CN105063033B

CN105063033B - 一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用

Info

Publication number: CN105063033B
Application number: CN201510502589.XA
Authority: CN
Inventors: 张椿雨; 战宗祥; 朴钟云; 江莹芬; 吴江生; 周永明; 傅廷栋
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-08-15
Filing date: 2015-08-15
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2035-08-15
Also published as: CN105063033A

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜抗根肿病基因PbBa8.1的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用本发明通过重测序的方法，对两亲本在PbBa8.1位点周围的序列进行多态性分析后，利用Indel位点的侧翼序列进行引物开发设计，进而获得能够区分抗与不抗根肿病甘蓝型油菜的DNA分子标记。针对该分子标记设计引物：F A08‑300:5’‑GTAGTGCGGGCCACAAAAT‑3’；R A08‑300:5’‑CACAATGGAGTGTTGAAATTCACT‑3’，该引物可用于提高抗根肿病基因选育的速度与鉴定效率，其方法易行、重复性好、操作性强、鉴定速度快、检测成本低、省时省力，极大减轻了田间通过表型鉴定进行抗病单株选择的工作量。

Description

一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用

技术领域

本发明涉及与甘蓝型油菜抗根肿病基因PbBa8.1位点紧密连锁的分子标记A08-300的侧翼基因组序列、根据该侧翼序列设计的引物以该引物在筛选油菜抗根肿病植株中的应用。

背景技术

根肿病(Clubroot disease)是由鞭毛菌亚门根肿菌属芸苔根肿菌(Plasmodiophora bra ssicae)侵染引起的一种传染性非常强的土壤病害。根肿病菌专性寄生于芸薹属、萝卜属以及拟南芥等十字花科植物的根部。当根系受到病菌刺激，其薄壁细胞大量分裂和增大而形成肿瘤。由于根的生理机能受阻抑，病株地上部则表现出叶片失绿、无光泽、叶边变黄、生长缓慢、植株矮小以及萎蔫等症状。发病严重时可导致作物绝收。目前根肿病对全世界油菜产量造成10-15％的损失，通过遗传转育的方式提高油菜抗病性是被认为最有效的防治根肿病的措施(Dixon G 2009J of Plant Growth Regul 28:194–202)。其中芜菁(AA，2n＝20)中含有的抗病位点最多，在抗病育种中应用也最为广泛(Diederichsen E 2009Journal of P lant Growth Regulation,28)。日韩等国以芜菁为抗源培育出了多个抗根肿病的大白菜品种，而在欧洲也利用芜菁(ECD04)与抗病性甘蓝(CC,2n＝18)杂交人工合成了甘蓝型油菜，进而培育出了抗病品种Mendel(Rahman H2014Canadian Journal of Plant Pathology,36(s uppl.1):122-134)。

2011年，我们获得了1份抗根肿病的纯系芜菁材料ECD04，芜菁ECD04(AA)含有多个抗病位点。朴钟云课题组利用ECD04和白菜构建的BC1F2群体定位到了5个抗病位点分别对2号、4号、7号和10号生理小种具有一定抗性。其中PbBa8.1是唯一对4号生理小种具有抗性的位点(Jing J,2013Plos One,8(12):e85307-e85307)。经过我们的研究证明该位点同时对安徽黄山、湖北巴东地区的生理小种具有良好的抗性，其中与PbBa8.1位点遗传距离最近的2个侧翼标记为cnu_m090a、sau_um353a见(Jing J,2013Plos One,8(12):e85307-e85307)。但这两个标记与大白菜抗根肿病基因PbBa8.1的遗传距离较远。本发明以ECD04抗源材料为供体，结合回交育种及分子标记辅助选择，将ECD04中抗4号生理小种的抗病位点PbBa8.1定向地向优良甘蓝型油菜常规品种华双5号转移。在此基础上，通过对两亲本进行全基因组重测序，对cun_m090a和sau_um353a两对标记之间的序列进行比较分析后，开发了与甘蓝型油菜抗根肿病基因PbBa8.1紧密连锁的标记A08-300，并精细定位该基因，从而简化甘蓝型油菜抗根肿病品种的转育过程。

在常规油菜抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法来鉴定中间材料的基因型，并且温度、湿度以及病原菌的田间分布等因素会影响到接种发病率，进而影响抗病材料的正确选择及转育进程。本发明提供的分子标记及其选育方法可以在育种过程中的任何时期根据基因型对单株进行有效选择，提高了选择效率、缩短育种年限。本发明将为甘蓝型油菜抗根肿病育种提供重要支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供了与芜菁ECD04抗根肿病基因位点PbBa8.1紧密连锁的分子标记A08-300的侧翼序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了根据芜菁ECD04分子标记A08-300的侧翼序列设计的特异性引物，该引物可特异鉴别SEQ ID NO.1所示序列。

