CN101854797A - 针对性状表现和表达选择基因座的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在植物育种中用于鉴别和选择调控转基因表现和表达的基因座的新型方法和组合物。另外还提供了对于至少一种转基因的表现和表达筛选种质的方法。

Description

针对性状表现和表达选择基因座的方法和组合物

交叉引用

本发明要求美国临时申请60/945,760(于2007年6月22日提交)的优先权，其全部内容通过引用方式结合于本文中。

序列表引用

于2007年9月17日创建的包含3110个字节(

计数的)的、名为“54008seq.txt”的文件的序列表包含200个核苷酸序列，其全部内容通过引用方式结合于本文中。

技术领域

本发明属于植物育种领域。特别地，本发明提供了用于选择一种或多种转基因性状与一份或多份(entries)种质的优选组合的方法和组合物。提供了确定用于标记辅助育种活动中的转基因调控基因座的方法。并且提供了用于评价种质的性状表现(performance)的方法。

背景技术

造成在多种性状中的任一性状方面观察到的表型范围的基因组中的遗传变异构成了在植物和动物育种中的决定的基础。通常，任何一个表型将会受多种遗传因子的调控，个体间这些遗传因子的差异可与表型结果相关。在表型是转基因的产物的情况下，可预期到生物体基因组中的遗传因子可有助于该转基因的表型。转基因植物育种的一个目标是，符合一个转基因或者一组转基因的产品概念或效力，同时至少保持转基因植物相对于非转基因类型的基线相等。

转基因的效力可受宿主植物遗传背景中组成型基因的影响。组成型基因的等位基因变异(包括拷贝数变异和缺失)可以调控转基因的表达或者提高转基因产品概念的表现。因此，需要在植物育种中确定和选择调控转基因表现和表达的基因座的方法和组合物。此外，缺乏用于筛选种质以确定转基因的表现和表达或者确定遗传背景的方法。

发明内容

本发明提供了在植物育种中用于确定和选择调节转基因表现和表达的基因座的方法和组合物。影响目标性状的表现或者调控转基因表达的基因或者QTL的确定通过标记辅助选择策略为控制这些效应提供了基础。大多数农艺学上重要的性状由许多基因控制。比如产率、湿度、干旱耐受性，种子组成和蛋白质和淀粉质量这些性状是由多个基因座定量遗传的。可以选择在多个基因座处的较好的等位基因，对于所有数量性状而言改善遗传背景，包括已通过转基因修饰改善的那些性状。

当鉴别转基因调控基因座时，可使用标记来直接或间接选择用于调控基因和/或数量性状基因座(quantitative trait loci)(QTL)的有益等位基因，以提高性状的表现和表达。用于鉴别转基因调控基因座的方法包括但不限于：受控杂交的遗传连锁作图以及不相关的种系的关联性研究，其中，除了那些非常紧密地与目的性状连锁的基因座以外，所有基因座都处于连锁平衡中。用于鉴别能够改善表现和表达的转基因调控基因座的相同标记也可用于选择在确定的基因座处包含理想的等位基因的最大频率的个体。另外，这些标记也可用于将一个或多个转基因调控基因座渗入到至少一个不含转基因调控基因座的遗传背景中，即，渗入到具有优选的农学性状的优良种质中。而且，这些标记也可包含与至少一个转基因调控基因座相关的表型性状，其中，可在至少一种表型或遗传特征的基础上进行植物的筛选。

本发明进一步提供了用于快速筛选多份种质以确定遗传背景效应是否影响转基因表现的方法。对于遗传背景效应而言，提供了鉴别至少一种基因型和至少一种转基因的优选组合的方法。为了鉴别对于至少一个转基因优选的近交系，本发明能够在包括将近交系与含有至少一种转基因的测交系(tester)进行杂交的育种方案中快速筛选种质。

本发明包括选育具有包含至少一种目的表型的转基因的农作物的方法，该农作物例如是玉米(玉米(Zea mays))、大豆(大豆(Glycinemax))、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、大麦(大麦(Hordeum vulgare))；燕麦(燕麦(Avena sativa))；野茅(鸭茅(Dactylis glomerata))；水稻(稻(Oryza sativa)，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)变种)；高粱(双色高粱(Sorghum bicolor))；甘蔗(甘蔗属的种(Saccharum sp))；高羊茅(苇状羊茅(Festuca arundinacea))；草皮草物种(例如物种：四季青(Agrostis stolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、钝叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、芸苔属的成员、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆、茄子、茴香、青刀豆、葫芦、韭菜、莴苣、甜瓜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、萝卜、菠菜、笋瓜、甜玉米、西红柿、西瓜、观赏植物以及其它水果、蔬菜、块茎和块根农作物，进一步限定为赋予选自除草剂耐受性、抗病性、昆虫或害虫抗性、改变的脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢、提高的谷物产量、增加的油、增加的营养含量、增加的生长速度、增强的应激耐受性、优选的成熟度、增强的感官特性、改变的形态特征、不育性、其它农学性状、用于工业应用的性状或用于提高消费者吸引力的性状的优选特性。

