CN105993929B - 一种母本起源的烟草单倍体及其育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种母本起源的烟草单倍体及其育种方法，包括以下步骤：1）以Coker176与Coker371 Gold杂交所得的杂交种F1作为母本；2）当杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.0~2.5cm时，以非洲烟N. africana为父本进行杂交，授粉后用纸管套住已授粉柱头，待种子成熟后，收获成熟的杂交种种子，进行脱粒、精选，并播种；3）当步骤2中播种的烟苗两片真叶时，采集表型判断为单倍体的植株叶片，利用流式细胞术分析其倍性，得到母本起源的单倍体。本发明的方法操作简单、易于实现，单倍体诱导效果好，诱导效率高，鉴定快速准确，对于烟草单倍体育种具有重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于烟草育种技术领域，具体涉及一种母本起源的烟草单倍体及其育种方法。
背景技术
烟草单倍体是含有烟草配子体染色体数目（n=24）的植株。单倍体育种可以缩短育种年限。通过单倍体的染色体加倍可获得纯合二倍体，只要获得的二倍体植株符合育种目标即可繁殖推广，这样从杂交到纯合品系的整个过程只需3~4年，所花的时间比常规育种获得稳定株系所需的时间要短。但是在自然界中出现单倍体植株的频率低，且多数植株不能成活，因此在育种中很难直接利用。诱导来源于父本的单倍体的常用方法为花药培养，具有步骤简便，单倍体苗易获得等优点，但是花药培养方式获得的加倍单倍体，其品质及农艺性状等退化严重，同时利用父本来源的单倍体育成的烟草品种还存在产量降低等劣势。
目前母本起源单倍体育种技术已在实践中得到了应用，但是目前存在苗期单倍体鉴别困难的问题，也没有不同授粉时期和不同的套袋方式对母本起源单倍体诱导效果影响的相关研究，大大阻碍了现有母本起源单倍体育种的发展。
流式细胞术(flow cytometry)是一种用于生物医学中对血细胞进行快速计数与分析的技术，其利用流式细胞仪对处于快速流动中的单个细胞或微小颗粒(细胞核、染色体等)进行快速定量分析和分选。因具有检测方便、快速、用量少的特点，该技术已经用于动物、微生物及细胞生物学方面的特定细胞分选研究。但现如今流式细胞仪在植物科学中的应用滞后于其它学科。因此，如果能够用其在烟草母本起源单倍体方面进行早期快速准确筛选，对加快烟草育种进程具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种母本起源的烟草单倍体；本发明的第二目的在于提供一种母本起源的烟草单倍体的育种方法。
本发明的第一目的是这样实现的，所述烟草单倍体是以Coker176与Coker371Gold杂交所得的杂交种F1作为母本，以非洲烟N.africana为父本，进行杂交筛选所得。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的母本起源烟草单倍体的育种方法包括以下步骤：
1）以Coker176与Coker371 Gold杂交所得的杂交种F1作为母本；
2）当杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.0~2.5cm时，以非洲烟N.africana为父本进行杂交，授粉后用纸管套住已授粉柱头，并将纸管的顶端折叠，封住柱头，待种子成熟后，收获成熟的杂交种种子，进行脱粒、精选，并播种；
3）当步骤2中播种的烟苗两片真叶时，采集表型判断为单倍体的植株叶片，利用流式细胞术分析其倍性，得到母本起源的单倍体。
本发明的有益效果：
1、该方法操作简单、易于实现，单倍体诱导效果好，诱导效率高，鉴定快速准确，对于烟草单倍体育种具有重要的作用；
2、本发明的母本起源单倍体育种技术育种周期明显缩短、目标性状选择效率显著提高，可在苗期建立混倍体与单倍体标准倍性图，在苗床上淘汰非单倍体植株，无需移栽所有存活苗，节省时间与后续鉴定步骤；
3、本发明通过对不同授粉时期和不同的套袋方式对母本起源单倍体诱导效果影响的进行研究，确定了最佳的授粉时期和套袋方式，在苗期鉴定单倍体植株，本发明的流式细胞术通过结合已知不同倍性烟草材料，通过苗期表型指标、成熟期发育情况观测等，确定的分析步骤对单倍体、二倍体和混倍体等不同倍性材料以及母本起源单倍体后代材料的分析结果稳定可靠，操作简单，鉴别准确性、效率均显著提高。