本发明的最后一个目的在于A08-300分子标记的侧翼序列及其引物在油菜抗根肿病育种中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人通过以芜菁ECD04(Jingjing Chen等Identification of novel QTLs forisolate-sp ecific partial resistance to Plasmodiophora brassicae in Brassicarapa.[J].Plos One,2013,8(12):e85307-e85307)为父本，易感常规甘蓝型油菜华双5号为母本杂交，构建分离群体，发现了一个与芜菁抗根肿病PbBa8.1基因位点紧密连锁的分子标记A08-300：

(1)ECD04中A08-300的侧翼序列如下：

5’-AATTTTGATATTTTAAAAACAAATTTTATTAATATAATAAATATGCTTGAATAATTGAGTGAGGATAAATATCAAGTGAAATTTGCCGAACCATGAAAGTAAAGCATTTAAATCTTATCCAGATTAAAAAAAAATCAAGTAAATGTTTTTGGCCAACCACCGAGCGACACGTGGTAGTGCGGGCCACAAAATTTTTTTTCAGGTGTTGAAATTTTCCAACGATGCCATGTAGACAAACACATTTTTACAACATCCTCACTGCAAAGATTTAAACTGTTGAAAGTGAATTTCAACACTCCATTGTGAGTGGTCTAACAGAATAAATGTCTTGTGCCAATCCAAGTTTGTTCTATGCAGTTCTCAAAATACATATATGTGTATGTATATATTAAGATTAGTATTTGATTGTAAATATCTCAAAATTACGAAAACTTTAACCCAACATATCTTAAATAAGGATATTTTGGACTGAATTTCA-3’

(2)华双5号中A08-300的侧翼序列序列如下：

5’-AATTTTGATATTTTAAAAACAAATTTTATTAATATAATAAATGTGTTTGAATAATTGAGTGAGGATAAATATCAAGTGAAATCTGCCGAACCAATGAAAATAAAGCATTTAAGTCTTATCCAGATTTAAAAAAAATCAAGTAAATGTTTTTGGCCAACCACAGAGCGACACGTGGTAGTGCGGGCCACAAAATTTTTTTTCAGCTGTTGAAATTTTTCAACGCCTGTTGCTACCATGTAGACAAACATATTTTTACAACATCCTCACTACAAAGATTTAAACTGTTGAAAGTGAATTTCAACACTCCATTGTGAGTGGTCTAACAGAATAAATGTCTTGTGCCAATCCAGGTTTGTTCTATGCAGTTCTCAAAATACATATATGTGTATGTATATATTAAGATTAGTATTTGATTGTAAATATCTTGAAATTACGAAAAATTTAACCCAACATACCCTAAATAAGGATATTTTGGACTGAATTTCA-3’

根据芜菁ECD04分子标记A08-300的侧翼序列设计的特异性引物，所述的引物优选：F A08-300:5’-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3’；R A08-300:5’-CACAATGGAGTGTTGAAATTCACT-3’

A08-300分子标记引物在油菜抗根肿病育种中的应用，包括利用上述引物对待测植株DNA进行PCR扩增，能特异性的扩增出ECD04中，优选的，利用引物F A08-300:5’-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3’；R A08-300:5’-CACAATGGAGTGTTGAAATTCACT-3’对待测植株DNA进行PCR。

扩增结果中带有132bp条带的单株是含有抗根肿病位点PbBa8.1的材料。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明公开的分子标记A08-300与芸薹属抗根肿病位点PbBa8.1紧密连锁，可广泛应用于芸薹属抗根肿病位点PbBa8.1的分子标记辅助选择育种。本发明通过引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短育种进程。

附图说明

图1为ECD04相对华双5号不同的碱基数差异所对应的Indel位点数量。

图2为A08-300引物在亲本及BC₃F₂部分抗病、感病个体上的扩增结果示意图。

其中▼为华5号、▲为ECD04，图2中A是BC₃F₂部分抗病个体扩增结果示意图；图2中B是BC₃F₂部分感病个体扩增结果示意图。

图3为ZHE-226自交后代在湖北恩施巴东田间病圃的抗病性表现。

箭头标识的是对照组，未标识的是抗病新株系。

具体实施方式

实施例1：

与甘蓝型油菜抗根肿病基因PbBa8.1紧密连锁标记的获得与鉴定

1、分离群体的构建

以含有抗4号生理小种PbBa8.1位点的芜菁ECD04(Jingjing Chen等Identification of novel QTLs for isolate-specific partial resistance toPlasmodiophora brassicae in Brassica rapa.[J].Plos One,2013,8(12):e85307-e85307)为父本，易感常规甘蓝型油菜华双5号为母本杂交获得F1。以安徽黄山生理小种对F1进行抗病性鉴定，F1全部表现为抗病。接下来，我们将F1继续和华双5号回交3代，分别获得BC1、BC2、BC3代回交群体，同时利用与PbBa8.1位点两侧与之连锁的SSR标记cum_m090a和sau_um353a开始对BC1群体进行基因型分析，从中筛选出可能含有PbBa8.1位点的单株用于后续的回交工作，直至获得BC2、BC3以及BC3F2群体。

