CN104472345B - 一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法 - Google Patents
一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，是选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术。本发明提供的方法聚合了烟草普通花叶病和黑胫病的抗性，获得了双抗种质资源，与传统杂交育种方法相比，可以明显减轻育种的工作强度、缩短育种的周期，具有效率高、选育周期短的优点；选育的品种虽然农艺性状离生产应用还有差距，但创建的聚合抗性种质与常规栽培推广的品种可以实现正常杂交，可用于优良品种的抗性改良。
Description
技术领域
本发明属于烟草育种技术领域，具体涉及一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法。
背景技术
烟草母本起源单倍体育种是栽培烟草（母本）与非洲烟（Nicotiana africana）（父本）杂交产生的母本起源的单倍体（Burk L. G., Wernsman D. U. 1979. MaternalHaploids of Nicotiana tabacum L. from Seed. Science. 206:585.）。这些F1 种子播种后，只有孤雌生殖的烟苗和少数混倍体存活下来，那些腺毛密度小、叶片薄圆的烟苗即为单倍体。处于绝对领先地位的美国在烟草母本起源单倍体育种新技术实践中得到了广泛使用，选育出NC2000、NC71等优良品种。因此，在单基因控制的显性抗烟草普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus TMV）基因 N（Lewi et al. 2005. Molecular and GeneticCharacterization of Nicotiana tabacum L. Chromosome Segments in ResistantTobacco Accessions. Crop Science. 45:2355.）和来源于N.plumbaginifolia的单基因控制的显性抗黑胫病（Phytophthora nicotianae）基因PhP（Johnson et al.2002.Marker-Assisted Selection for Resistance to Black Shank Disease in Tobacco.Plant Disease. 86:1303-1309.）等单抗烟草栽培品种成功选育的基础上，采用母本来源单倍体育种技术，为双抗烟草普通花叶病和黑胫病种质资源的创建提供了可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法。
本发明的目的是这样实现的，选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：
A、杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料；
B、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟 为父本，进行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到单倍体烟苗；
C、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；
D、抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种获得的种子即可作为种质资源进行保存。
本发明采用杂交聚合抗性、母本来源单倍体育种技术、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的方法创建新种质。先将抗黑胫病的Coker371与抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176进行杂交；以获得的杂种材料为母本，以非洲烟（Nicotiana africana）为父本，进行远缘杂交；将获得的杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗，待长出3片真叶后选择叶缘圆形、叶缘中部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的幼苗即为单倍体烟苗；再选择有抗TMV的N基因及抗黑胫病的PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体植株；选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定验证，即获得兼抗这两种病害的加倍单倍体植株，常规繁种获得的种子就可作为种质资源进行保存。本方法不仅具有效率高、选育周期短的优点，而且创建的聚合抗性种质可用于优良品种的抗性改良。
本发明具有以下优点及效果：
1、本发明提供的方法聚合了烟草普通花叶病和黑胫病的抗性，获得了双抗种质资源，与传统杂交育种方法相比，可以明显减轻育种的工作强度、缩短育种的周期，具有效率高、选育周期短的优点。
2、选育的品种虽然农艺性状离生产应用还有差距，但创建的聚合抗性种质与常规栽培推广的品种可以实现正常杂交，可用于优良品种的抗性改良。
附图说明
图1为聚合双抗烟草普通花叶病和黑胫病种质资源的选育过程示意图；
图2为Coker371×Coker176双抗杂交种与非洲烟杂交获得单倍体材料，其中，a为目标单倍体材料，b为单倍体现蕾，c为二倍体与单倍体花器比较；
图3为Coker371× Coker176双抗单倍体分子标记筛选；其中：a为M 100bp 标准分子量，1 为Coker176，2为F1杂交种，3-7 为单倍体植株（H1,H3,H4,H7,H8），8为红大；b为M100bp 标准分子量，1为红大，2为Coker371，3为 F1杂交种，4-8 为单倍体植株（H1,H3,H6,H7,H8）；
图4为双抗单倍体组培加倍，其中a为外植体材料, b为外植体丛生芽萌发，c为目标丛生芽筛选，d为加倍单倍体；
图5为双抗单倍体组培加倍材料TMV及黑胫病常规抗性接种鉴定，其中a为TMV抗性鉴定鉴定， 1为 RBST，2为红大；b 黑胫病抗性鉴定，1为RBST，2为红大；
图6为双抗单倍体组培加倍材料TMV及黑胫病抗性相关分子标记分析，其中，a 为抗黑胫病PhP基因RAPD分析M 100 bp标准，1为红大 2-3 为RBST，4-5为 Coker371，6为Coker176，7为H2O；b 抗TMV的N基因电泳分析M 100 bp 标准，1为红大 2-3为 RBST，4为Coker176，5-6为 Coker371，7为H2O。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，是选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：
A、杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料；
B、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟 为父本，进行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到单倍体烟苗；
C、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；
D、抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种获得的种子即可作为种质资源进行保存。
B步骤中所述的点播育苗是将杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗。
C步骤中N基因及PhP基因分子标记的引物分别为：
N基因F：5′-ACCAGAATGATATGTTCCAC-3′；
N基因R：5′-GGACTCAACGTTAATTCTCTG -3′；
PhP基因（RAPD）：5′- TCCCATGCTG -3′。
C步骤中N基因及PhP基因分子标记引物扩增的特征谱带分别为545bp、770bp。
若未特别指明，实施例和应用例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：
1、杂种聚合抗性：将抗黑胫病的Coker371和抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176进行杂交；
2、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟为父本，进行远缘杂交；再将获得的杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗，待长出3片真叶后选择叶缘圆形、叶缘中部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的幼苗即为单倍体烟苗；