在其它实施方案中，本发明包括用于鉴别优选的基因型和转基因组合的方法和组合物以及选育转基因植物的方法。特别地，本发明提供了用于鉴别在标记辅助育种、标记辅助基因渗入和预筛选中使用的转基因调控基因座的方法。本发明还提供了用于评价在多杂交方案中用于测量转基因表现的转基因性状配合力(combiningability)的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴别植物基因型与一种或多种转基因性状的表现的关联性(association)的方法。该方法包括筛选显示至少一种转基因性状的遗传变异的多份转基因种质，其中该遗传变异与至少一种基因型相关；和将来自这些转基因种质的至少一种基因型与至少一种转基因性状相关联。

在另一实施方案中，本发明提供了用于鉴别和选育具有调控转基因性状表现的基因型的植物种质的方法。该方法包括将至少两份种质与具有至少一种转基因性状的测试种质进行杂交；和检测杂交后代中至少一种转基因性状的被调控的表现。

在另一实施方案中，本发明提供了能够为商业育种单位带来更高价值的商业方法。单位许可具有至少一种基因型的至少一种转基因包，而不是仅许可转基因，其中，该基因型可以包括用于检测至少一个转基因调控基因座的试剂盒、用于发展至少一种转基因的种质建议，和/或用于转换以渗入至少一个转基因调控基因座的种质资源。

基于此处的描述将明白其它的应用领域。应该理解，说明书和具体实施方案仅意在阐明本发明，而并不意在限制本发明的范围。

具体实施方式

此处提供的定义和方法定义了本发明，并对本领域技术人员实施本发明起到指导作用。除非特别说明，根据相关领域普通技术人员的常规使用来理解这些术语。分子生物学的常见术语的定义还可以参见Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，5th Edition，Garland Science Publishing，Inc.：New York，2007；Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，5th edition，Springer-Verlag：New York，1991；King等人，A Dictionary of Genetics，6th ed，Oxford University Press：New York，2002；和Lewin，Genes IX，Oxford University Press：New York，2007。使用37CFR§1.822规定的DNA碱基的命名法。

“等位基因”是指在特定基因座处的替代序列；等位基因的长度可以短至1个核苷酸碱基，但是通常较长。等位基因序列可表示为核酸序列或由核酸序列编码的氨基酸序列。

“基因座”为通常由参考点(point of reference)发现的基因组序列上的位点；例如，为基因或基因部分或基因间区域的短DNA序列。基因座可以指染色体上参考点处的核苷酸位点，例如来自染色体末端的位点。特定基因组已知的基因座的有序排列被称为遗传图谱。在特定基因座处的DNA序列的变异体被称作等位基因，在基因座处的变异(即两种或更多种等位基因)构成了多态性。任何核酸序列的多态性位点可以通过比较两份或更多份种质中的一个或多个基因座处的核酸序列来确定。

此处所使用的“多态性”是指在一个或多个个体的群体中，在一个或多个基因座处存在核酸序列的一种或多种变异。这种变异可以包括但不限于一个或多个碱基改变、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性可能产生自核酸复制中的随机过程、通过诱变、移动基因组元件的结果、拷贝数变异以及可能在减数分裂的过程产生，例如不等交换、基因组复制以及染色体断裂和融合。变异可以是常见的，或者可能在群体中以低频率存在，前者在普通植物育种中具有更大的应用，后者可能与罕见的但是重要的表型变异相关。有用的多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性和标签SNP。遗传标记、基因、DNA衍生序列、单元型、RNA衍生序列、启动子、基因的5’非翻译区、基因的3’非翻译区、微RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录模式和甲基化模式可以具有多态性。此外，前述这些的存在、缺失或拷贝数的变化可以具有多态性。

此处所使用的术语“单核苷酸多态性”也被简称为“SNP”，是指单位点处的多态性，其中所述多态性构成了单个碱基对的改变、一个或多个碱基对的插入或一个或多个碱基对的缺失。

此处所使用的“标记”是指可用于区别生物体的可检测到的特征。这样的特征的例子包括遗传标记、蛋白质组成、蛋白质水平、油组成、油水平、碳水化合物组成、碳水化合物水平、脂肪酸组成、脂肪酸水平、氨基酸组成、氨基酸水平、生物聚合物、药物、淀粉组成、淀粉水平、可发酵的淀粉、发酵产率、发酵效率、能量产率、次级化合物、代谢物、形态学特征和农学特征。此处所使用的“遗传标记”是指多态性核酸序列或核酸特征。