2014年秋天，我们将2个BC3F2群体在安徽黄山田间病圃进行了抗病性鉴定，结果调查发现，对照组华双5号100％发病，其中一个包含117个单株编号为ZHE-226BC3F2测试群体中发现抗病株系91株、感病株系27株，卡方测验结果表明该群体的抗感分离比符合3:

1分离(χ²＝0.34<χ²0.05(1)＝3.84)(图2)，以上结果说明该抗性由显性单基因控制。

2、与PbBa8.1紧密连锁分子标记的开发

为了快速开发出与抗病位点PbBa8.1更加紧密连锁的分子标记，我们通过对两亲本进行全基因组重测序。对ECD04和华双5号分别进行40×、30×深度测序，分别得到20Gb、22Gb的数据，经过NGSQCToolkit_v2.3软件过滤最后分别获得19Gb、21Gb的clean reads。利用软件bowtie2分别以Chiifu、Darmor-bzh为参考基因组进行组装得到sam文件，利用samtools将sam文件转换成bam文件并进行排序建立索引。利用samtools和VarScan对cum_m090a和sau_um353a两标记之间序列进行indel分析。最后得到2885个indel位点。去除仅有1-2个碱基差异的位点后剩余898个indel位点(图1)。多态性位点的侧翼序列提取后利用Primer3进行引物设计。在合成的5对引物中有三对引物有多态性，其中A08-300效果最好。其中A08-300在芜菁ECD04和华双5号的序列分别如下：

(1)ECD04中A08-300及其侧翼序列

(2)华双5号中A08-300及其侧翼序列

根据上述序列设计的用于扩增甘蓝型油菜抗根肿病基因位点PbBa8.1特异分子标记的引物对命名为F A08-300/R A08-300，具有如下核苷酸序列：

A08-300：

F A08-300:5’-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3’

R A08-300:5’-CACAATGGAGTGTTGAAATTCACT-3’。

利用上述引物，在待测植株中能扩增出132bp条带的，即为含有PbBa8.1位点的抗根肿病甘蓝型油菜植株。

实施例2：

与抗根肿病基因PbBa8.1紧密连锁的分子标记A08-300在辅助选择甘蓝型油菜抗根肿病单株中的应用，应用过程包括：

利用实施例1制备的BC3F2群体中随机选取了35个抗病单株和27个感病单株，然后利用两对SSR引物cun_m090a、sau_um353a和Indel标记A08-300对它们进行了基因型鉴定。

利用本发明提供的引物F A08-300/R A08-300的鉴定过程包括：

一、基因组DNA的提取

1.在1.5ml离心管中加入498uL 1×CTAB提取液(2％CTAB，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，)以及2uLβ-巯基乙醇，摇匀；

2.取0.2g幼嫩叶片，在液氮条件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-巯基乙醇的离心管中，摇匀；

3.随后将离心管放入65℃水浴中，每隔5分钟摇一次，水浴30min；

4.取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇混合物(24:1)，摇晃10min后，常温下12000r/min离心10min；

5.将上清液转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),摇晃10min后，常温下12000r/min离心10min；

6.将上清液移至另一离心管当中，加入2倍体积事先预冷的无水乙醇，混匀后，将抱团的DNA挑入到装有400uL TE缓冲液的离心管中溶解；

7.加入1.5uL RNaseA(10ug/uL),混匀后37℃保存30min；

8.重复步骤5；

9.将上清液转移到另一离心管中，向离心管中加入50uL 3mol/L NaAC溶液和预冷的等体积的异丙醇，-20℃沉淀20min；4℃条件下12000r/m离心10min，弃掉上清液，加入75％的乙醇清洗2次；

