WO2020213728A1 - 生長性が改良された細胞質雄性不稔Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ植物 - Google Patents

生長性が改良された細胞質雄性不稔Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ植物 Download PDF

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brmt
brassica rapa
cytoplasmic
cytoplasmic male
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慎吾 堀内
鈴木　隆夫
敦 泉田
和裕 西川
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株式会社サカタのタネ
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Definitions

  • the present invention relates to a cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant with improved growth.
  • Brassica rapa belongs to the Brassicaceae genus Brassica and is said to have originated in the Mediterranean region. By natural crossing, it is differentiated into subspecies with various morphological characteristics, and has been inherited by many vegetables such as Chinese cabbage, turnip, Japanese mustard spinach, and pakchoi (Non-Patent Document 1).
  • F1 F1 hybrid varieties
  • F1 varieties are widespread among major crops.
  • F1 varieties have great advantages such as vigorous growth due to heterosis, fast growth, and high yield.
  • F1 varieties can be expected to improve resistance to pests and environmental adaptability such as cold resistance and heat resistance due to vigorous growth.
  • genotypes of the F1 varieties are heterozygous but have the same genotype, the phenotype shows extremely high uniformity. Therefore, the marketability of the product is enhanced.
  • useful traits controlled by dominant genes can be accumulated in parents of F1 varieties, rapid breeding becomes possible. Due to the above advantages, F1 varieties have come to occupy the mainstream of cultivars in the main crops.
  • CMS cytoplasmic male sterility
  • Ogura CMS which is used in Raphanus sativus, Brassica oleracea, Brassica juncea, Brassica napus, etc.
  • Ogura CMS was discovered in Japanese radish of unknown variety name, and has been widely used for the development of F1 varieties of Japanese radish to date.
  • Ogura CMS was introduced into rapeseed (Brassica napus) by intergeneric crossing and continuous backcrossing, and a male sterile strain was obtained, but initially it had the drawback of showing chlorosis at low temperature and could not be put into practical use. It was. To overcome this chlorosis, cell fusion was performed between Ogura CMS B. napus and B.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • the Ogura CMS B.oleracea plant of Patent Document 1 was used as the seed parent, and the B.rapa plant was used as the pollen parent for continuous backcrossing to develop the Ogura CMS B.rapa plant that does not cause chlorosis. It is cultivated from the seeds of Sakata Co., Ltd.
  • Non-Patent Document 4 CMS in petunia has been known for a long time, and its causative gene, S-pcf, is widely used as a research material.
  • S-pcf causative gene
  • F1 varieties using this CMS are rarely used at present because they cause flowering delay and flower bud development arrest (Non-Patent Document 4).
  • the existing Ogura CMS B.rapa plant has a problem that its growth is reduced as compared with the B.rapa plant having a normal cytoplasm because the affinity between the nuclear genome and the mitochondrial genome is insufficient.
  • the present invention provides Ogura CMS B. rapa plants that do not reduce growth, and the Ogura CMS B. rapa plants. It is an object of the present invention to provide a method for producing F1 seeds of a B. rapa plant that does not reduce the growth of the plant.
  • the present inventors have made the existing Ogura CMS B.rapa plant a cytoplasmic donor, and accept the B.rapa interspecific hybrid plant having high redifferentiation ability and normal cytoplasm.
  • asymmetric cytoplasmic fusion makes it possible to improve the mitochondrial genome, create an Ogura CMS B.rapa plant that does not reduce growth, and use the Ogura CMS B.rapa plant to improve growth. It was found that the Ogura CMS B.rapa plant was obtained.
  • the present invention is based on these findings. That is, according to the present invention, the following invention is provided.
  • ⁇ 4> Any of the above ⁇ 1> to ⁇ 3> obtained by performing asymmetric cell fusion using a cytoplasmic male sterile Brassica plant having a cytoplasmic male sterility gene derived from a Raphanus sativus plant as a cytoplasmic donor parent. Cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant, or its progeny.
  • Cytoplasmic male sterility of any of the above ⁇ 1> to ⁇ 3> obtained by performing asymmetric cell fusion using a cytoplasmic male sterility Brassica genus plant derived from a cytoplasmic male sterility Brassica plant as a cytoplasmic donor parent. Sterile Brassica rapa plant, or its progeny.
  • Cytoplasmic male sterility obtained by performing asymmetric cell fusion using a cytoplasmic male sterility Brassica rapa plant derived from a Brassica oleracea plant as a cytoplasmic donor parent, and which is any of the above ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • ⁇ 7> The above ⁇ 1> to obtained by performing asymmetric cell fusion using an existing cytoplasmic male sterile Brassica genus plant as a cytoplasmic donor and a Brassica rapa interspecific hybrid plant having a normal cytoplasm as a cytoplasmic acceptor. Any of the ⁇ 4> cytoplasmic male sterile Brassica rapa plants, or progeny.
  • cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant according to any one of ⁇ 3> to ⁇ 7> above, or a progeny thereof, wherein the interspecific hybrid plant is derived from the Brassica oleracea plant and the Brassica rapa plant.
  • ⁇ 9> The interspecific hybrid plant according to any one of ⁇ 3> to ⁇ 8>, wherein the interspecific hybrid plant has a high redifferentiation ability.
  • ⁇ 10> The cytoplasmic male sterility Brassica rapa plant according to ⁇ 7>, or a progeny thereof, wherein the existing cytoplasmic male sterility Brassica genus plant is an existing cytoplasmic male sterility Brassica rapa plant.
  • ⁇ 11> The cytoplasmic male sterility Brassica rapa plant of ⁇ 7>, or its progeny, wherein the existing cytoplasmic male sterility Brassica genus plant is derived from the cytoplasmic male sterility Brassica oleracea plant.
  • cytoplasmic male sterility Brassica rapa plant according to any one of ⁇ 4> to ⁇ 11> above, or a progeny thereof, wherein the cytoplasmic donor has the cytoplasmic male sterility gene orf138.
  • Cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant having DNA derived from the mitochondrial genome of Raphanus sativus plant, Brassica oleracea plant and Brassica rapa plant in the mitochondrial genome, or its progeny. Cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant, or its progeny, obtained by performing asymmetric cell fusion using a Brassica rapa interspecific hybrid plant with normal cytoplasm as the cytoplasmic acceptor.
  • Cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13> above, which contains a plant-derived mitochondrial genome identified by accession number FERM BP-22371 or accession number FERM BP-22372, or thereafter. Substitute.
  • At least one of the mitochondrial DNAs identified by the mitochondrial genome markers BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K, and BrMt-185K is of the Brassica rapa type. 1> ⁇ ⁇ 14> Cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant, or its progeny.
  • At least one of the mitochondrial DNAs identified by the mitochondrial genome markers BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K is of the Brassica oleracea type, described above ⁇ 1> to ⁇ 14> Any Brassica rapa plant, or its progeny.
  • Mitochondrial genome markers BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K The mitochondrial DNA identified by BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K, and BrMt-215K is Brassica rapa.
  • the Mitochondrial DNA identified by BrMt-208K is a Brassica oleracea type, any of the above ⁇ 1> to ⁇ 14> Brassica rapa plants, or its progeny.
  • Cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant having the mitochondrial genome of the plant identified by accession number FERM BP-22371 or accession number FERM BP-22372 is used as a cytoplasmic donor and has normal cytoplasm among Brassica rapa species.
  • ⁇ 21> A part of the cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant or its progeny plant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 20>.
  • ⁇ 22> The seed of the cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant or its progeny according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 20>.
  • ⁇ 23> Mitochondria contained in the cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 20>, or its progeny, a part of the plant body of ⁇ 21>, or the seed of ⁇ 22>. genome.
  • ⁇ 24> Equivalent to a Brassica rapa plant having a normal cytoplasm, including asymmetric cell fusion using an existing cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant as a cytoplasmic donor and a Brassica rapa plant having a normal cytoplasm as a cytoplasmic acceptor.
  • the method for producing ⁇ 24>, wherein the Brassica rapa plant having a normal cytoplasm is an interspecific hybrid plant of the Brassica rapa plant or a plant derived thereto.
  • cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 20> or its progeny is used as a seed parent, and a Brassica rapa plant capable of mating with the plant is mated as a pollen parent, and after mating.
  • a method for producing a F1 hybrid seed which comprises collecting a F1 hybrid seed from a seed parent.
  • Cytoplasmic male sterility including any of the above ⁇ 1> to ⁇ 20>, including continuous backcrossing of any Brassica rapa plant to the Brassica rapa plant or its progeny, and cytoplasmic replacement.
  • cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant with improved growth and above all, an Ogura CMS B. rapa plant with improved growth.
  • Growth is achieved by using the cytoplasmic male sterile B.rapa plant with improved growth according to the present invention as the seed parent and the B.rapa plant having normal cytoplasm as the pollen parent for F1 seed collection of the B.rapa plant. It becomes possible to efficiently collect F1 seeds of B. rapa plants that do not decrease.
  • Cytoplasmic male sterile Brassica rapa plant with improved growth and its progeny presents a cytoplasmic male sterile B. rapa plant or progeny with improved growth compared to existing cytoplasmic male sterile B. rapa plants. Regarding. This can be described as a cytoplasmic male sterile B.rapa plant, or its progeny, which has growth equivalent to that of a B.rapa plant having a normal cytoplasm, as described above.
  • normal cytoplasm is typically used to mean that the cytoplasm of a plant exhibiting male sterility, that is, the male sterility cytoplasm, is normal without showing sterility. ..
  • “equivalent” in the case of “growth equivalent to B. rapa plant having normal cytoplasm” means “equivalent” to B. rapa plant having normal cytoplasm when the growth property is measured by the weight of the above-ground part of the plant body. It means that the measured value in the target plant is within a range that can fluctuate within 25% (preferably within 20%, more preferably within 15%, and further preferably within 10%) as compared with the value. Therefore, for example, when the measured value of the target plant is 90% of the value of the normal plant with respect to the value of the above-ground weight of "B.rapa plant having normal cytoplasm", the above-mentioned The variation corresponds to 10%. Equivalence does not exclude cases that exceed the growth of "B. rapa plants with normal cytoplasm".
  • progeny includes a progeny using a B. rapa plant having a normal cytoplasm, and a cytoplasmic male sterile B. rapa plant with improved growth according to the present invention, which is hybridized with the plant. Hybrids obtained by crossing with possible B. rapa plants are also included. Therefore, for the "progeny", for example, the cytoplasmic male sterile B.rapa plant with improved growth according to the present invention is used as the seed parent (female parent), and the B.rapa plant capable of mating with the plant is used as the pollen parent (pollen parent). It also includes those obtained by mating as a male parent).
  • progeny includes, for example, a plant produced by cell fusion of a cytoplasmic male sterile B. rapa plant having improved growth according to the present invention and a plant capable of being fused with the B. rapa plant, or interspecific crossing. Plants are also included.
  • the "B. rapa plants” are bok choy (B. rapa var. Chinensis), cub (B. rapa var. Rapa), Mizuna (B. rapa var. Laciniifolia), hakusai (B. rapa var. Pekinensis), It is preferably Komatsuna (B. rapa var. Perviridis), Taasai (B. rapa var. Narinosa), or an interspecies hybrid plant between these and related species.
  • the cytoplasmic male sterility B. rapa plant or its progeny with improved growth of the present invention is the mitochondrial genome of the orf138 gene, which is a cytoplasmic male sterility gene derived from the R. sativus plant.
  • the mitochondrial genome more preferably DNA derived from the mitochondrial genome of Raphanus sativus plant, Brassica oleracea plant and Brassica rapa plant, and more preferably the orf138 gene and B. oleracea derived from R. sativus plant. It has a recombinant mitochondrial genome of plants and B. rapa plants.
  • asymmetric cell fusion means that one of the nuclear genomes of the isolated protoplasts used for cell fusion is previously destroyed before being fused, and then cell fusion is performed using the nuclear genome.
  • a cytoplasm donor a cell that destroys the nuclear genome during fusion and donates the cytoplasm to the fused cell by cell fusion.
  • a cytoplasmic accepting parent is a substance that maintains the nuclear genome without destroying it during fusion and accepts the cytoplasm from the cytoplasmic donor parent.
  • the cytoplasmic male sterility B.rapa plant with improved growth of the present invention uses the existing cytoplasmic male sterility B.rapa plant as the cytoplasmic donor parent and uses normal cytoplasm. It can be obtained by performing asymmetric cell fusion using a B. rapa interspecific hybrid plant as a cytoplasmic acceptor.
  • the existing cytoplasmic male sterile B.rapa plant means a cytoplasmic male sterile B.rapa plant before the growth is improved by the present invention.
  • the existing cytoplasmic male sterile B.rapa plant has room for improvement in growth, that is, the growth is reduced as compared with the B.rapa plant having normal cytoplasm. Means.
  • the existing cytoplasmic male sterility Brassica rapa plant is a cytoplasmic male sterility Brassica rapa plant derived from the cytoplasmic male sterility Brassica oleracea plant.
  • the cytoplasmic male sterile Brassica oleracea plant referred to here can be produced with reference to JP-A-07-031307, and as a typical example, it was developed by Sakata Seed Corporation and is a B. oleracea crop.
  • the CMS system "Cabbage MS-2" Japanese Patent Laid-Open No. 07-031307) used in the above can be mentioned.
  • the cytoplasm of "Cabbage MS-2” is used in commercially available broccoli varieties “Grandome", “Pixel” and the like, and can be easily obtained.
  • the cytoplasmic male sterility Brassica genus plant having a cytoplasmic male sterility gene derived from Raphanus sativus is typically a plant having an Ogura CMS gene, as described above.
  • At least one of the identified mitochondrial DNAs is of the Brassica rapa type.
  • the above-mentioned "at least any one” is more preferably “at least any two", further preferably “at least any three", and even more preferably "at least any four”. ..
  • DNA is of Brassica rapa type
  • At least one of the DNAs is of the Brassica oleracea type.
  • the above-mentioned "at least any one” is more preferably “at least any two", further preferably “at least any three", and even more preferably "at least any four”. ..
  • the mitochondrial DNA identified by the mitochondrial genomic markers BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K in the Brassica rapa plant of the present invention or its progeny is Brassica. It is an oleracea type.
  • At least one of the mitochondrial DNAs identified is of the Brassica oleracea type.
  • the above-mentioned "at least any one” is more preferably “at least any two", further preferably “at least any three", and even more preferably "at least any four”. ..
  • the mitochondrial DNA identified by -199K, BrMt-213K, and BrMt-215K is of the Brassica rapa type and is a mitochondrial genome marker BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K,
  • the mitochondrial DNA identified by BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, and BrMt-208K is of the Brassica oleracea type.
  • the cytoplasmic male sterile B. rapa plant with improved growth according to the present invention, or its progeny is the same as Accession No. FERM BP-22371 or FERM BP-22372 (described later).