此处所使用的“标记分析”是指使用特定的方法检测特定基因座处的多态性的方法，例如检测至少一种表型(例如种子颜色、花色或其它视觉上可检测到的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术。

此处所使用的术语“单元型”是指由至少一个多态性遗传标记限定的单元型窗口内的染色体区域。各单元型窗口内的独特的遗传标记指纹组合限定了该窗口的各单元型。此外，例如由重组造成的单元型的改变可造成单元型的修饰，因此其仅包含与性状可操作地连锁(例如通过与基因、QTL或转基因的物理连接)的最初的(亲本)单元型的一部分。单元型的任何这样的改变将会包含在我们关于什么构成单元型的定义中，只要该基因组区域的功能完整性未发生改变或者有所提高。

此处所使用的术语“单元型窗口”是指通过本领域普通技术人员已知的统计学分析建立的以及处于连锁不平衡的染色体区域。因此，两个近交个体(或两个配子)之间在位于这一区域内的一个或多个基因座处的状态同一性被视为整个区域来源同一性(identity-by-descent)的证据。每个单元型窗口包含至少一种多态性遗传标记。单元型窗口可沿着基因组中的各染色体进行绘制。考虑到遗传标记的密度不断增长，单元型窗口自身并非是固定的，本发明预期单元型窗口的数量和大小将会发展，即窗口的数目增长而它们的相应大小减小，因此导致在遗传标记基因座处状态同一性的基础上确定来源同一性的置信度不断增大。

此处所使用的“转基因调控基因座”是指影响一个或多个转基因的表现或表达的基因座。一个或多个转基因调控基因座可影响转基因的表现或表达。一个或多个转基因调控基因座可影响两个或多个转基因的集合的表现或表达。

此处所使用的“单元型效应评估”是指反映与一种或多种表型性状的关联的单元型的预测效应评估，其中，该关联可以从头进行或者通过梳理(leverage)历史上的单元型-性状关联数据进行。

此处所使用的“基因型”是指表型的遗传成分，其可使用标记进行间接表征，或者通过核酸测序进行直接表征。合适的标记包括表型特征、代谢模式、遗传标记或一些其它类型的标记。基因型可以构成至少一个遗传标记基因座的等位基因，或者至少一个单元型窗口的单元型。在一些实施方案中，基因型可表示单一基因座，在其它实施方案中，其可表示宽达整个基因组的一组基因座。在另一实施方案中，基因型可反映染色体一部分、整个染色体、基因组一部分和整个基因组的序列。

此处所使用的“表型”是指可由基因表达影响的细胞或生物体的可检测的特征。

此处所使用的“连锁”是指杂交中产生配子类型的相对频率。例如，如果基因座A具有“A”或“a”基因，基因座B具有“B”或“b”基因，则具有AABB的亲本I与具有aabb的亲本B之间的杂交将会产生四种可能的配子，其中基因被分离为AB、Ab、aB和ab。零期望为将会独立地等同地分离为四种可能的基因型中的每一种，即在没有连锁时，每种基因型将会包含1/4的配子。配子向基因型的分离不同于1/4是由于连锁。

此处使用的“连锁不平衡”在一代中许多个体的群体中配子类型的相对频率的文字环境中定义。如果等位基因A的频率为p，a为p’，B为q以及b为q’，那么预计的基因型AB的频率(没有连锁不平衡)为pq，Ab为pq’，aB为p’q以及ab为p’q’。任何不同于预期频率的偏离都被称为连锁不平衡。当两个基因座处于连锁不平衡时，它们被称为“遗传连锁的”。

此处所使用的“数量性状基因座(QTL)”是指控制通常连续分布的在一定程度上可用数值表示的性状的基因座。

此处所使用的术语“转基因”是指DNA如cDNA或基因组DNA形式的核酸分子，以及RNA如mRNA或微RNA形式的核酸分子，它们可以是单链或双链。

此处所使用的术语“事件”是指特定的转化体。在典型的转基因育种程序中，决定性状的转化构建体通过转化方法被引入到基因组中。通常对每个构建体产生许多独立的转化体(事件)。通过评价这些事件来选择具有优良表现的事件。

此处所使用的术语“近交系”是指为了遗传同质性而选育的种系。得到近交系的育种方法的例子包括但不限于谱系育种、轮回选择、单粒传法、回交和单倍体加倍。

此处所使用的术语“杂种”是指至少两个遗传上相异的亲本间杂交的后代。杂交方案的例子包括但不限于单杂交、改良单杂交、双改良单杂交、三元杂交、改良的三元杂交和双杂交，其中改良的杂交中的至少一个亲本为姐妹系间杂交的后代。

