取DNA；五是OE2-4标记与phi057相比，具有更大的适用范围。
附图说明
图1为标记OE2-4和OE2-1在F2群体中的分型图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中部分材料如下：
玉米材料CML165记载在如下文献中：外引优质蛋白玉米自交系利用潜力评析，广西农业科学，2001，4：177-179；
玉米材料CML189记载在如下文献中：外引优质蛋白玉米自交系利用潜力评析，广西农业科学，2001，4：177-179；
京科糯2000的母本京糯6记载在如下文献中：不同新型除草剂加倍糯玉米单倍体的效率研究，种子，2017，36(5)：71-73；
京科糯2000的父本BN2记载在如下文献中：不同新型除草剂加倍糯玉米单倍体的效率研究，种子，2017，36(5)：71-73；
玉米材料CML166记载在如下文献中：外引优质蛋白玉米自交系利用潜力评析，广西农业科学，2001，4：177-179。
下述实施例中赖氨酸含量检测方法如下：
用化学分析法测定赖氨酸含量(干基)的方法参照农业行业标准NY/T56-1987。
实施例1、与高赖氨酸相关的SNP位点的筛选及KASP引物的获得
将高赖氨酸(opague-2)玉米材料CML165和CML189作为供体，自主选育优良品种京科糯2000的母本京糯6(以下简写JN6)和父本BN2作为受体，开发高赖氨酸o2基因的SNP分子标记，用于材料改良过程中的分子标记辅助前景选择。
一、与高赖氨酸相关的SNP位点的筛选
1、试验材料
京科糯2000的母本京糯6，父本BN2，为国内优良糯玉米骨干系，由北京市农林科学院玉米研究中心选育并提供，赖氨酸含量分别为0.33％、0.32％。
CML165和CML189为引自CIMMYT高赖氨酸(opague-2，基因型o2o2)种质材料，赖氨酸含量均为0.46％(玉米籽粒中赖氨酸含量在0.4％以上，即为高赖氨酸玉米)。
2、SNP标记开发
利用NCBI基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载玉米参考基因组B73的opague-2基因(简称o2)序列(LOCUS，NC_024465)。
Primer-BLAST软件设计引物，扩增上述4个自交系该基因的编码区序列。扩增引物序列信息为F：GTTTTGCCGTGCTTGACCAT，R：TCTTCGCCGTTCATCAGCTT。SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，连接于T-Vector pMD19载体，由北京天一辉远生物科技有限公司测序。
利用Lasergene的MegAlign软件，比对高赖氨酸组(CML165和CML189)和低赖氨酸组(JN6和BN2)opague-2基因的编码区序列。
序列比对分析发现，高、低赖氨酸材料在o2基因的第五外显子区域第2137bp处存在稳定的T/G的碱基变异、在第六外显子区域第2372、2373bp处存在TG/的2bp插入缺失变异。根据LGC公司的KASP高通量技术平台标记引物设计原则，设计分子标记OE2-4和OE2-1，用于高赖氨酸材料改良过程中的分子标记辅助选择。
KASP引物序列如下：
OE2-4：
Primer AlleleFAM：CGTTGTACTTCTGGTTCAGAGC(序列1)，该核苷酸的5'末端标记FAM基团(蓝色)；
Primer AlleleHEX：GTCGTTGTACTTCTGGTTCAGAGA(序列2)，该核苷酸的5'末端标记HEX基团(红色)；
Primer Common：TTCTTGCCTGCTGAGGCGCATT(序列3)
OE2-4标记对应的SNP位点OE2-4为玉米基因组中o2基因(opaque endosperm 2,NC_024465，提交日2017.12.18，序列4)的第五外显子区域第2137位，SNP位点OE2-4基因型为GG或TT或TG。
OE2-1(针对第六外显子区域第2372、2373bp处2bp插入缺失变异设计的OE2-1)：
Primer AlleleFAM：GGCATGGACGACGGCACTC，该核苷酸的5'末端标记FAM基团；
Primer AlleleHEX：GGCATGGACGACGGCACTG，该核苷酸的5'末端标记HEX基团；
Primer Common：AAGCGGGTGATAGAGATGAGCTCAT
OE2-1标记对应的INDEL位点OE2-1为玉米基因组中o2基因(opaque endosperm 2,NC_024465，提交日2017.12.18)的第六外显子区域第2372、2373位，INDEL位点OE2-1的基因型为TG/TG或-/-或TG/-。
3、分子标记检测
1)DNA提取
第一年5月在北京基地(春播)，将自交系JN6和BN2作为母本，分别与高赖氨酸的自交系CML165和CML189进行杂交，组配2组F1代材料(JN6/CML165、BN2/CML189)。同年10月在三亚基地(秋播)种植F1自交，收获2个组合对应的F2果穗。次年5月在北京基地播种2个组合的F2群体，单株挂牌取样提取DNA。以亲本JN6、BN2、CML165和CML189为对照。
2)KASP检测
以上述1)的DNA为模板，用OE2-4标记进行KASP扩增；
KASP筛选引物试验的简要工作流程为：将母液板DNA稀释到20ng/μl为Master板；利用LGC公司的Replikator孔板复制机，选定合适的模式进行分液至1536孔的Working板，并将分液数据导入Kraken系统；利用干燥箱，烘干Working板中的DNA；利用Merdian微量分液器，加入对应的引物和反应液，同时保存分液信息；Fusion激光封膜仪进行样品孔封口后，利用Hydrocycler水浴锅进行Touch-down PCR反应；最后利用BMG Pherastar激光扫描仪识别PCR的荧光探针，Kluster Caller软件分析SNP等位点并生成基因分型图。