  • the term "part of a plant" of a cytoplasmic male sterile B. rapa plant with improved growth or its protoplasts is derived from one or more cells or one or more cells of the plant. It contains a cytoplasm, specifically, an organ or tissue such as a flower, a leaf, a stem, a root, or a cell (including a protoplast prepared from a cell) or a cytoplasm from these organs or tissues, or the cell. Or it means an aggregate of cytoplasm.
  • the cytoplasmic male sterile B.rapa plant with improved growth can be produced, for example, according to the following procedure. (1) Creation of cytoplasmic receptor parents with high redifferentiation ability and normal cytoplasm (2) Preparation of protoplasts (i) Isolation of protoplasts of B.
  • rapa interspecific hybrid plants with normal cytoplasm ii) Existing Isolation of protoplasts from cytoplasmic male sterility B.rapa plants (3) Fusion treatment of protoplasts (4) Culture of fused hybrid cells (5) Selection of cytoplasmic hybrid plants with cytoplasmic male sterility (6) Plants from callus Regeneration of the body (7) Acquisition of protoplasts and selection of excellent strains
  • production method can also be rephrased as the "production method”. That is, the terms “production” and “manufacturing” here are used interchangeably.
  • cytoplasmic receptor parent with high redifferentiation ability and normal cytoplasm
  • the cytoplasm that expresses male sterility is other than male sterility. It is important that it does not affect the traits of.
  • mitochondrial genome recombination occurs randomly, so there is a high probability that recombinant mitochondria that maintain male sterility without defective traits will be obtained. Since it is low, it is necessary to produce a large number of cytoplasmic hybrids and select excellent individuals.
  • B.rapa plants are more difficult to regenerate from fused cells obtained by asymmetric cell fusion than B.oleracea and B.napus plants of the same Brassica genus. Efficient methods for producing cytoplasmic hybrid plants of plants have not been reported. Therefore, it is indispensable to develop a method for efficiently producing a large number of cytoplasmic hybrids.
  • the cytoplasmic hybrid plant refers to a plant in which the cytoplasm is in a hybrid state, and refers to a plant obtained by performing cell fusion (preferably here, asymmetric cell fusion).
  • B. oleracea plants are known to have high redifferentiation ability from cultured cells.
  • the redifferentiation ability of B. rapa plants is low, and the examples of successful regeneration of plants from cultured cells are limited to specific varieties. Therefore, in order to increase the production efficiency of cytoplasmic hybrids, first, an interspecific hybrid plant is produced using a normal cytoplasmic B. rapa plant as a seed parent and a B. oleracea plant as a pollen parent, and B. has a high redifferentiation ability. It is desirable to produce interspecific hybrid plants of rapa plants and B. oleracea plants and use them as cytoplasmic acceptors.
  • B.rapa and B.oleracea interspecific hybrid plants with high redifferentiation ability may be referred to as "B.rapa interspecific hybrid plants”.
  • the obtained B.rapa interspecific hybrid plant has a normal cytoplasmic B.rapa plant as a seed parent, and has the same cytoplasm as the normal cytoplasmic B.rapa due to maternal inheritance of the cytoplasm, and is redifferentiated. It is desirable as a property of cytoplasmic acceptor because of its improved ability.
  • high redifferentiation ability means that the ability to redifferentiate from callus cells to plants is high, and the redifferentiation rate (redifferentiation) one month after placing the callus in the redifferentiation medium.
  • the number of differentiated callus / the number of callus placed in the redifferentiation medium) is 30% or more, more preferably 50% or more.
  • the diploidy produced by artificially doubling the above B.rapa interspecific hybrid plant is backcrossed as the seed parent and the normal cytoplasmic B.rapa plant as the pollen parent, and the obtained progeny is tissueed.
  • triploid B. rapa interspecific hybrid plants with high redifferentiation ability can be obtained.
  • a diploid B.rapa interspecific hybrid plant close to B.rapa is obtained. Since female fertility increases as the diploid approaches, it is desirable to use these B. rapa interspecific hybrid plants as cytoplasmic receptive parents.
  • the B.rapa plant used as the cytoplasmic acceptor is the interspecific B.rapa plant of (1) above. It is preferable to use a hybrid plant, more preferably a B.rapa interspecific hybrid plant grown by backcrossing B.rapa.
  • mesophyll tissue having high yield and high mitotic activity
  • other tissues such as hypocotyl, stem and callus may also be used as materials. ..
  • the method for isolating the protoplast may be a commonly used method known in the art (for example, the method described in Matsumoto, E, Plant cell reports, 1991. vol9 (10), etc.) and is not particularly limited.
  • the following shows procedures as specific examples, but the present invention is not necessarily bound by them.
  • the cell tissue of the B. rapa plant is shredded, and the protoplast is isolated by enzyme treatment using an enzyme solution for protoplast isolation.
  • This solution is an inorganic salt buffer solution mainly containing a cell wall degrading enzyme and an osmoregulator.
  • the cell wall degrading enzyme is not particularly limited as long as it can be used for decomposing the cell wall of a plant, and examples thereof include cellulase, hemicellulase, and pectinase.
  • a combination of cellulase Y-C and macerozyme R-10 is preferable.
  • osmoregulator general sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, glucose and the like can be used, mannitol is preferable, and mannitol having a concentration of 0.3M to 0.7M is particularly preferable.
  • an inorganic salt to the enzyme solution in order to stabilize the protoplast membrane.
  • a CPW salt (Cocking and Peberdy, 1974) having the composition shown in Table 1 below. is there.
  • the enzyme treatment is preferably a standing treatment at 25 to 30 ° C. for 8 to 20 hours.
  • Protoplasts isolated by enzyme treatment are filtered through a nylon mesh with a pore size of 30 to 100 ⁇ m, centrifuged to collect protoplasts, and the enzyme solution is removed. The protoplasts are then suspended in the wash solution to wash the protoplasts.
  • a commonly used CPW salt solution to which sugar alcohols are added as an osmotic pressure adjusting agent can be used.
  • the inactivation treatment can be carried out by suspending protoplasts in a CPW salt solution or the like in which an iodine compound such as iodoacetic acid or iodoacetamide is dissolved.
  • an iodine compound such as iodoacetic acid or iodoacetamide is dissolved.
  • the suspension of protoplasts also contains fragments of conduits and cells, it is preferable to further purify the protoplasts by a density gradient centrifugation method or the like.
  • the reagent used for purification include saccharides and synthetic colloids.
  • the use of a sucrose solution is preferable, and the use of a sucrose solution of 15% to 20% is particularly preferable.
  • the cell density is measured by a hemocytometer, and the liquid volume is adjusted with a CPW salt solution so that the cell density is suitable for cell fusion.
  • the cell density of protoplast is preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells / ml, and the use of CPW salt solution is preferable for adjusting the liquid volume.
  • cytoplasm of "Cabbage MS-2" can be used directly, but it is also subjected to nuclear replacement by continuous backcrossing of the conventional B.rapa plant to produce and use a cytoplasmic male sterile B.rapa plant. It is more desirable to do.
  • Isolation of the protoplasts of existing cytoplasmic male sterile plants can be performed, for example, according to the same method as the isolation of protoplasts of B. rapa interspecific hybrid plants described above.
  • the isolated protoplast of the existing cytoplasmic male sterile B. rapa plant whose nucleus is inactivated by radiation treatment examples include X-rays, ⁇ -rays, ultraviolet rays, and the like, but the radiation is not particularly limited as long as it can destroy the nucleus.
  • the irradiation dose is preferably as low as possible within the range in which the nucleus can be destroyed. For example, in the case of soft X-ray irradiation in the present invention, an irradiation amount of 100 Gy to 900 Gy is preferable.
  • Protoplast fusion treatment both types of protoplasts obtained above are mixed and cell fusion is performed.
  • fusion method conventional methods, for example, known electric fusion method (Planta, 151, 26-32, 1981), PEG (polyethylene glycol) method (Planta, 120, 215-227, 1974), dextran method (Jap) . J. Genet., 50, 235, 1975), etc., but are not particularly limited.
  • the PEG method is preferably used.
  • the cells obtained by the fusion treatment are preferably cultured in a medium suitable for culturing protoplasts derived from B. rapa interspecific hybrid plants.
  • the method for culturing protoplasts derived from interspecific hybrid plants of B. rapa and B. oleracea, which have high redifferentiation ability, is not particularly limited as long as it is appropriately modified based on the method for culturing Brassica protoplasts.
  • cytoplasmic hybrid plants with cytoplasmic male sterility The fusion cells are cultured, and when cell division is started and the callus can be visually confirmed, the callus is transplanted into the callus growth medium.
  • Conventional callus growth medium can be used, and the reaction varies depending on the genotype of the plant used as the material and the state of callus, but for example, 1.0 to 5.0 mg / l NAA and 0.1 to 3.0 mg. It is preferable to use an MS medium containing / l 4-CPPU.
  • the causative gene for cytoplasmic male sterility in Ogura CMS has been identified as orf138 in the mitochondrial genome. Therefore, in order to select an individual having cytoplasmic male sterility from the obtained callus, DNA is extracted from the callus grown by the above procedure, and a PCR method is used using a marker capable of specifically amplifying orf138. It is preferable to detect by.
  • the obtained callus having orf138 is transplanted to a redifferentiation medium and redifferentiated.
  • a redifferentiation medium a conventional medium can be used, and the reaction varies depending on the genotype of the plant used as the material and the state of callus, but for example, 0.1 to 1.0 mg / l NAA and 0.1 to 1. It is preferable to use an MS medium containing 0 mg / l 4-CPPU.
  • the regenerated shoots are transplanted to an MS medium or the like to which 3% sucrose and 0.8% agar are added to root them, and the plants are regenerated.
  • the regenerated plants are acclimatized and grown in the greenhouse.
  • the nucleus of the cytoplasmic donor is generally destroyed by radiation treatment, but the destruction of the nuclear genome is not complete, and a part of the genome is often taken up by the cytoplasmic recipient parent.
  • a plurality of protoplasts derived from the cytoplasmic donor parent or protoplasts of the cytoplasmic recipient parent may be fused, so that aneuploidy or higher-order polyploidy is often generated.
  • Higher-order polyploids of octaploids and above are likely to be difficult to redifferentiate, and it is difficult to obtain progeny due to decreased female fertility. Therefore, the DNA content was measured by flow cytometry. It is desirable to exclude higher-order polyploids higher than diploids.
  • Recombination of the mitochondrial genome by asymmetric cell fusion occurs frequently and randomly, so it is desirable to produce 50 or more cytoplasmic hybrid plants.
  • cytoplasmic hybrid plants are cultivated and bloomed, individuals having male sterility traits are selected, and any B. rapa plant having normal cytoplasm is bred as a pollen parent. .. Pollen parents should use any B. rapa plant with multiple genetically diverse normal cytoplasms, as cytoplasmic hybrid plants are often aneuploids or higher-order polyploids and difficult to obtain progeny. Is desirable. Embryo culture is often required to obtain progeny from the resulting cytoplasmic hybrid plants.
  • Embryo culture is a technique for removing embryos and growing them on an appropriate medium when the embryos grow insufficiently after pollination and die as they are.
  • the method of embryo culture can be carried out by a conventional method, but in the present invention, the embryo is extracted from the ovule 7 to 10 days after mating, 3% sucrose, 10% coconut water (Sigma-Aldrich), 0. It is desirable to culture on a 1/2 concentration MS medium supplemented with 8% agar.
  • the regenerated shoots are transplanted to an MS medium or the like to which 3% sucrose and 0.8% agar are added to root them, and the plants are regenerated.
  • the regenerated plants are acclimatized and grown in the greenhouse. When the regenerated plant blooms, male sterile individuals are selected.
  • Mating with any B. rapa plant having this normal cytoplasm as a pollen parent and subsequent embryo culture will continue until progeny seeds are obtained from male sterile individuals.
  • Individuals for which progeny seeds have become available undergo continuous backcrossing with B. rapa plants having a specific normal cytoplasm as pollen parents.
  • the B.rapa plant having a specific normal cytoplasm produces a genetically fixed lineage in which the growth is significantly reduced when continuous backcrossing is performed on the existing cytoplasmic male sterile B.rapa plant. It is desirable to select in advance.
  • Example 1 Method for producing Ogura CMS B. rapa plant with improved growth
  • B.rapa "SH" is used for the purpose of imparting high redifferentiation ability.
  • W potash flower
  • Embryos were removed from the ovules 10 days after mating in a sterile environment and placed in a 1/2 concentration MS medium containing 3% sucrose, 10% coconut water (Sigma-Aldrich), and 0.8% agar. , Embryo culture was performed. Two weeks later, the grown seedlings were transplanted into MS medium supplemented with 3% sucrose and 0.8% agar.
  • Six interspecific hybrids (F1) were obtained by embryo culture.
  • the petioles of "SH" and various inter-hybrids were cut to a length of 5 mm, placed on an MS medium supplemented with 1 mg / l 2,4-D, 3% sucrose, and 0.8% agar, and cultured for 3 weeks. .. Callus grown to a size of about 1 cm is cut into 1 mm sizes and put into an MS medium containing 0.3 mg / l 4-CPPU, 0.3 mg / l NAA, 3% sucrose, and 0.8% agar. The cells were placed on the bed, cultured for 1 month, and the redifferentiation rate was investigated.
  • Embryos were removed from the ovules 10 days after mating in a sterile environment and placed in a 1/2 concentration MS medium containing 3% sucrose, 10% coconut water (Sigma-Aldrich), and 0.8% agar. , Embryo culture was performed. Two weeks later, the grown seedlings were transplanted into MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose. Seven interspecific hybrids (F1BC1) were obtained by embryo culture.
  • the petioles of various interhybrid were similarly cut to a length of 5 mm, placed on MS medium supplemented with 1 mg / l 2,4-D, 3% sucrose, and 0.8% agar, and cultured for 3 weeks. did. Callus grown to a size of about 1 cm is cut into 1 mm sizes and put into an MS medium containing 0.3 mg / l 4-CPPU, 0.3 mg / l NAA, 3% sucrose, and 0.8% agar. The cells were placed on the bed, cultured for 1 month, and the redifferentiation rate was investigated.
  • the petioles of various interhybrid (F1BC2) individuals were cut to a length of 5 mm, placed on an MS medium supplemented with 1 mg / l 2,4-D, 3% sucrose, and 0.8% agar, and cultured for 3 weeks. did.
  • Callus grown to a size of about 1 cm is cut into 1 mm sizes and put into an MS medium containing 0.3 mg / l 4-CPPU, 0.3 mg / l NAA, 3% sucrose, and 0.8% agar.
  • the cells were placed on the bed, cultured for 1 month, and the redifferentiation rate was investigated.
  • F1BC2 has a high redifferentiation rate of 83% for "SH-WC4D-S5-X12" and 89% for "SH-WC4D-S5-X32", although the difference is large depending on the strain.
