CN106498068B - 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用 - Google Patents

一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106498068B
CN106498068B CN201610994749.1A CN201610994749A CN106498068B CN 106498068 B CN106498068 B CN 106498068B CN 201610994749 A CN201610994749 A CN 201610994749A CN 106498068 B CN106498068 B CN 106498068B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tobacco
seq
tmv
resistance gene
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610994749.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106498068A (zh
Inventor
童治军
焦芳婵
肖炳光
陈学军
李梅云
吴兴富
李永平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Original Assignee
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences filed Critical Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority to CN201610994749.1A priority Critical patent/CN106498068B/zh
Publication of CN106498068A publication Critical patent/CN106498068A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106498068B publication Critical patent/CN106498068B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用，所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508‑007和TM508‑118，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。所述的应用为所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。本发明所述的共显性SSR标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草TMV病抗病育种中N基因分子标记辅助选择的应用。

Description

一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。
背景技术
烟草花叶病是由烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus, TMV）引起的，它是第一个被鉴定的单链正义病毒（Beijerinck MW, Uebereincontagiumvivumfluidumalsursachederfleckenkrankheit der tabaksblatter.VerhKonAkadWetensch, 1898, 5: 3-21），属于花叶病毒家族（Dawson WOand Lehto KM, Regulation of tobamovirus geneexpression, Adv. Virus. Res., 1990, 8: 307-342），具有传染活性（Erickson FL,Holzberg S,Calderon-Urrea A,Handley V,Axtell M,Corr C,and Baker B, Thehelicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defenseresponse in tobacco. Plant J., 1999,18: 67-75）。因其宿主主要为包括烟草在内的茄科作物，严重影响烟叶的产量和品质，因此，对烟草产业造成巨大经济损失。因此，选育抗病品种、提高烟草本身的抗病性是防治TMV的根本途径。
N基因起源于烟草野生种粘毛烟草（Nicotianaglutinosa），是一个显性单基因（Gerstel DU, Inheritance in Nicotianatabacum.XIX. Identification of thetabacum chromosome replaced by one from N. glutinosa in mosaic-resistantholmessamsoun tobacco, Genetics, 1945, 30: 448-454），属于TIR-NBS-LRR类抗病基因，介导烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus, TMV）的抗性，通过转座子标签法得到克隆（Whitham S, Dinesh-Kumar S P, Choi D, HehlR,Corr C and Baker B, The productof the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and theInterleukin-1 Receptor, Cell , 1994, 78:1101-1115）。N基因很容易进入育种程序且能够很快在选育品种中稳定下来，仅仅导入N基因就可使烟草具有TMV抗性（Ternovsky MF, Methods of breeding tobacco varieties resistant to tobacco mosaic andpowdery mildew, The A.I. Mikoyan pan Soviet Sci. Res. Inst. Tob. & IndianTob.Ind. Krasnodar Publ, 1945, 143: 126-141），因此，通过选择具有N基因的育种材料可选出有抗性的基因型（Wernsman EA, Sources of resistance to virus diseases,Coresta Inf. Bull., 1992, 3: 113-119）。