CN113862391A

CN113862391A - 与白菜隐性核不育性状紧密连锁的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113862391A
Application number: CN202111288018.2A
Authority: CN
Inventors: 汪维红; 张凤兰; 于拴仓; 苏同兵; 温常龙; 张建; 李佩荣; 辛晓云; 余阳俊; 张德双; 赵岫云
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2021-11-02
Filing date: 2021-11-02
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-11-02
Also published as: CN113862391B

Abstract

本发明属于分子标记辅助育种领域，具体涉及与白菜隐性核不育性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。本发明公开了鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性的方法，所述方法包括使用检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质检测待测白菜的基因型，根据待测白菜的基因型鉴定或辅助鉴定白菜的雄性育性。利用本发明所提供的分子标记(SNP位点)鉴定A0612787223G/A位点多态性基因型与植株表型的准确率为97.9％。该标记可用于白菜雄性不育分子标记辅助育种。本发明获得的分子标记在实际应用中成本低、通量高、特异性高，为加速白菜雄性不育育种提供了高效的辅助育种方法和技术。

Description

与白菜隐性核不育性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记辅助育种领域，具体涉及与白菜隐性核不育性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

白菜类蔬菜属十字花科芸薹属芸薹种，是典型的异花授粉作物，杂种优势明显。目前，杂种优势的利用主要采用自交不亲和系和雄性不育系，自交不亲和系在利用上存在亲本繁殖困难、自交衰退、易受环境影响等问题，而雄性不育系具有生产的杂交种杂交率高，亲本不易流失等优势而深受育种工作者的重视。

白菜雄性不育系自上世纪70年代选育成功以来，已在生产F₁代杂种中发挥了一定作用。关于白菜细胞核隐性雄性不育基因和相关分子标记的研究较少(位于A05上的ftms、位于A02上的Bra2Ms)，目前还未完全实现分子标记辅助育种。因此，挖掘新的核不育基因并开发实用分子标记对于雄性不育育种具有重要意义。

到目前为止，大量芜菁重要性状基因如抗根肿病、耐抽薹等已被广泛应用到白菜类蔬菜育种中，这也加速了白菜类蔬菜的抗病、抗逆育种进程，为白菜产业发展做出了重要贡献。因此，挖掘芜菁新的优异基因对于白菜育种具有潜在的应用价值，而芜菁新型雄性不育基因的开发与应用对于白菜雄性不育系育种具有重要意义。

分子标记在目标资源筛选、定位调控特定农艺性状的基因、基因聚合、品种鉴定等方面的应用越来越广泛。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(Laboratory ofthe Government Chemist)公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点。该方案的核心是KASP技术，即Competitive Allele-Specific PCR。目前该项技术已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供与白菜隐性核不育性状(雄性不育)紧密连锁的SNP分子标记及其应用。

为实现上述目的，第一个方面，本发明提供鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性的方法，所述方法包括使用检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质检测待测白菜的基因型，根据待测白菜的基因型鉴定或辅助鉴定白菜雄性不育性；

所述基因型可为白菜基因组中A0612787223位点的基因型；A0612787223位点是白菜基因组中的一个SNP位点，如SEQ ID No.4的第101位核苷酸所示，其核苷酸种类为G或A，

所述A0612787223位点的基因型为GG基因型的待测白菜雄性不育；

所述A0612787223位点的基因型为GA基因型或者AA基因型的待测白菜雄性可育；

其中，所述GG基因型表示白菜基因组中所述A0612787223位点的核苷酸种类为G的纯合型；所述AA基因型表示白菜基因组中所述A0612787223位点的核苷酸种类为A的纯合型；所述GA基因型表示白菜基因组中所述A0612787223位点的核苷酸种类为G和A的杂合型。

进一步地，所述的方法中，所述检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质可为如下A1)、A2)或A3)：

A1)所述检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述A0612787223位点在内的白菜基因组DNA片段的PCR引物；

A2)所述检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质可为含有所述PCR引物的PCR试剂；

A3)含有A1)所述PCR引物或A2)所述PCR试剂的试剂盒。

进一步地，所述的方法中，所述PCR引物可为由核苷酸序列是SEQ ID No.1的第22-51位的单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.2的第22-49位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.3的单链DNA组成的引物组。

进一步地，所述的方法中，所述PCR引物可为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

第二个方面，本发明提供含有上述的检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质的产品，所述产品可为B1)-B3)中任一种：

