CN102154449A - 高赖氨酸玉米ssr分子标记辅助选择育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高赖氨酸玉米SSR分子标记辅助选择育种方法。该方法采用回交转育与分子标记相结合的手段，成功创建了高赖氨酸近等基因系QZ58、Q478和QC72。运用这种SSR分子标记辅助选择方法在回交一代后，利用与o₂基因内的SSR分子标记即可检测出哪些单株含有o₂基因，不需要自交就可以回交第二代，因此育种周期短、费用低、效率高。本发明方法可以针对不同育种目标要求，通过对回交后代苗期叶片进行基因型检测；同时，它不受环境条件影响，结合南繁加代，可以在较短的时间内将目标基因转入优良材料中去。

Description

高赖氨酸玉米SSR分子标记辅助选择育种方法

技术领域

本发明涉及作物育种领域，具体涉及一种高赖氨酸玉米SSR分子标记辅助选择育种方法。

背景技术

自从1964年Mertz等人发现opaque-2基因能够显著提高玉米籽粒中的赖氨酸和色氨酸含量以来，各国的育种家都相继投入到优质蛋白玉米育种中，但是，多年来并未出现理想中的有大批的优良优质蛋白玉米品种运用到生产实践中。这是因为优质蛋白玉米种质资源相对贫乏，很难直接组配单交种，育种家们大多是运用高赖氨酸的种质，通过回交转育的手段将普通玉米自交系转化成高赖氨酸的近等基因系。但实践证明由普通玉米转化而来的这些近等基因系发生了一系列的变化，如出现了容重降低，胚乳粉质程度增加，出苗速度慢，容易感染病虫害等。近年来，育种家们对转育成的高赖氨酸玉米自交系与普通玉米自交系的差异以及田间性状和配合力均有研究，但是，还未见到有关高赖氨酸玉米近等基因系的创建及胚乳质地变异的详细报道。

Schmidth(1987)和Motto(1988)利用转座子SPM和AC调出了o₂基因；Maddaloni(1989)克隆了o₂基因的全序列。o₂基因的分离与克隆，为分子标记在优质蛋白玉米育种中的应用提供了条件。Kata等(1994)利用cDNA探针和HindⅢ酶切相结合，建立了o₂基因的RFLP分子标记，能够较精确地鉴定O₂O₂、O₂o₂和o₂o₂基因型，但操作技术复杂繁琐，费用较高。Pioneer公司和Missour大学开发出3对o₂基因的SSR引物Phi057、Phi112和umc1066。中国农业科学院作物科学研究所利用Phi057结合Phi112，建立了优质蛋白玉米分子标记辅助选择的策略，在利用分子标记进行检测追踪的同时，通过不同轮次的回交和自交，获得遗传背景不同的QPM自交系。

中国农业科学院姜伟、李新海等利用[(CA335×黄早4)×CA335]回交群体和标记Phi057建立了优质蛋白玉米标记辅助选择技术体系。他们的研究结果表明，在已经开发出的三个o₂基因微卫星标记中，umc1066在所用的实验材料中未检测出多态型(对此他们也曾怀疑从网上查到的引物序列与其真实序列有出入，或者是与试验材料或扩增条件有关)，认为在由QPM和普通玉米自交系组配的群体中选择o₂o₂纯和基因型个体时，Phi057是目前最佳的选择标记。

运用回交的手段，对一些优良自交系的个别缺点进行改良是选育自交系十分有效的措施。自从1964年Mertz等人发现opaque-2基因能够显著提高玉米籽粒中的赖氨酸和色氨酸含量以来，各国的育种家相继投入到优质蛋白玉米育种中，但是，多年来并未出现理想中的有大批的优良优质蛋白玉米品种运用到生产实践中。这是因为优质蛋白玉米种质资源相对贫乏，很难直接组配单交种。为了拓宽种质基础，育种家们尝试采用高赖氨酸的种质，通过回交转育的手段将普通玉米自交系转化成高赖氨酸的近等基因系，这是丰富优质蛋白玉米遗传基础的有效途径。但o₂基因是隐性基因，常规育种方法将普通自交系转育成QPM近等基因系，回交一代必须自交一代，测定赖氨酸含量后，再进行回交，一般需要回交和自交各5代以上，最后再自交3～4代，育种周期很长，赖氨酸测定费用费用高、效率低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种育种周期短、效率高的高赖氨酸玉米SSR分子标记辅助选择育种方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种高赖氨酸玉米SSR分子标记辅助选择育种方法，包括以下步骤：

(1)选取材料：选择目前生产上主栽品种的重要亲本与QPM系CA339、CA042组配的3个组合，回交组建回交群体，进行连续回交，且从回交第2代开始进行o₂基因的筛选选择继续回交的单株；

(2)opaque-2基因SSR分子标记鉴定：根据o₂基因序列分析，采用SSR引物phi057、phi112和umc1066进行DNA提取、PCR扩增；三个引物序列如表1，引物序列来自MAIZEDATABASE，由北京BioAsia公司合成。