采用LGC的1536板进行SNP位点检测，Working板的DNA分液体积均为1.5μl。KASP反应体系为1μl，包括0.014μl的Primer mix和0.986μl1×KASP master mix(Primer mix和KASP master mix均由LGC公司提供)。
Touch-down PCR反应程序为：94℃15min；94℃20s，61～55℃60s，10个循环；94℃20s，55℃60s，26个循环。
KASP扩增产物采用激光扫描仪照射后，若产物仅显示序列1所示引物5'端连接荧光序列的颜色(蓝色)，则待测玉米o2基因的SNP位点OE2-4的基因型为GG；若所述PCR产物仅显示序列2所示引物5'端连接荧光序列的颜色(红色)，则待测玉米o2基因的SNP位点OE2-4的基因型为TT；若所述PCR产物显示序列1所示引物5'端连接荧光序列与序列2所示引物5'端连接荧光序列的混合色(绿色)，则待测玉米o2基因的SNP位点OE2-4的基因型为GT。
采用同样的方法，用OE2-1标记进行KASP扩增，作为对照。
JN6/CML165和BN2/CML189F2群体的KASP检测结果如图1所示，左图为OE2-4标记，右图为OE2-1标记，可以看出，OE2-4标记在高低赖氨酸自交系和F2群体材料中具有很好的分型效果，检测的2个分离群体基因型均符合1:2:1的分离比例；而OE2-1标记在高低赖氨酸自交系和F2群体材料中分型效果较差，不能用来区分高低赖氨酸材料。
4、赖氨酸含量检测
在JN6/CML165、BN2/CML189的两个F2群体中，分别取OE2-4标记检测为TT和GG两种基因型的6个单株，收获自交果穗，取部分籽粒用化学分析法测定赖氨酸含量(干基)，结果如表1所示。
表1为F2群体不同基因型单株的籽粒赖氨酸含量
Figure BDA0002114109570000071
由表1可以看出，
JN6/CML165F2群体中SNP位点OE2-4基因型为TT的6个单株籽粒的赖氨酸含量为0.42-0.49％，均值为0.45％；SNP位点OE2-4基因型为GG的6个单株籽粒赖氨酸含量为0.28-0.34％，均值为0.32％。
BN2/CML189F2群体中SNP位点OE2-4基因型为TT的6个单株籽粒赖氨酸含量为0.42-0.47％，均值为0.445％；中SNP位点OE2-4基因型为GG的6个单株籽粒赖氨酸含量为0.31-0.34％，均值为0.32％。
可见，两个群体中OE2-4标记基因型为TT的单株，赖氨酸含量均在0.42％以上，而OE2-4标记基因型为GG的单株，赖氨酸含量均在0.34％以下。
通过比对标记基因型和赖氨酸含量表型数据可知，针对上述两个群体，OE2-4标记与赖氨酸含量表型具有很好的相关性，即OE2-4标记可以作为赖氨酸含量的分子标记，用于辅助高赖氨酸糯玉米种质改良。
因此，根据上述建立检测待测玉米赖氨酸含量的方法，包括如下步骤：检测待测玉米基因组中o2基因(opaque endosperm 2,NC_024465，提交日2017.12.18)的SNP位点OE2-4的基因型，
SNP位点OE2-4的基因型为TT的待测玉米的赖氨酸含量大于SNP位点OE2-4的基因型为GG的待测玉米的赖氨酸含量。
检测待测玉米基因组中o2基因的SNP位点OE2-4的基因型的方法可为如下：
1)直接测序；
2)用OE2-4标记引物对对待测玉米进行KASP检测，得到SNP位点OE2-4的基因型。
实施例2、SNP位点OE2-4的基因型在鉴定待测玉米赖氨酸含量中的应用
利用20份玉米种质材料鉴定高赖氨酸分子标记OE2-4和已公开的SSR标记phi057的适用范围。20份种质材料清单详见表2。
表2为20份种质赖氨酸含量及2个相关分子标记的基因型检测结果
Figure BDA0002114109570000081
上表中，162/162基因型，表示扩增产物大小为162bp；
153/153基因型，表示扩增产物大小为153bp。
156/156基因型，表示扩增产物大小为156bp。
种质参考文献如下：
1)外引优质蛋白玉米自交系利用潜力评析，广西农业科学，2001，4：177-179
2)玉米穗轴对穗粒腐病抗性的遗传研究，2015年，第一届全国玉米生物学学术研讨会论文汇编
3)玉米新品种MC703选育与配套技术，中国种业，2016，62-64
4)基于SNP芯片揭示中国玉米育种种质的遗传多样性与群体遗传结构，中国农业科学，2018,51(4):626-634
5)不同新型除草剂加倍糯玉米单倍体的效率研究，种子，2017，36(5)：71-73
6)杂交玉米新品种MC 817特征特性及配套栽培技术，种子，2018，37(6)：114-115
1、赖氨酸含量(干基)测定
取20份种质的成熟干籽粒30g，分别利用化学分析法进行赖氨酸含量(干基)测定。
结果表明，CML165、CML189、CML191、CML166、CML171、CML172、CML20、先甜5号和903M等9份种质材料赖氨酸含量在0.41-0.68％之间，平均值为0.50％；京X005、B73、京糯6、BN2、京724、京92、京2416、京2418、京464、京MC01和掖478等11份种质材料赖氨酸含量在0.3-0.36％之间，平均值为0.32％。
2、SNP位点OE2-4和SSR标记phi057的检测
取20份种质材料的种子室内发苗，混株提取DNA。以上述20份DNA为模板，检测SNP位点OE2-4和SSR标记phi057。
1)SNP位点OE2-4的KASP检测
方法与实施例1的3相同；
2)SSR标记phi057检测
phi057引物序列源自https://www.maizegdb.org/网站，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
phi057-F：5’-CTCATCAGTGCCGTCGTCCAT-3’；