此处所使用的术语“测交系”是指在与另一种系测交中使用的种系，其中测交系和测试的种系来自不同的种质库。测交系可以是等基因的或非等基因的。

此处所使用的术语“玉米”是指玉米(Zea mays)或玉米，并包括可用玉米选育的所有植物品种，包括野生玉米种。更具体而言，来自玉米种和Zea mays L.ssp.mays玉米亚种的玉米植物可通过使用本发明的组合物和方法进行基因型分型。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.mays Indentata，也被称为马齿型玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.mays Indurata，也被称为硬质玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.mays Saccharata，也被称为甜玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.maysAmylacea，也被称为面粉玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.mays Everta，也被称为爆裂种玉米。可以使用在此描述的组合物和方法进行基因型分型的玉米属或玉米植物包括杂种、近交系、部分近交系、或者定义或未定义的群体的成员。

此处所使用的术语“大豆”是指大豆(Glycine max)，包括可用大豆选育的所有植物品种，包括野生大豆种。更具体而言，来自大豆种和大豆max亚种(Glycine max L.ssp.max)或扁豆莢大豆(Glycine max L.ssp.formosana)的大豆植物可通过使用本发明的组合物和方法进行基因型分型。另一方面，大豆植物来自野生大豆(Glycine soja)种，也被称为野生大豆，可以使用这些组合物和方法进行基因型分型。或者，来自大豆、大豆max亚种、扁豆莢大豆和/或野生大豆的大豆种质可以使用在此提供的组合物和方法进行基因型分型。

此处所使用的术语“油菜(canola)”是指甘蓝型油菜(Brassicanapus)和油菜(B.campestris)，包括可用油菜选育的所有植物品种，包括野生芸苔属的种和其它农业芸苔属的种。

此处所使用的术语“包括”是指“包括但不局限于”。

此处所使用的术语“优良种系”是指针对优良的农学表现进行育种和选择产生的任何种系。优良植物为来自优良种系的任何植物。

根据本发明，申请人已发现了用于鉴别和关联对转基因表现有影响的基因型的方法。例如，在一个实施方案中，本发明的方法包括筛选对至少一种转基因性状显示出遗传变异的多份转基因种质，其中，该遗传变异与至少一种基因型相关联；和将来自这些转基因种质的至少一种基因型与至少一种转基因性状相关联。在另一实施方案中，本发明的方法包括将至少两份种质与测试种质进行杂交，用于评价至少一种转基因的表现，以便确定优选的杂交方案。本发明的方法可与下面描述的传统育种技术一起使用，以便更有效地筛选和鉴别影响转基因表现的基因型。

A.标记辅助育种

通过基于个体的表型记录及其在分子遗传学应用中的相关性来鉴别具有有价值的遗传性状的基因组区域，在植物和动物中选择经济上重要的性状已经改进了育种。与仅基于表型数据得到的结果相比，在育种程序中使用遗传标记加速了有价值的性状向种质中的遗传积累。此处的“种质”包括育种种质、育种群体、优良近交系的集合、随机杂交个体的群体和双亲杂交。遗传标记等位基因(“等位基因”为基因座处的可替换序列)被用于鉴别在多个基因座处包含理想的基因型以及预期能将理想的基因型和理想的表型一起转移给它们的后代的植物。遗传标记等位基因可用于鉴别在一个标记基因座、几个基因座或单元型处包含理想的基因型以及预期能将理想的基因型和理想的表型一起转移给它们的后代的植物。这一方法已被广泛引用，并通过加速有利等位基因的固定和消除每一代表型分型的需求而使植物育种极大地节约。

1.标记技术

标记的发展以及标记与表型的关联性或用于标记辅助育种的数量性状基因座(QTL)定位(mapping)已在近年来取得了进展。遗传标记的例子为限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失多态性(Indel)、可变数目串联重复(VNTR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)和本领域普通技术人员已知的其它标记。农作物中标记的发现和发展为将其应用到标记辅助育种活动中提供了最初的构架(美国专利申请2005/0204780、2005/0216545、2005/0218305和2006/00504538)。得到的“遗传图谱”表示表征的基因座(DNA标记或其等位基因可被鉴别的任何其它基因座)沿染色体的相对位置。该图谱上距离的测量与处于减数分裂的姐妹染色单体之间的交换事件的频率相关。

作为一套使用，多态性标记可作为指纹分析植物以获得种系或变种的同一性程度的有用的工具(美国专利6,207,367)。这些标记构成了确定与表型的关联性的基础，并可用于促进遗传增益。标记辅助选择的实现取决于检测个体间内在遗传差异的能力。