  • the redifferentiation rate was shown. Since “SH-WC4D-S5-X12” has low female fertility, we decided to try “SH-WC4D-S5-X32" with high female fertility as a cytoplasmic acceptor.
  • the enzyme solution containing leaf tissue was filtered through a 92 ⁇ m nylon mesh to remove cell residues.
  • the obtained protoplast suspension was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes.
  • the obtained protoplast after removing the supernatant was suspended in 5 ml of a CPW salt solution containing 15 mM iodoacetamide and incubated at 4 ° C. for 15 minutes. After incubation, the iodoacetamide-treated protoplast suspension was centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed. 10 ml of CPW salt solution was added to the protoplast suspension, and the operation of centrifuging at 800 rpm for 5 minutes to remove the supernatant was repeated 3 times to wash the protoplast.
  • the washed protoplast suspension was centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and 2 ml of CPW salt solution was added to suspend the protoplast.
  • 5 ml of a CPW salt solution containing 20% sucrose was added to a new centrifuge tube, the suspension of the above protoplast was layered on it, and centrifugation was performed at 800 rpm for 5 minutes.
  • the cell debris sank to the bottom of the centrifuge tube and the purified protoplasts floated into the upper CPW salt solution layer and were transferred to a new centrifuge tube with a Pasteur pipette. A small amount of the suspension was taken, the cell density of protoplast was determined using a hemocytometer, and CPW solution was added to prepare 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the sterilized seeds were placed on an MS medium containing 3% sucrose and 0.8% agar, and grown at 20 ° C. for 16 hours under illumination for about 1 month. Approximately 1 g of the developed true leaf was collected, chopped to a size of approximately 2 mm, and then immersed in 10 ml of a CPW salt solution containing 0.3% cellulase Y-C, 0.3% macerozyme R-10, and mannitol. The mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 16 hours.
  • the enzyme solution containing leaf tissue was filtered through a 92 ⁇ m nylon mesh to remove cell residues.
  • the protoplast was transferred to a plastic petri dish with a Pasteur pipette and irradiated with 900 Gy of soft X-rays.
  • the obtained protoplast suspension was transferred to a centrifuge tube, centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and 2 ml of CPW salt solution was added to suspend the protoplast.
  • 5 ml of a CPW salt solution containing 20% sucrose was added to a new centrifuge tube, the suspension of the above protoplast was layered on it, and centrifugation was performed at 800 rpm for 5 minutes.
  • the cell debris sank to the bottom of the centrifuge tube and the purified protoplasts floated into the upper CPW salt solution layer and were transferred to a new centrifuge tube with a Pasteur pipette.
  • a small amount of the suspension was taken, the cell density of protoplast was determined using a hemocytometer, and a CPW salt solution was added to prepare 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • CPW salt solution After 1 minute, 3.5 ml of CPW salt solution was added dropwise around the protoplast mixture. After another 2 minutes, 3.5 ml of CPW salt solution was added dropwise around the protoplast mixture. After 5 minutes, the dropped liquid was gently sucked up and removed from the edge of the petri dish, and 20 ml of CPW salt solution was added from the edge of the petri dish. The operation of washing with this CPW salt solution was repeated 3 times at 5-minute intervals.
  • the cells attached to the bottom of the petri dish were peeled off by rubbing with the tip of a tweezers, and 7.5 ml of a solution containing 0.2 M mannitol, 4% sucrose, and 0.6% gellan gum was added. , A semi-solid gel medium was formed by mixing, and the culture was continued.
  • callus Approximately one month after the start of culturing, the callus became visible to the naked eye, so callus was added to the callus growth medium (1 mg / l 4-CPPU, 3 mg / l NAA, 3.0% sucrose, 0.8% agar). The MS medium containing the mixture was transplanted to pH 5.8). As for callus, 464 individuals were obtained from 13 fusion treatment experiments.
  • PCR was performed using the extracted whole genomic DNA as a template and each combination of primers orf138-1F and orf138-2R. For PCR, heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 60 ° C. for 2 minutes, and extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes were repeated for 35 cycles.
  • the PCR product was electrophoresed on a 1.8% agarose gel, immersed in an ethidium bromide solution, and then photographed under UV irradiation to select individuals having a band of the expected size (376 bp).
  • 154 calluses had the orf138 gene and were considered to be cytoplasmic hybrid cells.
  • Callus started shoot differentiation 2 weeks after transplantation into the redifferentiation medium.
  • the differentiated shoots were rooted by transplanting them into MS medium (pH 5.8) containing 3.0% sucrose and 0.8% agar.
  • MS medium pH 5.8
  • a redifferentiation medium containing 3.0% sucrose and 0.8% agar.
  • 154 calluses having the orf138 gene in (5) into a redifferentiation medium and subculturing them, 68 lines of redifferentiated plants were obtained.
  • the cytoplasmic hybrid plants were transplanted to a 50-well cell tray and acclimatized, and after acclimatization, seedlings were raised in a glass greenhouse.
  • the cytoplasmic hybrid plant When the ploidy of the cytoplasmic hybrid plant was tested by a flow cytometer, it was diploid to octaploid including aneuploidy.
  • the aneuploidy was caused by the introduction of a part of the genome of the cytoplasmic donor parent irradiated with soft X-rays. For plants with polyploidy within octaploid, progeny may be obtained, so seedling raising of all individuals was continued in this experiment.
  • the cytoplasmic hybrid plants were raised in a glass greenhouse for 1 month, then stored in a refrigerator (8-hour lighting) set at 4 ° C. and subjected to vernalization treatment for 2 months. After vernalization, cytoplasmic hybrid plants were transplanted into 15 cm pots. Within 1 to 2 months after the vernalization treatment, 49 of the 68 cytoplasmic hybrid plants reached flowering, but 11 did not bloom due to morphological abnormalities, and 8 were genetically weak. It died because of it. Of the 49 flowering lines, 29 lines developed male sterility, and the remaining 20 lines were male fertile. Of the 20 strains that were male fertile, one strain had lost the orf138 gene, but 19 strains showed complete or partial male fertility despite carrying the orf138 gene. ..
  • cytoplasmic hybrid plants produced by asymmetric cell fusion have the mitochondrial genome recombined and the heteroplasmy state continues for 5 generations or more. Therefore, the orf138 gene was considered to have completely disappeared in the process of mitochondria moving from the heteroplasmy state to the homoplasmy state. In addition, even if the orf138 gene was introduced, there were cases in which male sterility became unstable due to its lack of quantity.
  • each cytoplasmic hybrid line was divided into many lines due to differences in characteristics thought to be due to heteroplasmy, but growth, male sterility stability, seed collection, and flowers. Selection was repeated from the mold, and finally "J1" with the best trait was selected. "J1" was lined in each generation of continuous backcrossing, but two lines, "J1-3” and “J1-7", were finally selected due to the difference in growth. That is, “J1-3” and “J1-7”, which are branches of "J1", are lines derived from the same fused cell, but the mitochondria after cell fusion are in a heteroplasmic state to a homoplasmic state. It was divided into BC4 generations in the process of going to. The growth of "J1-3” was higher than that of the normal cytoplasmic line, and that of "J1-7” was equal to or slightly higher than that of the normal cytoplasmic line.
  • Example 2 Evaluation of Growth of "J1-3" and "J1-7" In order to confirm the usefulness of the improved CMS strain produced by Example 1, B. rapa plants having normal cytoplasm and CMS cytoplasm A comparative test of growth was performed.
  • the seeds of the collected "SH” and each CMS strain were sown in a 50-hole cell tray and cultivated in an artificial weather room set to a day temperature of 20 ° C., a night temperature of 10 ° C., and lighting for 16 hours.
  • the above-ground part of the seedlings of each line was cut off at the ground, and the weight per plant was weighed and shown in Table 6.
  • the generations in the table indicate the number of times "SH” was continuously backcrossed, for example BC7 means that "SH" was used as the pollen parent for 7 consecutive backcrosses.
  • the existing Ogura CMS strains derived from "Shiraran oil rape", “Niihao phon", and “Cabbage MS-2” have a relative value of the above-ground weight to "SH” of 60.7, respectively. , 76.0, 63.4, showing low growth.
  • the improved CMS system "J1-3” showed a very high growth property with the relative value of the above-ground weight to "SH” being 130.0.
  • the improved CMS system "J1-7” showed a growth property equivalent to that of "SH", with the relative value of the above-ground weight to "SH” being 105.5.
  • the CMS line derived from "Shiraran oil rape” has a relative value of 77.8 above-ground weight to "SH"
  • the CMS line derived from "Cabbage MS-2” has a above-ground weight relative to "SH”.
  • the relative value of was 85.3, and a decrease in growth was observed. Compared with the test with seedlings, the decrease in growth was small overall, which was considered to be due to the restriction of fertilizer components in the medium by relatively long-term pot cultivation. Comparing the results in Tables 6 and 7, there was a correlation in the order of decreased growth of each CMS line. Therefore, it can be confirmed that the existing Ogura CMS strains derived from "Shiraran oil rape", “Niihao von”, and "Cabbage MS-2” have reduced growth in the background of the "SH” nuclear genome. It was.
  • the improved CMS line "J1-3” showed a very high growth property as in the test at the time of seedling, with the relative value of the above-ground weight to "SH” being 130.0.
  • the improved CMS system “J1-7” showed a growth property equivalent to that of "SH", with the relative value of the above-ground weight to "SH” being 104.4.
  • the existing Ogura CMS B.rapa plant-derived CMS line shows lower growth than the normal cytoplasmic B.rapa plant
  • the improved CMS line of the present invention has a normal cytoplasmic B. It was confirmed that it has the same or higher growth potential than the .rapa plant.
  • Example 3 In order to analyze the mitochondrial genomes of the improved CMS lines "J1-3" and “J1-7” produced in Example 1, known B. rapa mitochondrial genome sequence information (Gene Bank registration number AP017997), known B.oleracea mitochondrial genome nucleotide sequence information (Gene Bank registration number AP012988) and known R. sativus mitochondrial genome nucleotide sequence information (Gene Bank registration number AB694744) were compared and identified SNPs (single nucleotide polymorphisms) and in Based on the -del (insertion / deletion) polymorphism information, markers targeting 35 regions were designed (Table 8, SEQ ID NOs: 1-88 (seq ID-1-ID-88)).
  • a marker for detecting the orf138 gene which is a cytoplasmic male sterility gene derived from the R. sativus plant, was designed based on known nucleotide sequence information (Gene Bank registration number AB055435.1) (Table 8, SEQ ID NO:). 89, SEQ ID NO: 90 (seq ID-89, ID-90)).
  • primers as shown in Table 9 were designed based on the known nucleotide sequence information of the B. rapa chloroplast genome (Gene Bank registration number DQ231548) (Table 9, sequence). Numbers 91 to 92 (seq ID-91 to ID-92)).
  • test materials include B.rapa plant "SH” with normal cytology, B.oleracea plant “G” with normal cytology, R.sativus plant “KN” with Ogura CMS cytology, and the existing CMS line “ “Shiraran oil rape”, “Niihao phon”, “Cabbage MS-2”, and improved CMS strains "J1-3" and "J1-7" were used.
  • PCR Whole genomic DNA was extracted from each test material and used as a template, and PCR was performed using the primer sets shown in Tables 8 and 9.
  • the PCR conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 65 ° C., 60 ° C. or 55 ° C. for 1 minute, extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes, and 30 or 35 cycles of reaction (Table 10).
  • PCR products were treated with the restriction enzymes listed in Table 10 to perform PCR-RFLP analysis to detect polymorphisms among B. rapa plants, B. oleracea plants, and R. sativus plants. These PCR products were electrophoresed on a 1.8% agarose gel, immersed in an ethidium bromide solution, and photographed under UV irradiation to investigate polymorphisms.
  • Table 11 shows the analysis results of the mitochondrial genome using the PCR-RFLP method
  • Table 12 shows the analysis results of the chloroplast genome.
  • “Br” indicates B.rapa type
  • “Bo” indicates B.oleracea type
  • “Rs” indicates R.sativus type.
  • “0” indicates that there is no detection with the marker
  • “1” indicates that there is detection with the marker.
  • the results of mitochondrial genome analysis are summarized in Table 13.
  • the numbers in parentheses in Table 13 indicate the ratio of each mitochondrial genome type to the total number of markers used.
  • the total number of markers here refers to the 35 markers Nos. 1 to 35 in Table 11 used for the analysis of the mitochondrial genome, excluding orf138 among the markers in Table 11.
  • the CMS strains derived from "Shiraran oil rape” and “Niihao von” had chloroplasts derived from B.rapa and had recombinant mitochondrial genomes of B.rapa and R.sativus.
  • the pattern of recombination was exactly the same at 35 markers, suggesting that it was a CMS cytoplasm of the same origin.
  • a chloroplast derived from B.rapa, and a recombinant mitochondrial genome of B.rapa and R.sativus it has an Ogura CMS cytoplasm and a normal cytoplasm. It was considered that it was produced by asymmetric cell fusion with a plant having a cytoplasm of a B.
  • the recombinant mitochondrial genome of the CMS strain derived from "Shirahao Fon" has 63% of B.rapa type mitochondrial DNA and 37% of R. sativus type mitochondrial DNA.
  • the decrease in growth shown in Tables 6 and 7 is derived from the nuclear genome and R. sativus of B. rapa plants because many R. sativus-type mitochondrial genomes were introduced into B. rapa plants together with orf138. It was thought that the cause was the incompatibility between the mitochondrial genomes of.
  • Cabbage MS-2 had 77% of B. oleracea type mitochondrial DNA and 23% of R. sativus type mitochondrial DNA, and its chloroplast was derived from B. oleracea.
  • the decrease in growth shown in Tables 6 and 7 is due to the fact that the chloroplasts are derived from B. oleracea and that they have mitochondrial genomes from B. oleracea and R. sativus. It was thought that it induced an incompatibility with the nuclear genome of the plant and reduced its growth. However, the degree of decrease in growth is intermediate between "Shiraran oil rape" and “Niihao phon” and does not cause obvious growth abnormalities such as chlorosis.
  • the mitochondrial genomes of "J1-3" and "J1-7" produced according to the present invention have 60% of B.rapa type mitochondrial DNA and 31% of B.oleracea type mitochondrial DNA, and are of R. sativus type. The proportion of mitochondrial DNA was only 9%.
  • the method of the present invention increases the efficiency of producing cytoplasmic hybrid plants of B. rapa plants by asymmetric cell fusion, thereby introducing the cytoplasmic male sterility gene orf138 and causing a decrease in growth. It was considered that CMS strains with minimal introduction of the mitochondrial genome of R. sativus could be selected. As a result, it was considered that the obtained CMS strain had an increased affinity between the B. rapa plant and the mitochondrial genome while maintaining cytoplasmic male sterility, and the growth was improved.
  • Any B.rapa plant can be freely converted to CMS by continuous backcrossing with the CMS plant as the seed parent and any B.rapa plant as the pollen parent to perform nuclear substitution. It doesn't matter at all. That is, by using the Ogura CMS B.rapa plant with improved growth, which was deposited in the present invention, any B.rapa plant can be freely converted to CMS.
