CN112011637A - 一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记，所述分子标记为Xdw15；所述分子标记Xdw15的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；以所述分子标记Xdw15的标记引物对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，电泳分离，获得对应的扩增产物分子量为100bp，即为与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记。本发明开发的与基因Pm68紧密连锁的分子标记Xdw15，不仅可用于基因Pm68的精细定位与图位克隆，而且用于基因Pm68的标记辅助选择育种，大大提高转育基因Pm68的效率和精度，加速基因Pm68在不同遗传背景抗白粉病小麦新品种的培育，不仅能够缩短育种年限，而且能够消除连锁累赘，实现目标基因的有效转移和聚合，有效提高抗白粉病小麦新品种选育的效率。

Description

一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
小麦白粉病是小麦最严重的三大病害之一，一般可造成10-15%的产量损失以及一定程度上品质的下降，严重时减产可达50%以上（Ma et al. Characterization of apowdery mildew resistance gene in wheat breeding line 10V-2 and itsapplication in marker-assisted selection. Plant Disease. 2018, 102:925–931）。为防控小麦白粉病，一般采取田间农业措施、喷施化学药剂和种植抗病品种。在这些防控措施中，种植抗病品种无疑是最为经济、有效和环保的策略（Petersen et al. Mapping ofpowdery mildew resistance gene Pm53 introgressed from Aegilops speltoidesinto soft red winter wheat. Theoretical and Applied Genetics. 2015, 128:303-312）。迄今，已在63个位点发现了90多个正式命名的小麦抗白粉病基因/等位基因，源于普通小麦、小麦近缘种及祖先种等不同的小麦种质资源（Li et al. A spontaneous wheat-Aegilops longissima translocation carrying Pm66 confers resistance to powderymildew. Theoretical and Applied Genetics, 2020, 133:1149–1159）。但是，我国小麦品种中的白粉病抗性不容乐观，抗病小麦品种中抗白粉病基因多为小种特异性抗性，较易随着病原菌群的演化而丧失抗性，而且很多抗病基因由于品种-菌群的互作逐渐丧失了对白粉病的抗性，因此，行业内亟需发掘更多抗白粉病基因应用于抗病育种。
在过去几十年中，小麦遗传育种取得了重要成就，但品种间的杂交也使得我国小麦品种的异质性越来越高，从普通小麦中发掘新的广谱抗病基因越来越困难。因此，从小麦近缘种及祖先种等资源中发掘广谱抗白粉病基因，用于小麦抗白粉病育种显得尤为关键。在小麦近缘种中，硬粒小麦是一种重要的种质资源，携带了的很多优秀抗病基因，可用于小麦抗病育种。小麦传统育种在过去几十年中，取得了瞩目成就。然而，传统育种往往具有一定的盲目性，无法保持稳定的增长。利用分子育种则可以在较少的回交代数中去除不利基因，加速育种进程（Chhetri et al. Development of robust molecular markers formarker-assisted selection of leaf rust resistance gene Lr23 in common anddurum wheat breeding programs. Molecular Breeding. 2017, 37: 21）。尤其近年来，随着高通量、自动化测序技术的发展，小麦高通量SNP（Single nucleotide polymorphism）芯片、SLAF-seq（Specific-locus amplified fragment sequencing）和BSR-Seq（Bulkedsegregant RNA-seq）等开始应用于小麦饱和遗传图谱的构建，大大促进了抗病分子育种的进程（Semagn et al. Single nucleotide polymorphism genotyping usingkompetitive allele specific PCR (KASP): overview of the technology and itsapplication in crop improvement. Molecular Breeding. 2016, 33:1-14）。
本实验室收集的一个硬粒小麦TRI 1796经实验室苗期抗白粉病遗传分析及分子标记检测表明，TRI 1796苗期对不同毒性小麦白粉菌具有广谱抗性，遗传分析及分子定位表明，TRI 1796的白粉病抗性由一个显性抗白粉病基因控制，该基因不同于已发掘的其他抗白粉病基因，被正式命名为Pm68，但该基因尚未有报道紧密连锁的分子标记，尤其是具有广适性的育种可用标记。因此，若能开发该基因新的紧密连锁的分子标记，进而应用于高效、准确的检测和追踪抗白粉病基因，这对实现其育种具有非常重要的价值和意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用，以利用该分子标记对小麦抗白粉病基因Pm68进行定位和检测，在小麦选育中对其亲本进行有目的地选择，进而选育出在抗白粉病方面表现优异的小麦品种或品系，为选育抗白粉病类型的小麦新品种提供了指导依据。
本发明是通过以下方法实现的：一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记，该分子标记为是共显性SSR标记Xdw15；
所述分子标记Xdw15的上游引物为Xdw15-F，其核苷酸序列如下所示：