3、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；
4、抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为抗性加倍单倍体植株，常规繁种获得的种子就可作为种质资源进行保存。
本发明的具体操作如下：
1材料和方法
1.1材料
烤烟品种红花大金元、Coker371、Coker176、非洲烟（N.africana）。
1.2 方法
1.2.1杂种聚合抗性
将抗黑胫病Coker371和抗烟草普通花叶病的Coker176进行杂交。
1.2.2母本来源单倍体烟苗的选择
以Coker176×Coker371的杂交材料为母本，以N.africana为父本，进行远缘杂交。再将获得的杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗，待长出3片真叶后，参考前人（Burk L. G., Wernsman D. U. 1979. Maternal Haploids of Nicotianatabacum L. from Seed. Science. 206:585; Wernsman E. A., et al .1989.Androgenetic vs. Gynogenetic Doubled Haploids of Tobacco. Crop Science 29:1151-1155; Lewis and Rose. 2011. Identification of Tobacco Haploids on theBasis of Transgenic Overexpression of PAP1 from Arabidopsis thaliana. CropScience 51: 1491-1497.）的方法，进行单倍体苗期形态鉴别，选择真叶叶缘圆形、叶缘中部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的单倍体烟苗。单倍体诱导频率=（诱导的单倍体数/种子数量）×100%。
1.2.2抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍
按文献（Lewi et al. 2005. Molecular and Genetic Characterization ofNicotiana tabacum L. Chromosome Segments in Resistant Tobacco Accessions.Crop Science. 45:2355；（Johnson et al.2002. Marker-Assisted Selection forResistance to Black Shank Disease in Tobacco. Plant Disease. 86:1303-1309.）方法开展抗TMV、黑胫病分子标记辅助筛选。选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体植株。黑胫病接种采用创伤贴接法，以烟株凋萎死亡表示高感，存活为高抗。参照国家标准方法（GB/T 23224-2008 烟草品种抗病性鉴定）进行TMV抗性鉴定评价。
2 结果和分析
2.1 单倍体诱导频率比较
供试材料与N.africana杂交种播种25d后发现，远缘杂交后代大部分苗已致死，存活的烟苗中，多数为混倍体，而两片真叶表现凹痕的烟苗为单倍体苗。
表1 单倍体诱导频率
不同授粉方法对单倍体诱导频率的初步比较表明（表1），采用纸管授粉后，单倍体诱导频率达到0.13%，比常规套袋法的0.02%提高了5.5倍。
2.2单倍体植株分子标记辅助筛选
对单倍体材料进行N基因及PhP基因分子标记分析，含有N基因扩增的单倍体植株为H1、H3、H4和H7，而有黑胫病基因扩增的单倍体植株为H1、H3和H6，选择H1及H3单倍体植株进行组培加倍处理。
2.3 单倍体植株组培加倍
选择现蕾期的中部叶片中脉，在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，可以获得60%以上的加倍单倍体植株。
2.4 加倍单倍体植株抗性鉴定
TMV及黑胫病常规抗性鉴定及分子标记辅助分析表明，获得的加倍单倍体均含有抗TMV的N基因及抗黑胫病（race 0）PhP基因。
实施例1 聚合双抗杂交种的获得
常规方法育苗供试材料，移栽大田，以抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本进行纸管套袋杂交。
实施例2 母本来源单倍体烟苗的选择
1、以Coker371×Coker176的杂交材料为母本，以N.africana为父本，纸管套袋杂交。
2、在漂浮盘播种远缘杂交种，播种量为每100平方厘米0.055g种子，约600粒，按照常规漂浮苗管理措施育苗。
3、待烟苗长出3片真叶后，选择真叶叶缘圆形、叶缘中部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的烟苗即为单倍体烟苗。
实施例3 抗TMV的N基因及抗黑胫病PhP基因的分子标记选择及常规抗性鉴定验证
1、双抗单倍体的筛选和组培加倍
利用QiaGenDNA提取试剂盒，提取单倍体烟苗DNA，参考文献报道，进行PCR扩增，苗期选择既含有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗，移栽大棚培养至现蕾初期，取中部叶片5cm大小中脉，无菌处理后在普通MS培养基上直接诱导丛生芽。培养35d后，选择叶片圆形、生长快的丛生芽进行诱根培养，即可获得加倍单倍体植株。
2、双抗黑胫病、TMV加倍单倍体种质资源的建立
漂浮盘培育有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体种苗，40d后，采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定验证，验证结果表明抗上述两种病害的，即为双抗加倍单倍体植株，常规繁种获得的种子就可作为种质资源进行保存与育种利用。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法
<130> 2014
<160> 3
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> N基因F
<400> 1
accagaatga tatgttccac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> N基因R
<400> 2
ggactcaacg ttaattctct g 21
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> PhP基因（RAPD）
<400> 3
tcccatgctg 10
Claims (4)
1.一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征在于选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤：
A、杂种聚合抗性：将所述母本Coker371材料和所述父本烟草Coker176杂交，获得双抗杂种材料；
B、母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟为父本，采用纸管授粉进行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到单倍体烟苗；
C、抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体烟苗；
D、抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种获得的种子即可作为种质资源进行保存。
2.根据权利要求1所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征在于B步骤中所述的点播育苗是将杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗。
3.根据权利要求1所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征在于C步骤中N基因及PhP基因分子标记的引物分别为：
N基因F：5′-ACCAGAATGATATGTTCCAC-3′；
N基因R：5′-GGACTCAACGTTAATTCTCTG -3′；
PhP基因RAPD：5′- TCCCATGCTG -3′。
4.根据权利要求1所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征在于C步骤中N基因及PhP基因分子标记引物扩增的特征谱带分别为545bp、770bp。
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