CN109439789B

CN109439789B - 一组打破烟草tmv抗性基因n上游（5’端）连锁累赘的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109439789B
Application number: CN201811385811.2A
Authority: CN
Inventors: 肖炳光; 童治军; 李永平; 方敦煌; 陈学军; 谢贺; 黄昌军; 刘勇
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2038-11-20
Also published as: CN109439789A

Abstract

本发明公开了一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记及其应用。所述的打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记编号为TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302、TMn306和TMn323_N。本发明所述的一组分子标记具有稳定、可靠、简捷和高灵敏度的特点，可用于检测和判断烟草N基因上游（5’端）不同位置的连锁累赘片段打破信息，培育出既含有N基因又能完全打破或在不同位置部分打破不利连锁累赘影响的烟草抗TMV新品种。

Description

一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记及其应用。

背景技术

烟草花叶病是由属于花叶病毒家族的烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus ,TMV）引起的，因其宿主为包括烟草在内的茄科作物，因其严重影响烟叶的产量和品质，是我国烟叶生产上的重要病害。目前，生产上主要采取药剂防治和人为销毁田间病残体等措施进行防治，虽在控制TMV的发生流行上取得了一定的效果，但在局部田块爆发TMV的情况仍然时有发生，对烟草产业造成巨大经济损失。因此，选育抗病品种、提高烟草本身的抗病性是防治TMV的根本途径。

在采用传统的杂交育种手段获得的含有N基因而具有TMV抗性的烟草品种中，除了目标基因N外还携带N基因上（5’端）下游（3’端）紧密连锁的累赘片段（源自野生烟-心叶烟染色体片段）。因连锁累赘的存在，使烟草在获得TMV抗性的同时也存在产量上较低、上部叶落黄较慢、后期成熟叶片烘烤困难等不利影响，严重阻碍了含有TMV抗性基因N的烟草在生产上大面积推广应用。已有研究证明N基因本身除了提供TMV抗性外，并无产量和产值的不利影响，而连锁累赘造成的不利性状或影响是源自N基因上（5’端）下游（3’端）紧密连锁片段上的其他基因（Lewis RS., Linger LR., Wolff MF., Wernsman EA., The negativeinfluence of N-mediated TMV resistance on yield in tobacco: linkage dragversus pleiotropy. Theor Appl Genet, 2007, 115:169-178; Lewis RS, Rose C,Agronomic performance of tobacco mosaic virus-resistant tobacco lines andhybrids possessing the resistance gene N introgressed on differentchromosomes. Crop Sci., 2010, 50:1339-1347）。

基于烟草TMV抗性基因N的序列，国内外研究者成功的开发出多个用于检测含有N基因而具有TMV抗性的分子标记（Lewis R S , Milla S R , and Levin J S , Molecularand genetic characterization of Nicotiana glutinosa L . chromosome segmentsin tobacco mosaic virus resistant tobacco accessions, Crop Sci., 2005, 45(6):2355-2362；袁清华, 陈俊标, 李淑玲, 马柱文, 邱道寿, 张振臣, 抗TMV烟草种质资源的N基因片段序列研究, 广东农业科学, 2011 , 1(29): 96-99；陈爽, 朴世领, 金爱兰，烟草抗TMV N基因及其在分子标记辅助育种中的应用, 延边大学农学学报, 2012 , 34(4):355-361；张玉, 罗成刚, 殷英, 胡小波, 戴培刚, 张波,烟草N基因及其在烤烟遗传育种中的应用, 中国农学通报, 2013 , 29(19): 89-92），同时建立了相应的检测体系（刘磊,郭兆奎, 万秀清, 颜培强, 乔婵, 刘丹, N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用, 分子植物育种, 2010, 8(1): 167-171），并将其中的部分检测标记及方法申请了专利（CN101892304B；CN102140546B；CN103866038B）。但上述标记和方法仅是用来检测具有N基因的TMV抗性烟草品种，而不具有打破N基因紧密连锁的累赘片段的功能。虽有相关文献（Lewis RS, Milla SR, Levin JS, Molecular and genetic characterizationof Nicotiana glutinosa L. chromosome segments in tobacco mosaic virus-resistant tobacco accessions. Crop Sci., 2005, 45:2355-2362）和专利（CN105200052 B; CN 105200149 B）利用分子标记来衡量和估算因导入N基因而携带的连锁片段长度，但这些研究所公开的分子标记是基于番茄基因组数据而不是与N基因紧密连锁的累赘片段序列信息，因此，这些分子标记只能用来粗略估计烟草中N基因上（5’端）下游（3’端）连锁累赘片段的长短，而不具备精确检测、判断和打破烟草中N基因的连锁累赘及具体位置信息，进而，限制了上述标记在培育既含N基因又具有完全打破连锁累赘或在不同位置部分打破连锁累赘的烟草抗TMV品种中的应用。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记；第二目的在于提供所述的打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记编号为TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302、TMn306和TMn323_N，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No .1、SEQ ID No .2和SEQ ID No .3、SEQ ID No.4和SEQ ID No .5、SEQ ID No .6、SEQ ID No .7、SEQ ID No .8、SEQ ID No .9、SEQ IDNo .10、SEQ ID No .11和SEQ ID No .12、SEQ ID No .13和SEQ ID No .14、SEQ ID No.15和SEQ ID No .16、SEQ ID No .17和SEQ ID No .18、SEQ ID No .19和SEQ ID No .20、SEQ ID No .21和SEQ ID No .22、SEQ ID No .23、SEQ ID No .24、SEQ ID No .25、SEQ IDNo .26所示。