B1)检测与白菜雄性育性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

B2)鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性的产品；

B3)用于白菜辅助育种的产品。

第三个方面，本发明提供检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质在下述C1)-C6)中的应用：

C1)鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性；

C2)制备鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性的产品；

C3)筛选或辅助筛选雄性育白菜品种；

C4)制备筛选或辅助筛选雄性不育白菜品种的产品；

C5)白菜辅助育种；

C6)制备白菜辅助育种的产品。

进一步地，所述的应用中，所述检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质可为如下A1)、A2)或A3)：

A3)含有A1)所述PCR引物或A2)所述PCR试剂的试剂盒。

所述PCR引物可为P1或P2：

P1、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中序列1的第22-51位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中序列2的第22-49位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA组成的引物组；

P2、所述PCR引物为由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列2所示的单链DNA和由序列表中序列3所示的单链DNA组成的引物组。

第四个方面，本发明提供白菜育种的方法，包括选择上述A0612787223位点的基因型为GG的白菜作为亲本进行育种，所述GG基因型表示白菜基因组中所述A0612787223位点的核苷酸种类为G的纯合型。

进一步地，上述任一项所述的白菜可为白菜与芜菁的杂交子代。

进一步地，所述白菜可为大白菜SD与芜菁MRT(m)的杂交子代，如F₁代、F₂代。

其中，大白菜SD在文献“Tongbing S,Shuancang Y,Zhenping G,etal.Evaluating multiple resistance to major diseases in a core set of inbredlines of Brassica rapa at seedling stage[J].Journal of Plant Pathology,2018.100:457–465.”中公开；芜菁MRT(m)为芜菁材料Melon Red Top中发现的雄性不育株与可育株杂交获得F₁代，然后F₁代自交获得F₂代，以F₂代中的雄性不育株为母本，可育株为父本杂交获得F₃代，其中F₃代中的雄性不育株即为MRT(m)。芜菁材料Melon Red Top(编号11017)来源于北京蔬菜种质资源库。

以上任一所述白菜具体可为满足如下描述的白菜：将所述白菜种子或播种后的植株置于12℃以下进行低温春化，等春化完成后置于常温下，开花后观察花粉，若有花粉则为可育，若无花粉则为不育。

以上任一所述A0612787223位点为白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第101位核苷酸，A0612787223位点为G/A多态。

本发明中，上述产品可为试剂或试剂盒。

本发明中，上述育种的目的包括培育或选育雄性不育的白菜。

上述应用、方法和产品中，所述PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

结果表明，利用本发明所提供的分子标记(SNP位点)A0612787223位点及其所对应的引物的鉴定准确率为97.9％。由此表明，本发明所提供的分子标记(SNP位点)A0612787223位点及其所对应的引物将有助于白菜雄性不育种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为白菜雄性不育性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。

本发明通过白菜F₂群体的QTL定位，在A06染色体上获得了1个与白菜隐性核不育性状紧密连锁的主效QTL，进一步在此区间发开出1个与白菜隐性核不育性状紧密连锁的SNP标记，通过对F₂群体188个单株验证发现标记的准确率能达到97.9％，该标记可用于白菜雄性不育分子标记辅助育种。本发明获得的分子标记在实际应用中成本低、通量高、特异性高，为加速白菜雄性不育育种提供了高效的辅助育种方法和技术。

附图说明

图1为A0612787223G/A位点在待测白菜材料中的基因分型结果图。

图2为基于BSA-Seq在A06染色体定位的与白菜雄性不育性状紧密连锁的主效QTL。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大白菜SD在文献“Tongbing S,Shuancang Y,Zhenping G,et al.Evaluatingmultiple resistance to major diseases in a core set of inbred lines ofBrassica rapa at seedling stage[J].Journal of Plant Pathology,2018.100:457–465.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

本发明中，芜菁MRT(m)为芜菁材料Melon Red Top中发现的雄性不育株与可育株杂交获得F₁代，然后F₁代自交获得F₂代，以F₂代中的雄性不育株为母本，可育株为父本杂交获得F₃代，其中F₃代中的雄性不育株即为MRT(m)。芜菁材料Melon Red Top(编号11017)来源于北京蔬菜种质资源库(网址为http://123.127.162.62:9999/Web/index.html)。