Xdw15-F：5' - 3'：GCTAATTACTACTCTCTTCGTTCCGA；
所述分子标记Xdw15的下游引物为Xdw15-R，其核苷酸序列如下所示；
Xdw15-R：5' - 3'：GAATATGACCCAACAAATATCCGACA；
以所述分子标记Xdw15的上、下游引物对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，电泳、检测，获得对应的扩增产物的分子量为100bp，即为与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记。
所述PCR扩增的体系为25μL，包括：30-50 ng/μL小麦基因组DNA 2.5 μL，10×PCRbuffer 2.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10 mM MgCl2 6.75μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2 μM上游引物1.0μL，2μM下游引物1.0 μL，无菌去离子水10.55μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，延伸60秒，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
所述电泳指在质量体积比在8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 29/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，180 V恒压下电泳1.0-1.5h，硝酸银染色后拍照。
本发明所述的任意一项所述的与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记在小麦抗白粉病基因Pm68的定位、图位克隆、检测和分子标记辅助选择育种中的应用。
所述的应用中检测待测品种中是否携带小麦抗白粉病基因Pm68主要包括以下步骤：
（1）从待测小麦样品的新鲜叶片提取基因组DNA；
（2）利用分子标记Xdw15的标记引物对所述小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
（3）对扩增产物进行电泳、检测，若能扩增出100 bp的特异条带，说明待测小麦中携带抗白粉病基因Pm68；否则，待测小麦中不携带小麦抗白粉病基因Pm68。
步骤（2）所述分子标记Xdw15的标记引物包括上游引物Xdw15-F和下游引物Xdw15-R，所述上游引物Xdw15-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物Xdw15-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述PCR扩增的体系为25 μL，包含30-50 ng/μL小麦基因组DNA 2.5 μL，10×PCRbuffer 2.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10 mM MgCl2 6.75μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2 μM上游引物1.0μL，2μM下游引物1.0 μL，无菌去离子水10.55μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，延伸60秒，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
步骤（3）所述的对扩增产物进行电泳、检测是指在质量体积比8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/ bisacrylamide = 29/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，180 V恒压下电泳1.0-1.5h，硝酸银染色后拍照。
本发明通过实验室苗期抗白粉病遗传分析及分子标记检测表明，硬粒小麦TRI1796苗期对不同毒性小麦白粉菌的抗性由单个显性基因控制，命名为Pm68，再利用Bulkedsegregant RNA-Seq（BSR-seq）对TRI 1796、感病硬粒小麦PI 584832以及TRI 1796×PI584832的F2群体中60个纯合抗病和60个纯合感病家系组成的抗病池和感病池进行BSR-Seq测序，通过全基因组范围内差异SNP分析，发现只在2B染色体16.2 -24.8 Mb物理区间内存在明显富集峰，进一步根据该区间抗感亲本及抗池间均存在Indel，利用primer5.0软件设计并筛选了分子标记Xdw15的上游引物Xdw15-F和下游引物Xdw15-R，经过遗传分离群体检测，分子标记Xdw15与基因Pm68的遗传距离仅为0.44cM，与Pm68紧密连锁。本发明提供的分子标记Xdw15不仅可以高效、准确地检测基因Pm68的遗传作图大群体，应用于基因Pm68的精细定位和图位克隆，还可利用该标记进行基因Pm68的分子标记辅助选择育种，无连锁累赘，减少回交代数，使得利用该分子标记对基因Pm68进行的高效分子育种更具实践意义。
附图说明
图1为基因Pm68在2B染色体上的分子标记定位图。左侧为遗传距离，单位为cM，右侧为分子标记，箭头所指分子标记即为所述的分子标记Xdw15。
图2为分子标记Xdw15检测TRI 1796、PI 584832及其杂交后代分离群体的结果。
图中：M：DL2000 DNA marker；1-15：TRI 1796×PI 584832的F2:3家系，其中，1-5：纯合抗病的F2:3家系，6-10：抗感分离的F2:3家系，11-15：纯合感病的F2:3家系；16：TRI 1796（携带Pm68）；17：PI 584832（感白粉病硬粒小麦）；黑色箭头为能追踪Pm68的特异性条带。
图3为分子标记Xdw15通过PCR扩增检测部分感病主栽品种育种可用性的结果。