表1 引物序列

(3)SSR分子标记回交育种创建近等基因系

第一季：以普通玉米自交系为母本与高赖氨酸供体亲本CA339、CA042杂交，得到F₁；

第二季：以普通玉米做轮回亲本回交，得到BC₁F₁；

第三季：按穗行种下BC₁F₁，每个群体挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的100个单株挂牌取样，提DNA，检测基因型，得到成功转入了o₂基因的单株后，继续回交得到BC₂F₁；

第四季：按穗行种下BC₂F₁，同样每个群体再挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的单株挂牌取样，提DNA，检测基因型，选取已经成功转入了o₂基因的单株，再自交2代；

(4)基因型SSR分子标记鉴定

直接观察玉米胚乳外部形态、统计各种结构类型，并且选用o₂基因内3个标记，对转化后材料基因型SSR分子标记鉴定，o₂基因转化成功后即得高赖氨酸近等基因系。

所述回交群体为(郑58×CA339)×郑58、(昌7-2×CA042)×昌7-2和(掖478×CA042)×掖478。

本发明具有积极有益的效果：

1.分子标记辅助选择通常在回交一代后不需要自交就可以回交第二代，因此育种周期短、费用低、效率高。

2.本发明用回交转育与分子标记相结合的手段，利用SSR分子标记umc1066作为检测o₂基因的标记，对回交群体的主效基因选择，快速成功地创建了骨干系郑58、478和昌72的高赖氨酸近等基因系QZ58、Q478和QC72。

3.本发明方法可以针对不同育种目标要求，通过对回交后代苗期叶片进行基因型检测。同时，它不受环境条件影响，结合南繁加代，可以在较短的时间内将目标基因转入优良材料中去。大大加快了育种进程，而且不会导致硬质o₂o₂基因型材料丢失。

附图说明

图1为用3对SSR引物检测3个QPM和9个普通玉米自交系在o₂位点的多态性；其中，1.Primer3：Phi057；Primer4：Phi112；Primer5：umc1066；2.M-Marker(DL2000)；1：郑58；2：Bt；3：齐205；4：059；5：登9；6：昌7-2；7：P138；8：CA042；9：掖478；10：7331；11：CA339；12：综3。

图2为轮回亲本昌72、高赖供体亲本CA042和其回交群体o₂基因内umc1066标记电泳图；其中，M：Marker(Del3000)；P1：轮回亲本普通昌72；P2：高赖氨酸供体亲本CA042；编号1-20代表回交1代群体的20个单株样品。

图3为普通昌72及其高赖氨酸近等基因QC72家系opaque-2基因内umc1066标记电泳图；其中，M：Marker(Del3000)；P1：轮回亲本普通昌72；P2：高赖氨酸供体亲本CA042；编号1-29代表29个QC72家系单株样品(其中9、22、25是杂株，考种时已经去除)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。

以9个优良普通玉米自交系为母本分别与3个QPM自交系组配27个杂交组合中，选择目前生产上主栽品种的3个重要亲本郑58、掖478和昌7-2与QPM系CA339、CA042组配的3个组合，回交组建3个回交群体[(郑58×CA339)×郑58]、[(昌7-2×CA042)×昌7-2]和[(掖478×CA042)×掖478]，进行连续回交。从回交第2代开始进行o2基因的筛选选择继续回交的单株。

实施例1 SSR标记筛选

o₂基因内3个微卫星标记Phi057、Phi112、umc1066在12个自交系之间的多态性见图1。由图可见，在o₂基因内的3个引物中引物5(umc1066)可以同时很好地区分出郑58、昌7-2、掖478和2个o₂基因供体自交系CA339、CA042。而其他2个引物不能同时区分。引物3(Phi057)，在1号(郑58)与11号(CA339)之间没有多态性；在6号(昌7-2)、9号(掖478)与8号(CA042)之间均有较好的多态性，但是8号带型不太清晰。引物4(Phi112)，在1号(郑58)与11号(CA339)之间没有多态性；在6号(昌7-2)与8号(CA042)之间有较好的多态性，在9号(掖478)与8号(CA042)之间也没有多态性。而引物5(umc1066)在1号(郑58)与11号(CA339)之间有很好的多态性，在6号(昌7-2)、9号(掖478)与8号(CA042)之间也均有很好的多态性，而且5条带型都十分清晰。

由此可见，在o₂基因内的3个引物中只有引物5(umc1066)可用在[(郑58×CA339)×郑58]、[(昌7-2×CA042)×昌7-2]和[(掖478×CA042)×掖478]回交群体中来追踪o₂基因，引物5(umc1066)是一个构建回交群体近等基因系比较理想的分子标记。