  • Table 11 show an example of the analysis results of individuals expressing cytoplasmic male sterility, and it is assumed that Ogura CMS B.rapa plants with improved growth always show such a band pattern. Is not always.
  • Example 4 Since the productivity of seeds of CMS lines is directly linked to the productivity of seed parents and commercial seeds, the seed productivity of each CMS line was compared.
  • B.rapa plant "SH” with normal cytoplasm existing CMS line "Shirahao Yuna”, “Niihao Fon”, “Cabbage MS-2”, improved CMS line "J1-3""And” J1-7 "were used.
  • Table 14 shows the results of the average seed collection amount per strain of each strain.
  • the CMS line of "Cabbage MS-2” grew at the same level as the CMS line derived from "Shiraran oil rape” and “Niihao Fong” before the vernalization treatment, but the growth after the vernalization treatment was temporary. It was considered that the growth was extremely poor and it was easily damaged by low temperature.
  • the improved CMS strains "J1-3” and “J1-7” have larger plant sizes than "SH” throughout the period, and as a result, the relative values of the seeds are different, respectively. It was 149.2, 146.7, and it was confirmed that the seed collection was high and there was no problem with female fertility.

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Abstract

本明細書は、正常細胞質を有するBrassica rapa植物と同等の生長性を有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代を開示する。既存の細胞質雄性不稔 B.rapa植物は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの親和性が不十分なため、正常細胞質を有するB.rapa植物に比較して、生長性が低下する問題点があった。本発明の態様によれば、従来の細胞質雄性不稔 B. rapa植物にみられる生長性が低下する点を改善し、生長性が改善された細胞質雄性不稔 B. rapa植物を提供することができる。

Description

生長性が改良された細胞質雄性不稔Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ植物 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１９－７８９０６号（出願日：２０１９年４月１７日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
　本発明は、生長性が改良された細胞質雄性不稔Brassica rapa植物に関する。
　Brassica rapaは、アブラナ科アブラナ属に属し、地中海地方が起源とされている。自然交雑により、様々な形態的特徴を有する亜種に分化し、ハクサイやカブ、コマツナ、パクチョイなど数多くの野菜類へと受け継がれている（非特許文献１）。
　一般的に、植物品種には、固定種と雑種第一代（以下、「Ｆ１」と記す）品種があり、主要作物においてはＦ１品種が普及している。Ｆ１品種は、雑種強勢（ヘテロシス）により生育が旺盛で、生育が速く、収量性が高まるなど大きな利点がある。さらにＦ１品種は、生育が旺盛になることにより、病害虫への耐性や、耐寒・耐暑性などの環境適応性の向上も期待できる。またＦ１品種の遺伝子型はヘテロ性でありながら同一の遺伝子型であるため、表現型は極めて高い均一性を示す。このため、生産物の市場性が高まる。さらにＦ１品種の両親に優性遺伝子に支配されている有用形質を集積できるため、迅速な育種が可能となる。
　以上のような優位性があることから、Ｆ１品種は、主要作物において栽培品種の主流を占めるようになった。
　Ｆ１品種の採種を行う場合、一般に両親は、自殖（近交）系統が用いられ、雑種強勢の効果が大きい組み合わせ等の中で、種子親と花粉親が選定される。種子親は、自家受精を防ぐため除雄を行う必要があるが、人手による除雄は、極めて多大な労力が必要となる。そこで、遺伝的な雄性不稔性である細胞質雄性不稔（Cytoplasmic Male Sterility（以下において、「ＣＭＳ」と記す））系統を種子親に用いれば、人手による除雄の作業が不要となり、Ｆ１種子を経済的かつ大量に生産することができる。ＣＭＳを利用したＦ１種子の生産は、ヒマワリ、テンサイ、ジャガイモ、コムギ、ニンジン、タマネギ、ネギ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、ダイコン、およびハクサイなどで商業的な生産システムが確立されている。
　アブラナ科作物の中で、最も利用されているＣＭＳは、Ogura CMSであり、Raphanus sativus 、Brassica oleracea、Brassica juncea、Brassica napus等で利用されている。Ogura CMSは、品種名不明の日本型ダイコンから発見され、今日までダイコンにおけるF1品種の開発に広く利用されている。さらに、Ogura CMSは、属間交雑と連続戻し交雑によって、ナタネ（Brassica napus）に導入され、雄性不稔系統が得られたが、当初は低温でクロロシスを示す欠点を持っており実用化できなかった。このクロロシスを克服するため、Ogura CMS B.napus と正常な細胞質を有するB.napusの間で細胞融合が行われた。得られた再生植物は、ダイコン由来の葉緑体が、B.napus由来の葉緑体に置換されており、低温下でも正常に生育した。B.napusでは、細胞融合を用いることにより、実用的なCMS系統が作出されている（非特許文献２）。
　その後、B.oleraceaとR.sativusの間でも同様に細胞融合が行われ、クロロシスを引き起こさないOgura CMS B.oleracea植物が作出され、ブロッコリー、キャベツなどのＦ１品種の開発において実用化されている（特許文献１）。
　B.rapa植物においても、特許文献１のOgura CMS B.oleracea植物を種子親とし、B.rapa植物を花粉親として連続戻し交雑を行い、クロロシスを引き起こさないOgura CMS B.rapa植物が開発され、株式会社サカタのタネから品種化されている。
　しかしながら、育種の過程では、多くの親系統やＦ１系統において、生長性の低下が認められていた。そのため、自家不和合性（Self Incompatibility（以下において、「ＳＩ」と記す））利用Ｆ１と比較して、既存のＣＭＳ　を利用したＦ１では一般的に、その生長性が低下することが顕著であった。したがって、B.rapa植物では、ＣＭＳ利用のＦ１化が進んでいなかった。
　例えば、コマツナ、チンゲンサイ等の軟弱野菜では、種子を段播きして、計画的に栽培し、一斉収穫することから、播種から収穫までの熟期の均一性は非常に重要で、農家の収益に直結する特性である。ここでの生長性の低下の問題は、収穫期が３日遅れることで、市場性が著しく低下し、品種としての価値を失ってしまうほど深刻である。また、収穫までの生育が比較的長いハクサイなどにおいても、同様に収穫期が５日程度ずれることで、別品種と見なされるほど、生長性は、重要な特性といえる。
　このように、幼苗から青果に至るまで、生長性が低下しないことは、B.rapaでのＣＭＳ利用Ｆ１においては非常に大きな課題であり、このため、ＣＭＳ利用　Ｆ１の普遍的普及が遅れてきた。この課題が克服されれば、前述のＣＭＳ利用Ｆ１のメリットが最大限享受可能となる。使用する系統によっては、生長性の低下が軽微であったため、Ｆ１の雑種強勢を利用しつつ品種化に成功した例があるが、使用できる親系統や組み合わせが限られ、少なからず育種的制限が存在することから、ユニバーサルに使用できるOgura CMS B.rapa植物の開発が強く求められてきた。
　他にもB.rapa植物では、属間交雑と連続戻し交雑によって、Ogura CMS R.sativus植物からB.rapaにＣＭＳが導入され、有性交雑により核置換されたOgura CMS B.rapa植物が得られたが、ナタネと同様に低温でクロロシスを示す欠点を有していた。このクロロシスの問題点を克服するため、有性交雑により核置換されたOgura CMS B.rapa植物と正常細胞質のB.rapaの間で非対称細胞融合が行われ、新しいOgura CMS B.rapa植物である「new OguCMS」が作出された。「new OguCMS」は、低温でのクロロシスを引き起こさず、発達した蜜腺を有しており、その種子生産性は、維持系統と同等であるなどの特性が示された（特許文献２、非特許文献３）。
　しかしながら、特許文献２および非特許文献３では、「new OguCMS」の生長性に関する定量的な評価は行われておらず、当該ＣＭＳ植物の種子も寄託されていないため、「new OguCMS」の生長性を確認することはきわめて困難であった。この点に関し、非特許文献３のFig. 1.の写真では、「new OguCMS」は、「parental CMS」よりも植物体が明らかに小さく見えるので、正常細胞質を有するB.rapa植物よりも生長性が低いと推察された。また本発明者等が「new OguCMS」ではないかと推測する品種「紫羅蘭油菜」（注１）や「ニイハオ・フォン」はいずれもミニチンゲンサイの品種であることから、この点からも「new OguCMS」は正常細胞質を有するB.rapa植物よりも生長性が低いと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
  
　ＣＭＳを利用するＦ１品種の開発において、雄性不稔性を発現させる細胞質は、雄性不稔性以外の形質にできるだけ影響を及ぼさないことが重要となる。例えば、トウモロコシでは、Ｔ型雄性不稔細胞質を導入したＦ１品種が育成されたが、１９７０年に、ごま葉枯病菌のＴレースが出現し、Ｔ型雄性不稔細胞質は、この病原菌に特異的に罹病性であったため、大きな打撃を受けた。このため、Ｔ型雄性不稔細胞質の利用は、直ちに中止され、従来の人工除雄法に逆戻りせざるを得なかった（非特許文献４）。
　また、ペチュニアにおけるＣＭＳは、古くから知られており、その原因遺伝子であるＳ－ｐｃｆが研究材料として、数多く利用されている。しかしながら、このＣＭＳを利用したＦ１品種は、開花遅れや花蕾の発達停止等を引き起こすため、現在ではほとんど利用されていない（非特許文献４）。
　これらの例のように、ＣＭＳが見出されても、そのＣＭＳが不良形質を伴う場合には、ＣＭＳの利用が困難あるいは利用が限定される場合があり、さらなるＣＭＳの改良法の開発と、改良ＣＭＳの提供が依然として求められているといえる。
日本国　特開平７－３１３０７号公報 ＣＮ１２３２６０８Ａ 日本国特許第３９６４３６８号 日本国特許第５０８９７６４号
諏訪部圭太(2012)育種学研究14：114-120 Hiroshi Yamagishi and Shripad R. Bhat (2014) Breeding Science 64: 38-47"Cytoplasmic male sterility in Brassicaceae crops" Xi-Lin Hou, Shou-Chun Cao, Yu-Ke He (2004) ISHS Acta Horticulturae 637:75-81"Creation of a New Germplasm of CMS Non-Heading Chinese Cabbage" 細胞質雄性不稔と育種技術１９８５年　株式会社シーエムシー出版発行
　既存のOgura CMS B.rapa植物は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの親和性が不十分なため、正常細胞質を有するB.rapa植物に比較して、生長性が低下する問題点があった。
　本発明は、上記したような既存のOgura CMS B. rapa植物における生長性が低下する問題点に鑑みて、生長性の低下しないOgura CMS B. rapa植物の提供および、当該Ogura CMS B. rapa植物を利用した生長性の低下しないB. rapa植物のＦ１種子の生産方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは今般、鋭意検討を行った結果、既存のOgura CMS B.rapa植物を細胞質供与親とし、高再分化能を有し、正常細胞質を有するB.rapa種間雑種植物を細胞質受容親として、非対称細胞融合を行うことによって、ミトコンドリアゲノムの改良が可能となり、生長性の低下しないOgura CMS B.rapa植物を作出し、当該Ogura CMS B.rapa植物を利用して、生長性が改良されたOgura CMS B.rapa植物が得られることを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づくものである。すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　正常細胞質を有するBrassica rapa植物と同等の生長性を有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜２＞　Raphanus sativus植物、Brassica oleracea植物およびBrassica rapa植物のミトコンドリアゲノムに由来するＤＮＡをミトコンドリアゲノム内に有する、前記＜１＞の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜３＞　正常細胞質を有するBrassica rapa種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、前記＜１＞または＜２＞の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜４＞　Raphanus sativus 植物に由来する細胞質雄性不稔遺伝子を有する細胞質雄性不稔Brassica属植物を細胞質供与親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、前記＜１＞～＜３＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代 。
＜５＞　細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物に由来する細胞質雄性不稔Brassica属植物を細胞質供与親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、前記＜１＞～＜３＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜６＞　細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物に由来する細胞質雄性不稔Brassica rapa植物を細胞質供与親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、前記＜１＞～＜３＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜７＞　既存の細胞質雄性不稔Brassica属植物を細胞質供与親として用い、正常細胞質を有するBrassica rapa 種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、前記＜１＞～＜４＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜８＞　種間雑種植物が、Brassica oleracea植物およびBrassica rapa植物に由来するものである、前記＜３＞～＜７＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜９＞　種間雑種植物が、高再分化能を有するものである、前記＜３＞～＜８＞のいずれかの種間雑種植物。
＜１０＞　既存の細胞質雄性不稔Brassica属植物が、既存の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物である、前記＜７＞の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜１１＞　既存の細胞質雄性不稔Brassica属植物が、細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物に由来するものである、前記＜７＞の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜１２＞　細胞質供与親が、細胞質雄性不稔遺伝子orf138を有するものである、前記＜４＞～＜１１＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜１３＞　Raphanus sativus植物、Brassica oleracea植物およびBrassica rapa植物のミトコンドリアゲノムに由来するＤＮＡをミトコンドリアゲノム内に有する細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代であって、
　正常細胞質を有するBrassica rapa 種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜１４＞　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１または受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される植物由来のミトコンドリアゲノムを含む、前記＜１＞～＜１３＞のいずれかの細胞質雄性不稔 Brassica rapa 植物、またはその後代 。
＜１５＞　ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K,　BrMt-185K により特定されるミトコンドリアDNAの少なくともいずれか１つが、Brassica rapa 型である、前記＜１＞～＜１４＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa 植物、またはその後代。