图中：M：DNA marker pUC19 Msp I；1：TRI 1796（携带Pm68）；2-16：感病主栽品种，其中2：烟农187；3：山农1538；4：山农202；5：周麦27；6：中育1311；7：烟农1212；8：济麦229；9：FC009；10：中育9398；11：涡麦8号；12：邯麦13；13：岱麦2173；14：武农6号；15：良星619；16：泰麦1918；黑色箭头为能追踪Pm68的特异性条带。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1 小麦抗白粉病基因Pm68的分子标记Xdw15的开发
1、 材料
TRI 1796和PI 584832由德国莱布尼兹植物遗传与作物研究所的Genebank系统提供，本实验室保存。TRI 1796和PI 584832杂交，所得F1自交，获得F2群体及对应的F2:3家系。
2、小麦基因组DNA的提取
小麦基因组DNA提取采用酚/氯仿法，流程如下：
(1) 取新鲜小麦叶片，液氮研磨粉碎，取约0.5g置于2mL离心管中；
(2) 加入600 μL DNA提取液 (100 mM Tris, 50mM EDTA, 500 mM NaCl, 1.8% SDS,pH = 8.0)，65℃水浴40-60 min，每隔10 min混匀一次；
(3) 加入500-600 μL氯仿-异戊醇 (24:1, v/v)，置于摇床上轻摇15 min；
(4) 12000 rpm 离心15 min，取上清，加3倍体积的预冷无水乙醇混匀，置于-20 ºC冰箱中沉淀60 min；
(5) 取絮状DNA沉淀，用75%预冷乙醇洗涤2-3遍；
(6) 将洗涤好的DNA沉淀置于新的1.5 mL离心管中，室内自然风干；
(7) 加入60 μL TE缓冲液 (100 mM Tris-Hcl，10 mM的EDTA，pH = 8.0) 将DNA沉淀溶解，制成DNA储存液；
(8) 将DNA储存液用超纯水稀释成10-30 ng/μL作为工作液备用。
3、苗期白粉病抗性鉴定及遗传分析
小麦白粉病抗性鉴定在温度、湿度和光照可控的自动化玻璃温室中完成。将TRI 1796、PI 584832、TRI 1796×PI 584832的F1杂交种、F2群体和F2:3家系种植于128穴的穴盘(2×2cm)中，亲本TRI 1796和PI 584832各播种2个穴，每穴5粒种子。TRI 1796×PI 584832的F1杂交种播种4个穴，每穴5粒种子。F2群体播种224粒，每穴5粒种子，F2群体对应的F2:3家系，每个家系播种4个穴，每个穴播种5粒种子，感病对照铭贤169随机分布。发苗期间条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度30-40%。长至一叶期时，接种白粉病菌株E09，接种后第一个24h条件控制为：黑暗，温度18-22℃，相对湿度80-90%，之后条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度80-90%。当感病对照铭贤169第一片叶子充分发病后按单株调查白粉病反应型。反应型按0-4级标准记载，抗病等级为0-2级，感病等级为3-4级。结果显示，10株抗病亲本TRI 1796均为抗病，10株感病亲本均为感病，20株F1杂交种均为抗病，说明TRI 1796中的白粉病抗性受显性基因控制，所鉴定的F2群体抗感分离比为166:58，卡方检验符合单显性基因的分离比例3:1（χ2 = 0.10, P= 0.76），对应的F2:3家系纯合抗病家系、抗感分离家系和纯合感病家系数分别为56、110和58，卡方检验符合单显性基因的分离比例1:2:1（χ2 = 0.19, P = 0.91），进一步证实TRI 1796的白粉病抗性由单个显性基因控制，该基因已被命名为Pm68。此外，根据抗谱分析表明，苗期对22个具有不同毒性小麦白粉病菌株均表现抗性，具有广谱抗性。因此，Pm68对小麦抗白粉病遗传育种具有重要意义。Pm68通过杂交导入到主栽品种后，如何高效、准确的检测和追踪抗白粉病基因Pm68对实现其育种价值极为重要。
4、BSR-Seq分析
根据上述抗性鉴定结果，在F2群体中分别选取60株抗病和60株感病单株构建抗病池和感病池进行BSR-Seq。
5、与Pm68紧密连锁分子标记的开发
对BSR-Seq差异SNP进行分析，发现全基因组只有在2B染色体上16.2 -24.8 Mb物理区间内存在明显富集峰，进一步根据该区间抗感亲本及抗池间均存在Indel，利用primer5.0软件设计了分子标记Xdw15，通过检测TRI 1796×PI 584832的F2:3家系的连锁分析发现，该标记与Pm68紧密连锁，其连锁图如图1所示，遗传距离仅为0.44cM。
其分子标记Xdw15的引物包括一条上游引物和一条下游引物：
上游引物序列：Xdw15-F：GCTAATTACTACTCTCTTCGTTCCGA；
下游引物序列：Xdw15-R：GAATATGACCCAACAAATATCCGACA。
PCR扩增的体系为20μL，体系各成分分别为：30-50 ng/μL小麦基因组DNA 2.5 μL，10×PCR buffer 2.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10 mM MgCl2 6.75μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2μM上游引物1.0μL，2μM下游引物1.0 μL，无菌去离子水10.55μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，延伸60秒，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR扩增产物检测程序为：在质量体积比为8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 29/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，180 V恒压下电泳1.0-1.5h，硝酸银染色后拍照。显示扩增产物分子量为100bp和128bp片段分别为与抗病和感病表型连锁的特异片段；扩增产物分子量为100bp为与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记。
实施例2 小麦抗白粉病基因Pm68的分子标记Xdw15的检测分离群体单株应用
