CN106498068B - 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用 - Google Patents

一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用,所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508‑007和TM508‑118,其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。所述的应用为所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。本发明所述的共显性SSR标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点,因此该分子标记可以作为烟草TMV病抗病育种中N基因分子标记辅助选择的应用。

Description

一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。
背景技术
烟草花叶病是由烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV)引起的,它是第一个被鉴定的单链正义病毒(Beijerinck MW, Uebereincontagiumvivumfluidumalsursachederfleckenkrankheit der tabaksblatter.VerhKonAkadWetensch, 1898, 5: 3-21),属于花叶病毒家族(Dawson WOand Lehto KM, Regulation of tobamovirus geneexpression, Adv. Virus. Res., 1990, 8: 307-342),具有传染活性(Erickson FL,Holzberg S,Calderon-Urrea A,Handley V,Axtell M,Corr C,and Baker B, Thehelicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defenseresponse in tobacco. Plant J., 1999,18: 67-75)。因其宿主主要为包括烟草在内的茄科作物,严重影响烟叶的产量和品质,因此,对烟草产业造成巨大经济损失。因此,选育抗病品种、提高烟草本身的抗病性是防治TMV的根本途径。
N基因起源于烟草野生种粘毛烟草(Nicotianaglutinosa),是一个显性单基因(Gerstel DU, Inheritance in Nicotianatabacum.XIX. Identification of thetabacum chromosome replaced by one from N. glutinosa in mosaic-resistantholmessamsoun tobacco, Genetics, 1945, 30: 448-454),属于TIR-NBS-LRR类抗病基因,介导烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的抗性,通过转座子标签法得到克隆(Whitham S, Dinesh-Kumar S P, Choi D, HehlR,Corr C and Baker B, The productof the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and theInterleukin-1 Receptor, Cell , 1994, 78:1101-1115)。N基因很容易进入育种程序且能够很快在选育品种中稳定下来,仅仅导入N基因就可使烟草具有TMV抗性(Ternovsky MF, Methods of breeding tobacco varieties resistant to tobacco mosaic andpowdery mildew, The A.I. Mikoyan pan Soviet Sci. Res. Inst. Tob. & IndianTob.Ind. Krasnodar Publ, 1945, 143: 126-141),因此,通过选择具有N基因的育种材料可选出有抗性的基因型(Wernsman EA, Sources of resistance to virus diseases,Coresta Inf. Bull., 1992, 3: 113-119)。基于烟草普通花叶病抗性基因N的基因组序列,国内外的研究者成功的开发出多个用于检测烟草TMV抗性的分子标记(Lewis R S,Milla S R, and Levin J S, Molecular and genetic characterization ofNicotianaglutinosa L. chromosome segments in tobacco mosaic virus resistanttobacco accessions, Crop Sci., 2005, 45(6): 2355-2362;袁清华, 陈俊标, 李淑玲,马柱文, 邱道寿, 张振臣,抗TMV烟草种质资源的N基因片段序列研究, 广东农业科学,2011, 1(29): 96-99;陈爽, 朴世领, 金爱兰,烟草抗TMVN基因及其在分子标记辅助育种中的应用, 延边大学农学学报, 2012, 34(4): 355-361;张玉, 罗成刚, 殷英, 胡小波,戴培刚, 张波,烟草N基因及其在烤烟遗传育种中的应用, 中国农学通报, 2013, 29(19):89-92),同时建立了相应的检测体系(刘磊, 郭兆奎, 万秀清, 颜培强, 乔婵, 刘丹, N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用, 分子植物育种, 2010, 8(1):167-171),并将其中的部分检测标记及方法申请了专利(CN101892304B;CN102140546B;CN103866038B)。但上述所有基于N基因开发的分子标记均是显性标记,其在实际的烟草育种实践中存在着严重的缺陷:1)不能区分材料中N基因的全部基因型,也即上述显性标记只能分辨出材料中是否含有抗性基因N,而无法进一步的区分出纯合抗性(NN)和杂合抗性(Nn);2)无法确保其检测结果的准确性,即利用上述的显性标记在进行N基因检测时,若无特征(目的)条带出现时,并不能确定检测材料是感病的,极有可能存在实验因素造成的PCR扩增失败;3)检测体系繁琐,有部分标记是基于N基因的全长cDNA进行设计的,因而在实际检测中涉及到RNA的提取、cDNA的合成及长片段DNA的PCR扩增等过程。鉴于此,开发一种能解决上述问题的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记;第二目的在于提供所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用。
本发明的第一目的是这样实现的,所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118,其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
本发明的第二目的是这样实现的,所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。
为了简便、高效选择抗TMV病烟草品种,有针对性的、特异性的选择含N基因的后代材料,本发明提供一种用于检测烟草抗TMV病基因N的分子标记TM508-007和TM508-118,该分子标记采用分离群体分组分析(Bulked Segregation Analysis, BSA)法,筛选获得与烟草普通花叶病(TMV)N基因连锁的共显性SSR标记,可以用于烟草TMV抗性基因N的辅助选择,以提高分子标记辅助选择的效率及抗病品种选育的效率。