本发明的第二目的是这样实现的，利用上述一组分子标记来检测和判断待测烟草中N基因上游（5’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的精确位置信息。

本发明的另一目的是提供一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的PCR扩增所用的引物对。

本发明的又一目的是提供一种用于精确检测和判断待测烟草中N基因上游（5’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的位置信息的方法。

本发明的再一目的是提供上述分子标记、引物对及应用方法在培育烟草抗TMV品种中打破N基因上游（5’端）不利连锁累赘影响的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的标记，所述的分子标记为SEQ ID No .1、SEQ ID No .2和SEQ ID No .3、SEQ ID No .4和SEQ ID No .5、SEQ ID No .6、SEQ ID No .7、SEQ ID No .8、SEQ ID No .9、SEQ ID No .10、SEQ ID No.11和SEQ ID No .12、SEQ ID No .13和SEQ ID No .14、SEQ ID No .15和SEQ ID No .16、SEQ ID No .17和SEQ ID No .18、SEQ ID No .19和SEQ ID No .20、SEQ ID No .21和SEQID No .22、SEQ ID No .23、SEQ ID No .24及SEQ ID No .25所示序列。

本发明还公开了一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的PCR扩增所用的引物对，所述的引物对为TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302和TMn306引物对，所述的一组引物对分别为：

TMn007序列为TMn007F：5’- CGACTTCATGAAAGCACCAG -3’，

TMn007R：5’- CTACTGGACTCCACCCACGA -3’；

TMn025序列为TMn025F：5’- TGGTTAAAACTCCCATCCCTA -3’，

TMn025R：5’- TGGAAAATGAATTTTTCGAATG -3’；

TMn027序列为TMn027F：5’- TTTGTGCCAAAAGAAAAGGAA -3’，

TMn027R：5’- TGGAGAGATCGTGAAGGTCA -3’；

TMn085序列为TMn085F：5’- TGCACGTCTGATACTTTTTGA -3’，

TMn085R：5’- CAACTTTGCACCACCATCAC -3’；

TMn113序列为TMn113F：5’- CAACACGCACCATCACAAGT -3’，

TMn113R：5’- CTATGCTGCCCCTTCTTCAC -3’；

TMn131序列为TMn131F：5’- TGGTTAAAGCATGCGACTTG -3’，

TMn131R：5’- AGGAGTTTTTCGGCGATTG -3’；

TMn163序列为TMn163F：5’- TTTACGCCCTCACAAAAACC -3’，

TMn163R：5’- GATTTCACCGTCGGGACTAA -3’；

TMn183序列为TMn183F：5’- TACCGGTTTTTGGGAAATTG -3’，

TMn183R：5’- GCCCATTTTCTTGGGATTCT -3’；

TMn203序列为TMn203F：5’- TGAAAGTCACGCAACTCCAA -3’，

TMn203R：5’- CGAAATGTGAAAGGGGAGAA -3’；

TMn223序列为TMn223F：5’- CTGCTCAGGCCAGTGTGAT -3’，

TMn223R：5’- CACACAGGGTTATAGTCGTCCA -3’；

TMn226序列为TMn226F：5’- AGATTGCACACGAAATCGTAGA -3’，

TMn226R：5’- GAGAGATAAATGGAAGGAGAACGA -3’；

TMn233序列为TMn233F：5’- ATTTGGTTGTGTTGCTGTCG -3’，

TMn233R：5’- TGAAAAACAGGGAAGGAGGA -3’；

TMn245序列为TMn245F：5’- GAGGGCAAATTGGGTAAACA -3’，

TMn245R：5’- GGGTGGTGGGAGACAAATTA -3’；

TMn249序列为TMn249F：5’- AGTGGGATGAGGTAGGTGGA -3’，

TMn249R：5’- GAATGCTAGATTCCCGGATG -3’；

TMn288序列为TMn288F：5’- TCATCGTCAATAACGCCATAA -3’，

TMn288R：5’- TGTATGCCGGCTCTAAGGAG -3’；

TMn302序列为TMn302F：5’- ACGAGCAATTAGGGGTAGGG -3’，

TMn302R：5’- ACCTCTTCTATCGCCATGCT -3’；

TMn306序列为TMn306F：5’- TTGCTCAAATCCTTTGTGTCC -3’，

TMn306R：5’- TCATCCACTCTTGTGGCTTTT -3’。

本发明还公开了一种精确检测和判断待测烟草中N基因上游（5’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的位置信息的方法。首先，以引物TMn323_N对待测烟草基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物中是否含有如SEQ ID No .26所示序列来判断该待测烟草是否含有N基因，即，PCR扩增产物中含有如SEQ ID No .26所示序列，则表明该待测烟草基因组中含有TMV抗性基因N，反之，则表明该待测烟草基因组中无N基因存在；其次，在已知待测烟草基因组中有N基因存在的前提下，分别以TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302和TMn306共17对引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物并根据产物序列的有无或不同组合方式进行判断待测烟草中N基因上游（5’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的精确位置信息。

本发明所公开的一组引物序列（Seq ID No .27- Seq ID No .62）及分子标记序列(Seq ID No .1-Seq ID No .26)是通过以下技术方案获得的。首先，利用基因组重测序技术（以二代测序技术为主同时以三代测序技术为辅助）分别对含有显性单基因N的野生烟草心叶烟（Nicotiana glutinosa）和通过人工杂交培育的含N基因及其连锁累赘片段的抗TMV烤烟品种Coker176进行15×的重测序，获得的重测序数据再利用生物信息学方法进行过滤、拼接和组装，最终形成高质量的Scaffold数据；其次，将获得的心叶烟和烤烟Coker176的Scaffold数据分别与已公开的烤烟K326全基因组数据信息（Sierro N.,Battey JN., Ouadi S., Bakaher N., Bovet L., Willig A., Goepfert S., Peitsch MC and Ivanov NV. The tobacco genome sequence and its comparison with those oftomato and potato. 2014, Nat. Commun., 5, doi:10.1038/ncomms4833）进行比对，获得N基因上游（5’端）连锁累赘片段的完整序列信息；最后，基于获得的N基因上游（5’端）连锁累赘片段序列信息开发一组具有精确位置信息的分子标记并进行实验验证。