基于烟草普通花叶病抗性基因N的基因组序列，国内外的研究者成功的开发出多个用于检测烟草TMV抗性的分子标记（Lewis R S,Milla S R, and Levin J S, Molecular and genetic characterization ofNicotianaglutinosa L. chromosome segments in tobacco mosaic virus resistanttobacco accessions, Crop Sci., 2005, 45（6）: 2355-2362；袁清华, 陈俊标, 李淑玲,马柱文, 邱道寿, 张振臣,抗TMV烟草种质资源的N基因片段序列研究, 广东农业科学,2011, 1（29）: 96-99；陈爽, 朴世领, 金爱兰,烟草抗TMVN基因及其在分子标记辅助育种中的应用, 延边大学农学学报, 2012, 34（4）: 355-361；张玉, 罗成刚, 殷英, 胡小波,戴培刚, 张波,烟草N基因及其在烤烟遗传育种中的应用, 中国农学通报, 2013, 29（19）:89-92），同时建立了相应的检测体系（刘磊, 郭兆奎, 万秀清, 颜培强, 乔婵, 刘丹, N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用, 分子植物育种, 2010, 8（1）:167-171），并将其中的部分检测标记及方法申请了专利（CN101892304B；CN102140546B；CN103866038B）。但上述所有基于N基因开发的分子标记均是显性标记，其在实际的烟草育种实践中存在着严重的缺陷：1）不能区分材料中N基因的全部基因型，也即上述显性标记只能分辨出材料中是否含有抗性基因N，而无法进一步的区分出纯合抗性（NN）和杂合抗性（Nn）；2）无法确保其检测结果的准确性，即利用上述的显性标记在进行N基因检测时，若无特征（目的）条带出现时，并不能确定检测材料是感病的，极有可能存在实验因素造成的PCR扩增失败；3）检测体系繁琐，有部分标记是基于N基因的全长cDNA进行设计的，因而在实际检测中涉及到RNA的提取、cDNA的合成及长片段DNA的PCR扩增等过程。鉴于此，开发一种能解决上述问题的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记；第二目的在于提供所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。
为了简便、高效选择抗TMV病烟草品种，有针对性的、特异性的选择含N基因的后代材料，本发明提供一种用于检测烟草抗TMV病基因N的分子标记TM508-007和TM508-118，该分子标记采用分离群体分组分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，筛选获得与烟草普通花叶病（TMV）N基因连锁的共显性SSR标记，可以用于烟草TMV抗性基因N的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及抗病品种选育的效率。
本发明利用Coker176（抗病亲本，其TMV抗性由N基因控制）和Y3（综合性状优良但易感TMV）构建回交一代（BC1F1）作图群体，采用分离群体分组分析（Bulked SegregationAnalysis, BSA）法，筛选与烟草普通花叶病（TMV）N基因连锁的共显性SSR标记，加速分子标记辅助选择（Marker Assistant Selection，MAS）在烟草TMV抗性品种选育中的利用。
本发明所述的共显性SSR标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草TMV病抗病育种中N基因分子标记辅助选择的应用。
附图说明
图1 是与烟草TMV抗性基因N连锁的共显性SSR标记在5份材料中的PCR扩增产物凝胶电泳图；
其中，A，共显性SSR标记TM508-007；B，共显性SSR标记TM508-007；RB，抗病池；SB，感病池；RP，抗病亲本（Coker176）；SP，感病亲本（Y3）；F1，两亲本间的杂交子一代；M，500bpDNA ladder，长度片段分别为：100bp，150bp，200bp，300bp，400bp，500bp；
图2 是共显性SSR标记TM508-007在123个BC1F1单株中的PCR扩增产物凝胶电泳图；
其中，编号70（带黑色星星）为单交换单株；1-123为BC1F1单株编号；编号1-66，感病单株编号；编号67-123，抗病单株编号；RP，抗病亲本Coker176；SP，感病亲本Y3；F1，杂交子一代；
图3是共显性SSR标记TM508-118在123个BC1F1单株中的PCR扩增产物凝胶电泳图；
其中，编号69（带黑色星星）为单交换单株；1-123为BC1F1单株编号；编号1-66，感病单株编号；编号67-123，抗病单株编号；RP，抗病亲本Coker176；SP，感病亲本Y3；F1，杂交子一代；
图4是共显性SSR标记T508-007和TM508-118分别与烟草TMV抗性基因N的连锁关系；
其中，左侧为标记（基因）名称；右侧为标记与N基因间的遗传距离（单位为：cM）。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
TM508-007序列为TM508-007F：5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’，
TM508-007R：5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’；
TM508-118序列为TM508-118F：5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’，
TM508-118R：5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。
本发明所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。
所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TM508-007序列的引物和TM508-118序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯和基因NN；如果PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为不含有烟草抗TMV病的纯和基因NN，而含有其感病的纯合等位基因nn；如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，同时含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn。