＜１６＞　ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K により特定されるミトコンドリアDNAの少なくともいずれか１つが、Brassica oleracea型である、前記＜１＞～＜１４＞のいずれかのBrassica rapa 植物、またはその後代。
＜１７＞　ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K, およびBrMt-215K により特定されるミトコンドリアDNAが、Brassica rapa 型であり、かつ、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, およびBrMt-208K により特定されるミトコンドリアDNAが、Brassica oleracea型である、前記＜１＞～＜１４＞のいずれかのBrassica rapa 植物、またはその後代。
＜１８＞　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１、または、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される植物のミトコンドリアゲノムを有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜１９＞　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１、または、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜２０＞　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１または、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される植物のミトコンドリアゲノムを有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物を細胞質供与親として用い、正常細胞質を有するBrassica rapa 種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、前記＜１＞～＜１９＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
＜２１＞　前記＜１＞～＜２０＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物またはその後代の植物体の一部。
＜２２＞　前記＜１＞～＜２０＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物またはその後代の種子。
＜２３＞　前記＜１＞～＜２０＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代、前記＜２１＞の植物体の一部、または前記＜２２＞の種子に含まれる、ミトコンドリアゲノム。
＜２４＞　既存の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物を細胞質供与親として用い、正常細胞質を有するBrassica rapa植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことを含む、正常細胞質を有するBrassica rapa植物と同等の生長性を有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代の製造方法。
＜２５＞　正常細胞質を有するBrassica rapa植物が、Brassica rapa植物の種間雑種植物またはそれに由来するものである、前記＜２４＞の製造方法。
＜２６＞　前記＜１＞～＜２０＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なBrassica rapa植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の製造方法。
＜２７＞　前記＜２６＞のいずれかの方法により製造された雑種第一代種子、または該種子から生育させた雑種第一代植物、その後代、またはそれらの植物体の一部。
＜２８＞　前記＜１＞～＜２０＞のいずれかの細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代に、任意のBrassica rapa植物を連続戻し交雑し、細胞質置換することを含む、細胞質雄性不稔性を発現するBrassica rapa植物の製造方法。
　本発明によれば、生長性が改良された細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、中でも、生長性が改良されたOgura CMS B.rapa植物を提供することができる。本発明による生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物を種子親、正常細胞質を有するB.rapa植物を花粉親としてB.rapa植物のＦ１種子の採種に利用することにより、生長性が低下しないB.rapa植物のＦ１種子を効率的に採種することが可能となる。
　以下、本発明について詳細に説明する。
生長性が改善された細胞質雄性不稔Brassica rapa植物およびその後代
　本発明は、既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物に比べて生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物またはその後代に関する。これは、前記したように、正常細胞質を有するB.rapa植物と同等の生長性を有する、細胞質雄性不稔B.rapa植物、またはその後代と表現することができる。
　本発明においては、典型的には、「正常細胞質」は、雄性不稔性を示す植物の細胞質、すなわち雄性不稔細胞質に対して、不稔性を示さず正常であるという意味で使用される。
　また「正常細胞質を有するB.rapa植物と同等の生長性」という場合における「同等」とは、生長性を植物体の地上部の重量で計量した場合に、正常細胞質を有するB.rapa植物の値に比べて、対象とする植物における計量値が、２５％以内（好ましくは２０％以内、より好ましくは１５％以内、さらに好ましくは１０％以内）で変動しうる範囲に入る場合をいう。したがって、例えば「正常細胞質を有するB.rapa植物」の地上部重量の値に対して、対象とする植物の計量値が、正常な植物の値の９０％の値である場合には、前記の変動が１０％であるに相当する。同等は、「正常細胞質を有するB.rapa植物」の生長性を超える場合を排除しない。
　本明細書において、「後代」とは、正常細胞質を有するB.rapa植物を用いた後代を含む他、本発明による生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物と、該植物と交配可能なB.rapa植物とを交配させて得られる交雑種も包含される。したがって、「後代」には、例えば、本発明による生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物を種子親（雌親）とし、該植物と交配可能なB.rapa植物を花粉親（雄親）として交配することによって得られるものも含まれる。また、「後代」には、例えば本発明による生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物と、該B.rapa植物と融合可能な植物との細胞融合による植物や、種属間交雑植物も含まれる。
　ここで「B.rapa植物」は、チンゲンサイ(B. rapa var. chinensis)、カブ(B. rapa var. rapa)、ミズナ(B. rapa var. laciniifolia)、ハクサイ(B. rapa var. pekinensis)、コマツナ(B. rapa var. perviridis)、タアサイ(B. rapa var. narinosa) 、またはこれらと近縁種との種属間雑種植物であることが好ましい。
　本発明の好ましい態様によれば、本発明の生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物またはその後代は、R.sativus植物に由来する細胞質雄性不稔遺伝子であるorf138遺伝子をミトコンドリアゲノム内に有し、より好ましくはRaphanus sativus植物、Brassica oleracea植物 およびBrassica rapa植物のミトコンドリアゲノムに由来するＤＮＡをミトコンドリアゲノム内に有し、さらに好ましくはR.sativus植物に由来するorf138遺伝子とB.oleracea植物およびB.rapa植物の組み換えミトコンドリアゲノムを有する。
　本明細書において、非対称細胞融合とは、細胞融合に用いる単離したプロトプラストの一方の核ゲノムを融合させる前に予め破壊させた後、それを用いて細胞融合を行うことをいう。この非対称細胞融合において、融合に際して核ゲノムを破壊して、細胞融合によってその細胞質を融合細胞に供与するものを、細胞質供与親という。また、融合に際して、核ゲノムを破壊させることなく、維持し、前記細胞質供与親からの細胞質を受け入れるものを、細胞質受容親という。
　本発明の生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物を得る場合には、非対称細胞融合において、細胞質受容親として、正常細胞質を有するB. rapa種間雑種植物を用いることが望ましい。したがって、本発明の好ましい態様によれば、本発明の生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物は、既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物を細胞質供与親として用い、正常細胞質を有するB.rapa種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得ることができる。
　ここで、既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物とは、本発明によって生長性が改良される前の細胞質雄性不稔B.rapa植物を意味する。本発明では好ましくは、既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物は、生長性を改良する余地のあるもの、すなわち、生長性が、正常細胞質を有するB.rapa植物に比べて低下しているものを意味する。
　本発明の好ましい態様によれば、既存の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物は、細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物に由来する細胞質雄性不稔Brassica rapa植物である。ここでいう、細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物としては、特開平０７－０３１３０７号公報を参考に作出することができ、典型的な例としては、株式会社サカタのタネで開発され、B.oleracea作物で使用されている、ＣＭＳ系統“キャベツＭＳ－２”（特開平０７－０３１３０７号公報）が挙げられる。なお、“キャベツＭＳ－２”の細胞質は、市販のブロッコリー品種“グランドーム”、“ピクセル”などで使用されており、容易に入手することができる。
　Raphanus sativus に由来する細胞質雄性不稔遺伝子を有する細胞質雄性不稔Brassica属植物とは、上記したように、典型的には、Ogura CMS遺伝子を有するものをいう。
　本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明のBrassica rapa 植物、またはその後代において、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K,　BrMt-185K により特定されるミトコンドリアDNAの少なくともいずれか１つは、Brassica rapa 型である。なおここで、前記の「少なくともいずれか１つ」は、より好ましくは「少なくともいずれか２つ」、さらに好ましくは「少なくともいずれか３つ」、さらにより好ましくは「少なくともいずれか４つ」である。さらに好ましい態様によれば、本発明のBrassica rapa 植物、またはその後代において、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K,　BrMt-185K により特定されるミトコンドリアDNAは、Brassica rapa 型である
　本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明のBrassica rapa 植物、またはその後代において、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K により特定されるミトコンドリアDNAの少なくともいずれか１つが、Brassica oleracea型である。なおここで、前記の「少なくともいずれか１つ」は、より好ましくは「少なくともいずれか２つ」、さらに好ましくは「少なくともいずれか３つ」、さらにより好ましくは「少なくともいずれか４つ」である。さらに好ましい態様によれば、本発明のBrassica rapa 植物、またはその後代において、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K により特定されるミトコンドリアDNAは、Brassica oleracea型である。
　本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明のBrassica rapa 植物、またはその後代において、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K, およびBrMt-215K により特定されるミトコンドリアDNAの少なくともいずれか１つは、Brassica rapa 型であり、かつ、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, およびBrMt-208K により特定されるミトコンドリアDNAの少なくともいずれか１つは、Brassica oleracea型である。なおここで、前記の「少なくともいずれか１つ」は、より好ましくは「少なくともいずれか２つ」、さらに好ましくは「少なくともいずれか３つ」、さらにより好ましくは「少なくともいずれか４つ」である。
　本発明の一つのさらに好ましい態様によれば、本発明のBrassica rapa 植物、またはその後代において、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K, およびBrMt-215K により特定されるミトコンドリアDNAは、Brassica rapa 型であり、かつ、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, およびBrMt-208K により特定されるミトコンドリアDNAは、Brassica oleracea型である。
　本発明のより好ましい態様によれば、本発明による生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物、またはその後代は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１またはＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２（後述）と同一の植物のミトコンドリアゲノムを有するB.rapa植物またはその後代であり、さらに好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１またはＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２と同一のB.rapa植物、またはその後代である。
　本明細書において、生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物またはその後代の「植物体の一部」とは、当該植物体の１個以上の細胞または１個以上の細胞からの細胞質を含むものであり、具体的には花、葉、茎、根等の器官または組織、或いは、これらの器官または組織からの細胞（細胞から調製されたプロトプラストを含む）もしくは細胞質、或いは前記細胞もしくは細胞質の集合体を意味する。
生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物の作出方法
　本発明による生長性が改良された細胞質雄性不稔B.rapa植物は、例えば、以下の手順に従って作出することができる。
（１）高再分化能を有し、正常細胞質を有する細胞質受容親の作出
（２）プロトプラストの調製
　（ｉ）正常細胞質を有するB. rapa種間雑種植物のプロトプラストの単離
　（ｉｉ）既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物のプロトプラストの単離
（３）プロトプラストの融合処理
（４）融合雑種細胞の培養
（５）細胞質雄性不稔性を有する細胞質雑種植物の選抜
（６）カルスからの植物体の再生
（７）後代の獲得と優良系統の選抜
　なお本明細書においては、「製造方法」は「作出方法」とも言い換えることができる。すなわち、ここでいう「作出」と「製造」との用語は同等の意味で使用される。
　これら各工程は、より具体的には以下のとおりである。
（１）高再分化能を有し、正常細胞質を有する細胞質受容親の作出
　前述のように、ＣＭＳを利用するＦ１品種の開発において、雄性不稔性を発現させる細胞質は、雄性不稔性以外の形質にできるだけ影響を及ぼさないことが重要となる。非対称細胞融合技術を用いて細胞質雑種を作出する場合、ミトコンドリアゲノムの組換えは、ランダム(random)に生じるため、不良形質を伴わずに、雄性不稔性を維持する組み換えミトコンドリアが得られる確率は低いため、数多くの細胞質雑種を作出し、優良個体を選抜する必要がある。
　しかしながら、B.rapa植物は、同じBrassica属植物のB.oleracea植物やB.napus植物に比べて、非対称細胞融合によって得られた融合細胞からの植物体の再生が困難であるため、B.rapa植物の効率的な細胞質雑種植物の作出方法は、報告されていない。そのため、数多くの細胞質雑種を効率的に作出する方法の開発が必要不可欠である。
　なおここで、細胞質雑種植物とは、細胞質が雑種状態となっている植物をいい、例えば、細胞融合（ここで好適には、非対称細胞融合）を行うことにより得られるものを言う。
　また、軟Ｘ線など放射線を利用した非対称細胞融合を実施した場合、アブラナ科植物では、細胞質供与親の断片化した核ゲノムの一部が導入されることが多く、融合細胞の分裂や融合細胞からの植物体の再生が困難となる場合がある。したがって、細胞質受容親の再分化能をできるだけ高めておくことは、細胞質雑種を効率的に作出するために非常に重要となる。