附图说明
图1为流式细胞仪对实施例1的样品倍性分析结果；
其中，图1-A为已知单倍体的倍性分析结果，图1-B为已知二倍体的倍性分析结果，图1-C为已知混倍体的倍性分析结果；
图2为实施例3中不同SCD长度时花粉管萌发情况；
其中，图2-A为SCD长度为2.5cm时的花粉管萌发情况，图2-B为SCD长度为3.0cm时的花粉管萌发情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明的烟草单倍体是以Coker176与Coker371 Gold杂交所得的杂交种F1作为母本，以非洲烟N.africana为父本，进行杂交筛选所得。
本发明的母本起源烟草单倍体的育种方法，包括以下步骤：
1）以Coker176与Coker371 Gold杂交所得的杂交种F1作为母本；
2）当杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.0~2.5cm时，以非洲烟Nicotiana africana为父本进行杂交，授粉后用纸管套住已授粉柱头，并将纸管的顶端折叠，封住柱头，待种子成熟后，收获成熟的杂交种种子，进行脱粒、精选，并播种；
3）当步骤2中播种的烟苗两片真叶时，采集表型判断为单倍体的植株叶片，利用流式细胞术分析其倍性，得到母本起源的单倍体。
步骤2中所述的杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.5cm。
步骤2中所述的杂交具体为用镊子剥开母本花瓣，从0.5cm处用解剖刀切断雄蕊花丝，将父本花粉涂于母本柱头。
步骤2中所述的纸管为两端开口，直径为0.45~0.5cm，长为4.5~5.0cm的纸管。
步骤3中所述的表型判断为单倍体的植株叶片具体为观察两片真叶的表面有粒状或起皱、叶缘无波浪状的烟苗判断为单倍体苗。
步骤3中所述的利用流式细胞术分析的具体步骤为：取1.5×1.5cm2大小嫩叶，用去离子水洗净叶片表面，滤纸吸干表面水分后放入培养皿里，加入1ml预冷到4℃的解离液，所述解离液为Galbraith’s Buffer，用刀片快速切碎叶片，碎片大小约为0.5mm，整个切碎过程，材料需保持浸没在解离液里，最后再用0.5ml解离液清洗刀片，将培养皿摆成斜面，使液体和切碎的材料流至培养皿底半弧侧，用修饰过的移液枪头轻轻混匀培养皿斜壁上粘连液体；吸取培养皿中的液体，滤过300目滤膜，用1.5ml离心管收集滤液，置于冰中孵育5分钟后离心，转速为1100rpm，温度4℃，时间5min；吸取上清液1300微升左右，加入200微升冰浴解离液，再加入1微升母液浓度为2mg/ml的 RNase，吹打混匀，避光冰浴染色20min作为样品，在流式细胞仪上采用FL2-A通道使用低速上样检测样品染色体的倍性。
所述的流式细胞仪为BD Accuri-C6 Flow Cytometer。
实施例1
分别取已知单倍体、已知二倍体、已知混倍体播种35d后的植株的1.5×1.5cm2大小嫩叶，用去离子水洗净叶片表面，滤纸吸干表面水分后放入培养皿里，加入1ml预冷到4℃的解离液，所述解离液为Galbraith’s Buffer，用刀片快速切碎叶片，碎片大小约为0.5mm，整个切碎过程，材料需保持浸没在解离液里，最后再用0.5ml解离液清洗刀片，将培养皿摆成斜面，使液体和切碎的材料流至培养皿底半弧侧，用修饰过的移液枪头轻轻混匀培养皿斜壁上粘连液体；吸取培养皿中的液体，滤过300目滤膜，用1.5ml离心管收集滤液，置于冰中孵育5分钟后离心，转速为1100rpm，温度4℃，时间5min；吸取上清液1300微升左右，加入200微升冰浴解离液，再加入1微升母液浓度为2mg/ml的 RNase，吹打混匀，避光冰浴染色20min作为样品，在流式细胞仪上采用FL2-A通道使用低速上样检测样品染色体的倍性，所述的流式细胞仪为BD Accuri-C6 Flow Cytometer。