phi057-R：5’-CAGTCGCAAGAAACCGTTGCC-3’
PCR扩增的反应体系为：总体积20μL，其中DNA模板1μl，上下游混合后的引物1μl，MIX(含2×Buffer)10μl，ddH2O为8μL。
上述PCR扩增的程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，总共30个循环；72℃延伸7min。
若扩增产物大小为162bp，则待测玉米基因型为162/162，即o2o2，籽粒表现为高赖氨酸含量；
若扩增产物大小为153bp或156bp，则待测玉米基因型为153/153或156/156，即O2O2，籽粒表现为非高赖氨酸含量。
结果如表2所示，表型为高赖氨酸含量(≥0.4％)的9份种质中，除903M外，标记OE2-4的基因型均为TT，与实施例1中的高赖氨酸材料检测基因型一致；SSR标记phi057的基因型均为162/162。表型为非高赖氨酸含量的11份种质，标记OE2-4的基因型均为GG，与实施例1中的非高赖氨酸材料检测基因型一致；SSR标记phi057的基因型均为153/153或156/156。可见，上述2个分子标记与高赖氨酸(opague-2，基因型o2o2)性状具有很好的相关性，并在多份不同遗传背景的种质材料中均适用。
种质903M，赖氨酸含量为0.68％，为高赖氨酸表型，标记OE2-4基因型为TT，与其他高赖氨酸种质基因型一致；而SSR标记phi057基因型为153/153，与其他非高赖氨酸种质基因型一致。因此可知，与phi057相比，标记OE2-4具有更大的适用范围。
实施例3、高赖氨酸鲜食玉米的选育
1、杂交子代F1的获得
第一年夏，以高赖氨酸玉米自交系CML166(非轮回亲本，o2基因)做供体、非高赖氨酸鲜食玉米自交系京糯6(可购自北京市农林科学院玉米研究中心)(轮回亲本，不含o2基因)做受体，杂交组配F1代，收获F1代的种子。
同年冬海南第一代，种植F1代的种子，得到F1代玉米植株。
2、回交一次BC1代的获得
(1)回交
以F1代植株做母本，继续与轮回亲本京糯6回交，收获BC1代的种子。同年冬海南第二代，种植BC1代群体的种子，得到BC1代群体。
(2)BC1代OE2-4分子标记辅助前景选择
对2000株BC1代群体通过田间表型(主要指植株性状，包括株高、穗位高、株型、雄穗分枝数等性状。)选择初步入选的600株BC1代单株；再将600株BC1代单株在KASP-SNP分型平台上检测SNP位点OE2-4基因型，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株进行下一步的SSR分子标记辅助背景选择。
(3)BC1代SSR分子标记辅助背景选择
以CML166和京糯6的DNA为模板，对40对SSR引物(表3)进行PCR扩增和电泳检测，筛选在二者之间存在多态性的引物。通过扩增产物电泳图谱比对，发现bnlg439w1、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi072k4、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1506k12、bnlg1671y17、phi96100y1、umc1536k9、umc1489y3、bnlg490y4、umc1429y7、bnlg249k2、phi299852y2、umc2160k3、bnlg2235y5、phi233376y1、phi041y6和umc2163w3共25对引物在CML166和京糯6上存在差异。
每对SSR核心引物对应一个位点；每个位点有2个等位基因。
利用在CML166和京糯6上存在差异的25对引物对对SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株进行SSR扩增，每个SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株得到25个位点对应的PCR扩增图谱，与京糯6得到的25个位点对应的PCR扩增图谱进行比较，PCR扩增图谱谱带不一致的等位基因数目为差异等位基因数；比较总位点数为25。
根据扩增结果，选取与京糯6差异等位基因数从小到大排列后前10个单株(差异位点数≤7个)作为进一步回交的母本，记作BC1代-A单株。
表3为40对SSR核心引物
Figure BDA0002114109570000111
Figure BDA0002114109570000121
Figure BDA0002114109570000131
3、回交二次BC2代的获得
(1)回交
以上述2得到的BC1代-A单株作母本，与轮回亲本京糯6回交，组配BC2代。
次年夏，种植BC2代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株。
(2)BC2代OE2-4分子标记辅助前景选择
对1500株BC2代群体通过田间表型(主要指植株性状，包括株高、穗位高、株型、雄穗分枝数等性状。)选择初步入选的300株BC2代单株；再将300株BC2代单株在KASP-SNP分型平台上检测SNP位点OE2-4基因型，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株进行下一步的SSR分子标记辅助背景选择。
(3)BC2代分子标记SSR辅助背景选择
选择BC1代-A单株与京糯6扩增带型不同的SSR引物对对SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株进行SSR扩增，每个SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株对应的PCR扩增图谱，与京糯6对应的PCR扩增图谱进行比较，选取与京糯6无差异等位基因的单株作为进一步回交的母本，记作BC2代-A单株。