利用小麦抗白粉病基因Pm68的分子标记Xdw15检测TRI 1796、PI 584832以及TRI 1796与PI 584832杂交形成的F2:3家系中的材料。
待测样品：TRI 1796、PI 584832以及TRI 1796与PI 584832杂交形成的15个F2:3家系（包含5个纯抗家系，5个抗感分离家系，5个纯感家系）。
提取上述材料的DNA为模板，利用本发明开发的分子标记Xdw15的引物进行扩增：
上游引物序列：
Xdw15-F：GCTAATTACTACTCTCTTCGTTCCGA；
下游引物序列：
Xdw15-R：GAATATGACCCAACAAATATCCGACA。
PCR扩增的体系为25μL，体系各成分及浓度分别为：30-50 ng/μL小麦基因组DNA2.5 μL，10×PCR buffer 2.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10 mM MgCl2 6.75μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2 μM上游引物1.0μL，2μM下游引物1.0 μL，无菌去离子水10.55μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，延伸60秒，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR扩增产物检测是指用质量体积比8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 29/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，180 V恒压下电泳1.0-1.5h，硝酸银染色后拍照。
分子标记检测结果见图2。图中显示抗病亲本TRI 1796中可以扩增出与抗病表型连锁的100bp的特异条带，感病亲本PI 584832可以扩增出与感病表型连锁的128bp的特异条带，TRI 1796与PI 584832杂交形成的F2:3家系中，5个纯抗家系（1-5泳道）可以扩增出与抗病表型连锁的100 bp的特异条带，5个抗感分离家系（6-10泳道）可以同时扩增出与抗病表型连锁的100 bp的特异条带和与感病表型连锁的128bp的特异条带，5个纯感家系（11-15泳道）可以扩增出与感病表型连锁的128 bp的特异条带。16和17泳道分别为抗病亲本TRI1796和感病亲本PI 584832，M为DNA marker pUC19 Msp I，黑色箭头为能追踪基因Pm68的特异性条带。
实施例3 小麦抗白粉病基因Pm68的分子标记Xdw15检测品种中是否携带目的基因的应用
利用小麦抗白粉病基因Pm68的分子标记Xdw15检测现有品种中是否含有抗白粉病基因Pm68。
待测样品包括携带Pm68的TRI 1796以及15个小麦材料。15个小麦材料分别为：烟农187、山农1538、山农202、周麦27、中育1311、烟农1212、济麦229、FC009、中育9398、涡麦8号、邯麦13、岱麦2173、武农6号、良星619、泰麦1918。
提取待测材料的DNA为模板，利用本发明开发的分子标记Xdw15的引物进行扩增：
上游引物序列：
Xdw15-F：GCTAATTACTACTCTCTTCGTTCCGA；
下游引物序列：
Xdw15-R：GAATATGACCCAACAAATATCCGACA。
PCR扩增的体系为25μL，体系各成分及浓度分别为：30-50 ng/μL小麦基因组DNA2.5 μL，10×PCR buffer 2.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10 mM MgCl2 6.75μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2 μM上游引物1.0μL，2μM下游引物1.0 μL，无菌去离子水10.55μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，延伸60秒，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR扩增产物检测用质量体积比为8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 29/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，180 V恒压下电泳1.0-1.5h，硝酸银染色后拍照。
其扩增产物电泳后的图谱如图3所示。分子标记检测结果显示，携带Pm68的TRI1796（第1泳道）可以扩增出与抗病表型连锁的100 bp的特异条带，15个小麦材料（第2-16泳道）均扩增出与感病表型连锁的128 bp的特异条带。这与经本实验室前期抗白粉病鉴定15个感病小麦材料对小麦白粉病菌株E09表现感病是相一致的。
将Pm68基因导入到感病小麦主栽品种中，利用本发明开发的与Pm68紧密连锁的分子标记Xdw15，可高效、准确地检测育种大群体，大大提高转移抗病基因Pm68基因的效率和精度，加快Pm68基因不同遗传背景抗白粉病小麦新品种的培育，不仅能够缩短育种年限，而且能够消除连锁累赘，实现目标基因的有效转移和聚合，有效提高小麦育种的效率。
基因Pm68是本实验室从一个硬粒小麦中发掘的广谱抗白粉病基因，目前该基因尚未见被精细定位和图位克隆的报道。通过构建遗传作图大群体、精细定位并图位克隆Pm68基因，对基因Pm68抗病机制的深入解析具有重要意义。利用本发明开发的与基因Pm68紧密连锁的分子标记Xdw15，可以高效、准确地检测基因Pm68的遗传作图大群体和育种群体，应用于基因Pm68的精细定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种，具有理论和实践研究的双重意义。
上述实施例为本发明优化的实施方案，仅用于说明本发明而非限制本发明。本领域的技术人员在不脱离本发明实施方案的宗旨和原理的基础上所作的修改或等同替换，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 烟台大学
<120> 一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Xdw15-F