流式细胞仪对上述样品分别进行倍性分析结果见图1，其中纵坐标轴C值代表测定细胞数的相对值，横坐标轴F值代表荧光的通道值，峰值为测试样品倍性观测位置。已知单倍体见图1-A，其荧光强度高峰出现在253220位置，已知二倍体见图1-B，其荧光强度高峰出现在513052位置，已知混倍体见图1-C，其荧光强度高峰出现在635878的位置。结合已知不同倍性材料，以及表型指标观测等，发现本发明采用的流式细胞仪及其分析步骤对不同倍性材料的分析结果稳定可靠，操作简单，鉴别效率显著提高。
实施例2
材料：二倍体植株Coker176和Coker371 Gold，杂交种F1（Coker176为母本、Coker371 Gold为父本），N.africana。
不同套袋方法对单倍体诱导效果影响： 1）以Coker176与Coker371 Gold杂交所得的杂交种F1作为母本；2）当杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.5cm时，以非洲烟N.africana为父本进行杂交，所述杂交为用镊子剥开母本花瓣，从0.5cm处用解剖刀切断雄蕊花丝，将父本花粉涂于母本柱头，授粉后分别以纸管和纸袋套袋（简称纸管法和纸袋法），所述纸管法为授粉后用纸管套住已授粉柱头，并将纸管的顶端折叠，封住柱头，所述的纸管为两端开口，直径为0.45cm，长为4.5cm的纸管。收获成熟的杂交种种子，按常规考种方法进行脱粒和精选，各选两种方法得到的饱满杂交种种子5000粒，分成9份播种于育苗盘中，35d后统计存活率及单倍体诱导频率。存活率为存活植株数量/播种种子数量*100%，单倍体诱导频率为单倍体数量/播种种子数量*100%，单倍体诱导效率为单倍体数量/存活植株数量*100%。
纸袋法与纸管法采收的(Coker176与Coker371杂交种)×N.africana杂交组合种子在播种后1周出苗，多数幼苗的子叶小，并且不能长出真叶，最终死亡，能够存活并生长的植株是混倍体或母本起源单倍体。表1可知，在播种35d后，纸袋法存活苗数为78株，存活苗率为1.56%，明显比纸管法的存活苗多。
表型鉴定：观察两片真叶的表面有粒状或起皱、叶缘无波浪状的烟苗判断为单倍体苗，利用流式细胞术分析其倍性，得到母本起源的单倍体；流式细胞仪分析：取1.5×1.5cm2大小嫩叶，用去离子水洗净叶片表面，滤纸吸干表面水分后放入培养皿里，加入1ml预冷到4℃的解离液，所述解离液为Galbraith’s Buffer，用刀片快速切碎叶片，碎片大小约为0.5mm，整个切碎过程，材料需保持浸没在解离液里，最后再用0.5ml解离液清洗刀片，将培养皿摆成斜面，使液体和切碎的材料流至培养皿底半弧侧，用修饰过的移液枪头轻轻混匀培养皿斜壁上粘连液体；吸取培养皿中的液体，滤过300目滤膜，用1.5ml离心管收集滤液，置于冰中孵育5分钟后离心，转速为1100rpm，温度4℃，时间5min；吸取上清液1300微升左右，加入200微升冰浴解离液，再加入1微升母液浓度为2mg/ml的 RNase，吹打混匀，避光冰浴染色20min作为样品，在流式细胞仪上采用FL2-A通道使用低速上样检测样品染色体的倍性。所述的流式细胞仪为BD Accuri-C6 Flow Cytometer。经过表型鉴定和流式细胞术分析结果表明，纸管法单倍体的诱导频率比纸袋法高出20%。可见纸袋法较易混杂杂交种，存活苗数多，增加了单倍体鉴别的难度和工作量。
表1 不同套袋方法对单倍体诱导效果（5000粒种子）
| 套袋方法 | 存活苗数（株） | 单倍体数（株） | 存活苗率（%） | 单倍体诱导频率（%） | 单倍体诱导效率（%） |
| 纸管法 | 12 | 4 | 0.24 | 0.08 | 33.33 |
| 纸袋法 | 78 | 3 | 1.56 | 0.06 | 3.85 |
实施例3
材料：二倍体植株Coker176和Coker371 Gold，杂交种F1（Coker176为母本、Coker371 Gold为父本），非洲烟N.africana。
不同授粉时期对单倍体诱导效果影响：以杂交种F1（Coker176为母本、Coker371Gold为父本）的花冠长度与萼片长度之差（以SCD表示）为指标，分别在SCD为0.5cm、1.5cm、2.0cm、2.5cm、 3.0cm及3.5cm时，剥取花蕾，用解剖刀纵切雄蕊并涂布在花粉萌发培养基（0.02%硼酸+2%蔗糖+0.6%琼脂）上，花粉培养5h后观察花粉管萌发情况。在Zeiss ImagerA1显微镜20倍物镜下，统计5个视野花粉数目与花粉管萌发数，花粉萌发率为萌发的花粉数/总花粉数*100%。