以TM508-007序列的引物进行PCR扩增的反应体系为：20uL，其中包含2.0μL的1×buffer（10mM Tris-Cl, PH=8.4, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2），200μM的 dNTPs（TakaraBiotechnology Co. Ltd., Dalian, China），0.5 μM 的上下游引物（Takara），1.0 U的rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐20uL，反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。
以TM508-118序列的引物进行PCR扩增的反应体系为：20uL，其中包含2.0μL 的1×buffer（10mM Tris-Cl, PH=8.4, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2），200μM 的 dNTPs（TakaraBiotechnology Co. Ltd., Dalian, China），0.5μM 的上下游引物（Takara），1.0 U的rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐20uL，反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
利用分离群体分组分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，筛选与烟草抗TMV基因N连锁的共显性SSR标记
一、实验材料
以综合性状优良但易感TMV的烤烟Y3为母本，以抗TMV烤烟材料Coker176（其抗性由N基因控制）为父本。2014年种植抗、感TMV亲本材料，经杂交，获得F1。2015年种植F1和两亲本，以Y3为轮回亲本，杂交获得回交一代（BC1F1）群体。2016年种植两亲本、F1和BC1F1世代材料。
二、亲本及BC1F1分离群体TMV抗性鉴定
试验材料成苗后移栽至大田，行株距为100cm × 50cm；移栽3周后进行人工接种。接种时将带TMV的病叶片磨碎后用水稀释至1%，采用高压喷枪接种病毒稀释液，喷射压力为1.5-2kg/cm2。
现蕾前开始调查病情，7天调查1次发病情况，取最后一次的调查数据进行以下分析，根据“TMV病害分级标准”进行分级。
0级：全株无病；
1级：心叶脉明或轻微花叶，植株无明显矮化；
3级：上部少于1/3叶片花叶但不变形，或植株矮化为正常株高的3/4以上；
5级：1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常株高的2/3-3/4；
7级：1/2-2/3叶片花叶，或变形或主脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2-2/3；
9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/3-1/2。
把0-1级定为抗病植株，3-9级定为感病植株。
三、SSR标记分析
在烟草幼苗长到4片叶左右时，采用改良的CTAB法（Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotianatabacum andconstruction of a genetic map of flue-cured tobacco. Plant Breeding, 2012,131: 674-680）提取所有参试材料的全基因组DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定提取后的DNA浓度和纯度。
SSR-PCR的体系配制、产物扩增及扩增产物的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（6%-non-PAGE）检测，参照童治军等（童治军等.普通烟草及其祖先种基因组SSR位点分析.中国农业科学, 2015, 48（11）: 2108-2117）提供的方法进行。SSR标记（引物）由两部分构成，共18764对，其中，PT系列引物5119对（Bindler, et al. A high density genetic map oftobacco （NicotianatabacumL.） obtained from large scale microsatellite markerdevelopment.Theor. Appl. Genet., 2011, 123（2）: 219-230），TM系列引物13645对（Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers inNicotianatabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco.Plant Breeding, 2012, 131: 674-680；Tong ZJ, et al. Large-scale development ofSSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-curedtobacco. Breeding Science, 2016, 66: 381-390）。
四、 抗、感病基因组池的构建
采用分离群体分组分析法（Bulked Segregation Analysis, BSA），选取BC1F1分离群体中的极端抗病（0级抗病）单株和极端感病（9级感病）单株各15株的基因组DNA，等量混合构建抗、感池，用于引物多态性筛选和标记连锁分析。
在苗期按实施例1所述方法，利用18764对SSR引物对抗病亲本Coker176、感病亲本Y3、两亲本间杂交子一代（F1）、抗病池和感病池共5份材料进行PCR扩增，筛选与烟草抗TMV基因N连锁的共显性SSR标记。筛选的结果如图1所示：共显性SSR标记TM508-007和TM508-118分别与烟草TMV抗性基因N连锁，标记TM508-007和TM508-118在感病池与感病亲本中的带型完全一致，仅出现一条220bp（序列如SEQ ID NO.3）和230bp（序列如SEQ ID NO.4）的特异性条带；在抗病池与F1中的带型完全一致，呈现出共显性的两条特异性条带（同时具有抗、感亲本的特异性条带，也即，同时呈现如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示序列及如SEQID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列）。其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列长度分别为228bp和190bp，分别是共显性SSR标记TM508-007和TM508-118在含有N基因的抗TMV品种中的特异性PCR扩增条带。