本发明中使用的遗传标记包括“显性”或“共显性”标记。“共显性标记”揭示了存在两个或更多个等位基因(每个二倍体个体有两个)。“显性标记”揭示了仅存在一个等位基因。显性标记表型的存在(例如DNA带)指示一个等位基因在纯合或杂合条件下存在。不存在显性标记表型(例如不存在DNA带)仅证明了存在“某些其它”未限定的等位基因。在其中个体主要为纯合的且基因座主要为二态性的群体中，显性和共显性标记可以具有相同的价值。当群体变得更加杂合和多等位基因时，共显性标记通常比显性标记更能提供关于基因型的信息。

核酸分子或其片段在特定环境下能够与其它核酸分子特异性杂交。如果两个分子能够形成反平行的、双链核酸结构，则此处所使用的两个核酸分子能够彼此特异性杂交。如果它们显示完全互补性，则该核酸分子与另一核酸分子是“互补的”。当一个分子的每一核苷酸与另一分子的核苷酸互补时，此处所使用的分子显示“完全互补性”。如果它们可以彼此杂交并且其稳定性足以使其至少在常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则两个分子是“最低限度互补的”。类似地，如果它们可以彼此杂交并且其稳定性足以使其在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则该分子为“互补的”。常规的严格性条件在Sambrook等人，In：Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Edition，ColdSpring Harbor Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)，和Haymes等人，In：Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)中描述。因此，偏离完全互补性是允许的，只要这一偏离不完全排除分子形成双链结构的能力就行。为了使核酸分子可作为引物或探针使用，只需要序列充分互补同，以在使用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。

此处所使用的基本上同源的序列为在高严格性条件下将会与所比较的核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。本发明的核酸探针和引物可以在严格性条件下与目标DNA序列杂交。术语“严格性杂交条件”被定义为可根据经验确定的、探针或引物与目标序列而不与非目标序列特异性杂交时的条件。通过Sambrook等人，1989，9.52-9.55中讨论的特异性杂交方法，在核酸探针与目标核酸(即与特定的目的核酸序列)杂交方面，对术语“严格性条件”进行了功能性定义。还可以参见Sambrook等人，19899.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa 1984Nucl.Acids Res.12：203-213；和Wetmur等人1968J.Mol.Biol.31：349-370。促进DNA杂交的适当的严格性条件是本领域技术人员已知的，或者可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6。

此处所使用的核酸分子的片段可为任何大小的。示例性的片段包括但不限于SEQ ID NO：1-176所示的核酸序列及其互补序列。一方面，片段可为15-25、15-30、15-40、15-50、15-100、20-25、20-30、20-40、20-50、20-100、25-30、25-40、25-50、25-100、30-40、30-50以及30-100个核苷酸。另一方面，片段可以大于10、15、20、25、30、35、40、50、100或250个核苷酸。

其它遗传标记也可用于本发明的方法中来选择具有与本发明的转基因调控基因座相关的QTL的等位基因的植物。公开的标记数据库的例子包括例如：美国农业部农业研究局的玉米基因组数据库(Maize Genome Database)或美国农业部农业研究局的大豆数据库(Soybase)。

在另一实施方案中，可以使用与本发明的QTL的等位基因遗传连锁或相关的标记，例如单序列重复标记(SSR)、AFLP标记、RFLP标记、RAPD标记、表型标记、同工酶标记、单核苷酸多态性(SNP)、插入或缺失(Indel)、单特征多态性(SFP，例如，如Borevitz等人2003Gen.Res.13：513-523所述)、微阵列转录模式、DNA衍生序列和RNA衍生序列。

在一个实施方案中，用于判断是否存在遗传多态性的基于核酸的分析可用于在育种群体中选择种子。用于分析遗传多态性的多种遗传标记是可获得的，也是本领域技术人员公知的。该分析可用于选择包含遗传标记或与遗传标记连接的基因、基因的部分、QTL、等位基因或基因组区域(单元型)。

在此，核酸分析方法是本领域已知的，包括但不限于基于PCR的检测方法(例如TaqMan分析)、微阵列方法和核酸测序方法。在一个实施方案中，使用核酸扩增方法可有利于DNA、RNA或cDNA样品中多态性位点的检测。这些方法特异性地增加了横跨多态性位点或者包括该位点的多聚核苷酸和位于其远侧或近侧的序列的浓度。这些扩增的分子可以很容易地通过凝胶电泳、荧光检测方法或其它方式进行检测。

获得这种扩增的方法利用了聚合酶链反应(PCR)(Mullis等人1986 Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-273；欧洲专利50,424；欧洲专利84,796；欧洲专利258,017；欧洲专利237,362；欧洲专利201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；和美国专利4,683,194)，使用能够与以其双链形式限定多态性的近侧序列杂交的引物对。