实施例1、F₂代群体的制备

以芜菁材料MRT(m)作为母本，以大白菜材料SD作为父本进行杂交，获得F₁代种子，F₁代种子长成的植株即为F₁代植株。F₁代植株自交，得到F₂代种子，F₂代种子长成的植株即为F₂代植株。选取F₂群体中与大白菜SD遗传背景相近的不育单株作为母本，以大白菜SD作为父本杂交，获得新的F₁代种子，F₁代植株继续自交，获得新的F₂代种子。

实施例2、雄性不育基因的定位及SNP分子标记开发

1、F₂群体(由实施例1得到的300株F₂代植株组成)，开花后统计有粉株(可育)和无粉株(不育)，分别选取30株无粉株和30株有粉株的单株构建不育池和可育池进行重测序。

2、采用SNP-index法将雄性不育基因定位在A06染色体2.96Mb的区间内(如图2)，进一步在此区间内根据重测序获得的SNP位点开发SNP分子标记，最终获得与雄性不育性状紧密连锁的SNP位点A0612787223(序列表序列4中第101位核苷酸)，为G/A多态，将该SNP位点命名为A0612787223位点。

针对A0612787223位点，基于竞争性等位基因特异性PCR原理，设计引物如下：

上游引物A0612787223G/A-FF(序列表的序列1)：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTTTGTGAAGGAATCATTTACACAATCTT-3'(其中下划线指示的为FAM荧光标记序列)；

上游引物A0612787223G/A-FV(序列表的序列2)：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTGTGAAGGAATCATTTACACAATCTC-3'(其中下划线指示的为HEX荧光标记序列)；

下游引物A0612787223G/A-R(序列表的序列3)：5'-CGAGTCGCGTAATTCGGATATAACAAG-3'。

上述SEQ ID No.1与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增序列表序列4中第101位核苷酸为A的片段，用仪器可读取到与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；

上述SEQ ID No.2与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增序列表序列4中第101位核苷酸为G的片段，用仪器可读取到与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。

上述上游引物最后一位核苷酸T/C对应A06染色体上第12787223G/A位的SNP位点，即序列表序列4中第101位核苷酸。

实施例3、A0612787223G/A位点在鉴定白菜可育和雄性不育材料中的应用

1、DNA提取

常规CTAB法分别提取表1中191种待测白菜材料的基因组DNA。

191份材料为亲本MRT(m)与亲本SD的杂交后代F₂的各单株，具体方法如下：以芜菁材料MRT(m)作为母本，以大白菜材料SD作为母父本进行杂交获得F₁代种子，F₁代植株自交获得到F₂代，选取F₂群体中与大白菜SD遗传背景相近的不育单株作为母本，以大白菜SD作为父本杂交，获得新的F₁代，该F₁代继续自交，获得新的F₂群体。

琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4-10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。

2、竞争性等位基因特异性PCR

按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程(基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程)进行。所用试剂除特殊说明外均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B。反应在1536微孔板中进行。

具体步骤：首先利用K-pette分液工作站将1.5μl模板溶液加入1536孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1μL反应体系，分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。

反应体系：10μM A0612787223A1溶液、10μM A0612787223A2溶液和10μMA0612787223C溶液，依次按照6:6:15体积比混匀，得到引物预混液；2×Master mix(货号为Part No.KBS-1016-011)、引物预混液和水依次按照36：1：36的体积比混匀。其中，10μMA0612787223A1溶液的组成如下：其中，10μM A0612787223A1溶液的组成如下：4.2nmol序列表中序列1所示引物加入到420ul的ddH₂O，混匀(引物委托实际公司合成，成品为干粉)；10μM A0612787223A2溶液的组成如下：4.35nmol序列表中序列2所示引物加入到435ul的ddH₂O，混匀；10μM A0612787223C溶液的组成如下：7.92nmol序列表中序列3所示引物加入到792ul的ddH₂O，混匀。

PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒、复性延伸1min(第一个循环为61℃，每个循环降低0.6℃，最后一个循环为55℃)；94℃变性20秒、55℃延伸60秒，26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。

反应体系的结果见图1。图1中，A代表GG基因型(红色荧光)，B代表GA基因型(绿色荧光)，C代表AA基因型(蓝色荧光)。

GG基因型表示白菜基因组中A0612787223位点的核苷酸种类为G的纯合型；AA基因型表示白菜基因组中A0612787223位点的核苷酸种类为A的纯合型；GA基因型表示白菜基因组中A0612787223位点的核苷酸种类为G和A的杂合型。