本发明还公开了上述一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记在培育打破不利连锁累赘影响的烟草抗TMV品种中的应用。本发明的分子标记可用于培育打破N基因不利连锁累赘影响的烟草抗TMV品种中，本领域技术人员可以理解，比如首先利用引物TMn323_N检测待测烟草中是否含有N基因；其次，通过检测含有N基因的烟草基因组DNA中是否含有上述一组引物对所对应的PCR扩增产物核苷酸序列，据此，判断该烟草中N基因上游（5’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的精确位置信息。

所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302、TMn306和TMn323_N引物对进行PCR扩增。所述检测还可以通过测序方法进行。该烟草育种辅助选择方法具有简捷、快速、高灵敏度的优点。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供了一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记，该组分子标记是基于N基因上游（5’端）完整的连锁累赘片段序列信息而开发获得且具有精确位置信息。与文献或专利已报道的N基因抗性相关分子标记或估算N导入片段长度标记相比，本发明所述分子标记是用于精确检测、判断和打破N基因上游（5’端）不同位置的连锁累赘片段，而不是用于评价N基因具有的抗性有无和模糊的估算N基因导入的连锁累赘片段长度。根据上述公开的一组分子标记，可精确的检测和打破N基因上游（5’端）不同位置的连锁累赘片段，从而获得具有完全打破或在不同位置上部分打破不利连锁累赘影响的抗TMV烤烟品种。

附图说明

图1 为18对引物在N基因上游（5’端）连锁累赘片段上的具体位置信息。图中左侧为具体的物理距离（单位为Mb），右侧为引物名称，其中，Scf_start为N基因上游（5’端）连锁累赘片段的起始端，N_gene_start和N_gene_start为N基因自身所在的位置信息；

图2为引物TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131和TMn163的PCR扩增产物在Coker176（含有N基因的烤烟，基因型NN）、K326（无N基因的烤烟，基因型nn）及其子一代（F1，Coker176×K326，基因型Nn）三份材料中的电泳图；其中每对引物的三份烟草材料从左到右分别为：Coker176、K326和F1；电泳图的最右侧泳道为100 bp DNA Ladder，从上往下依次是500bp、400bp、300bp和200bp；

图3为引物TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245和TMn249的PCR扩增产物在Coker176（含有N基因的烤烟，基因型NN）、K326（无N基因的烤烟，基因型nn）及其子一代（F1，Coker176×K326，基因型Nn）三份材料中的电泳图；其中每对引物的三份烟草材料从左到右分别为：Coker176、K326和F1；电泳图的最右侧泳道为100 bp DNA Ladder，从上往下依次是500bp、400bp、300bp和200bp；

图4为引物TMn288、TMn302、TMn306和TMn323_N的PCR扩增产物在Coker176（含有N基因的烤烟，基因型NN）、K326（无N基因的烤烟，基因型nn）及其子一代（F1，Coker176×K326，基因型Nn）三份材料中的电泳图；其中每对引物的三份烟草材料从左到右分别为：Coker176、K326和F1；电泳图的最右侧泳道为100 bp DNA Ladder，从上往下依次是500bp、400bp、300bp和200bp。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明公开了一组引物对以及打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记。利用本发明公开的一组引物对，以烟草基因组DNA为模板进行PCR，可以精确检测、判断和打破烟草N基因上游（5’端）不同位置的连锁累赘片段。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述PCR扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。

本发明所述的一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记的编号为TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302、TMn306和TMn323_N，其扩增产物核苷酸序列为SEQ ID No .1-26所示。