本发明利用Coker176(抗病亲本,其TMV抗性由N基因控制)和Y3(综合性状优良但易感TMV)构建回交一代(BC1F1)作图群体,采用分离群体分组分析(Bulked SegregationAnalysis, BSA)法,筛选与烟草普通花叶病(TMV)N基因连锁的共显性SSR标记,加速分子标记辅助选择(Marker Assistant Selection,MAS)在烟草TMV抗性品种选育中的利用。
本发明所述的共显性SSR标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点,因此该分子标记可以作为烟草TMV病抗病育种中N基因分子标记辅助选择的应用。
附图说明
图1 是与烟草TMV抗性基因N连锁的共显性SSR标记在5份材料中的PCR扩增产物凝胶电泳图;
其中,A,共显性SSR标记TM508-007;B,共显性SSR标记TM508-007;RB,抗病池;SB,感病池;RP,抗病亲本(Coker176);SP,感病亲本(Y3);F1,两亲本间的杂交子一代;M,500bpDNA ladder,长度片段分别为:100bp,150bp,200bp,300bp,400bp,500bp;
图2 是共显性SSR标记TM508-007在123个BC1F1单株中的PCR扩增产物凝胶电泳图;
其中,编号70(带黑色星星)为单交换单株;1-123为BC1F1单株编号;编号1-66,感病单株编号;编号67-123,抗病单株编号;RP,抗病亲本Coker176;SP,感病亲本Y3;F1,杂交子一代;
图3是共显性SSR标记TM508-118在123个BC1F1单株中的PCR扩增产物凝胶电泳图;
其中,编号69(带黑色星星)为单交换单株;1-123为BC1F1单株编号;编号1-66,感病单株编号;编号67-123,抗病单株编号;RP,抗病亲本Coker176;SP,感病亲本Y3;F1,杂交子一代;
图4是共显性SSR标记T508-007和TM508-118分别与烟草TMV抗性基因N的连锁关系;
其中,左侧为标记(基因)名称;右侧为标记与N基因间的遗传距离(单位为:cM)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或替换,均属于本发明的保护范围。
本发明所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118,其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为:
TM508-007序列为TM508-007F:5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’,
TM508-007R:5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’;
TM508-118序列为TM508-118F:5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’,
TM508-118R:5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。
本发明所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。
所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TM508-007序列的引物和TM508-118序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA,检测PCR扩增产物,如果PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯和基因NN;如果PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为不含有烟草抗TMV病的纯和基因NN,而含有其感病的纯合等位基因nn;如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列,同时含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn。
以TM508-007序列的引物进行PCR扩增的反应体系为:20uL,其中包含2.0μL的1×buffer(10mM Tris-Cl, PH=8.4, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2),200μM的 dNTPs(TakaraBiotechnology Co. Ltd., Dalian, China),0.5 μM 的上下游引物(Takara),1.0 U的rTaq 聚合酶(Takara),20-50ng模板DNA,最后用ddH2O补齐20uL,反应条件为:95℃预变性5分钟,30个循环(95℃变性30秒,复性30s,72℃延伸30s),72℃延伸5分钟,4℃保存。
以TM508-118序列的引物进行PCR扩增的反应体系为:20uL,其中包含2.0μL 的1×buffer(10mM Tris-Cl, PH=8.4, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2),200μM 的 dNTPs(TakaraBiotechnology Co. Ltd., Dalian, China),0.5μM 的上下游引物(Takara),1.0 U的rTaq 聚合酶(Takara),20-50ng模板DNA,最后用ddH2O补齐20uL,反应条件为:95℃预变性5分钟,30个循环(95℃变性30秒,复性30s,72℃延伸30s),72℃延伸5分钟,4℃保存。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明:
实施例1
利用分离群体分组分析(Bulked Segregation Analysis, BSA)法,筛选与烟草抗TMV基因N连锁的共显性SSR标记
一、实验材料
以综合性状优良但易感TMV的烤烟Y3为母本,以抗TMV烤烟材料Coker176(其抗性由N基因控制)为父本。2014年种植抗、感TMV亲本材料,经杂交,获得F1。2015年种植F1和两亲本,以Y3为轮回亲本,杂交获得回交一代(BC1F1)群体。2016年种植两亲本、F1和BC1F1世代材料。
二、亲本及BC1F1分离群体TMV抗性鉴定
试验材料成苗后移栽至大田,行株距为100cm × 50cm;移栽3周后进行人工接种。接种时将带TMV的病叶片磨碎后用水稀释至1%,采用高压喷枪接种病毒稀释液,喷射压力为1.5-2kg/cm2
现蕾前开始调查病情,7天调查1次发病情况,取最后一次的调查数据进行以下分析,根据“TMV病害分级标准”进行分级。
0级:全株无病;
1级:心叶脉明或轻微花叶,植株无明显矮化;
3级:上部少于1/3叶片花叶但不变形,或植株矮化为正常株高的3/4以上;
5级:1/3-1/2叶片花叶,或少数叶片变形,或主脉变黑,植株矮化为正常株高的2/3-3/4;
7级:1/2-2/3叶片花叶,或变形或主脉坏死,或植株矮化为正常株高的1/2-2/3;
9级:全株叶片花叶,严重变形或坏死,病株矮化为正常株高的1/3-1/2。
把0-1级定为抗病植株,3-9级定为感病植株。
三、SSR标记分析