以上结果表明，标记TM508-007和TM508-118分别与烟草抗TMV基因N连锁，且该标记为共显性标记。PCR扩增产物中分别含有如ID NO.1（220bp）和SEQ ID NO.2（190bp）所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯合基因NN；PCR扩增产物中分别含有如ID NO.3（220bp）和SEQ ID NO.4（230bp）所示序列即含有其感病的纯合等位基因nn；PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3或同时含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列即含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn。
实施例2
共显性连锁标记的图距及其在BC1F1群体单株中的验证
一、数据分析
首先，按实施例1所述方法进行烟草基因组DNA提取、纯化，BC1F1群体单株TMV抗性鉴定和SSR标记分析。其次，利用通过BSA法筛选获得的标记TM508-007和TM508-118对BC1F1群体中的123个单株进行基因型分析。最后，对各个单株的带型进行数据统计，抗病杂合条带标记做“H”，感病条带标记做“A”，条带不清晰或者无扩增条带的记做“U”。
二、共显性连锁标记遗传距离的计算
利用JoinMap 4.0软件并结合BC1F1群体单株的TMV抗性鉴定数据，对共显性SSR标记在BC1F1分离群体中的基因型数据进行遗传连锁分析，计算出其连锁距离并绘制连锁图。
BC1F1群体单株TMV抗性鉴定的结果为：123个单株中，感病单株有66个，抗病单株有57个，其中，感病单株编号为1-66，抗病单株编号为67-123。
以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，对123株BC1F1单株基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果如图2所示：前66个单株（编号为1-66）仅含有长度为220bp的条带，其序列如SEQ ID NO.3所示，即该66个单株感TMV病，且基因型为nn；后57个单株（编号为67-123）中除一个单株（编号为70）外，其余56个单株中同时含有228bp和220bp两条带，其序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.3所示，即该56个单株中因含有如SEQ ID NO.1所示的序列（228bp）而抗TMV病，且基因型为Nn。
以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，对123株BC1F1单株基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果如图3所示：前66个单株（编号为1-66）仅含有长度为230bp的条带，其序列如SEQ ID NO.4所示，即该66个单株感TMV病，且基因型为nn；后57个单株（编号为67-123）中除一个单株（编号为69）外，其余56个单株中同时含有190bp和230bp两条带，其序列分别如SEQID NO.2和SEQ ID NO.4所示，即该56个单株中因含有如SEQ ID NO.2所示的序列（190bp）而抗TMV病，且基因型为Nn。
由上述两个共显性连锁标记对123个BC1F1单株的基因型分析可知：两个标记中均有1个单株（编号分别为70和69）则呈现出单交换，即抗性鉴定的结果为抗性单株，而基因型分析的结果却为感病（仅出现感病基因型的特异条带）。因此，利用Joinmap 4.0 作图软件计算可知，该两个共显性标记TM508-007和TM508-118与烟草TMV抗性基因N的紧密且位于N基因的两侧，其各自与N基因间的遗传距离均约为0.41 cM，如图4所示。
结论：利用上述两个共显性标记既可简便、快捷、稳定地检测烟草TMV抗性基因N存在，又可清晰地鉴定出抗TMV纯合基因型NN、抗TMV杂合基因型Nn及感TMV纯合基因型nn，也可有针对性的、特异性的选择含N基因的后代材料并大大提高选择抗TMV病烟草品种的效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
<130> 2016
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 228
<212> DNA
<213> TM508-007-1
<400> 1
caccatggtt tggctttcat atcctttgat ataaatgaca ccgaacgata gaagggtaaa 60
aacagaaatt acaaaacata tatatatata tatatatata tatatatatg aaatactaac 120
ataaatggtt tttacttctg gaagttctag aaagtgaaaa ttagttcaaa aaagaattgt 180
ttatactgca taagacagga tcagcgacat tgcctttttg cattttgc 228
<210> 2
<211> 190
<212> DNA
<213> TM508-118-1
<400> 2
accaacatgg ccaaacctta cttttcattg tttacataag aaatgtatat aaatatggaa 60
aaaagatcaa atttatcata aataaataaa taacgtctac tttagtaaat tatccacgtt 120
tatccctaat tctactatcg gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc 180
ttttcctcgc 190
<210> 3
<211> 220
<212> DNA
<213> TM508-007-2
<400> 3
caccatggtt tggctttcat atcctttgat ataaatgaca ccgaacgata gaagggtaaa 60
aacagaaatt acaaaacata tatatatata tatatatata tgaaatacta acataaatgg 120
tttttacttc tggaagttct agaaagtgaa aattagttca aaaaagaatt gtttatactg 180
cataagacag gatcagcgac attgcctttt tgcattttgc 220
<210> 4
<211> 230
<212> DNA
<213> TM508-118-2
<400> 4
accaacatgg ccaaacctta cttttcattg tttacataag aaatgtatat aaatatggaa 60
aaaagatcaa atttatcata aataaataaa taaataaata aataaataaa taaataaata 120
aataaataaa taacgtctac tttagtaaat tatccacgtt tatccctaat tctactatcg 180
gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc ttttcctcgc 230