所述的分子标记所对应的18个位点的引物序列分别为：

TMn007序列为TMn007F：5’- CGACTTCATGAAAGCACCAG -3’，

TMn007R：5’- CTACTGGACTCCACCCACGA -3’；

TMn025序列为TMn025F：5’- TGGTTAAAACTCCCATCCCTA -3’，

TMn025R：5’- TGGAAAATGAATTTTTCGAATG -3’；

TMn027序列为TMn027F：5’- TTTGTGCCAAAAGAAAAGGAA -3’，

TMn027R：5’- TGGAGAGATCGTGAAGGTCA -3’；

TMn085序列为TMn085F：5’- TGCACGTCTGATACTTTTTGA -3’，

TMn085R：5’- CAACTTTGCACCACCATCAC -3’；

TMn113序列为TMn113F：5’- CAACACGCACCATCACAAGT -3’，

TMn113R：5’- CTATGCTGCCCCTTCTTCAC -3’；

TMn131序列为TMn131F：5’- TGGTTAAAGCATGCGACTTG -3’，

TMn131R：5’- AGGAGTTTTTCGGCGATTG -3’；

TMn163序列为TMn163F：5’- TTTACGCCCTCACAAAAACC -3’，

TMn163R：5’- GATTTCACCGTCGGGACTAA -3’；

TMn183序列为TMn183F：5’- TACCGGTTTTTGGGAAATTG -3’，

TMn183R：5’- GCCCATTTTCTTGGGATTCT -3’；

TMn203序列为TMn203F：5’- TGAAAGTCACGCAACTCCAA -3’，

TMn203R：5’- CGAAATGTGAAAGGGGAGAA -3’；

TMn223序列为TMn223F：5’- CTGCTCAGGCCAGTGTGAT -3’，

TMn223R：5’- CACACAGGGTTATAGTCGTCCA -3’；

TMn226序列为TMn226F：5’- AGATTGCACACGAAATCGTAGA -3’，

TMn226R：5’- GAGAGATAAATGGAAGGAGAACGA -3’；

TMn233序列为TMn233F：5’- ATTTGGTTGTGTTGCTGTCG -3’，

TMn233R：5’- TGAAAAACAGGGAAGGAGGA -3’；

TMn245序列为TMn245F：5’- GAGGGCAAATTGGGTAAACA -3’，

TMn245R：5’- GGGTGGTGGGAGACAAATTA -3’；

TMn249序列为TMn249F：5’- AGTGGGATGAGGTAGGTGGA -3’，

TMn249R：5’- GAATGCTAGATTCCCGGATG -3’；

TMn288序列为TMn288F：5’- TCATCGTCAATAACGCCATAA -3’，

TMn288R：5’- TGTATGCCGGCTCTAAGGAG -3’；

TMn302序列为TMn302F：5’- ACGAGCAATTAGGGGTAGGG -3’，

TMn302R：5’- ACCTCTTCTATCGCCATGCT -3’；

TMn306序列为TMn306F：5’- TTGCTCAAATCCTTTGTGTCC -3’，

TMn306R：5’- TCATCCACTCTTGTGGCTTTT -3’；

TMn323_N序列为TMn323_NF：5’- GCAGTTCAAATGGGAACACA -3’，

TMn323_NR：5’- TGAAACCGAAATCGTCAAAG -3’。

所述的一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记及其应用是：首先以引物TMn323_N对待测烟草基因组DNA进行PCR扩增并检测其扩增产物中是否含有如SEQ ID No .26所示序列来判断该待测烟草中是否含有N基因；其次，在已知含有N基因的前提下，利用上述一组17个引物（除TMn323_N外）分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No .1、SEQ ID No .2、SEQ ID No .4、SEQ IDNo .6、SEQ ID No .7、SEQ ID No .8、SEQ ID No .9、SEQ ID No .10、SEQ ID No .11、SEQID No .13、SEQ ID No .15、SEQ ID No .17、SEQ ID No .19、SEQ ID No .21、SEQ ID No.23、SEQ ID No .24、SEQ ID No .25所示的全部17个序列即为在N基因上游（5’端）存在完全连锁累赘；如若上述17个PCR扩增产物序列均不存在，则为在N基因上游（5’端）的连锁累赘完全被打破；如若上述17个PCR扩增产物序列仅有部分存在，则表示在N基因上游（5’端）的连锁累赘部分被打破，即，有PCR扩增产物序列存在的位置处，连锁累赘未被打破，没有PCR扩增产物序列的位置处，连锁累赘完全被打破。此外，如若PCR扩增产物中仅含有如SEQID No .3、SEQ ID No .5、SEQ ID No .12、SEQ ID No .14、SEQ ID No .16、SEQ ID No.18、SEQ ID No .20、SEQ ID No .22所示的8条序列，则同样表明在N基因上游（5’端）存在上述PCR扩增产物序列位置处的连锁累赘完全被打破；如若PCR扩增产物中含有SEQ ID No.2和SEQ ID No .3、SEQ ID No .4和SEQ ID No .5、SEQ ID No .11和SEQ ID No .12、SEQID No .13和SEQ ID No .14、SEQ ID No .15和SEQ ID No .16、SEQ ID No .17和SEQ IDNo .18、SEQ ID No .19和SEQ ID No .20、SEQ ID No .21和SEQ ID No .22所示的两两序列组合形式中任何一个组合存在，则表明在N基因上游（5’端）存在部分的连锁累赘，即，上述有两个PCR扩增产物序列以组合形式存在的位置处，连锁累赘部分被打破。具体的信息见表1：

表1 公开的18对引物PCR扩增产物核苷酸序列信息及其在烟草N基因上游（5’端）打破连锁累赘的位置信息

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

一、实验材料

含有N基因且具有TMV抗性的烟草材料共23份，其中白肋烟10份，烤烟11份，香料烟和野生烟各1份，此23份烟草材料中的N基因均是源自野生烟草-心叶烟（N .glutinosa），故此，N基因上游（5’端）或多或少存在着连锁累赘片段。此外，还有1份不含N基因也不具备TMV抗性的烤烟（K326）用做对照，上述共计24份烟草材料均为常见的烟草种质资源，公众可从烟草种质资源保存单位或云南省烟草农业科学研究院获得。具体的烟草材料信息见表2。

表2 24份烟草材料的信息

二、烟草基因组DNA提取

采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献报道或试剂盒中的说明书。

三、PCR扩增及电泳检测

PCR扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献；PCR扩增程序中，上述18对引物的退火温度均为60℃，具体的PCR扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。

四，N基因的检测

利用引物TMn323_N对上述24份烟草材料进行PCR扩增，检测PCR扩增产物是否有如SEQ ID No .26所示的序列，如有则表明材料中含有N基因；如没有则表明材料中没有N基因存在。

五、N基因上游（5’端）的连锁累赘打破信息

利用上述一组除TMn323_N外的17对引物分别扩增待检测的24份烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物序列并根据产物序列的有无或不同组合方式进行判断待测的24份烟草中N基因上游（5’端）连锁累赘的打破程度及连锁累赘打破的精确位置信息。详细的结果表3.