　アブラナ科植物の中でB.oleracea植物は、培養細胞からの再分化能が高いことが知られている。それに対し、B.rapa植物の再分化能は低く、培養細胞から植物体の再生に成功した例は、特定の品種に限られている。そのため、細胞質雑種の作出効率を高めるためには、まず、正常細胞質のB.rapa植物を種子親、B.oleracea植物を花粉親として種間雑種植物を作出し、高再分化能を有するB.rapa植物とB.oleracea植物の種間雑種植物を作出し、細胞質受容親とすることが望ましい。
　以下において、「高再分化能を有するB.rapaとB.oleraceaの種間雑種植物」は、「B.rapa種間雑種植物」と表記することがある。得られたB.rapa種間雑種植物は、正常細胞質のB.rapa植物を種子親としており、細胞質が母性遺伝することにより、正常細胞質のB.rapaと同一の細胞質を有し、かつ再分化能が向上しているため、細胞質受容親の性質として望ましい。
　ここで、「高再分化能」とは、カルス化した細胞から植物体への再分化する能力が高いことをいい、カルスを再分化培地へ置床した後１か月後の再分化率（再分化したカルス数／再分化培地に置床したカルス数）が３０％以上、より好ましくは５０％以上の場合をいう。
　さらに望ましくは、上記B.rapa種間雑種植物を人為的に倍加して作出した複二倍体を種子親、正常細胞質のB.rapa植物を花粉親として戻し交雑し、得られた後代を組織培養し高再分化能を有する個体を選抜すると、高再分化能を有する三倍体のB.rapa種間雑種植物が得られる。このように、正常細胞質のB.rapa植物を花粉親として連続戻し交雑と、組織培養による高再分化能を有する個体の選抜を繰り返すと、最終的には高再分化能を有し、核ゲノムがB.rapaに近い二倍体のB.rapa種間雑種植物が得られる。二倍体に近づくに従って雌性稔性が高まるため、これらのB.rapa種間雑種植物を細胞質受容親とすることが望ましい。
（２）プロトプラストの調製
　（ｉ）正常細胞質を有するB.rapa種間雑種植物のプロトプラストの単離
　本発明において、細胞質受容親として用いるB.rapa植物は、前記（１）のB.rapa種間雑種植物、より好ましくは、さらにB.rapaを戻し交雑して育成したB.rapa種間雑種植物を使用することが好ましい。
　プロトプラストを得るために使用する細胞組織としては、収量性が高く、分裂活性が高い葉肉組織を供試することが望ましいが、胚軸や茎、カルスなどの他の組織も材料として用いてもよい。
　プロトプラストを単離する方法は、当該技術分野において公知である通常用いられる方法（例えば、Matsumoto,E, Plant cell reports, 1991. vol9(10)等に記載の方法）で良く、特に制限されない。以下は具体例としての手順を示すが本発明は必ずしもそれらに拘束されるものではない。
　まず、B.rapa植物の細胞組織を細切し、プロトプラスト単離用酵素溶液を用いて、酵素処理することによってプロトプラストを単離する。この溶液は主に細胞壁分解酵素、浸透圧調整剤を含む無機塩緩衝液である。細胞壁分解酵素としては、植物の細胞壁の分解に使用できるものであれば特に制限されないが、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ等が挙げられる。本発明では、セルラーゼＹ－ＣとマセロザイムＲ－１０の組み合わせが好ましい。
　浸透圧調整剤としては、一般的な糖アルコール類、例えば、マンニトール、ソルビトール、グルコース等を用いることができ、マンニトールが好ましく、０．３Ｍ～０．７Ｍの濃度のマンニトールが特に好ましい。さらに、酵素溶液には、プロトプラストの膜の安定化のために、無機塩を添加することが望ましく、例えば、下記表１に記載の組成のＣＰＷ塩（Cocking and Peberdy, 1974）を添加すると好適である。酵素処理は、２５～３０℃で８～２０時間静置処理すると好適である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　酵素処理により単離したプロトプラストを３０～１００μｍの孔径のナイロンメッシュで濾過し、遠心分離してプロトプラストを集めて酵素液を除く。次にプロトプラストを洗浄液に懸濁し、プロトプラストを洗浄する。洗浄液としては、一般的に用いられるＣＰＷ塩溶液に浸透圧調整剤として糖アルコール類を添加したものを用いることができる。
　次に、B.rapa種間雑種植物プロトプラストの単独での分裂を防ぐために不活化処理を行うことが望ましい。不活化処理は、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド等のヨード化合物を溶解したＣＰＷ塩溶液などにプロトプラストを懸濁させることで行うことができる。本発明ではヨードアセトアミドを５ｍＭ～３０ｍＭの濃度に調整したＣＰＷ溶液に懸濁し５～２０分間処理を行うと好適である。
　次に遠心分離機を利用してＣＰＷ塩溶液での洗浄操作を１～３回繰り返すことが好ましい。プロトプラストの懸濁液には、導管や細胞の断片も混入するため、さらに密度勾配遠心分離法等により、プロトプラストを精製することが好ましい。
　精製に用いる試薬には、糖類、合成コロイド等が挙げられるが、本発明ではショ糖液の利用が好適であり、１５％～２０％のショ糖液の利用が特に好適である。プロトプラストの精製後、血球計算盤によって細胞密度を計測し、細胞融合に適した細胞密度になるようにＣＰＷ塩溶液によって液量を調整する。プロトプラストの細胞密度は、１×１０５～１×１０７細胞／ｍｌが好ましく、液量の調整にはＣＰＷ塩溶液の利用が好ましい。
　（ii）　既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物のプロトプラストの単離
　細胞質供与親として用いる既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物は、特に制限されないが、株式会社サカタのタネで開発され、B.oleracea作物で使用されている、ＣＭＳ系統“キャベツＭＳ－２”（特開平０７－０３１３０７号公報）の使用が望ましい。“キャベツＭＳ－２”の細胞質は、市販のブロッコリー品種“グランドーム”、“ピクセル”などで使用されており、容易に入手することができる。“キャベツＭＳ－２”の細胞質は、直接利用することも可能であるが、さらに慣用のB.rapa植物の連続戻し交雑による核置換を行い、細胞質雄性不稔B.rapa植物を作出して使用することがより望ましい。
　既存の細胞質雄性不稔植物のプロトプラストの単離は、例えば、上述したB.rapa種間雑種植物のプロトプラストの単離と同様の方法に従って行うことができる。
　単離した、既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物のプロトプラストは、放射線処理により核を不活化したものを用いることが望ましい。放射線処理のために照射する放射線としては、Ｘ線、γ線、紫外線等が挙げられるが、核を破壊できれば、特に限定されるものではない。照射線量は核を破壊できる範囲で、できる限り低照射量で行うことが好ましい。例えば、本発明での軟Ｘ線の照射の場合１００Ｇｙ～９００Ｇｙの照射量が好ましい。
（３）　プロトプラストの融合処理
　次に、前記で得られた両種のプロトプラストを混合し、細胞融合を行う。
　融合方法としては、慣用の方法、例えば、公知の電気融合法（Planta, 151, 26-32, 1981）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法（Planta, 120, 215-227, 1974）、デキストラン法（Jap. J. Genet., 50, 235, 1975）などが挙げられるが、特に限定されない。本発明では好ましくは、ＰＥＧ法を用いる。
（４）　融合雑種細胞の培養
　融合処理して得られた細胞は、B.rapa種間雑種植物由来のプロトプラストの培養に好適な培地で培養することが好ましい。高再分化能を有するB.rapaとB.oleraceaの種間雑種植物由来のプロトプラストの培養方法としては、Brassica類のプロトプラストの培養法に基づいて、適宜改変を行えば、特に限定されないが、本発明では、ＮＨ４ＮＯ３を２００ｍｇ／ｌに低減させた１／２濃度のＭＳ培地を基本培地とし、適宜、植物生長調整物質、各種添加物等を加えて、用いることが好ましい。
（５）　細胞質雄性不稔性を有する細胞質雑種植物の選抜
　融合細胞の培養を行い、細胞分裂が開始され、カルスが目視で確認できるようになった段階で、カルスをカルス増殖培地に移植する。カルス増殖培地は、慣用のものが使用でき、材料とする植物の遺伝子型やカルスの状態により反応の差はあるが、例えば１．０～５．０ｍｇ／ｌ　ＮＡＡおよび０．１～３．０ｍｇ／ｌ　４－ＣＰＰＵを含むＭＳ培地などを用いると好適である。
　Ogura CMSの細胞質雄性不稔性の原因遺伝子は、ミトコンドリアゲノムにあるorf138と特定されている。したがって、得られたカルスから、細胞質雄性不稔性を有する個体を選抜するためには、上記の手順で増殖したカルスからＤＮＡを抽出し、orf138を特異的に増幅できるマーカーを用いて、ＰＣＲ法によって検出することが好ましい。
（６）カルスからの植物体の再生
　得られたorf138を有するカルスを再分化培地に移植し再分化させる。
　再分化培地は、慣用のものが使用でき、材料とする植物の遺伝子型やカルスの状態により反応の差はあるが、例えば０．1～１．０ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび０．1～１．０ｍｇ／ｌの４－ＣＰＰＵを含むＭＳ培地などを用いると好適である。
　再生したシュートは、３％ショ糖、０．８％寒天を添加したＭＳ培地などに移植して発根させ、植物体を再生させる。再生した植物体は、順化して温室内で育成する。
　アブラナ科植物の非対称細胞融合においては、一般的に放射線処理により細胞質供与親の核を破壊させるが、核ゲノムの破壊は完全ではなく、ゲノムの一部が細胞質受容親に取り込まれることが多い。また、非対称細胞融合時に、細胞質供与親由来のプロトプラスト、または細胞質受容親のプロトプラストが複数融合する場合もあるため、異数体や高次倍数体が生じることが多い。八倍体以上の高次倍数体は、再分化が困難である可能性が高く、また雌性稔性の低下により後代を得ることが困難であるため、フローサイトメトリーでＤＮＡ含量を測定し、八倍体以上の高次倍数体を排除しておくことが望ましい。
　非対称細胞融合によるミトコンドリアゲノムの組換えは、高頻度かつ、ランダム(random)に生じるため、５０個体以上の細胞質雑種植物を作出することが望ましい。
（７）後代の獲得と優良系統の選抜
　得られた細胞質雑種植物を育成し開花させ、雄性不稔形質を有する個体を選抜し、正常細胞質を有する任意のB.rapa植物を花粉親として交配する。
　細胞質雑種植物は、異数体や高次倍数体である場合が多く後代の獲得が難しいため、花粉親は、遺伝的に多様な複数の正常細胞質を有する任意のB.rapa植物を使用することが望ましい。得られた細胞質雑種植物から、後代を獲得するためには、胚培養を必要とする場合が多い。
　胚培養は、受粉後の胚の生長が不十分で、そのままでは枯死する場合に、胚を摘出して，適切な培地上で胚を成長させる技術である。胚培養の方法は、慣用の方法で行えるが、本発明では、交配後７日～１０日目の胚珠から胚を摘出し、３％ショ糖、１０％ココナッツ水（Sigma-Aldrich）、０．８％寒天を添加した１／２濃度のＭＳ培地上で培養することが望ましい。再生したシュートは、３％ショ糖、０．８％寒天を添加したＭＳ培地などに移植して発根させ、植物体を再生させる。再生した植物体は、順化して温室内で育成する。再生した植物体が開花したら、雄性不稔性の個体を選抜する。
　この正常細胞質を有する任意のB.rapa植物を花粉親とする交配とその後の胚培養は、雄性不稔性の個体から後代種子が得られるまで継続する。後代種子が得られるようになった個体は、特定の正常細胞質を有するB.rapa植物を花粉親として連続戻し交雑を行う。ここで、特定の正常細胞質を有するB.rapa植物は、既存の細胞質雄性不稔B.rapa植物に連続戻し交雑を行った場合に、生長性が顕著に低下する遺伝的に固定された系統をあらかじめ選定しておくことが望ましい。
　特定の正常細胞質を有するB.rapa植物を花粉親として繰り返し交配することにより、核ゲノムが特定の正常細胞質を有するB.rapa植物と同一となるため、細胞質の特性を比較して選抜することが可能となる。連続戻し交雑は、十分な核置換を行なうため、７回以上行うことが望ましい。連続戻し交雑が完了した系統は、特定の正常細胞質を有するB.rapa植物との比較を行い、細胞質雄性不稔性の形質を有し、その他の不良形質を伴っていないことを確認する。
　以下の実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：　生長性が改善されたOgura CMS B.rapa植物の作出方法
（１）高再分化能を有し、正常細胞質を有する細胞質受容親の作出
　B.rapaでは、一般的に再分化能が低いため、高再分化能を付与する目的で、B.rapa“ＳＨ”を種子親、カリフラワー“ＷＣ”を花粉親として交配を行った。交配後１０日目の胚珠から無菌環境下で胚を摘出し、３％　ショ糖、１０％　ココナッツ水（Sigma- Aldrich）、０．８％　寒天を添加した１／２濃度のＭＳ培地に置床し、胚培養を行った。２週間後、生長した幼植物を３％ショ糖、０．８％　寒天を添加したＭＳ培地に移植した。胚培養により、６個体の種間雑種（Ｆ１）を獲得した。
　“ＳＨ”および各種間雑種の葉柄を５ｍｍの長さで切断し、１ｍｇ／ｌ　２,４－Ｄ、３％ショ糖、０．８％寒天を添加したＭＳ培地へ置床し、３週間培養した。１ｃｍ程度の大きさに生育したカルスを１ｍｍの大きさに切り分けて、０．３ｍｇ／ｌ　４－ＣＰＰＵ、０．３ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、３％　ショ糖、０．８％　寒天を添加したＭＳ培地へ置床し、１か月間培養し、再分化率を調査した。
　結果は表２に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　表２で“ＳＨ”由来のカルスは、再分化しなかったが、種間雑種では、高再分化能を有する個体が得られた。最も再分化率の高かった系統“ＳＨ－ＷＣ４”をコルヒチン処理により、人為的に倍加し、複二倍体化した。以後、複二倍体化した“ＳＨ－ＷＣ４”を“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ”と表記する。“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ”を種子親、B.rapaの“Ｓ”を花粉親として交配した。交配後10日目の胚珠から無菌環境下で胚を摘出し、３％ショ糖、１０％ココナッツ水（Sigma-Aldrich）、０．８％　寒天を添加した１／２濃度のＭＳ培地に置床し、胚培養を行った。２週間後、生長した幼植物をショ糖３０ｇ／ｌを添加したＭＳ培地に移植した。胚培養により、７個体の種間雑種（Ｆ１ＢＣ１）を獲得した。
　各種間雑種（Ｆ１ＢＣ１）の葉柄を同様に５ｍｍの長さで切断し、１ｍｇ／ｌ　２,４－Ｄ、３％ショ糖、０．８％寒天を添加したＭＳ培地へ置床し、３週間培養した。１ｃｍ程度の大きさに生育したカルスを１ｍｍの大きさに切り分けて、０．３ｍｇ／ｌ　４－ＣＰＰＵ、０．３ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、３％　ショ糖、０．８％　寒天を添加したＭＳ培地へ置床し、１か月間培養し、再分化率を調査した。
　結果は表３に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　表３の結果から、Ｆ１ＢＣ１においても、系統間により差はあるものの、高い再分化率を示す系統が得られた。ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ１、ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ３、ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５、ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ７は、再分化率が６１％で同じであったが、最も雌性稔性が高い“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５”を種子親として選定した。“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５”を種子親として、さらにB.rapa植物のバッククロスを行うことが望ましいが、“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５”は、複二倍体に二倍体を交配しているため、異質三倍体となっており、後代が得られにくいと予想された。
　したがって、後代を得るには、様々な遺伝子型のB.rapa植物を花粉親に使うことが必要であると考えられたため、“ＳＨ”、“ＯＳ”、“Ｓ”、“Ｗ”の４系統を花粉親として準備して交配を行った。しかし、手交配では、全く後代が得られなかったため、閉鎖系温室内に“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５”を種子親として配置し、その横に、上記４系統のB.rapa植物を配置して、虫媒による交配を行った。種間雑種の後代は、一般的に高温下で得られやすいため、温室の温度は、昼温３２℃、夜温１５℃に制御した。虫媒による交配の結果、約１００粒の種子が得られたが、サイズの小さい種子が多かった。通常のB.rapa植物の種子の大きさに近い種子を３７粒選び、in vitroで無菌播種を行ったところ、Ｆ１ＢＣ２となる３６個体のB.rapa種間雑種植物が発芽した。発芽した個体の系統名をそれぞれ“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ１～３６”とした。
　各種間雑種（Ｆ１ＢＣ２）の個体の葉柄を５ｍｍの長さで切断し、１ｍｇ／ｌ　２,４－Ｄ、３％　ショ糖、０．８　％寒天を添加したＭＳ培地へ置床し、３週間培養した。１ｃｍ程度の大きさに生育したカルスを１ｍｍの大きさに切り分けて、０．３ｍｇ／ｌ　４－ＣＰＰＵ、０．３ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、３％　ショ糖、０．８％寒天を添加したＭＳ培地へ置床し、１か月間培養し、再分化率を調査した。
　結果は表４に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　表４の結果から、Ｆ１ＢＣ２は、系統間により差が大きいものの、“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ１２”が再分化率８３％、“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ３２”が再分化率８９％と高い再分化率を示した。“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ１２”は、雌性稔性が低いため、雌性稔性の高い“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ３２”を細胞質受容親として供試することとした。
（２）プロトプラストの調製
　(i)　正常細胞質を有するB. rapa種間雑種植物のプロトプラストの単離