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-007F
<400> 5
caccatggtt tggctttcat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-007R
<400> 6
gcaaaatgca aaaaggcaat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-118F
<400> 7
accaacatgg ccaaacctta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-118R
<400> 8
gcgaggaaaa gccagtaaaa 20

Claims (6)

1.一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记，其特征在于所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记，其特征在于TM508-007和TM508-118所对应的引物序列分别为：
TM508-007引物序列为TM508-007F：5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’，
TM508-007R：5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’；
TM508-118引物序列为TM508-118F：5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’，
TM508-118R：5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。
3.一种权利要求1或2所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用，其特征在于所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。
4.根据权利要求3所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用，其特征在于是分别以TM508-007的引物和TM508-118的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯和基因NN；PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为含有感病的纯合等位基因nn；PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.3所示序列，或同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列即为含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn；其中，TM508-007的引物序列为TM508-007F：5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’， TM508-007R：5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’；TM508-118的引物序列为TM508-118F：5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’，TM508-118R：5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。
5.根据权利要求4所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用，其特征在于以TM508-007的引物进行PCR扩增的反应体系为：20μL，其中包含2.0μL的1×buffer，1×buffer为10mM Tris-Cl、pH=8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，0.5μM上下游引物，1.0U rTaq聚合酶，20-50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐20μL，反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒、复性30s、72℃延伸30s共30个循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。
6.根据权利要求4所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用，其特征在于以TM508-118的引物进行PCR扩增的反应体系为：20μL，其中包含2.0μL的1×buffer，1×buffer为10mM Tris-Cl、pH=8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，0.5μM上下游引物，1.0 U rTaq聚合酶，20-50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐20μL，反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒、复性30s、72℃延伸30s共30个循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。
CN201610994749.1A 2016-11-11 2016-11-11 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用 Active CN106498068B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610994749.1A CN106498068B (zh) 2016-11-11 2016-11-11 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610994749.1A CN106498068B (zh) 2016-11-11 2016-11-11 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106498068A CN106498068A (zh) 2017-03-15
CN106498068B true CN106498068B (zh) 2020-02-07

Family