表3 利用18对引物分析24份烟草材料中N基因上游（5’端）连锁累赘打破情况

注：引物后面括号内数字表示该标记距离N基因的位置（TMn323_N为N基因的位置）；+：该引物有PCR扩增产物且在该位置的连锁累赘未被打破；-：该引物没有PCR扩增产物且在该位置的连锁累赘完全被打破；+/+：该引物有一个PCR扩增产物（基因型为NN）且在该位置的连锁累赘未被打破；+/-：该引物有两个PCR扩增产物（基因型为Nn）且在该位置的连锁累赘被部分打破；-/-：该引物有一个PCR扩增产物（基因型为nn）且在该位置的连锁累赘完全被打破；每对引物的PCR扩增产物序列信息（SEQ ID No .1-26）详见表1。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5'端）连锁累赘的分子标记及其应用

<130> 2018

<160> 62

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 214

<212> DNA

<213> TMn007扩增产物核苷酸序列

<400> 1

cgacttcatg aaagcaccag gattctagga ggtcatgggt cgtatgctac ggttcataga 60

ttccatgact ccggccgaat tatttccagc agatccggcc acatctcaga cgggaggggg 120

agcgcagacc gctaccgcta ccgctcatgc ttctggggtt gcagtcgcta tgtatcatac 180

accggggacc cttctcgtgg gtggagtcca gtag 214

<210> 2

<211> 251

<212> DNA

<213> TMn025扩增产物核苷酸序列

<400> 2

tggttaaaac tcccatccct atcttcttct cattattatt attattatta ttattattat 60

tattattatt attattatta ttgatgtaat taagttgaaa aaatcaattt tttaccctac 120

taattatttc acatacctct ctccaaaatt tatccaatac caagctcatg attactgttt 180

tttttttttg gaaaattaaa ttaacaagat attttttcaa ttaaataaac attcgaaaaa 240

ttcattttcc a 251

<210> 3

<211> 260

<212> DNA

<213> TMn025扩增产物核苷酸序列

<400> 3

tggttaaaac tcccatccct atcttcttct cattattatt attattatta ttattattat 60

tattattatt attattatta ttattattat tgatgtaatt aagttgaaaa aatcaatttt 120

ttaccctact aattatttca catacctctc tccaaaattt atccaatacc aagctcatga 180

ttactgtttt ttttttttgg aaaattaaat taacaagata ttttttcaat taaataaaca 240

ttcgaaaaat tcattttcca 260

<210> 4

<211> 197

<212> DNA

<213> TMn027扩增产物序列

<400> 4

tttgtgccaa aagaaaagga aaaaagaaaa tgaaaaaaat tataataacg gtttggaaaa 60

gatgcacgta gtcctcaaat gaataattgt ccaatgagaa gatgtcaaaa atatagttga 120

attgaatata tatatatata tatatctctt ccacccaatc ctaagctgtc tcctaagtga 180

ccttcacgat ctctcca 197

<210> 5

<211> 207

<212> DNA

<213> TMn027扩增产物序列

<400> 5

tttgtgccaa aagaaaagga aaaaagaaaa tgaaaaaaat tataataacg gtttggaaaa 60

gatgcacgta gtcctcaaat gaataattgt ccaatgagaa gatgtcaaaa atatagttga 120

attgaatata tatatatata tatatatata tatatctctt ccacccaatc ctaagctgtc 180

tcctaagtga ccttcacgat ctctcca 207

<210> 6

<211> 170

<212> DNA

<213> TMn085扩增产物序列

<400> 6

tgcacgtctg atactttttg attcttggtg ctatatatat tcttttattc ttgttaaaaa 60

agagtgtttc ttacctatca agaaataaag gagagacagt ttctctgatt cgtgtgtgtg 120

tgtgtatata tatagagaga gagagaggtg gtgatggtgg tgcaaagttg 170

<210> 7

<211> 239

<212> DNA

<213> TMn113扩增产物核苷酸序列

<400> 7

caacacgcac catcacaagt gtttattagt agccattttt tcaagtaaag atgttcaaat 60

gagaaactca agagttcata tatcgacttt ataaactgat acaagtttaa gtggccagga 120

agtcatttcg tctttaaatt atttgctgaa tttcaacctc ctacccctac cccccaaaaa 180

aaattccctt tattatttat ttatttattt gagaaagtgg tgaagaaggg gcagcatag 239

<210> 8

<211> 215

<212> DNA

<213> TMn131扩增产物核苷酸序列

<400> 8

tggttaaagc atgcgacttg tatgtcattt tacacacaca cacacagtcc tttgtcgtcc 60

aatctaagtt ggcactctct ctttccttat ttccttcttc ctccattatt gcttcctaaa 120

accctaaaaa tggaacatcc cttcttcatc aatagcccgc cgcctacaaa cccatctgaa 180

gcattacgat ggctatcaat cgccgaaaaa ctcct 215

<210> 9

<211> 210

<212> DNA

<213> TMn163扩增产物核苷酸序列

<400> 9

tttacgccct cacaaaaacc caaccataaa cacacacaca cacacagtaa tcatctctct 60

ctcactcact cactcgccga tttcttcatt cgtaagcata tatgcattca gatttttaac 120

aaaattgatt cgaaccttag cttcaatagt agtgatggga gggggaggag gagagcgttc 180

aatcggagct ttagtcccga cggtgaaatc 210

<210> 10

<211> 198

<212> DNA

<213> TMn183扩增产物核苷酸序列

<400> 10

taccggtttt tgggaaattg tgaattctgt caagatctct atatcgagac tgtctttgtt 60

attgttgtta ttgagtaaat gttaggctta cctagtccct aagactaggt gccatcacga 120

tacccaacag agggaaattt gggtcatgac aactcttcca cttaatagag gcatacctag 180

aatcccaaga aaatgggc 198

<210> 11

<211> 218

<212> DNA

<213> TMn203扩增产物核苷酸序列

<400> 11

tgaaagtcac gcaactccaa aataaatttt ttaaaagatt tctataaatt aaagaaaaaa 60

ttcacatcta agaatatagt tgaaattact gaaatataat gtccaaacaa aaaaaaacaa 120

aaaaggaaag agccatcaaa agccccctct ctcgtacagg gtgttttcat tggtggcgca 180

ctccatttcc ttctcttttt ctcccctttc acatttcg 218

<210> 12

<211> 204

<212> DNA

<213> TMn203扩增产物核苷酸序列

<400> 12

tgaaagtcac gcaactccaa aataaatttt ttaaaagatt tctataaatt aaagaaaaaa 60