10.在超净工作台上风干DNA，加入50μL TE(Tris-EDTA)溶解DNA，-20℃冰箱中保存。

二、PCR扩增:

a.反应体系：20μL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA；5pmol·L^- ¹primer；1.0mmol·L^-1dNTP；1.0uL 10×PCR Buffer；0.5U Taq DNA polymerase；ddH₂O补齐20μL，混匀，离心；

b.扩增程序：预变性94℃/5min；94℃/30s；55℃/30s；72℃/1mins；35个循环后；72℃延伸10min；最后4℃保存；

c.电泳：将PCR扩增产物与等体积的上样缓冲液混合(98％formamide，10mM EDTA，0.001％xylene cyanol和bromphenol blue)。94℃变性6min，之后在DNA测序电泳仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶(6％)电泳70W条件下40min，电泳结束后进行银染显影。

三、结果分析：

在使用A08-300的引物F A08-300/R A08-300的扩增结果带有132bp条带的单株是含有抗根肿病位点PbBa8.1的材料(图2)。

鉴定结果为表1、图2所示。根据表1的结果可以确PbBa8.1位点位于cum_m090a、sau_um353a引物之间，并且与A08-300连锁更加紧密。本发明开发的分子标记引物能更为准确的筛选抗根肿病甘蓝型油菜。

表1

注：A是华双5号基因型；H是杂合基因型；B是ECD04基因型；R是抗病单株；S是感病单株

实施例3：

与抗根肿病基因PbBa8.1紧密连锁的分子标记A08-300引物在甘蓝型油菜抗根肿病单株辅助性选择中的应用：

利用本发明提供的抗病分子标记引物，对实施例1中ZHE-226的BC3单株所衍生的BC3F2代植株进行基因型分析及农艺性状选测，获得了含纯合抗病位点(即利用引物F A08-300/R A08-300能扩增出132bp条带的单株)、生育期比较一致、农艺性状表现比较好的单株200个，通过自交获得了BC3F3混合群体。

2015年5月在湖北恩施巴东的根肿病病区再次进行田间抗病性鉴定，并于播种后45天进行田间表型调查。从田间整体效果来看，与我们转育的抗病新品系相比而言，对照品种华双5号成活的植株数明显减少(说明前期有部分植株已经死亡)，同时长势也比较差(图3)。继续随机调查根部受害情况时发现，对照组中有47株发病等级为4级，13株发病等级为0级。而抗病新品系中有196株发病等级为0，仅有4株发病且发病等级较低仅为2级。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用

<130> 一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 478

<212> DNA

<213> 芜菁

<400> 1

aattttgata ttttaaaaac aaattttatt aatataataa atatgcttga ataattgagt 60

gaggataaat atcaagtgaa atttgccgaa ccatgaaagt aaagcattta aatcttatcc 120

agattaaaaa aaaatcaagt aaatgttttt ggccaaccac cgagcgacac gtggtagtgc 180

gggccacaaa attttttttc aggtgttgaa attttccaac gatgccatgt agacaaacac 240

atttttacaa catcctcact gcaaagattt aaactgttga aagtgaattt caacactcca 300

ttgtgagtgg tctaacagaa taaatgtctt gtgccaatcc aagtttgttc tatgcagttc 360

tcaaaataca tatatgtgta tgtatatatt aagattagta tttgattgta aatatctcaa 420

aattacgaaa actttaaccc aacatatctt aaataaggat attttggact gaatttca 478

<210> 2

<211> 486

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 2

aattttgata ttttaaaaac aaattttatt aatataataa atgtgtttga ataattgagt 60

gaggataaat atcaagtgaa atctgccgaa ccaatgaaaa taaagcattt aagtcttatc 120

cagatttaaa aaaaatcaag taaatgtttt tggccaacca cagagcgaca cgtggtagtg 180

cgggccacaa aatttttttt cagctgttga aatttttcaa cgcctgttgc taccatgtag 240

acaaacatat ttttacaaca tcctcactac aaagatttaa actgttgaaa gtgaatttca 300

acactccatt gtgagtggtc taacagaata aatgtcttgt gccaatccag gtttgttcta 360

tgcagttctc aaaatacata tatgtgtatg tatatattaa gattagtatt tgattgtaaa 420

tatcttgaaa ttacgaaaaa tttaacccaa cataccctaa ataaggatat tttggactga 480

atttca 486

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtagtgcggg ccacaaaat 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cacaatggag tgttgaaatt cact 24

Claims

1.芜菁抗根肿病基因位点PbBa8.1紧密连锁的分子标记A08-300的侧翼序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.扩增权利要求1所述序列的引物：F A08-300:5’-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3’；R A08-300:5’-CACAATGGAGTGTTGAAATTCACT-3’。

3.权利要求1所述的侧翼序列或权利要求2所述的引物在甘蓝型油菜抗根肿病育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的甘蓝型油菜的父本为芜菁ECD04，母本为华双5号。