DNA序列中的多态性可通过多种本领域公知的有效方法进行检测或分型，这些方法包括但不限于美国专利5,468,613、5,217,863、5,210,015、5,876,930、6,030,787、6,004,744、6,013,431、5,595,890、5,762,876、5,945,283、5,468,613、6,090,558、5,800,944、5,616,464、7,312,039、7,238,476、7,297,485、7,282,355、7,270,981和7,250,252中公开的那些方法，这些专利全部在此引入作为参考。但是，本发明的组合物和方法可与任何多态性分型方法一起使用，以对基因组DNA样品中的多态性进行分型。这些使用的基因组DNA样品包括但不限于直接从植物中分离的基因组DNA、克隆的基因组DNA或扩增的基因组DNA。

例如，DNA序列中的多态性可通过与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交进行检测，如美国专利5,468,613和5,217,863中所公开的。美国专利5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中核酸序列中的单个或多个核苷酸变异可通过一方法在核酸中进行检测，在该方法中，扩增含有核苷酸变异的序列，点样在膜上，并使用标记的序列特异性寡核苷酸探针进行处理。

还可以使用美国专利5,800,944中公开的探针连接方法来检测目标核酸序列，其中，扩增目的序列，与探针进行杂交，然后再进行连接，以检测探针的标记部分。

微阵列也可用于多态性检测，其中寡核苷酸探针组以重叠的方式装配以代表单序列，这样目标序列在某一点上的差异将会导致部分探针杂交(Borevitz等人，Genome Res.13：513-523(2003)；Cui等人，Bioinformatics 21：3852-3858(2005))。在任何一个微阵列上，预期将会存在多个目标序列，这些目标序列可以代表基因和/或非编码区，其中各目标序列由一系列重叠的寡核苷酸而不是单个探针表示。这一平台可以高通量筛选多种多态性。单特征多态性(SFP)为由寡核苷酸阵列上的单个探针检测到的多态性，其中特征为阵列上的探针。通过基于微阵列的方法的目标序列分型在美国专利6,799,12、美国专利6,913,879和美国专利6,996,476中公开。

还可以使用美国专利5,616,464中公开的探针连接方法来检测目标核酸序列，该方法使用至少一对探针，该探针具有与目标核酸序列的邻近部分同源的序列并且具有在探针与目标核酸序列碱基配对时非共价连接以形成茎的侧链。至少一个侧链带有能与茎上的其它侧链成员形成共价交联的光活化基团。

用于检测SNP和Indel的其它方法包括单碱基延伸(SBE)方法。SBE方法的例子包括但不限于美国专利6,004,744、美国专利6,013,431、美国专利5,595,890、美国专利5,762,876和美国专利5,945,283中公开的那些方法。SBE方法是基于邻近多态性的核苷酸引物的延伸，以在引物延伸时引入可检测到的核苷酸残基。在某些实施方案中，SBE方法使用3个合成的寡核苷酸。2个寡核苷酸作为PCR引物，并与基因组DNA的基因座序列互补，该序列的侧翼为包含待分析的多态性的区域。在包含多态性的基因组区域扩增之后，PCR产物与第三个寡核苷酸(被称为延伸引物)混合，该寡核苷酸被设计为在DNA聚合酶和两个差异标记的双脱氧核苷三磷酸的存在下可与邻近多态性的扩增DNA杂交。如果模板上存在多态性，标记的双脱氧核苷三磷酸中的一个可在单碱基链延伸中被添加到引物中。然后可以通过确定两个差异标记中的哪一个被加入到延伸引物上来推断存在的等位基因。纯合样品将会造成两个标记的碱基中仅有一个被引入，因此将只会检测到两个标记中的一个。杂合样品存在两个等位基因，因此将会引入两个标记(到延伸引物的不同分子中)，因此两个标记都会被检测到。

在用于检测多态性的另一种方法中，SNP和Indel可通过美国专利5,210,015、美国专利5,876,930和美国专利6,030,787中公开的方法进行检测，其中寡核苷酸探针带有共价连接到探针5’和3’末端的5’荧光报告染料和3’猝灭染料。当探针完整时，报告基因接近猝灭染料抑制了报告染料荧光，例如通过福斯特型能量转移(Forster-typeenergy transfer)。在PCR过程中，正向和反向引物与侧翼为多态性的目标DNA的特定序列杂交，而杂交探针与扩增PCR产物内含多态性的序列杂交。在后续的PCR循环中，具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶切割探针并从猝灭染料中分离出报告染料，导致报告染料的荧光增加。