实施例2 用SSR分子标记回交育种创建近等基因系

以普通玉米自交系为母本与高赖氨酸供体亲本CA339、CA042杂交，得到F₁；第二季：以普通玉米做轮回亲本回交，得到BC₁F₁；第三季：按穗行种下BC₁F₁，每个群体挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的100个单株挂牌取样，提DNA，检测基因型，得到已经成功转入了o₂基因的单株，继续回交得到BC₂F₁；第四季：按穗行种下BC₂F₁，同样每个群体再挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的100个单株挂牌取样，提DNA，检测基因型，得到已经成功转入了o₂基因的单株。再自交2代。一共包括1代杂交，2代回交和2代自交。

结果显示：有两个亲本特征带的杂合带型单株已经成功转入了o₂基因，基因型为O₂o₂；只有P1特征带的基因型为O₂O₂，这些单株没有o₂基因。说明该标记可以区分O₂o₂与O₂O₂(图2)。说明运用SSR分子标记回交育种创建近等基因系选择效率特别高。根据分子标记鉴定结果可以选择O₂o₂基因型单株，继续回交或自交。

在3个回交群体中分别统计100个单株的带型，卡方值均大于卡方临界值。结果表明：3个回交群体中单株两种基因型的比例O₂o₂∶O₂O₂，经卡方测验证明均符合1∶1的分离比例(表2)。

表2 三个回交BC₁F₁群体中O₂o₂和O₂O₂两种基因型统计分析

实施例3 转化后材料田间试验及基因型SSR分子标记鉴定

从2000年开始在河南农科院实验农场进行，并且每年在海南加繁一代。采用随机区组设计，单行小区，每小区行长3.5m，行距0.6m，株距0.2m，每行18株。从苗期开始进行田间综合农艺性状观察，并对转化后材料基因型SSR分子标记鉴定。

直接观察玉米胚乳外部形态、统计各种结构类型。由普通玉米自交系转化成的高赖氨酸近等基因系籽粒胚乳结构发生了很大的变化，但不同玉米种质的胚乳类型和质地又各不相同。马齿型的郑584和478，其近等基因系家系胚乳类型都只有3种，粉质程度比较高，但从表型来看，Q478家系的硬质程度比QZ58家系的要高，而硬粒型的昌72，转化后却发现了一系列不同程度的硬质胚乳连续性变异，有完全软质不透明的，也有规则的顶部胚乳是硬质的(硬质的比例不同)，还有斑块状硬质胚乳。

SSR标记选用o₂基因内3个标记，它们是Phi057、Phi112、umc1066；引物序列来自MAIZEDATABASE；引物由上海生工公司合成。DNA提取、PCR扩增等方法采用MAIZEDATABASE操作书。由图3可以清楚的看到，采用分子标记辅助选择与田间回交相结合的手段，经过2代回交，再自交1代，得到材料基因型与高赖氨酸供体亲本一样，是双隐性纯合体。说明经过2代的回交基因已经在o₂位点纯合。表明采用SSR标记umc1066辅助选择o₂基因是有效的。这与表现型相一致。

从田间观察来看，这些在o₂位点基因型纯合的材料其株型、株高、雄穗等农艺性状都与普通自交系郑58、478和昌72非常接近。这样我们采用回交转育与分子标记相结合的手段，成功创建了高赖氨酸近等基因系QZ58、Q478和QC72。

Claims (2)

1.一种高赖氨酸玉米SSR分子标记辅助选择育种方法，包括以下步骤：

(1)选取材料：选择目前生产上主栽品种的重要亲本与QPM系CA339、CA042组配的3个组合，回交组建回交群体，进行连续回交，且从回交第2代开始进行o₂基因的筛选选择继续回交的单株；

(2)opaque-2基因SSR分子标记鉴定：根据o₂基因序列分析，采用SSR引物phi057、phi112和umc1066进行DNA提取、PCR扩增；

(3)SSR分子标记回交育种创建近等基因系

第一季：以普通玉米自交系为母本与高赖氨酸供体亲本CA339、CA042杂交，得到F₁；

第二季：以普通玉米做轮回亲本回交，得到BC₁F₁；

第三季：按穗行种下BC₁F₁，每个群体挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的100个单株挂牌取样，提DNA，检测基因型，得到成功转入了o₂基因的单株后，继续回交得到BC₂F₁；

第四季：按穗行种下BC₂F₁，同样每个群体再挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的单株挂牌取样，提DNA，检测基因型，选取已经成功转入了o₂基因的单株，再自交2代；

(4)基因型SSR分子标记鉴定

直接观察玉米胚乳外部形态、统计各种结构类型，并且选用o₂基因内3个标记，对转化后材料基因型SSR分子标记鉴定，o₂基因转化成功后即得高赖氨酸近等基因系。

2.根据权利要求1所述的高赖氨酸玉米SSR分子标记辅助选择育种方法，其特征在于，所述回交群体为(郑58×CA339)×郑58、(昌7-2×CA042)×昌7-2和(掖478×CA042)×掖478。

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