ttcacatcta agaatatagt tgaaattact gaaatataat gtccaaacaa aaaaaaacaa 120

aaaaggaaac ccctctctcg tacagggtgt tttcattggt ggcgcactcc atttccttct 180

ctttttctcc cctttcacat ttcg 204

<210> 13

<211> 214

<212> DNA

<213> TMn223扩增产物核苷酸序列

<400> 13

ctgctcaggc cagtgtgatt tggacaatat tagatgattg ttgtacaagt tgaatgtatt 60

atttatgact agtaactgtt atcccagacc ctacctggtg ggaatatacc gggtttgttg 120

ttgttgttga tgactagtaa ttgttatctg acttggtatt ctttccttat aagcttgtat 180

ttctattaag tatggacgac tataaccctg tgtg 214

<210> 14

<211> 186

<212> DNA

<213> TMn223扩增产物核苷酸序列

<400> 14

ctgctcaggc cagtgtgatt tggacaatat tagatgattg ttagtaactg ttatcccaga 60

ccctacctgg tgggaatata ccgggtttgt tgttgttgtt gatgactagt aattgttatc 120

tgacttggta ttctttcctt ataagcttgt atttctatta agtatggacg actataaccc 180

tgtgtg 186

<210> 15

<211> 211

<212> DNA

<213> TMn226扩增产物核苷酸序列

<400> 15

agattgcaca cgaaatcgta gatagaatgt taaaaaatta aaaaaattaa aaaaataaaa 60

aaaaataaaa aaaactcatt aataaaataa taatcaactt catcattatt gcatagaaat 120

atcgataata atctttcaaa ttataattat aggtgttagt tcgattttct cttcttcatt 180

aattatctcg ttctccttcc atttatctct c 211

<210> 16

<211> 198

<212> DNA

<213> TMn226扩增产物核苷酸序列

<400> 16

agattgcaca cgaaatcgta gatagaatgt taaaaaatta aaaaaattaa aaaaaaaaaa 60

actcattaat aaaataataa tcaacttcat cattattgca tagaaatatc gataataatc 120

tttcaaatta taattatagg tgttagttcg attttctctt cttcattaat tatctcgttc 180

tccttccatt tatctctc 198

<210> 17

<211> 140

<212> DNA

<213> TMn233扩增产物核苷酸序列

<400> 17

atttggttgt gttgctgtcg ccatcgtgcc atgtgatgac tgatgactga tgactatgac 60

gttttcttca ctaattttct ggtaaaagtt aattgccaaa ataaataaat aaataaataa 120

tcctccttcc ctgtttttca 140

<210> 18

<211> 132

<212> DNA

<213> TMn233扩增产物核苷酸序列

<400> 18

atttggttgt gttgctgtcg ccatcgtgcc atgtgatgac tgatgactga tgactatgac 60

gttttcttca ctaattttct ggtaaaagtt aattgccaaa ataaataaat aatcctcctt 120

ccctgttttt ca 132

<210> 19

<211> 251

<212> DNA

<213> TMn245扩增产物核苷酸序列

<400> 19

gagggcaaat tgggtaaaca caaatcagtt cctattttta tttttatttt tatttttatt 60

tttattttat cagttgagaa atattaagaa taaaggaata tattgtacaa caatcaaatg 120

tggtattctt tcaacctcaa tatattctct tgtcaaaagg gattttgaat aaagaaaagt 180

aaaatactta gctgagtctt tcatttcaac tttattaacc ctacattgtc ctaatttgtc 240

tcccaccacc c 251

<210> 20

<211> 246

<212> DNA

<213> TMn245扩增产物核苷酸序列

<400> 20

gagggcaaat tgggtaaaca caaatcagtt cctattttta tttttatttt tatttttatt 60

tttatcagtt gagaaatatt aagaataaag gaatatattg tacaacaatc aaatgtggta 120

ttctttcaac ctcaatatat tctcttgtca aaagggattt tgaataaaga aaagtaaaat 180

acttagctga gtctttcatt tcaactttat taaccctaca ttgtcctaat ttgtctccca 240

ccaccc 246

<210> 21

<211> 206

<212> DNA

<213> TMn249扩增产物核苷酸序列

<400> 21

agtgggatga ggtaggtgga cggaggaggg tggatatccc atgcatgcat gcatgctaga 60

aaaataacat aatgatatgg tgaatgttta gtttataatt ggactgcatt taatttaatt 120

taagagaaag attagatagt gggaacaaaa ataataggtc atgtgacaat atcttttctc 180

acgtgacatc cgggaatcta gcattc 206

<210> 22

<211> 202

<212> DNA

<213> TMn249扩增产物核苷酸序列

<400> 22

agtgggatga ggtaggtgga cggaggaggg tggatatccc atgcatgcat gctagaaaaa 60

taacataatg atatggtgaa tgtttagttt ataattggac tgcatttaat ttaatttaag 120

agaaagatta gatagtggga acaaaaataa taggtcatgt gacaatatct tttctcacgt 180

gacatccggg aatctagcat tc 202

<210> 23

<211> 233

<212> DNA

<213> TMn288扩增产物核苷酸序列

<400> 23

tcatcgtcaa taacgccata aaattattct tttttacatt ttgcatattt attataaaat 60

tgaagtcttt atccaaataa cctctatcat gttccaaaaa gaatatacta tctttttaat 120

aattataatt ttacaatata tgtaattctt aataataata ataataaaaa ttagagcctt 180

caatttggta cgtaaagcaa ttgttttagt ggcctcctta gagccggcat aca 233

<210> 24

<211> 235

<212> DNA

<213> TMn302扩增产物核苷酸序列

<400> 24

acgagcaatt aggggtaggg tctttgtaca gactaccctc cccagacccc acctggtggg 60

aacatattgg gttagttgtt gttgttgttg ttgttgtatt caacaattca aataagagta 120

agtagcagaa ggtaatcata actccaatta agactaaaca attataggat gagataaaaa 180

taatttcaga taaagataag cagttatgaa aatatagcat ggcgatagaa gaggt 235

<210> 25

<211> 219

<212> DNA

<213> TMn306扩增产物核苷酸序列

<400> 25

ttgctcaaat cctttgtgtc cgaatatata tatataagtt aatggcaagt ctcataacca 60

actggtgata gacaacatca catgaagttt cacatggttt tgcttactct gtcaaagtat 120

tcagtccatc aatttgttga acaacaacac taggccctac tgcttctcag attaggaaca 180

taaagacccc cttaaaataa aagccacaag agtggatga 219

<210> 26

<211> 225

<212> DNA

<213> TMn323_N扩增产物核苷酸序列

<400> 26

gcagttcaaa tgggaacaca atgtatattg agaactagaa caatgacact gcatatatat 60

atatatatgt atgtatgtaa ttctcgtctt ttggactaga ataccttgtt tcattatgaa 120

atgaattaac atcttcgcct ttgctgacaa gtaaccaatt acagatgaat gaaatcacct 180

gatcaacatt cattagcttt gtattctttg acgatttcgg tttca 225

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn007F

<400> 27

cgacttcatg aaagcaccag 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn007R

<400> 28

ctactggact ccacccacga 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> TMn025F

<400> 29

tggttaaaac tcccatccct a 21

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> TMn025R

<400> 30

tggaaaatga atttttcgaa tg 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> TMn027F

<400> 31

tttgtgccaa aagaaaagga a 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn027R

<400> 32

tggagagatc gtgaaggtca 20

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> TMn085F

<400> 33

tgcacgtctg atactttttg a 21

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn085R

<400> 34

caactttgca ccaccatcac 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn113F

<400> 35

caacacgcac catcacaagt 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn113R

<400> 36

ctatgctgcc ccttcttcac 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn131F

<400> 37

tggttaaagc atgcgacttg 20

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> TMn131R

<400> 38

aggagttttt cggcgattg 19

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn163F

<400> 39

tttacgccct cacaaaaacc 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn163R

<400> 40

gatttcaccg tcgggactaa 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn183F

<400> 41

taccggtttt tgggaaattg 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn183R

<400> 42

gcccattttc ttgggattct 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn203F

<400> 43

tgaaagtcac gcaactccaa 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn203R

<400> 44

cgaaatgtga aaggggagaa 20

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> TMn223F

<400> 45

ctgctcaggc cagtgtgat 19

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> TMn223R

<400> 46

cacacagggt tatagtcgtc ca 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> TMn226F

<400> 47

agattgcaca cgaaatcgta ga 22

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> TMn226R

<400> 48

gagagataaa tggaaggaga acga 24

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn233F

<400> 49

atttggttgt gttgctgtcg 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn233R

<400> 50

tgaaaaacag ggaaggagga 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn245F

<400> 51

gagggcaaat tgggtaaaca 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn245R

<400> 52

gggtggtggg agacaaatta 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn249F

<400> 53

agtgggatga ggtaggtgga 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn249R

<400> 54

gaatgctaga ttcccggatg 20

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> TMn288F

<400> 55

tcatcgtcaa taacgccata a 21

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn288R

<400> 56

tgtatgccgg ctctaaggag 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn302F

<400> 57

acgagcaatt aggggtaggg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn302R

<400> 58

acctcttcta tcgccatgct 20

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> TMn306F

<400> 59

ttgctcaaat cctttgtgtc c 21

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> TMn306R

<400> 60

tcatccactc ttgtggcttt t 21

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn323_NF

<400> 61

gcagttcaaa tgggaacaca 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> TMn323_NR

<400> 62

tgaaaccgaa atcgtcaaag 20

Claims

1.一组用于确定烟草TMV抗性基因N上游5’端连锁打破程度及位置信息的分子标记，其特征在于，所述分子标记编号为TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302、TMn306和TMn323_N，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21和SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26所示；所述分子标记所对应的18个位点的引物序列分别为：

TMn007序列为TMn007F：5’- CGACTTCATGAAAGCACCAG -3’，如SEQ ID No.27所示，TMn007R：5’- CTACTGGACTCCACCCACGA -3’，如SEQ ID No.28所示；

TMn025序列为TMn025F：5’- TGGTTAAAACTCCCATCCCTA -3’ ，如SEQ ID No.29所示，TMn025R：5’- TGGAAAATGAATTTTTCGAATG -3’，如SEQ ID No.30所示；

TMn027序列为TMn027F：5’- TTTGTGCCAAAAGAAAAGGAA -3’ ，如SEQ ID No.31所示，TMn027R：5’- TGGAGAGATCGTGAAGGTCA -3’，如SEQ ID No.32所示；

TMn085序列为TMn085F：5’- TGCACGTCTGATACTTTTTGA -3’，如SEQ ID No.33所示，TMn085R：5’- CAACTTTGCACCACCATCAC -3’，如SEQ ID No.34所示；

TMn113序列为TMn113F：5’- CAACACGCACCATCACAAGT -3’ ，如SEQ ID No.35所示，TMn113R：5’- CTATGCTGCCCCTTCTTCAC -3’，如SEQ ID No.36所示；

TMn131序列为TMn131F：5’- TGGTTAAAGCATGCGACTTG -3’，如SEQ ID No.37所示，TMn131R：5’- AGGAGTTTTTCGGCGATTG -3’，如SEQ ID No.38所示；

TMn163序列为TMn163F：5’- TTTACGCCCTCACAAAAACC -3’，如SEQ ID No.39所示，TMn163R：5’- GATTTCACCGTCGGGACTAA -3’，如SEQ ID No.40所示；

TMn183序列为TMn183F：5’- TACCGGTTTTTGGGAAATTG -3’，如SEQ ID No.41所示，TMn183R：5’- GCCCATTTTCTTGGGATTCT -3’，如SEQ ID No.42所示；

TMn203序列为TMn203F：5’- TGAAAGTCACGCAACTCCAA -3’，如SEQ ID No.43所示，TMn203R：5’- CGAAATGTGAAAGGGGAGAA -3’，如SEQ ID No.44所示；

TMn223序列为TMn223F：5’- CTGCTCAGGCCAGTGTGAT -3’，如SEQ ID No.45所示，TMn223R：5’- CACACAGGGTTATAGTCGTCCA -3’，如SEQ ID No.46所示；

TMn226序列为TMn226F：5’- AGATTGCACACGAAATCGTAGA -3’，如SEQ ID No.47所示，TMn226R：5’- GAGAGATAAATGGAAGGAGAACGA -3’，如SEQ ID No.48所示；

TMn233序列为TMn233F：5’- ATTTGGTTGTGTTGCTGTCG -3’，如SEQ ID No.49所示，TMn233R：5’- TGAAAAACAGGGAAGGAGGA -3’，如SEQ ID No.50所示；

TMn245序列为TMn245F：5’- GAGGGCAAATTGGGTAAACA -3’，如SEQ ID No.51所示，TMn245R：5’- GGGTGGTGGGAGACAAATTA -3’，如SEQ ID No.52所示；

TMn249序列为TMn249F：5’- AGTGGGATGAGGTAGGTGGA -3’，如SEQ ID No.53所示，TMn249R：5’- GAATGCTAGATTCCCGGATG -3’，如SEQ ID No.54所示；

TMn288序列为TMn288F：5’- TCATCGTCAATAACGCCATAA -3’，如SEQ ID No.55所示，TMn288R：5’- TGTATGCCGGCTCTAAGGAG -3’，如SEQ ID No.56所示；

TMn302序列为TMn302F：5’- ACGAGCAATTAGGGGTAGGG -3’，如SEQ ID No.57所示，TMn302R：5’- ACCTCTTCTATCGCCATGCT -3’，如SEQ ID No.58所示；

TMn306序列为TMn306F：5’- TTGCTCAAATCCTTTGTGTCC -3’，如SEQ ID No.59所示，TMn306R：5’- TCATCCACTCTTGTGGCTTTT -3’，如SEQ ID N .60所示；

TMn323_N序列为TMn323_NF：5’- GCAGTTCAAATGGGAACACA -3’，如SEQ ID No.61所示，TMn323_NR：5’- TGAAACCGAAATCGTCAAAG -3’，如SEQ ID No.62所示。

2.一种根据权利要求1中所述分子标记的应用，其特征在于，利用所述分子标记来检测和判断待测烟草中N基因上游5’端的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的精确位置信息；首先，以TMn323_N序列的引物对待测烟草基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物中是否含有如SEQ ID No.26所示序列来判断该待测烟草是否含有N基因而具有TMV抗性，即，PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.26所示序列，则表明该待测烟草基因组中含有TMV抗性基因N，反之，则表明该待测烟草基因组中无N基因存在；其次，在已知含有N基因的前提下，利用除TMn323_N外的17组引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25所示的全部17个序列即为在N基因上游5’端存在完全连锁累赘；如若上述17个PCR扩增产物序列均不存在，则为在N基因上游5’端的连锁累赘完全被打破；如若上述17个PCR扩增产物序列仅有部分存在，则表示在N基因上游5’端的连锁累赘部分被打破，即，有PCR扩增产物序列存在的位置处，连锁累赘未被打破，没有PCR扩增产物序列的位置处，连锁累赘完全被打破；此外，如若PCR扩增产物中仅含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22所示的8条序列，则同样表明在N基因上游5’端存在上述PCR扩增产物序列位置处的连锁累赘完全被打破；如若PCR扩增产物中含有SEQ ID No.2和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的两两序列组合形式中任何一个组合存在，则表明在N基因上游5’端存在部分的连锁累赘，即，上述有两个PCR扩增产物序列以组合形式存在的位置处，连锁累赘部分被打破，具体的信息见表1：

表1 公开的18对引物PCR扩增产物核苷酸序列信息及其在烟草N基因上游5’端打破连锁累赘的位置信息