在SCD长度为2.5cm、3.0cm时，进行授粉，按照实施例2中的纸管法，以纸管套袋，收获成熟的杂交种种子，按常规考种方法进行脱粒、精选，并播种，采用实施例2中表型鉴定和流式细胞仪分析的方法计算存活率和单倍体诱导频率。
在不同SCD长度时期，母本花粉萌发情况如表2和图2所示。由表和图可知，在SCD长度小于等于2.5cm时，花粉萌发率为0，母本的花粉还未萌发，花粉管未伸长，这时去雄，进行杂交，不会有自交情况的发生。而如果大于3cm时，母本材料的花粉萌发率在9.6%以上，这时植株的自交可能已经发生，不利于真杂交种的产生。当SCD长度为3.5cm时，母本的花粉基本完全萌发，此时母本已经完成自交授粉。因此SCD长度为1.5~2.5cm，是开展非洲烟杂交、预防混杂的适宜时期，当SCD长度太小，母本花柱和柱头发育并未成熟，授粉也不容易成功。
表2 不同SCD长度时花粉萌发情况
| SCD长度（cm） | 观察花粉数（个） | 萌芽花粉数（个） | 花粉萌发率（%） |
| 0.5 | 65 | 0 | 0 |
| 1.5 | 59 | 0 | 0 |
| 2.0 | 58 | 0 | 0 |
| 2.5 | 54 | 0 | 0 |
| 3.0 | 125 | 12 | 9.6 |
| 3.5 | 68 | 64 | 94.1 |
不同SCD长度时花粉管萌发情况见图2，其中图2-A为SCD长度为2.5cm，图2-B为SCD长度为3.0cm。
分别在SCD长度为2.5cm和3.0cm时进行授粉，纸管法套袋，后代单倍体获得效率如表3所示。由表可知，不同时期授粉获得的单倍体数和诱导频率相同，但后代存活苗数差异显著，在SCD长度3.0cm时授粉，后代存活苗数明显比SCD长度2.5cm时的高。可见，在SCD长度3.0cm时授粉，后代的植株中有其他混杂的植株，不利于单倍体植株的选择和鉴别，增加了单倍体鉴别的难度和工作量。
表3 不同SCD长度下授粉单倍体获得效率（5000粒种子）
| SCD长度（cm） | 存活苗数（株） | 单倍体数（株） | 存活苗率（%） | 单倍体诱导频率（%） | 单倍体诱导效率（%） |
| 2.5 | 14 | 3 | 0.28 | 0.06 | 21.43 |
| 3.0 | 88 | 3 | 1.76 | 0.06 | 3.41 |
通过本发明实施例的结果表明，纸管法单倍体的诱导频率比纸袋法高、其他非二倍体材料少，而纸袋法较易混杂其他杂交种，存活苗数多，增加了苗期单倍体鉴别的难度和工作量。此外，在SCD长度等于2.5cm时，母本的花粉还未萌发，花粉管未伸长，这时去雄，进行杂交，不会有自交情况的发生。而虽然SCD长度小于2.5cm时，如0.5cm、1.5 cm，母本的花粉也还未萌发，花粉管也未伸长，但此时母本花柱和柱头的发育不如SCD长度2.5cm时的成熟，对杂交的成功率和杂交种的产量有较大的影响。而如果SCD大于3cm时，母本材料花粉已经萌发，特别是当其长度为3.5cm时，母本的花粉基本完全萌发，此时母本有可能已经完成自交授粉。由此可见，SCD长度为2.5cm左右，是开展非洲烟杂交、预防混杂的最适宜时期。
实施例4
材料：二倍体植株Coker176和Coker371 Gold，杂交种F1（Coker176为母本、Coker371 Gold为父本），非洲烟N.africana。
1）以Coker176与Coker371 Gold杂交所得的杂交种F1作为母本；
2）当杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.0时，以非洲烟N.africana为父本进行杂交，所述的杂交具体为用镊子剥开母本花瓣，从0.5cm处用解剖刀切断雄蕊花丝，将父本花粉涂于母本柱头，授粉后用纸管套住已授粉柱头，所述的纸管为两端开口，直径为0.5cm，长为5.0cm的纸管，并将纸管的顶端折叠，封住柱头，待种子成熟后，收获成熟的杂交种种子，进行脱粒、精选，并播种；