在烟草幼苗长到4片叶左右时,采用改良的CTAB法(Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotianatabacum andconstruction of a genetic map of flue-cured tobacco. Plant Breeding, 2012,131: 674-680)提取所有参试材料的全基因组DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定提取后的DNA浓度和纯度。
SSR-PCR的体系配制、产物扩增及扩增产物的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(6%-non-PAGE)检测,参照童治军等(童治军等.普通烟草及其祖先种基因组SSR位点分析.中国农业科学, 2015, 48(11): 2108-2117)提供的方法进行。SSR标记(引物)由两部分构成,共18764对,其中,PT系列引物5119对(Bindler, et al. A high density genetic map oftobacco (NicotianatabacumL.) obtained from large scale microsatellite markerdevelopment.Theor. Appl. Genet., 2011, 123(2): 219-230),TM系列引物13645对(Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers inNicotianatabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco.Plant Breeding, 2012, 131: 674-680;Tong ZJ, et al. Large-scale development ofSSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-curedtobacco. Breeding Science, 2016, 66: 381-390)。
四、 抗、感病基因组池的构建
采用分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis, BSA),选取BC1F1分离群体中的极端抗病(0级抗病)单株和极端感病(9级感病)单株各15株的基因组DNA,等量混合构建抗、感池,用于引物多态性筛选和标记连锁分析。
在苗期按实施例1所述方法,利用18764对SSR引物对抗病亲本Coker176、感病亲本Y3、两亲本间杂交子一代(F1)、抗病池和感病池共5份材料进行PCR扩增,筛选与烟草抗TMV基因N连锁的共显性SSR标记。筛选的结果如图1所示:共显性SSR标记TM508-007和TM508-118分别与烟草TMV抗性基因N连锁,标记TM508-007和TM508-118在感病池与感病亲本中的带型完全一致,仅出现一条220bp(序列如SEQ ID NO.3)和230bp(序列如SEQ ID NO.4)的特异性条带;在抗病池与F1中的带型完全一致,呈现出共显性的两条特异性条带(同时具有抗、感亲本的特异性条带,也即,同时呈现如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示序列及如SEQID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列)。其中,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列长度分别为228bp和190bp,分别是共显性SSR标记TM508-007和TM508-118在含有N基因的抗TMV品种中的特异性PCR扩增条带。
以上结果表明,标记TM508-007和TM508-118分别与烟草抗TMV基因N连锁,且该标记为共显性标记。PCR扩增产物中分别含有如ID NO.1(220bp)和SEQ ID NO.2(190bp)所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯合基因NN;PCR扩增产物中分别含有如ID NO.3(220bp)和SEQ ID NO.4(230bp)所示序列即含有其感病的纯合等位基因nn;PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3或同时含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列即含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn。
实施例2
共显性连锁标记的图距及其在BC1F1群体单株中的验证
一、数据分析
首先,按实施例1所述方法进行烟草基因组DNA提取、纯化,BC1F1群体单株TMV抗性鉴定和SSR标记分析。其次,利用通过BSA法筛选获得的标记TM508-007和TM508-118对BC1F1群体中的123个单株进行基因型分析。最后,对各个单株的带型进行数据统计,抗病杂合条带标记做“H”,感病条带标记做“A”,条带不清晰或者无扩增条带的记做“U”。
二、共显性连锁标记遗传距离的计算
利用JoinMap 4.0软件并结合BC1F1群体单株的TMV抗性鉴定数据,对共显性SSR标记在BC1F1分离群体中的基因型数据进行遗传连锁分析,计算出其连锁距离并绘制连锁图。
BC1F1群体单株TMV抗性鉴定的结果为:123个单株中,感病单株有66个,抗病单株有57个,其中,感病单株编号为1-66,抗病单株编号为67-123。
以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物,对123株BC1F1单株基因组DNA进行PCR扩增,扩增结果如图2所示:前66个单株(编号为1-66)仅含有长度为220bp的条带,其序列如SEQ ID NO.3所示,即该66个单株感TMV病,且基因型为nn;后57个单株(编号为67-123)中除一个单株(编号为70)外,其余56个单株中同时含有228bp和220bp两条带,其序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.3所示,即该56个单株中因含有如SEQ ID NO.1所示的序列(228bp)而抗TMV病,且基因型为Nn。
以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物,对123株BC1F1单株基因组DNA进行PCR扩增,扩增结果如图3所示:前66个单株(编号为1-66)仅含有长度为230bp的条带,其序列如SEQ ID NO.4所示,即该66个单株感TMV病,且基因型为nn;后57个单株(编号为67-123)中除一个单株(编号为69)外,其余56个单株中同时含有190bp和230bp两条带,其序列分别如SEQID NO.2和SEQ ID NO.4所示,即该56个单株中因含有如SEQ ID NO.2所示的序列(190bp)而抗TMV病,且基因型为Nn。
由上述两个共显性连锁标记对123个BC1F1单株的基因型分析可知:两个标记中均有1个单株(编号分别为70和69)则呈现出单交换,即抗性鉴定的结果为抗性单株,而基因型分析的结果却为感病(仅出现感病基因型的特异条带)。因此,利用Joinmap 4.0 作图软件计算可知,该两个共显性标记TM508-007和TM508-118与烟草TMV抗性基因N的紧密且位于N基因的两侧,其各自与N基因间的遗传距离均约为0.41 cM,如图4所示。
结论:利用上述两个共显性标记既可简便、快捷、稳定地检测烟草TMV抗性基因N存在,又可清晰地鉴定出抗TMV纯合基因型NN、抗TMV杂合基因型Nn及感TMV纯合基因型nn,也可有针对性的、特异性的选择含N基因的后代材料并大大提高选择抗TMV病烟草品种的效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
<130> 2016