ID=58324380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610994749.1A Active CN106498068B (zh) 2016-11-11 2016-11-11 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106498068B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109355419B (zh) * 2018-11-20 2021-05-18 云南省烟草农业科学研究院 一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记及其应用
CN109439789B (zh) * 2018-11-20 2021-05-18 云南省烟草农业科学研究院 一组打破烟草tmv抗性基因n上游（5’端）连锁累赘的分子标记及其应用
CN109182594A (zh) * 2018-11-20 2019-01-11 云南省烟草农业科学研究院 一种与烟草红花色基因Rt紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
CN115873984A (zh) * 2022-11-22 2023-03-31 云南省烟草农业科学研究院 与烟草株高相关性状基因qPH和qIL，连锁SSR标记及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892304A (zh) * 2010-04-07 2010-11-24 云南省烟草农业科学研究院 分子标记检测n基因控制的烟草tmv抗性的方法
CN103333950A (zh) * 2013-05-14 2013-10-02 广州大学 一种开发烟草中具多态性ssr分子标记的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892304A (zh) * 2010-04-07 2010-11-24 云南省烟草农业科学研究院 分子标记检测n基因控制的烟草tmv抗性的方法
CN103333950A (zh) * 2013-05-14 2013-10-02 广州大学 一种开发烟草中具多态性ssr分子标记的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Large-scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-cured tobacco;Zhijun Tong等;《Breeding Science》;20160526;第66卷(第3期);381-390页 *
一个与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记;粟阳萌 等;《中国烟草学报》;20170323;第23卷(第2期);92-96页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106498068A (zh) 2017-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106868131B (zh) 陆地棉6号染色体与纤维强度相关的snp分子标记
CN107619881B (zh) 一种与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因Bs_t连锁的SSR标记及其应用
CN106498068B (zh) 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用
CN111197101A (zh) 一种与烟草多叶基因mLN紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
US20240093224A1 (en) Maize plants with improved disease resistance
CN110499389B (zh) 与烟草抗斑萎病位点rtsw紧密连锁的共显性标记引物、鉴别方法及其应用
US10982292B2 (en) Marker associated with anthracnose resistance in plant of the genus Fragaria and use thereof
CN110684858A (zh) 一种水稻细长粒型基因的分子标记及其应用
CN112795692B (zh) 与玉米株高连锁的分子标记及其应用
CN106755413B (zh) 水稻氮素吸收利用位点qNUE6及其分子标记方法
CN110551843B (zh) 可区分烟草抗斑萎病位点rtsw纯合杂合基因型的共显性标记引物、区分方法及其应用
CN110499390B (zh) 用于烟草抗斑萎病rtsw基因辅助选择的分子标记引物、辅助选择的方法及其应用
CN110468229B (zh) 水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1
CN105543366B (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi25基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用
CN109486992B (zh) 烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记及应用
CN107619875B (zh) 一种用于鉴定西瓜果实形状的插入缺失标记位点、引物及应用
CN114480709B (zh) 检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用
CN113913548B (zh) 与黄瓜白粉病抗病和感病主效基因共分离的InDel分子标记及其应用
CN113278723B (zh) 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用
CN107287210B (zh) 一种水稻外观品质基因qAQ7及其分子标记方法和应用
AU2020103450A4 (en) Molecular marker of Sogatella furcifera, Horváth resistance gene WBPH2 and application thereof
CN110499388B (zh) 鉴别烟草抗斑萎病位点rtsw等位基因类型的共显性标记引物组、鉴别方法及其应用
CN112011637B (zh) 一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用
CN104762299A (zh) 一种水稻苗期耐盐基因qST2及其分子标记方法
JP4437895B2 (ja) 小穂非脱落性遺伝子等についての新規遺伝マーカーおよびその利用法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant