CN101892304B - 分子标记检测n基因控制的烟草tmv抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测烟草普通花叶病抗性基因(N gene)的分子标记方法，包括引物设计、基因组DNA提取、PCR扩增及电泳检测，根据烟草TMV抗性基因(N gene)核苷酸序列设计特异引物，通过PCR反应能够在含有TMV抗性基因(N gene)的烟草品种(系)中扩增得到一条1200bp左右的特征条带，从而达到检测烟草品种(系)是否具有对TMV抗性的目的。利用本发明的分子标记对84份烤烟材料进行检测，结果与品种(系)的TMV抗性相吻合。本发明操作简便、结果可靠、检测速度快、不受植株生长发育时期的影响，将本发明应用于烤烟TMV抗性品种的选育，可以大大提高选择效率。
Description
技术领域：
本发明属地生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测烟草品种(系)中是否含有TMV抗性基因(N gene)，从而预测其对TMV的抗性的方法。
背景技术：
烟草普通花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)病是烟草的主要病害之一，一般年份田间发病率约为5～25％，重病年份达50％以上，自苗期至收获期均能发病。TMV侵染感病植株发生系统症状：首先在新叶上发生明脉，几天后形成花叶。严重时病叶畸形，早期发生病株节间缩短，植株矮化，生长缓慢。烟草普通花叶病在中国东北三省、云南、湖南、湖北、福建、四川等烟区普遍发生，严重降低了烟草产量和品质，经济损失惨重。
目前在烟草育种中应用的主要抗源来自黏烟草，黏烟草对TMV的抗性是由显性单基因N控制的。其抗性表现为：当病原物侵染植株叶片后，会在侵染部位出现1～10mm的局部枯斑，即过敏性坏死反应，这些坏死的细胞会阻止侵染植株的病原物进一步扩散。Whithan等(1994年)克隆了N基因。N基因编码TIR-NBS-LRR类抗性蛋白，TIR、NBS和LRR保守域对N基因的功能都很重要。N基因有两个转录产物NS和NL，NS主要在TMV侵染后3小时发挥功能，NL主要在TMV侵染后4～8小时发挥功能，缺少其中的任何一个转录产物，N基因都不能完全表现对TMV的抗性。该抗源已经成功转入普通烟草品种。我国利用该抗源育成的品种有中国烟草育种研究(南方)中心育成的云烟201、云烟202、云烟203，由中国农业科学院烟草研究所育成的CV87，由辽宁省丹东市农业科学研究所育成的辽烟8号、辽烟12号。从国外引进的抗性资源有Coker176、NC567、NC102、NC297、SC71、SC72、Reams C73等。
另外，普通烟草中的安巴里玛(Ambalema)品种对TMV具有耐病性，且依赖于气温条件。安巴里玛的耐病性是由隐性等位基因rm1和rm2控制的，其抗病基因与不良性状基因有连锁关系，所以在育种中很难利用。TI245对TMV的抗性是由隐性基因t1t1t2t2控制的。野生烟草中也有丰富的抗性资源，如残波烟草(N.repanda)、渐尖叶烟草(N.acuminata)、古德斯比氏烟草(N.goodspeedii)等都具有TMV抗性。
烟草是我国重要的经济作物之一，烟草普通花叶病给烟叶生产造成了巨大的损失。种植抗性品种是防治普通花叶病最经济、有效的方法。而培育抗性品种的一个重要环节就是对TMV抗性的鉴定。传统的鉴定方法主要是依靠田间鉴定方法，存在工作量大而且与实验者的接菌成功与否有直接的关系。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，筛选鉴定烟草N基因特异的分子标记，利用分子标记辅助选择筛选TMV抗性材料。该标记是以N基因核酸序列为模板设计引物，通过PCR扩增，能够在含有N基因的TMV抗性烟草资源中扩增出一条特异条带，而在TMV感病品种或非N基因控制的TMV抗性品种(系)中不能扩增出目的条带。该发明将加速分子标记辅助选择在TMV抗性品种选育中的利用。
为了实验本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
通过特异DNA分子标记检测N基因控制的烟草TMV抗性的方法，以烟草TMV抗性基因N gene部分核苷酸序列为模板设计引物，上游引物N2F：GGCATGACATCTCTGCTTCA，下游引物N2R：CCATTTGAACTGCAAAAGCA；利用该引物对待测烟草样品的DNA进行PCR扩增，扩增产物用电泳检测，若含有1200bp左右的特征条带则待测烟草样品中含有烟草TMV抗性基因N gene。
更具体地方案为：选择待测烟草品种(系)，当烟草长到3～4片真叶时，取叶片，利用CTAB法提取DNA，以DNA为模板，利用引物N2F/N2R进行PCR扩增，PCR体系包括1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50ng模板DNA，上下游引物各0.5μmol/L，2U Taq DNA聚合酶；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测，若待测烟草品种(系)能够扩增出一条1200bp左右的条带，表明检测品种含有N基因烟草品种，对TMV具有抗性。
本发明更具体的方法可表述为：
根据烟草N基因序列片段设计引物，利用该引物对待测烟草基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，如果产物有N基因特异条带，表明检测品种(系)含有N基因，具有对TMV的抗性。
设计引物的核苷酸序列如下：
1 GGCATGACAT CTCTGCTTCA GATTCCTTGT CACTAACAGT ATTTACCGGT CAACCGTATC
61 CTGAAAAGAT CCCGAGTTGG TTCCACCATC AGGGTTGGGA TAGTAGTGTA TCAGTCAATT
121 TGCCTGAAAA TTGGTATATA CCTGATAAAT TCTTGGGATT TGCTGTATGT TACTCTCGTA
181 GCTTAATTGA CACAACAGCT CACTTGATTC CCGTATGTGA TGACAAGATG TCGCGCATGA
241 CCCAGAAACT TGCCTTATCA GAATGTGATA CAGAATCATC CAACTATTCA GAATGGGATA
301 TACATTTTTT CTTTGTACCT TTTGCTGGCT TATGGGATAC ATCTAAGGCA AATGGAAAAA
361 CACCAAATGA TTATGGGATT ATTAGGCTAT CTTTTTCTGG AGAAGAGAAG ATGTATGGAC
421 TTCGTTTGTT GTATAAAGAA GGACCAGAGG TTAATGCCTT GTTACAAATG AGGGAAAATA
481 GCAATGAACC AACAGAACAT TCCACTGGGA TAAGGAGGAC TCAATATAAC AACAGAACTT
541 CCTTTTATGT AAGTCTCTAC TTCTATTAGC TACAAAGTCT TCTTCCAAAA TCAATACTCC
601 ATCCGTTCCA GTTTATGTGA ACCTATTTTT TGTTCGTCCA TTCTAAAAAG AATGACCCCT
661 TTCTAAATTT GGAAATAATT TTGGTTAAAC TTATAATTCT ACCATTAACG AGAAGCTTTT
721 ATAACCACAC AAATATTCTG GGGCCCTTTT TGAATTGTTT AGGACCATAA ATTCCAAAAG
781 TCCTCATTTT TTCTTAAACT CCGTGCCCAA TCAAACAAGT TCACGTAAAT TGGAACGGAG
841 GGAATATATT TTTTCTTCTC ATTCTTTTCC CCTATTTACA GGAGCTCATC AATGGGTGAT
901 GTACATATCA ACAACGAGTT TTAAAGGATT CCAACAAGTA TAACTTTTTA TGCTCAAATC
961 AGCTCCTTGT ATTGTGGAGA AAGCTGAGTA CGAGATGAAG TTGACGTCCG TTATCCTTTA
1021 TGATCTCTCT GTTCTTTGTG TTAACTTGCC TACTTCATCA GATGAATAAC AGAAGCCCGT
1081 TCCTCTCATT CTCAACACTG TTTGCACGTC TGTTGTTACT TGTTAAAATG GATCTTGATA
1141 AAGTAATAAC ATCTCTATAT TACTTATAAG TGGTTTTAAC AAGTTCACTC TTTTGCTTTT
1201 GCAGTTCAAA TGG
下划线表示引物位置，引物序列如下：
上游引物N2F：GGCATGACATCTCTGCTTCA
下游引物N2R：CCATTTGAACTGCAAAAGCA
上述引物用于检测N基因控制的烟草TMV抗性的方法如下：
(1)材料：TMV抗性烟草品种Coker176和TMV感病品种K326。Coker176对TMV的抗性由N基因控制，K326对TMV表现感病。
(2)DNA提取：当烟草生长到3～4片真叶时，取叶片100mg，利用CTAB法提取两个品种的DNA。
(3)以Coker176和K326DNA为模板，利用引物N2F/N2R进行PCR扩增。PCR体系包括1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50ng模板DNA，上下游引物各0.5μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min。
(4)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测，Coker176品种能够扩增出一条1200bp左右的条带，而K326的扩增产物没有这条带。与其对TMV的抗性相符，即如果烟草品种(系)对TMV具有抗性，引物对N2F/N2R能够扩增出1200bp左右的条带，表明该品种(系)基因组中含有N基因。否则不能扩增到该条带。
与现有技术相比，本发明所提供的检测N基因控制的烟草TMV抗性的方法具有以下优益效果：
本发明方法首先利用分子标记技术检测N基因控制的烟草TMV抗性；
本发明方法可应用于分子标记辅助选择，具有操作简便、结果可靠、检测速度快、不受环境影响等优点。在传统育种中，要选择TMV抗性材料需要对各个单株进行接种，如果接种不成功会影响选择效率。利用本发明可以在苗期就能鉴定出TMV抗性单株，淘汰其它单株，不仅速度快、能够大大降低成本，而且能够提高选择效率。
附图说明：
图1为标记N2F/N2R在烤烟品种K326和Coker176中的扩增结果。从左到右依次是DL2000Marker、K326、Coker176；
图2为标记N2F/N2R在12个烤烟品种(系)中的筛选结果。从左到右依次是DL2000Marker、云烟201、云烟202、云烟85、云烟203、吉烟5号、K326、辽烟8号、翠碧一号、NC102、KRK22、KRK26、YH05。
具体实施方式：
实施例1：
(1)烟草N基因部分核苷酸序列为：
(GGCATGACATCTCTGCTTCAGATTCCTTGTCACTAACAGTATTTACCGGTCAACCGTATCCTGAAAAGATCCCGAGTTGGTTCCACCATCAGGGTTGGGATAGTAGTGTATCAGTCAATTTGCCTGAAAATTGGTATATACCTGATAAATTCTTGGGATTTGCTGTATGTTACTCTCGTAGCTTAATTGACACAACAGCTCACTTGATTCCCGTATGTGATGACAAGATGTCGCGCATGACCCAGAAACTTGCCTTATCAGAATGTGATACAGAATCATCCAACTATTCAGAATGGGATATACATTTTTTCTTTGTACCTTTTGCTGGCTTATGGGATACATCTAAGGCAAATGGAAAAACACCAAATGATTATGGGATTATTAGGCTATCTTTTTCTGGAGAAGAGAAGATGTATGGACTTCGTTTGTTGTATAAAGAAGGACCAGAGGTTAATGCCTTGTTACAAATGAGGGAAAATAGCAATGAACCAACAGAACATTCCACTGGGATAAGGAGGACTCAATATAACAACAGAACTTCCTTTTATGTAAGTCTCTACTTCTATTAGCTACAAAGTCTTCTTCCAAAATCAATACTCCATCCGTTCCAGTTTATGTGAACCTATTTTTTGTTCGTCCATTCTAAAAAGAATGACCCCTTTCTAAATTTGGAAATAATTTTGGTTAAACTTATAATTCTACCATTAACGAGAAGCTTTTATAACCACACAAATATTCTGGGGCCCTTTTTGAATTGTTTAGGACCATAAATTCCAAAAGTCCTCATTTTTTCTTAAACTCCGTGCCCAATCAAACAAGTTCACGTAAATTGGAACGGAGGGAATATATTTTTTCTTCTCATTCTTTTCCCCTATTTACAGGAGCTCATCAATGGGTGATGTACATATCAACAACGAGTTTTAAAGGATTCCAACAAGTATAACTTTTTATGCTCAAATCAGCTCCTTGTATTGTGGAGAAAGCTGAGTACGAGATGAAGTTGACGTCCGTTATCCTTTATGATCTCTCTGTTCTTTGTGTTAACTTGCCTACTTCATCAGATGAATAACAGAAGCCCGTTCCTCTCATTCTCAACACTGTTTGCACGTCTGTTGTTACTTGTTAAAATGGATCTTGATAAAGTAATAACATCTCTATATTACTTATAAGTGGTTTTAACAAGTTCACTCTTTTGCTTTTGCAGTTCAAATGG，下划线表示引物位置)设计引物。引物序列为：上游引物N2F：GGCATGACATCTCTGCTTCA，下游引物N2R：CCATTTGAACTGCAAAAGCA。
(2)植物材料的准备：将Coker176和K326种子播种于烟草专用漂浮育苗盘中，当烟苗长到3～4片真叶时，每个材料取叶片100mg左右。
(3)DNA提取：用液氮研磨叶片至粉末状，迅速装入1.5ml离心管，快速加入600μl 2％CTAB提取液，剧烈摇动混匀，65℃水浴保温30min不时摇动，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)溶液，颠倒混匀，室温下静置10min。室温下，12000rpm
(4)离心10min。取上清，转入新的1.5ml离心管，并加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)重抽提1次，取上清，加2倍体积的预冷无水乙醇，在-20℃冰箱中放置20min，钩出DNA沉淀，转入1.5ml离心管中，用70％乙醇洗两次，室温干燥20min，用灭菌双蒸水溶解，-20℃保存。
提取液的成份为：1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，2％CTAB，2％PVP，1％(V/V)β-Me。
(5)PCR及电泳：PCR反应体系包括1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50ng左右模板DNA，上下游引物各0.5μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。PCR反应在ABI 2720型PCR仪上进行：94℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min。扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳30～50min(5v/cm)，经溴化乙锭染色，紫外观察照相记录。
(6)电泳结果见附图和N基因部分序列表，从图中可以看出，Coker176能够扩增出一条1200bp左右的特征条带，而K326的扩增产物没有这条带。与其对TMV的抗性相符，即如果烟草品种(系)对TMV具有抗性，N2F/N2R引物能够扩增出1200bp左右的条带，表明该品种(系)基因中含有N基因。否则不能扩增到这条带。
实施例2：
(1)选取84份烤烟品种(系)，这些材料对TMV的抗性见表1。
(2)提取这84份材料的DNA，提取方法同实例1。
(3)PCR扩增及产物检测同实例1。结果见表1(S：表示感病，R：表示抗病，+：表示标记检测结果为阳性，-：表示标记检测结果为阴性)，部分电泳结果见附图1。从表1中可以看出，标记N2F/N2R检测结果与N基因控制的TMV抗性相吻合，证明该引物应用于鉴定N基因控制的TMV抗性具有可靠性。
表1.标记N2F/N2R检测结果与品种(系)抗病性对比
| 品种 | TMV抗性 | N2引物扩增结果 | 品种 | TMV抗性 | N2引物扩增结果 |
| K326 | S | - | 辽烟8号 | R | + |
| 小黄金1025 | S | - | 辽烟12号 | R | + |
| 长脖黄 | S | - | 台烟8号 | S | - |
| 净叶黄 | S | - | 云烟87号 | S | - |
| Coker 371-Gold | S | - | 86-3002 | S | - |
| Hicks Broad Leaf | S | - | Coker 139 | S | - |
| G-28 | S | - | CU 236 | S | - |
| V2 | S | - | Dixie Bright 101 | S | - |
| 云烟85 | S | - | Hicks | S | - |
| 云烟317 | S | + | Kutsaga 51E | S | - |
| NC 82 | S | - | NC 95 | S | - |
| K346 | S | - | NC 567 | R | + |
| RG 11 | S | - | NC 2326 | S | - |
| 翠碧一号 | S | - | 0xford 2 | S | - |
| NC 89 | S | - | 0xford 26 | S | - |
| G-80 | S | - | Reams c73 | R | + |
| G-140 | S | - | SC 71 | R | + |
| 金星6007 | S | - | SC 72 | R | + |
| 金元(GoldDollar) | S | + | 云97 | S | - |
| 云烟2号 | S | - | 云98 | S | - |
| 581 | S | - | 云99 | S | - |
| 77089-12 | S | - | RG17 | S | - |
| 黄苗榆 | S | - | 龙江911 | S | - |
| 歪把子 | R(来源不清) | - | 中烟98 | S | - |
| CV 87 | R | + | 中烟100 | S | - |
| 大白筋599 | S | - | 永定1号 | S | - |
| 革新3号 | S | - | Coker86 | R | + |
| 晋太66 | S | - | Coker319 | S | - |
| NC729 | S | - | NC297 | R | + |
| K149 | S | - | KRK26 | S | - |
| NC1071 | S | - | YH05 | R | + |
| 龙江851 | R | + | 云烟109 | S | - |
| 吉烟5号 | R | + | 云烟113 | S | - |
| 吉烟7号 | R | + | Ti245 | R(非N基因) | - |
| 贵烟11号 | S | - | T29 | S | - |
| 中烟14 | S | - | NC196 | S | - |
| 中烟90 | S | - | NC471 | R | + |
| SC58 | S | - | T66 | R | + |
| 云201 | R | + | KRK22 | R | + |
| 云202 | R | + | KRK23 | R | + |
| 云203 | R | + | 临朐1号 | S | - |
| NC102 | R | + | Kutsaga 110 | S | - |
本发明根据的N基因部分序列设计引物的N基因部分序列表；
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>分子标记检测N基因控制的烟草TMV抗性及其应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1162
<212>DNA
<213>Nicotiana glutinosa
<400>1
aaccgtatcc tgaaaagatc ccgagttggt tccaccatca gggttgggat agtagtgtat 60
cagtcaattt gcctgaaaat tggtatatac ctgataaatt cttgggattt gctgtatgtt 120
actctcgtag cttaattgac acaacagctc acttgattcc cgtatgtgat gacaagatgt 180
cgcgcatgac ccagaaactt gccttatcag aatgtgatac agaatcatcc aactattcag 240
aatgggatat acattttttc tttgtacctt ttgctggctt atgggataca tctaaggcaa 300
atggaaaaac accaaatgat tatgggatta ttaggctatc tttttctgga gaagagaaga 360
tgtatggact tcgtttgttg tataaagaag gaccagaggt taatgccttg ttacaaatga 420
gggaaaatag caatgaacca acagaacatt ccactgggat aaggaggact caatataaca 480
acagaacttc cttttatgta agtctctact tctattagct acaaagtctt cttccaaaat 540
caatactcca tccgttccag tttatgtgaa cctatttttt gttcgtccat tctaaaaaga 600
atgacccctt tctaaatttg gaaataattt tggttaaact tataattcta ccattaacga 660
gaagctttta taaccacaca aatattctgg ggcccttttt gaattgttta ggaccataaa 720
ttccaaaagt cctcattttt tcttaaactc cgtgcccaat caaacaagtt cacgtaaatt 780
ggaacggagg gaatatattt tttcttctca ttcttttccc ctatttacag gagctcatca 840
atgggtgatg tacatatcaa caacgagttt taaaggattc caacaagtat aactttttat 900
gctcaaatca gctccttgta ttgtggagaa agctgagtac gagatgaagt tgacgtccgt 960
tatcctttat gatctctctg ttctttgtgt taacttgcct acttcatcag atgaataaca 1020
gaagcccgtt cctctcattc tcaacactgt ttgcacgtct gttgttactt gttaaaatgg 1080
atcttgataa agtaataaca tctctatatt acttataagt ggttttaaca agttcactct 1140
tttgcttttg cagttcaaat gg 1162
Claims (2)
1.通过特异性DNA分子标记检测N基因控制的烟草TMV抗性的方法，以烟草TMV抗性基因N gene部分核苷酸序列为模板设计引物，上游引物N2F：GGCATGACATCTCTGCTTCA，下游引物N2R：CCATTTGAACTGCAAAAGCA；利用该引物对待测烟草样品的DNA进行PCR扩增，扩增产物用电泳检测，若含有1200bp左右的特征条带，则该待测烟草样品中含有烟草TMV抗性基因N基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于选择待测烟草品种或品系，当烟草生长到3～4片真叶时，取叶片，利用CTAB法提取DNA，以DNA为模板，利用引物N2F/N2R进行PCR扩增，PCR体系包括1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50ng模板DNA，上下游引物各0.5μmol/L，2U Taq DNA聚合酶；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测，若待测烟草品种或品系能够扩增出一条1200bp左右的条带，表明检测品种含有N基因的烟草品种或品系，对TMV具有抗性。
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| CN1157549A (zh) * | 1994-06-17 | 1997-08-20 | 美国政府农业部 | 植物抗病毒基因和方法 |
-
2010
- 2010-04-07 CN CN2010101407712A patent/CN101892304B/zh active Active
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN1157549A (zh) * | 1994-06-17 | 1997-08-20 | 美国政府农业部 | 植物抗病毒基因和方法 |
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