4、回交三次BC3代的获得
(1)回交
以上述3得到的BC2代-A单株作母本，与轮回亲本京糯6回交，组配BC3F1代。
次年夏，种植BC3F1代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株。
(2)BC3代OE2-4分子标记辅助前景选择
对150株BC3F1代群体通过田间表型(主要指植株性状，包括株高、穗位高、株型、雄穗分枝数等性状。)选择初步入选的50株BC3代单株；再将50株BC3代单株在KASP-SNP分型平台上检测SNP位点OE2-4基因型，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC3F1代单株。
5、BC3F2代的获得
(1)自交：将SNP位点OE2-4基因型为TG的BC3代单株通过前景选择入选的BC3F1代单株，进行自交得到BC3F2。
田间种植BC3F2代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株。
(2)BC3F2代目标性状表型选择
对BC3F2代植株，在KASP-SNP分型平台上检测SNP位点OE2-4基因型，选取SNP位点OE2-4基因型为TT的BC3F2代单株继续自交，即获得了遗传背景与京糯6基本一致，同时表现高赖氨酸性状的新自交系L京糯6。
检测L京糯6的赖氨酸含量，为0.46％。
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种高赖氨酸玉米自交系的选育方法
<160> 83
<170> PatentIn version 3.5
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cgtcttgtct ccgtccgtgt g 21
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ccaccaaccc atacccatac cag 23
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ttgatgggca cgatctcgta gtc 23
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aaccaagttc ttcagacgct tcagg 25
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gaggaatgat gtccgcgaag aag 23
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ttcagtcgag cgcccaacac 20
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cactctccct ctaaaatatc agacaacacc 30
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gcttctgctg ctgttttgtt cttg 24
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gcctactctt gccgttttac tcctgt 26
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catcggcgtt gatttcgtca g 21
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tcattcccag agtgccttaa cactg 25
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ctgtgctcgt gcttctctct gagtatt 27
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gcttgaggcg gttgaggtat gag 23
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tgcacagaat aaacataggt aggtcaggtc 30
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cgcacggcac gatagaggtg 20
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aactgcttgc cactggtacg gtct 24
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ccggcagtcg attactccac g 21
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<211> 25
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<213> Artificial sequence
<400> 75
cagtagcccc tcaagcaaaa cattc 25
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actgatcgcg acgagttaat tcaaac 26
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<400> 77
taccgaagaa caacgtcatt tcagc 25
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acagaggaac gacgggacca at 22