　正常細胞質を有するB. rapa種間雑種植物として、“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ３２”を使用した。“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ３２”は、３％ショ糖、０．８％寒天を添加したＭＳ培地に移植し、１か月間育成した。展開した本葉を約１ｇ採取し、約２ｍｍの大きさに細切した後に、０．３％　セルラーゼＹ－Ｃ，０．３％　マセロザイムＲ－１０，０．５Ｍ　マンニトールを含むＣＰＷ塩溶液１０ｍｌに浸漬し、２５℃、１６時間静置した。
　葉組織を含む酵素液を９２μｍのナイロンメッシュで濾過し、細胞残渣を除去した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠沈管に移し、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。上澄みを除去して得られたプロトプラストを１５ｍＭのヨードアセトアミドを含むＣＰＷ塩溶液５ｍｌに懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後、ヨードアセトアミド処理したプロトプラスト懸濁液を８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上澄みを除去した。プロトプラスト懸濁液にＣＰＷ塩溶液１０ｍｌを加え、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行って上澄みを除去する操作を３回繰り返して、プロトプラストを洗浄した。
　洗浄されたプロトプラスト懸濁液を８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上澄みを除去して２ｍｌのＣＰＷ塩溶液を加えてプロトプラストを懸濁させた。新しい遠沈管に２０％ショ糖を添加したＣＰＷ塩溶液５ｍｌを加えて、その上に上記プロトプラストの懸濁液を重層させ、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。細胞残渣は、遠沈管の底に沈み、精製されたプロトプラストが、上層のＣＰＷ塩溶液層中に浮上するのでパスツールピペットで新しい遠沈管に移した。懸濁液を少量取り血球計算板を用いてプロトプラストの細胞密度を求め、ＣＰＷ液を加えて１×１０６個／ｍｌに調製した。
　(ii)　 既存のOgura CMS B.rapa植物のプロトプラストの単離
　既存のOgura CMS B.rapa植物として、 交配によりB.oleraceaからB.rapaへ核置換させた“キャベツＭＳ－２”由来のＣＭＳ系統“ＨＡ２８０”を使用した。
　まず、滅菌した種子を３％ショ糖、０．８％寒天を添加したＭＳ培地に置床し、２０℃、１６時間照明下で約１か月間育成した。展開した本葉約１ｇを採取し、約２ｍｍの大きさに細切した後に、０．３％セルラーゼＹ－Ｃ，０．３％マセロザイムＲ－１０，マンニトールを含むＣＰＷ塩溶液１０ｍｌに浸漬し、２５℃、１６時間静置した。
　葉組織を含む酵素液を９２μｍのナイロンメッシュで濾過し、細胞残渣を除去した。パスツールピペットでプロトプラストをプラスチックシャーレに移し、軟Ｘ線を９００Ｇｙ照射した。
　得られたプロトプラスト懸濁液を遠沈管に移し、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上澄みを除去して２ｍｌのＣＰＷ塩溶液を加えてプロトプラストを懸濁させた。新しい遠沈管に２０％のショ糖を添加したＣＰＷ塩溶液５ｍｌを加え、その上に上記プロトプラストの懸濁液を重層させ、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。細胞残渣は、遠沈管の底に沈み、精製されたプロトプラストが、上層のＣＰＷ塩溶液層中に浮上するのでパスツールピペットで新しい遠沈管に移した。懸濁液を少量取り血球計算板を用いてプロトプラストの細胞密度を求め、ＣＰＷ塩溶液を加えて１×１０６個／ｍｌに調製した。
（３）プロトプラストの融合処理
　ヨードアセトアミド処理したB. rapa種間雑種植物プロトプラスト懸濁液と、軟Ｘ線照射した既存のOgura CMS B.rapa植物プロトプラスト懸濁液を１：３の比率で混合し、９ｃｍシャーレの底面中央に混合液を２ｍｌ滴下した。３０分間静置後、　５００ｇ／ｌ　ＰＥＧ溶液（ポリエチレングリコール＃６０００（nacalai tesque Inc.）、１，５００ｍｇ／ｌ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ５．５）３ｍｌをプロトプラスト混合液の周辺に滴下した。
　１分後ＣＰＷ塩溶液３．５ｍｌをプロトプラスト混合液の周辺に滴下した。さらに２分後　ＣＰＷ塩溶液３．５ｍｌをプロトプラスト混合液の周辺に滴下した。５分後シャーレの縁から、滴下した液を静かに吸い上げて除去し、ＣＰＷ塩溶液２０ｍｌをシャーレの縁から加えた。このＣＰＷ塩溶液での洗浄の操作を５分間隔で３回繰り返した。
（４）融合雑種細胞の培養
　洗浄液を除去後、０．５Ｍ　マンニトール、１５０ｍｇ／ｌ　カザミノ酸、１００ｍｇ／ｌ　Ｌ－グルタミン、０．０３ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、０．０３ｍｇ／ｌ　２,４－Ｄ、０．１ｍｇ／ｌ　ＢＡおよび１％ショ糖を含み、ＮＨ４ＮＯ３を２００ｍｇ／ｌに低減させた１／２濃度のＭＳ培地１０ｍｌ（ｐＨ５．８）を添加し、２５℃暗所において培養した。
　培養開始から５日後、１５０ｍｇ／ｌカザミノ酸、１００ｍｇ／ｌＬ－グルタミン、０．０３ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．０３ｍｇ／ｌ　２,４－Ｄ、０．１ｍｇ／ｌ　ＢＡおよび１％ショ糖を含み、ＮＨ４ＮＯ３を２００ｍｇ／ｌに低減させた１／２濃度のＭＳ培地５ｍｌ（ｐＨ５．８）を添加し、マンニトール濃度を低下させて培養を継続した。
　培養開始から１０日後、シャーレの底に付着した細胞をピンセットの先で、こするようにして剥がし、０．２Ｍマンニトール、４％ショ糖、０．６％ゲランガムを含む溶液７.５ｍｌを添加し、混合することにより半固体化状態のゲル培地を形成させ培養を継続した。
　培養開始約１か月で、カルスが肉眼で確認できるようになったため、カルスをカルス増殖培地（１ｍｇ／ｌ　４－ＣＰＰＵ、３ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、３．０％ショ糖、０．８％寒天を含むＭＳ培地、ｐＨ５．８）に移植した。カルスは、１３回の融合処理実験より、４６４個体が得られた。
（５）　細胞質雄性不稔性を有する細胞質雑種植物の選抜
　Ogura CMSの細胞質雄性不稔性の原因遺伝子は、ミトコンドリアゲノムにあるorf138と特定されている。ＰＣＲ法によりOgura CMSに特異的なＤＮＡを検出するため、公知の塩基配列情報（Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ　登録番号　ＡＢ０５５４３５．１）よりorf138遺伝子に特異的なプライマーを設計した（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　カルスが５ｍｍ以上の大きさに生育した段階で、カルスの一部をサンプリングし、ＤＮＡを抽出した。抽出した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーorf138-1Fとorf138-2Rの各組み合わせを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、熱変性９４℃　１分、アニーリング６０℃　２分、伸長反応７２℃　２分を３５サイクル繰り返した。
　ＰＣＲ産物は、１．８％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド溶液に浸漬後、ＵＶ照射下で写真撮影を行い予想されるサイズ（３７６ｂｐ）のバンドを有する個体を選抜した。（４）で得られた４６４個のカルスを上記ＰＣＲ法によりorf138遺伝子の有無を調査したところ、１５４個のカルスがorf138遺伝子を有しており、細胞質雑種細胞であると考えられた。
（６）カルスからの植物体の再生
　カルスが１ｃｍ程度の大きさになったときに、カルスを２ｍｍ程度のサイズに切り分け、再分化培地（０．３ｍｇ／ｌ　４－ＣＰＰＵ、０．３ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、３．０％　ショ糖、０．８％　寒天を含むＭＳ培地、ｐＨ５．８）に移植した。
　カルスは、再分化培地へ移植後２週間で、シュートの分化を開始した。分化したシュートを、３．０％ショ糖，０．８％寒天を含むＭＳ培地（ｐＨ５．８）へ移植することにより発根した。（５）でorf138遺伝子を有していた１５４個のカルスを再分化培地に移植し、継代することにより、６８系統の再分化植物が得られた。細胞質雑種植物は、５０穴セルトレーに移植して順化を行い、順化後はガラス温室内で育苗を行った。
　細胞質雑種植物の倍数性をフローサイトメーターにより、検定したところ、異数性を含む二倍体～八倍体であった。
　細胞質受容親であるB. rapa種間雑種植物“ＳＨ－ＷＣ４Ｄ－Ｓ５―Ｘ３２”は、二倍体であるが、細胞質雑種植物が高次倍数性になったのは、非対称細胞融合時に複数のB. rapa種間雑種植物由来プロトプラストが融合したためと考えられた。また、異数性となったのは、軟Ｘ線を照射した細胞質提供親のゲノムの一部が導入されたためと考えられた。倍数性が八倍体以内の植物は、後代が得られる可能性があるため、本実験では全個体の育苗を継続した。
　細胞質雑種植物は、ガラス温室で１か月間育苗した後、４℃設定の冷蔵庫（８時間照明）に入庫し、２か月間春化処理を行った。春化処理後、細胞質雑種植物は、１５ｃｍポットへ移植した。
　春化処理後１～２か月の間に、６８系統の細胞質雑種植物のうち、４９系統が開花に至ったが、１１系統は形態異常のため開花に至らず、８系統は遺伝的弱勢のため枯死した。開花した４９系統のうち、雄性不稔性を発現した系統は、２９系統で、残りの２０系統は、雄性可稔であった。雄性可稔であった２０系統のうち、１系統はorf138遺伝子が消失していたが、１９系統は、orf138遺伝子を保持しているにもかかわらず完全、あるいは部分的な雄性可稔を示した。
　一般的に、非対称細胞融合により作出された細胞質雑種植物は、ミトコンドリアゲノムが組み換わり、ヘテロプラズミーの状態が５世代以上続くと考えられている。したがって、orf138遺伝子は、ミトコンドリアがヘテロプラズミーな状態からホモプラズミーな状態に向かう過程で完全に消失したと考えられた。また、orf138遺伝子が導入されていても、その量的不足などで雄性不稔性が不安定になるケースも考えられた。
　雄性不稔性を発現した２９系統を種子親として、正常細胞質を有するB.rapa植物“ＯＳ”を花粉親として温室に入れて虫媒による交配を行った。
　その結果、雄性不稔系統１７系統より、後代種子ＢＣ１を得ることができた。ＢＣ１系統を育成したところ、１７系統のうち、１０系統は雄性稔性が部分的に回復したため廃棄した。雄性不稔性を維持していた７系統は、さらに、正常細胞質を有する４系統のB.rapa植物“ＳＨ”、“ＯＳ”、“Ｓ”、“Ｗ”を花粉親として虫媒による交配を行った。その結果、すべての７系統より、後代種子ＢＣ２を得ることができた。
　ＢＣ２世代では、種子が容易に得られるようになったため、ＢＣ３以降は、正常細胞質を有するB.rapa植物“ＳＨ”を使用することとした。“ＳＨ”は、以前の試験において、既存のOgura CMS B.rapa植物に連続戻し交雑した場合に、顕著に生長性の低下を示すことがわかっていた。すなわち、あえて生長性が低下しやすい“ＳＨ”を連続戻し交雑の花粉親として使用することにより、細胞質の影響による生長性の低下が検出しやすくなるため、生長性の低下しないＣＭＳ系統の選抜が可能となる。
　上記雄性不稔性を示す細胞質雑種７系統を種子親とし、“ＳＨ”を花粉親として連続戻し交雑を進めた。各世代で“ＳＨ”と同等以上の生長性を示す個体を選抜し、“ＳＨ”を７回交配したＢＣ７（B.rapaの戻し交配としてはＢＣ９）まで繰り返した。
　各細胞質雑種の系統は、連続戻し交雑の過程で、ヘテロプラズミーによると考えられる特性の違いから多くの分系に分けるなどしたが、生長性、雄性不稔性の安定性、採種性、花型から選抜を繰り返し、最終的に形質が最も優れていた“Ｊ１”を選抜した。“Ｊ１”は、連続戻し交雑の各世代で系分していたが、生長性の違いから“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”の２系統を最終的に選抜した。すなわち、“Ｊ１”の分系である“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”は、同一の融合細胞から生じた系統であるが、細胞融合後のミトコンドリアがヘテロプラズミーの状態からホモプラズミーの状態に向かう過程のＢＣ４世代で分系とした。“Ｊ１－３”は、生長性が正常細胞質系統を上回り、“Ｊ１－７”は、正常細胞質系統と同等かやや上回る生長性を示した。
　“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”の２系統のＢＣ７の種子はそれぞれ、２０１８年１２月１２日付けで独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に国際寄託（原寄託）されている。これらの系統の寄託者が付した識別のための表示および受託番号は以下の通りである：
　＜Ｊ１－３＞
　寄託者が付した識別のための表示：ＳＳＣ－ＧＣＣ－１８－００１
　受託番号：　ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１、
　＜Ｊ１－７＞
　寄託者が付した識別のための表示：ＳＳＣ－ＧＣＣ－１８－００２
　受託番号：　ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２。
実施例２：　“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”の生長性の評価
　実施例１によって作出された改良ＣＭＳ系統の有用性を確認するため、正常細胞質、ＣＭＳ細胞質を有するB.rapa植物の生長性の比較試験を行った。
　実施例１でも記載したように、“ＳＨ”は、既存のOgura CMS B.rapa植物に連続戻し交雑した場合に、顕著に生長性が低下することがわかっていた。したがって、この正常細胞質を有するB.rapa植物“ＳＨ”を各細胞質雄性不稔系統に連続戻し交雑する核置換によって、各細胞質雄性不稔系統の核ゲノムが“ＳＨ”と同一となると共に、生長性の低下を検出しやすくなる。したがって、各細胞質雄性不稔系統を同一条件で栽培することにより、細胞質の違いによる生長性を評価することができる。
　Ogura CMSを使用しているB.rapa植物としては、中国の好地種子有限公司が育成し、中国で種子が販売されている“紫羅蘭油菜”が知られている。また、日本でも渡辺農事株式会社から、“ニイハオ・フォン”の種子が販売されており、いずれもチンゲンサイの品種となっている。
　また、株式会社サカタのタネでは、B.oleracea、B.rapa植物においてクロロシスを引き起こさないOgura CMSである“キャベツＭＳ－２”が開発されている。
　これら市販されている２品種のＣＭＳ系統と、サカタのタネが保有する１系統のＣＭＳ系統、および、本発明で作出した改良ＣＭＳ系統“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”に対して、“ＳＨ”の連続戻し交雑を行った。
　各ＣＭＳ系統の生長性を正確に評価するため、“ＳＨ”と上記５系統のＣＭＳ系統から、同一環境下で虫媒による採種を行った。
　採種した“ＳＨ”および各ＣＭＳ系統の種子を、５０穴セルトレーに播種し、昼温２０℃、夜温１０℃、１６時間照明に設定した人工気象室内で栽培を行った。幼苗の生長性を定量的に評価するため、播種２週間後に、各系統の幼苗の地上部を地際で切り取り、株あたりの重量を計量し、表６に示した。表中の世代は、“ＳＨ”を連続戻し交雑した回数を示しており、例えばＢＣ７は“ＳＨ”を花粉親として７回の連続戻し交配を行ったことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　表６に記載のとおり、“紫羅蘭油菜”、“ニイハオ・フォン”、“キャベツＭＳ－２”由来の既存のOgura CMS系統は、“ＳＨ”に対する地上部重量の相対値が、それぞれ、６０．７、７６．０、６３．４となり低い生長性を示した。それに対して、改良ＣＭＳ系統“Ｊ１－３”は、“ＳＨ”に対する地上部重量の相対値が１３０．０となり非常に高い生長性を示した。また、改良ＣＭＳ系統“Ｊ１－７”は、“ＳＨ”に対する地上部重量の相対値が１０５．５となり、“ＳＨ”と同等の生長性を示した。
　次に、農作物として収穫するステージにおける生長性を評価するため、“ＳＨ”および各ＣＭＳ系統の種子を９ｃｍ硬質ポットに播種し、昼温２５℃、夜温１５℃に設定したガラス温室で栽培を行った。
　苗の生長性を定量的に評価するため、播種４６日後に、各系統の苗の地上部を地際で切り取り、株あたりの重量を計量し、表７に示した。表６の幼苗での生長性の評価試験では、“ニイハオ・フォン”由来の既存のOgura CMS系統を試験に含めていた。しかし、後述する実施例３のミトコンドリアゲノムの分析から、“紫羅蘭油菜”と“ニイハオ・フォン”由来の既存のOgura CMS系統は、同一の細胞質を有していると考えられたため、“ニイハオ・フォン”由来の既存のOgura CMS系統の収穫ステージにおける生長性試験を省略した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　表７に記載のとおり、“紫羅蘭油菜”由来ＣＭＳ系統は、“ＳＨ” に対する地上部重量の相対値が７７．８となり、“キャベツＭＳ－２”由来ＣＭＳ系統は、“ＳＨ”に対する地上部重量の相対値は、８５．３となり生長性の低下が認められた。
　幼苗での試験に比べて、全体的に生長性の低下は小さくなっているが、これは比較的長期のポット栽培によって、用土内の肥料成分が制限された影響が考えられた。表６と表７の結果を比較すると、各ＣＭＳ系統の生長性低下の順位には相関があった。したがって、“紫羅蘭油菜”、“ニイハオ・フォン”、“キャベツＭＳ－２”由来の既存のOgura CMS系統は、“ＳＨ”の核ゲノムの背景において、生長性が低下することを確認することができた。
　一方、改良ＣＭＳ系統“Ｊ１－３”は、“ＳＨ” に対する地上部重量の相対値が１３０．０となり幼苗時の試験と同様に非常に高い生長性を示した。改良ＣＭＳ系統“Ｊ１－７”は、“ＳＨ”に対する地上部重量の相対値が１０４．４となり、“ＳＨ”と同等の生長性を示した。
　以上のように、既存のOgura CMS B.rapa植物由来のＣＭＳ系統が、正常細胞質のB.rapa植物よりも低い生長性を示すのに対して、本発明の改良ＣＭＳ系統は、正常細胞質のB.rapa植物よりも同等以上の高い生長性を有することが確認できた。
実施例３