在另一实施方案中，可以使用核酸测序技术直接对一个或多个目的基因座进行测序。核酸测序方法是本领域已知的，包括454LifeSciences(Branford，CT)、Agencourt Bioscience(Beverly，MA)、AppliedBiosystems(Foster City，CA)、LI-COR Biosciences(Lincoln，NE)、NimbleGen Systems(Madison，WI)、Illumina(San Diego，CA)和VisiGen Biotechnologies(Houston，TX)提供的技术。这些核酸测序技术包括例如平行珠阵列、连接测序、毛细管电泳、电子微芯片、“生物芯片”、微阵列、平行微芯片和单分子阵列等形式，R.F.ServiceScience 2006311：1544-1546对其进行了总结。

为了QTL定位，本发明的方法中使用的标记应优选地显示起源，以便做出关于后续群体的推断。至今为止的经验表明SNP标记对于定位是理想的，因为特定的SNP等位基因来自特定物种的现存群体中的独立来源的可能性非常低。这样，SNP标记看起来对于跟踪和辅助QTL的基因渗入是有用的，特别是在单元型的情况中。

此处所使用的“核酸分子”可以为天然存在的分子，其它情况下可为“基本纯化的”，如果希望的话，是指从与其天然状态正常相关的基本所有其它分子中分离出来的分子。更优选地，基本上纯化的分子为制品中存在的主要种类。基本上纯化的分子可以至少大约60％不含、优选地至少大约75％不含、更优选地至少大约90％不含和最优选地至少大约95％不含天然混合物中存在的其它分子(不包括溶剂)。术语“基本上纯化的”并不意在包括以它们的天然状态存在的分子。

本发明的制剂在结构属性(例如核酸与另一核酸分子杂交的能力)或蛋白质被抗体结合(或与另一分子竞争这一结合)的能力方面，优选地为“生物活性的”。或者，这种属性可以是催化的，因此包括该制剂介导化学反应或响应的能力。

本发明的制剂还可以是重组的。此处所使用的术语重组是指任何是或间接产生自核酸分子的人工操作的制剂(例如DNA、肽等)。

本发明的制剂可用有助于检测该制剂的试剂(例如荧光标签(Prober等人1987Science 238：336-340；欧洲专利144914)、化学标签(美国专利4,582,789；美国专利4,563,417)和修饰的碱基(欧洲专利119448))进行标记。

2.标记-性状关联性

本发明提供了使用定位技术鉴别转基因调控基因座的方法。通过建立作为表型的转基因表现，鉴别与优选的转基因表现相关的基因型。取决于转基因育种流水线中的转基因阶段，本发明的方法可用于比较一份或多份种质中的两种或更多种转基因事件，以及比较两份或更多份种质中的一种或多种转基因事件。用于检测标记-性状关联性的示例性的方法阐述如下。

由于遗传标记中的等位基因差异，可通过分离群的基因型和表型的统计学评价来鉴别QTL。QTL定位方法已经很好地描述(WO90/04651；美国专利5,492,547，美国专利5,981,832，美国专利6,455,758；Flint-Garcia等人2003Ann.Rev.Plant Biol.Ann.Rev.Plant Biol.54：357-374综述)。用于确定表型和基因型之间相关性的统计学显著性的方法(无论是遗传标记还是单元型)可通过本领域已知的任何统计学检验来确定，并使用需要的统计学显著性的任何可接受的阈值。特定的方法和显著性阈值的应用是本领域普通技术人员公知的。特别地，任何类型的标记可与作为原因的基因型相关，并可基于遗传或表型标记做出选择决定。

使用标记推断目的表型通过用基因型分型或较便宜的表型分型平台(例如早期出现的表型特征)来取代昂贵的、耗时的表型分型导致育种程序的节约。此外，育种程序可以设计为通过靶向特定的基因型来促进特定的、有利的表型的频率(美国专利6,399,855)。可以连续地监测这些关联性的保真度以确保维持的预测能力，因此可利于育种决定(美国公布专利申请2005/0015827)。

QTL的等位基因甚至在连续的基因座区域或连锁基团(例如单元型)中可以包含多个基因或其它遗传因子。此处所使用的QTL的等位基因或转基因调控基因座因此可以包含多于一个的基因或其它遗传因素，其中，各个体基因或遗传成分还能够显示出等位基因变异，各基因或遗传因素还能够引起对所述数量性状的表型效应。在本发明的一个方面，QTL的等位基因包含也能够显示等位基因变异的一个或多个基因或其它遗传因素。术语“QTL的等位基因”的使用因此不意在排除包含多于一个的基因或其它遗传因素的QTL。特别地，本发明中的“QTL的等位基因”可以表示单元型窗口内的单元型，其中表型可为抗病性。单元型窗口为可用一组一个或多个多态性标记限定和跟踪的连续基因组区域，其中多态性指示来源同一性。该窗口内的单元型可通过各标记处等位基因的独特的指纹进行限定。此处所使用的等位基因为占据染色体上特定基因座的基因的几种替代形式之一。当染色体上特定基因座处存在的所有等位基因都相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上特定基因座处存在的等位基因不同，该植物在该基因座处是杂合的。本发明的植物在任何特定的转基因调控基因座处或对于特定的多态性标记而言可以是纯合的或杂合的。