3）当步骤2中播种的烟苗两片真叶时，采集表型判断为单倍体的植株叶片，利用流式细胞术分析其倍性，得到母本起源的单倍体。所述的表型判断为单倍体的植株叶片具体为观察两片真叶的表面有粒状或起皱、叶缘无波浪状的烟苗判断为单倍体苗；所述的利用流式细胞术分析的具体步骤为：取1.5×1.5cm2大小嫩叶，用去离子水洗净叶片表面，滤纸吸干表面水分后放入培养皿里，加入1ml预冷到4℃的解离液，所述解离液为Galbraith’sBuffer，用刀片快速切碎叶片，碎片大小约为0.5mm，整个切碎过程，材料需保持浸没在解离液里，最后再用0.5ml解离液清洗刀片，将培养皿摆成斜面，使液体和切碎的材料流至培养皿底半弧侧，用修饰过的移液枪头轻轻混匀培养皿斜壁上粘连液体；吸取培养皿中的液体，滤过300目滤膜，用1.5ml离心管收集滤液，置于冰中孵育5分钟后离心，转速为1100rpm，温度4℃，时间5min；吸取上清液1300微升左右，加入200微升冰浴解离液，再加入1微升母液浓度为2mg/ml的 RNase，吹打混匀，避光冰浴染色20min作为样品，在流式细胞仪上采用FL2-A通道使用低速上样检测样品染色体的倍性，所述的流式细胞仪为BD Accuri-C6 FlowCytometer。
Claims (6)
1.一种母本起源烟草单倍体的育种方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以Coker176与Coker371 Gold杂交所得的杂交种F1作为母本；
2）当杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.0~2.5cm时，以非洲烟N.africana为父本进行杂交，杂交方法为：用镊子剥开母本花瓣，从0.5cm处用解剖刀切断雄蕊花丝，将父本花粉涂于母本柱头；授粉后用纸管套住已授粉柱头，并将纸管的顶端折叠，封住柱头，待种子成熟后，收获成熟的杂交种种子，进行脱粒、精选，并播种；
3）当步骤2）中播种的烟苗两片真叶时，采集表型判断为单倍体的植株叶片，利用流式细胞术分析其倍性，得到母本起源的单倍体。
2.根据权利要求1所述育种方法，其特征在于步骤2）中杂交种F1的花冠长度与萼片长度之差为2.5cm。
3.根据权利要求1所述育种方法，其特征在于步骤2）中纸管为两端开口，直径为0.45~0.5cm，长为4.5~5.0cm的纸管。
4.根据权利要求1所述育种方法，其特征在于步骤3）中通过表型判断单倍体的植株叶片是观察两片真叶的表面有粒状或起皱、叶缘无波浪状的烟苗判断为单倍体苗。
5.根据权利要求1所述育种方法，其特征在于步骤3）中利用流式细胞术分析的具体步骤为：取1.5×1.5cm2大小嫩叶，用去离子水洗净叶片表面，滤纸吸干表面水分后放入培养皿里，加入1ml预冷到4℃的解离液，所述解离液为Galbraith’s Buffer，用刀片快速切碎叶片，碎片大小约为0.5mm，整个切碎过程，材料需保持浸没在解离液里，最后再用0.5ml解离液清洗刀片，将培养皿摆成斜面，使液体和切碎的材料流至培养皿底半弧侧，用修饰过的移液枪头轻轻混匀培养皿斜壁上粘连液体；吸取培养皿中的液体，滤过300目滤膜，用1.5ml离心管收集滤液，置于冰中孵育5分钟后离心，转速为1100rpm，温度4℃，时间5min；吸取上清液1300微升，加入200微升冰浴解离液，再加入1微升母液浓度为2mg/ml的RNase，吹打混匀，避光冰浴染色20min作为样品，在流式细胞仪上采用FL2-A通道使用低速上样检测样品染色体的倍性。
6.根据权利要求5所述育种方法，其特征在于所述流式细胞仪为BD Accuri-C6 FlowCytometer。
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| Title |
|---|
| 利用母本来源的单倍体技术获得双抗TMV 和PVY 烟草株系;刘勇等;《中国烟草学报》;20140630;第20卷(第3期);84-88 * |
| 烤烟雄性不育杂交授粉时期对种子质量的影响;刘仁祥等;《西北农业学报》;20091231;第18卷(第1期);摘要，第3.1节，图1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105993929A (zh) | 2016-10-12 |
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