<400> 1
gctaattact actctcttcg ttccga 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Xdw15-R
<400> 2
gaatatgacc caacaaatat ccgaca 26

Claims (9)

1.一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记，其特征在于，该分子标记为Xdw15；所述分子标记Xdw15的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述分子标记Xdw15的下游引物核苷酸序列如SEQ ID N:2所示；以所述分子标记Xdw15的上、下游引物对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，电泳分离，获得对应的扩增产物分子量为100bp，即为与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记。
2.根据权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述PCR扩增的体系为25μL，包括：30-50 ng/μL小麦基因组DNA 2.5 μL，10×PCR buffer2.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10 mM MgCl2 6.75μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2 μM上游引物1.0μL，2μM下游引物1.0 μL，无菌去离子水10.55μL。
3.根据权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，延伸60秒，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
4.根据权利要求1、2或3所述的与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述电泳指在质量体积比为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上180 V恒压下电泳1.0-1.5h。
5.一种权利要求1-3所述的任意一项所述的与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记在小麦抗白粉病基因Pm68的定位、图位克隆、检测和分子标记辅助选择育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测待测品种中是否携带小麦抗白粉病基因Pm68主要包括以下步骤：
（1）从待测小麦样品的新鲜叶片提取基因组DNA；
（2）利用分子标记Xdw15的标记引物对所述小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
（3）对扩增产物进行电泳、检测，若能扩增出100 bp的特异条带，说明待测小麦携带抗白粉病基因Pm68；否则，待测小麦中不携带小麦抗白粉病基因Pm68。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述分子标记Xdw15的标记引物包括上游引物Xdw15-F和下游引物Xdw15-R，所述上游引物Xdw15-F的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述下游引物Xdw15-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增的体系为25μL，包括：30-50 ng/μL小麦基因组DNA 2.5 μL，10×PCR buffer 2.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10 mMMgCl2 6.75μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2 μM上游引物1.0μL，2μM下游引物1.0 μL，无菌去离子水10.55μL。
9.根据权利要求6、7和8所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，延伸60秒，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117757983A (zh) * 2024-02-22 2024-03-26 山东省烟台市农业科学研究院(山东省农业科学院烟台市分院) 与硬粒小麦抗白粉病基因PmYD001共分离的分子标记的引物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119279A (zh) * 2007-04-18 2016-11-16 波夫曼斯种植公司 对于热胁迫具有增强的耐受力的植物
CN110512025A (zh) * 2019-09-29 2019-11-29 烟台大学 一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119279A (zh) * 2007-04-18 2016-11-16 波夫曼斯种植公司 对于热胁迫具有增强的耐受力的植物
CN110512025A (zh) * 2019-09-29 2019-11-29 烟台大学 一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117757983A (zh) * 2024-02-22 2024-03-26 山东省烟台市农业科学研究院(山东省农业科学院烟台市分院) 与硬粒小麦抗白粉病基因PmYD001共分离的分子标记的引物及其应用
CN117757983B (zh) * 2024-02-22 2024-04-19 山东省烟台市农业科学研究院(山东省农业科学院烟台市分院) 与硬粒小麦抗白粉病基因PmYD001共分离的分子标记的引物及其应用

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