　実施例１で作出された改良ＣＭＳ系統“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”のミトコンドリアゲノムを分析するため、公知のB.rapaミトコンドリアゲノムの塩基配列情報（Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ　登録番号　AP017997）、公知のB.oleraceaミトコンドリアゲノムの塩基配列情報（Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ　登録番号　AP012988）、公知のR.sativusミトコンドリアゲノムの塩基配列情報（Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ　登録番号　AB694744）を比較し、同定したSNPs（一塩基多型）やin-del（挿入/欠失）の多型情報に基づいて、３５の領域をターゲットとしたマーカーを設計した（表８、配列番号１～８８（seq ID-1～ID-88））。また、R.sativus植物に由来する細胞質雄性不稔遺伝子であるorf138遺伝子を検出するためのマーカーを公知の塩基配列情報（Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ　登録番号　ＡＢ０５５４３５．１）に基づいて設計した（表８、配列番号８９、配列番号９０（seq ID-89,ID-90））。
　さらに、葉緑体ゲノムを分析するため、公知のB.rapa葉緑体ゲノムの塩基配列情報（Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ　登録番号　DQ231548）に基づいて、表９に示すようなプライマーを設計した（表９、配列番号９１～９２（seq ID-91～ID-92））。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　供試材料としては、正常細胞質を有するB.rapa植物“ＳＨ”、正常細胞質を有するB.oleracea植物“Ｇ”、Ogura CMS細胞質を有するR.sativus植物“ＫＮ”、既存のＣＭＳ系統である“紫羅蘭油菜”、“ニイハオ・フォン”、“キャベツＭＳ－２”、改良ＣＭＳ系統である“Ｊ１－３”、“Ｊ１－７”を用いた。
　各供試材料から、全ゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、表８、表９に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、熱変性を９４℃で１分、アニーリングを６５℃、６０℃もしくは５５℃で1分、伸長反応を７２℃で２分とし、３０サイクルもしくは３５サイクル反応させた（表１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
　B.rapa植物、B.oleracea植物、R.sativus植物の間で、多型を検出するＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析を行うため、ＰＣＲ産物を表１０に記載された制限酵素により処理した。それらのＰＣＲ産物は、１．８％アガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイド溶液に浸漬し、ＵＶ照射下で写真撮影を行って多型を調査した。
　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法を用いた、ミトコンドリアゲノムの分析結果を表１１に、葉緑体ゲノムの分析結果を表１２に示した。表１１、表１２中の“Ｂｒ”はB.rapa型、“Ｂｏ”はB.oleracea型、“Ｒｓ”はR.sativus型であることを示す。“０”は当該マーカーでの検出がないことを、“１”は当該マーカーでの検出があることを示す。また、ミトコンドリアゲノムの分析結果を表１３にまとめた。表１３の括弧内の数字は、使用した全マーカー数に対する各ミトコンドリアゲノムの型の割合を示す。ここでの全マーカー数は、表１１のマーカーのうちorf138を除く、ミトコンドリアゲノムの分析に使用した表１１のNo.１～３５の３５マーカーを指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
  
　“紫羅蘭油菜”および“ニイハオ・フォン”由来のＣＭＳ系統は、B.rapa由来の葉緑体を有し、B.rapaとR.sativusとの組み換えミトコンドリアゲノムを有していた。その組み換えのパターンは、３５マーカーで全く同一であったため、同じ由来のＣＭＳ細胞質であると考えられた。また、orf138遺伝子、B.rapa由来の葉緑体を有し、B.rapaとR.sativusとの組み換えミトコンドリアゲノムを有していることから、Ogura CMS細胞質を有するR.sativus植物と、正常細胞質を有するB.rapa植物の細胞質を有する植物との間での非対称細胞融合により作出されたと考えられた。このような細胞質の構成は、特許文献２の”new OguCMS”以外の報告が知られていないため、“紫羅蘭油菜”および“ニイハオ・フォン”の細胞質は特許文献２の方法で作出された可能性が高いと考えられた。
　表１３の結果では、“紫羅蘭油菜”および“ニイハオ・フォン”由来ＣＭＳ系統の組み換えミトコンドリアゲノムは、B.rapa型のミトコンドリアＤＮＡを６３％有し、R.sativus型のミトコンドリアＤＮＡを３７％有していた。表６および表７で示された生長性の低下は、B.rapa植物に、orf138と共に、多くのR.sativus型のミトコンドリアゲノムが導入されたため、B.rapa植物の核ゲノムとR.sativus由来のミトコンドリアゲノムの間での不親和性が原因であると考えられた。
　“キャベツＭＳ－２”は、B.oleracea型のミトコンドリアＤＮＡを７７％有し、R.sativus型のミトコンドリアＤＮＡを２３％有しており、その葉緑体は、B.oleracea由来であった。表６および表７で示された生長性の低下は、葉緑体がB.oleracea由来であること、およびB.oleraceaとR.sativus由来のミトコンドリアゲノムを有していることが、B.rapa植物の核ゲノムとの不親和性を誘発し、生長性が低下したと考えられた。しかしながら、その生長性の低下の程度は、“紫羅蘭油菜”および“ニイハオ・フォン”の中間であり、クロロシスなどの明らかな生育異常を引き起こさないことから、B.oleracea型のミトコンドリアゲノムとB.rapa型のミトコンドリアゲノムは、B.rapa植物に与える生長性への影響は、大きな差はないと推察された。本発明に従って作出した“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”のミトコンドリアゲノムは、B.rapa型のミトコンドリアＤＮＡを６０％、B.oleracea型のミトコンドリアＤＮＡを３１％有し、R.sativus型のミトコンドリアＤＮＡの割合は、わずか９％であった。
　以上の結果より、本発明の方法は、非対称細胞融合によるB.rapa植物の細胞質雑種植物の作出効率を高めたことにより、細胞質雄性不稔遺伝子orf138を導入しつつ、生長性低下の原因となるR.sativusのミトコンドリアゲノムの導入を最小限に抑えたＣＭＳ系統を選抜することができたと考えられた。その結果、得られたＣＭＳ系統は、細胞質雄性不稔性を保持しつつも、B.rapa植物とミトコンドリアゲノムの親和性が高まり、生長性が改良されたと考えられた。
　以上のように、“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”の生長性の向上の理由は、明らかとなっていないが、ＣＭＳ植物の開発においては、実用的なＣＭＳ植物が１系統得られれば、当該ＣＭＳ植物を種子親として、任意のB.rapa植物を花粉親として連続戻し交雑して核置換を行うことにより、任意のB.rapa植物を自由にＣＭＳ化することができるため、実用上何ら問題とならない。すなわち、本願発明で寄託している生長性が改良されたOgura CMS B.rapa植物を使用すれば、任意のB.rapa植物を自由にＣＭＳ化することが可能となる。
　なお、表１１の結果は細胞質雄性不稔性を発現する個体の分析結果の一例を示したものであり、生長性が改良されたOgura CMS B.rapa植物が必ずしもこのようなバンドパターンを示すとは限らない。
実施例４
　ＣＭＳ系統の種子の生産性は、種子親と商品種子の生産性に直結するため、各ＣＭＳ系統の採種性の比較を行った。供試材料として、正常細胞質を有するB.rapa植物“ＳＨ”、既存のＣＭＳ系統である“紫羅蘭油菜”、“ニイハオ・フォン”、“キャベツＭＳ－２”、改良ＣＭＳ系統である“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”を用いた。
　５０穴のセルトレーに各系統１０粒播種し、昼温２３℃、夜温１５℃のガラス温室で１か月間育苗した後、４℃設定の冷蔵庫（８時間照明）に２ヶ月間入れて、春化処理を行った。春化処理終了後、各系統２株を１０号鉢に定植し、昼温２３℃、夜温１５℃のガラス温室で栽培を行った。交配は虫媒により行い、結実後精選し、１株あたりの採種量を調査した。
　表１４に、各系統の１株あたりの平均採種量の結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
　正常細胞質を有するB.rapa植物“ＳＨ”の採種量を１００とすると、“紫羅蘭油菜”、“ニイハオ・フォン”由来ＣＭＳ系統の採種量の相対値は、７０前後となった。これらのＣＭＳ系統は、生長性の低下により、“ＳＨ”に比べて、植物体のサイズが小さいため、採種量の低下に影響したものと思われた。“キャベツＭＳ－２”の採種量の相対値は、１９．３となり、極端に低くなった。“キャベツＭＳ－２”のＣＭＳ系統は、春化処理前の生育は、“紫羅蘭油菜”、“ニイハオ・フォン”由来ＣＭＳ系統と同程度であったが、春化処理後の生育は、一時的に極めて生育不良となり、低温による障害を受けやすいと考えられた。改良ＣＭＳ系統である“Ｊ１－３”および“Ｊ１－７”は、全期間を通して“ＳＨ”よりも植物体のサイズが同等以上に大きくなっており、その結果、採種量の相対値は、それぞれ１４９．２、１４６．７となり、採種性が高く、雌性稔性に問題がないことが確認できた。
 

Claims (28)

  1. 　正常細胞質を有するBrassica rapa植物と同等の生長性を有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  2. 　Raphanus sativus植物、Brassica oleracea植物およびBrassica rapa植物のミトコンドリアゲノムに由来するＤＮＡをミトコンドリアゲノム内に有する、請求項１に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  3. 　正常細胞質を有するBrassica rapa種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、請求項１または２に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  4. 　Raphanus sativus 植物に由来する細胞質雄性不稔遺伝子を有する細胞質雄性不稔Brassica属植物を細胞質供与親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  5. 　細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物に由来する細胞質雄性不稔Brassica属植物を細胞質供与親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  6. 　細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物に由来する細胞質雄性不稔Brassica rapa植物を細胞質供与親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  7. 　既存の細胞質雄性不稔Brassica属植物を細胞質供与親として用い、正常細胞質を有するBrassica rapa 種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  8. 　種間雑種植物が、Brassica oleracea植物およびBrassica rapa植物に由来するものである、請求項３～７のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  9. 　種間雑種植物が、高再分化能を有するものである、請求項３～８のいずれか一項に記載の種間雑種植物。
  10. 　既存の細胞質雄性不稔Brassica属植物が、既存の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物である、請求項７に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  11. 　既存の細胞質雄性不稔Brassica属植物が、細胞質雄性不稔Brassica oleracea植物に由来するものである、請求項７に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  12. 　細胞質供与親が、細胞質雄性不稔遺伝子orf138を有するものである、請求項４～１１のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  13. 　Raphanus sativus植物、Brassica oleracea植物およびBrassica rapa植物のミトコンドリアゲノムに由来するＤＮＡをミトコンドリアゲノム内に有する細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代であって、
    　正常細胞質を有するBrassica rapa 種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  14. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１または受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される植物由来のミトコンドリアゲノムを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔 Brassica rapa 植物、またはその後代。
  15. 　ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K,　BrMt-185K により特定されるミトコンドリアＤＮＡの少なくともいずれか１つが、Brassica rapa 型である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa 植物、またはその後代。
  16. 　ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K により特定されるミトコンドリアＤＮＡの少なくともいずれか１つが、Brassica oleracea型である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のBrassica rapa 植物、またはその後代。
  17. 　ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K, およびBrMt-215K により特定されるミトコンドリアＤＮＡが、Brassica rapa 型であり、かつ、ミトコンドリアゲノムマーカー BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, およびBrMt-208K により特定されるミトコンドリアＤＮＡが、Brassica oleracea型である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のBrassica rapa 植物、またはその後代。
  18. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１、または、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される植物のミトコンドリアゲノムを有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  19. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１、または、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  20. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７１または、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３７２で特定される植物のミトコンドリアゲノムを有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物を細胞質供与親として用い、正常細胞質を有するBrassica rapa 種間雑種植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことにより得られる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代。
  21. 　請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物またはその後代の植物体の一部。
  22. 　請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物またはその後代の種子。
  23. 　請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代、請求項２１に記載の植物体の一部、または請求項２２に記載の種子に含まれる、ミトコンドリアゲノム。
  24. 　既存の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物を細胞質供与親として用い、正常細胞質を有するBrassica rapa植物を細胞質受容親として用いる非対称細胞融合を行うことを含む、正常細胞質を有するBrassica rapa植物と同等の生長性を有する、細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代の製造方法。
  25. 　正常細胞質を有するBrassica rapa植物が、Brassica rapa植物の種間雑種植物またはそれに由来するものである、請求項２４に記載の製造方法。
  26. 　請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なBrassica rapa植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の製造方法。
  27. 　請求項２６のいずれか一項に記載の方法により製造された雑種第一代種子、または該種子から生育させた雑種第一代植物、その後代、またはそれらの植物体の一部。
  28. 　請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞質雄性不稔Brassica rapa植物、またはその後代に、任意のBrassica rapa植物を連続戻し交雑し、細胞質置換することを含む、細胞質雄性不稔性を発現するBrassica rapa植物の製造方法。


     
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