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 228
<212> DNA
<213> TM508-007-1
<400> 1
caccatggtt tggctttcat atcctttgat ataaatgaca ccgaacgata gaagggtaaa 60
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<212> DNA
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tatccctaat tctactatcg gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc 180
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<212> DNA
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<400> 3
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tttttacttc tggaagttct agaaagtgaa aattagttca aaaaagaatt gtttatactg 180
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<212> DNA
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aaaagatcaa atttatcata aataaataaa taaataaata aataaataaa taaataaata 120
aataaataaa taacgtctac tttagtaaat tatccacgtt tatccctaat tctactatcg 180
gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc ttttcctcgc 230
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-007F
<400> 5
caccatggtt tggctttcat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-007R
<400> 6
gcaaaatgca aaaaggcaat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-118F
<400> 7
accaacatgg ccaaacctta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> TM508-118R
<400> 8
gcgaggaaaa gccagtaaaa 20

Claims (6)

1.一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记,其特征在于所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118,其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记,其特征在于TM508-007和TM508-118所对应的引物序列分别为:
TM508-007引物序列为TM508-007F:5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’,
TM508-007R:5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’;
TM508-118引物序列为TM508-118F:5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’,
TM508-118R:5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。
3.一种权利要求1或2所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用,其特征在于所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。
4.根据权利要求3所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用,其特征在于是分别以TM508-007的引物和TM508-118的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA,检测PCR扩增产物,PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯和基因NN;PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为含有感病的纯合等位基因nn;PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.3所示序列,或同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列即为含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn;其中,TM508-007的引物序列为TM508-007F:5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’, TM508-007R:5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’;TM508-118的引物序列为TM508-118F:5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’,TM508-118R:5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。
5.根据权利要求4所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用,其特征在于以TM508-007的引物进行PCR扩增的反应体系为:20μL,其中包含2.0μL的1×buffer,1×buffer为10mM Tris-Cl、pH=8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl2,200μM dNTPs,0.5μM上下游引物,1.0U rTaq聚合酶,20-50ng模板DNA,最后用ddH2O补齐20μL,反应条件为:95℃预变性5分钟,95℃变性30秒、复性30s、72℃延伸30s共30个循环,72℃延伸5分钟,4℃保存。
6.根据权利要求4所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用,其特征在于以TM508-118的引物进行PCR扩增的反应体系为:20μL,其中包含2.0μL的1×buffer,1×buffer为10mM Tris-Cl、pH=8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl2,200μM dNTPs,0.5μM上下游引物,1.0 U rTaq聚合酶,20-50ng模板DNA,最后用ddH2O补齐20μL,反应条件为:95℃预变性5分钟,95℃变性30秒、复性30s、72℃延伸30s共30个循环,72℃延伸5分钟,4℃保存。
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