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<213> Artificial sequence
<400> 79
ggcactcagc aaagagccaa attc 24
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cagcgccgca aacttggtt 19
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tggacgcgaa ccagaaacag ac 22
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caagcgggaa tctgaatctt tgttc 25
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<400> 83
cttcgtacca tcttccctac ttcattgc 28

Claims (6)

1.一种选育高赖氨酸含量的玉米自交系的方法，包括如下步骤：
1）以高赖氨酸玉米自交系作为非轮回亲本，非高赖氨酸玉米自交系作为轮回亲本，杂交后进行第一次回交，得到BC1代群体；
再将所述BC1代群体按照如下1）-a至1)-c的步骤鉴定：
1）-a、检测所述BC1代群体的SNP位点OE2-4基因型为TT、GG还是TG，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株；
所述SNP位点OE2-4为玉米基因组中o2基因的第五外显子区域第2137位；
1）-b、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株进行第一次SSR扩增，得到SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株的SSR扩增图谱；
所述第一次SSR扩增的SSR引物对为表3所示的40对SSR引物对中对所述非轮回亲本和所述轮回亲本存在差异扩增图谱的SSR引物对；
1）-c、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC1代单株的SSR扩增图谱和采用所述第一次SSR扩增的SSR引物对扩增所述轮回亲本的SSR扩增图谱进行比较，选取与所述轮回亲本的差异等位基因数按照从小到大排列后前10个单株作为下一步回交的母本，记作BC1代-A单株；
所述差异等位基因数为SSR扩增图谱谱带不一致的等位基因数目；
2）以所述BC1代-A单株作母本，和所述轮回亲本进行第二次回交，得到BC2代群体；
再将所述BC2代群体按照如下2）-a至2)-c的步骤鉴定：
2）-a、检测所述BC2代群体的SNP位点OE2-4基因型为TT、GG还是TG，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株；
2）-b、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株进行第二次SSR扩增，得到SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株的SSR扩增图谱；
所述第二次SSR扩增的SSR引物对为表3所示的40对SSR引物对中对所述非轮回亲本和所述BC1代-A单株存在差异扩增图谱的SSR引物对；
2）-c、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC2代单株的SSR扩增图谱和采用所述第二次SSR扩增的SSR引物对扩增所述轮回亲本的SSR扩增图谱进行比较，选取与所述轮回亲本无差异等位基因的单株作为下一步回交的母本，记作BC2代-A单株；
3）以所述BC2代-A单株作母本，和所述轮回亲本进行第三次回交，得到BC3 F1代群体；再将所述BC3代群体按照如下3）-a至3)-b的步骤培育：
3）-a、检测所述BC3F1代群体的SNP位点OE2-4基因型为TT、GG还是TG，选取SNP位点OE2-4基因型为TG的BC3F1代单株；
3）-b、将所述SNP位点OE2-4基因型为TG的BC3F1代单株自交，得到BC3F2代；检测所述BC3F2代群体的SNP位点OE2-4基因型，选取SNP位点OE2-4基因型为TT的BC3F2代单株；
3）-c、所述SNP位点OE2-4基因型为TT的BC3F2代单株自交，得到高赖氨酸的玉米自交系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤3）-c中，所述高赖氨酸的玉米自交系为携带o2基因且赖氨酸含量高于所述非轮回亲本。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述检测各个单株SNP位点OE2-4基因型的方法为如下A）或B）：
A）直接测序；
B）对待测玉米基因组DNA进行KASP检测，实现基因分型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述KASP检测采用如下1）或2）所示的物质进行：
1）KASP成套引物，
所述KASP成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成；
2）含有1）所述KASP成套引物的PCR试剂或试剂盒。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述非轮回亲本为高赖氨酸玉米自交系CML166；
所述轮回亲本为玉米自交系京糯6。
6.权利要求4中的所述物质在选育高赖氨酸含量的玉米自交系中的应用。
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