GG基因型带有FAM荧光，显示红色荧光；AA基因型带有HEX荧光，显示蓝色荧光，GA基因型显示绿色荧光。

结果显示分型效果良好，该引物能有效鉴定供试植株基于A0612787223位点的基因型为GG基因型、AA基因型还是GA基因型。

芜菁材料MRT(m)为雄性不育株，基于A0612787223位点的基因型为GG(表1中表示为“P1”)。大白菜材料SD为雄性可育株，基于A0612787223位点的基因型为AA(表1中表示为“P2”)。F₁代为雄性可育，基于A0612787223位点的基因型为GA(表1中表示为“F1”)。

188株F₂代(表1中表示为“1-188”)基于SNP位点的基因型结果见表1。

3、F₂代植株开花后育性情况检测

检测表1中191种待测白菜材料是否雄性不育。结果见表1。

综合表1中的结果，可得到如下结论：若待测白菜A0612787223位点的基因型为GG基因型(表1中表示为G：G)，则待测白菜不雄性不育；若待测白菜A0612787223位点的基因型为AA基因型(表1中表示为A：A)或基因型为GA基因型(表1中表示为G：A)，则待测白菜可育。

在137份表型为可育的材料中，分子标记鉴定A0612787223位点为AA纯合的材料有36份，杂合G/A位点的有99份，GG纯合位点的有2份，鉴定准确率为98.5％。在51份表型为不育的材料中，A0612787223位点为GG纯合的有49份，杂合G/A位点的有1份，AA纯合位点的有1份，鉴定准确率为96.1％。本发明方法的平均鉴定准确度为97.9％。

上述结果表明，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的育性。

表1.188份F₂群体材料在A0612787223G/A位点的基因分型及表型统计表

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种与白菜隐性核不育性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tcttttgtga aggaatcatt tacacaatct t 51

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat ttttgtgaag gaatcattta cacaatctc 49

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagtcgcgt aattcggata taacaag 27

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> 白菜(Brassica rapa )

<400> 4

aactgagaga cttgatcaac aagtgttgaa tcaagaaatg ttgatagatt aggaatcaat 60

ctccgccgag tcgcgtaatt cggatataac aagtctgtaa ragattgtgt aaatgattcc 120

ttcacaaaag ttacatgttc ttagaattac tttgtacctt gtgtttttga tgaattttga 180

ttctacagat gtttgaaagt g 201

Claims

1.鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性的方法，其特征在于：包括使用检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质检测待测白菜的基因型，根据待测白菜的基因型鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性；

所述基因型为白菜基因组中A0612787223位点的基因型；A0612787223位点是白菜基因组中的一个SNP位点，如SEQ ID No.4的第101位核苷酸，其核苷酸种类为G或A，

所述A0612787223位点的基因型为GG基因型的待测白菜雄性不育；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质为如下A1)、A2)或A3)：

A2)所述检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；

A3)含有A1)所述PCR引物或A2)所述PCR试剂的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR引物为由核苷酸序列是SEQ IDNo.1的第22-51位的单链DNA、核苷酸序列是SEQ ID No.2的第22-49位的单链DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述PCR引物为由SEQ ID No.1所示的单链DNA、SEQ ID No.2所示的单链DNA和SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

5.含有权利要求1-4中任一项所述的检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质的产品，所述产品为B1)-B3)中任一种：

B2)鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性的产品；

B3)用于白菜辅助育种的产品。

6.检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质在下述C1)-C6)中的应用：

C1)鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性；

C2)制备鉴定或辅助鉴定白菜雄性育性的产品；

C3)筛选或辅助筛选雄性不育白菜品种；

C4)制备筛选或辅助筛选雄性不育白菜品种的产品；

C5)白菜辅助育种；

C6)制备白菜和辅助育种的产品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述检测A0612787223位点的多态性或基因型的物质为如下A1)、A2)或A3)：

A3)含有A1)所述PCR引物或A2)所述PCR试剂的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述PCR引物为P1或P2：

9.白菜育种的方法，其特征在于：所述方法包括选择权利要求1中所述A0612787223位点的基因型为GG的白菜作为亲本进行育种，所述GG基因型表示白菜基因组中所述A0612787223位点的核苷酸种类为G的纯合型。

10.权利要求1-9中任一项所述的白菜为白菜与芜菁的杂交子代。