标记-性状关联性的鉴别已经发展成为使用遗传标记作为工具，如经统计学分析所确定的，用于通过优选的基因座区域的基因渗入选择“新的和优良的植物”(美国专利6,219,964)。标记辅助的基因渗入包括从一个种质向第二个种质转移由一个或多个标记限定的染色体区域。该方法中的初始步骤为通过基因定位来定位基因组区域或转基因，基因定位为通过连锁分析确定基因或基因组区域相对于其它基因和遗传标记的的位置的方法。连锁作图的基本原理为：染色体上两个基因越接近，它们越可能在一起遗传。简而言之，通常在两个遗传匹配、但是相对于目的性状而言不同的亲本之间进行杂交。然后可以利用遗传标记追踪这些性状在杂交(通常为回交(BC1))后代F₂或重组近交群体中的分离。

在植物育种群体中，连锁不平衡(LD)为偏离群体中两个或更多个基因座之间的随机关联性的水平，LD通常发生在大的染色体片段中。尽管人们可能关注片段中各基因的个体效应，但是出于实际的植物育种目的，一般强调该区域对于存在于种系、杂种或变种中的目的性状的平均影响。使用一组遗传标记和一组种质，针对以厘摩(cM，百分之一摩尔根，每次减数分裂平均一次重组，重组是在减数分裂时配对的同源染色体之间染色单体片段相互交换的结果，通常通过后代中来自不同祖父亲本的连锁基因座处的等位基因的关联性进行观察)为单位的距离，计算(使用r²统计量)配对LD的量。

其它遗传标记分子的遗传连锁可通过基因定位模型(例如但不限于Lander等人报告的侧翼标记模型(Lander等人1989Genetics，121：185-199))以及基于在此描述的最大似然法并在软件包MAPMAKER/QTL(Lincoln和Lander，Mapping Genes ControllingQuantitative Traits Using MAPMAKER/QTL，Whitehead Institute forBiomedical Research，Massachusetts，(1990)。其它软件包括Qgene，版本2.23(1996)，Department of Plant breeding and Biometry，266Emerson Hall，Cornell University，Ithaca，NY)中执行的区间定位来建立。使用Qgene软件是特别优选的方法。

对于存在遗传标记的最大似然估计(MLE)与假定没有QTL效应的MLE一起进行计算以避免假阳性。然后优势比的log₁₀(LOD)被计算为LOD＝log₁₀(存在QTL的MLE/假定不存在连锁的QTL的MLE)。LOD得分基本上表明了假定存在QTL时与其不存在时相比数据上升的可能性。具有特定的置信度(如95％)、用于避免假阳性的LOD阈值取决于遗传标记的数目和基因组的长度。标示LOD阈值的图表在Lander等人(1989)中有所描述，并进一步在Arús和Moreno-González，Plant breeding，Hayward，Bosemark，Romagosa(eds.)Chapman&Hall，London，pp.314-331(1993)中描述。

可以使用其它的模型。区间定位的许多改进和替代方法已有报道，包括使用非参数方法(Kruglyak等人1995Genetics，139：1421-1428)。还可以使用多元回归方法或模型，其中性状对大量遗传标记进行回归(Jansen，Biometrics in Plant Breed，van Oijen，Jansen(eds.)Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia SectionBiometrics in Plant breeding，The Netherlands，pp.116-124(1994)；Weber和Wricke，Advances in Plant breeding，Blackwell，Berlin，16(1994))。组合了区间定位与回归分析，由此表型以给定的遗传标记间隔对单个假定QTL进行回归并且同时对作为“辅因子”的多种遗传标记进行回归的方法已被Jansen等人(Jansen等人1994Genetics，136：1447-1455)和Zeng(Zeng 1994Genetics 136：1457-1468)报道。一般而言，辅因子的使用降低了估计的QTL位置的偏差和抽样误差(Utz和Melchinger，Biometrics in Plant breeding，van Oijen，Jansen(eds.)Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia SectionBiometrics in Plant breeding，The Netherlands，pp.195-204(1994))，因而提高了QLT定位的精确性和有效性(Zeng 1994)。这些模型可扩展到多环境实验中来分析基因型-环境的相互作用(Jansen等人1995Theor.Appl.Genet.91：33-3)。关联性研究方法(例如传递不平衡检验)可用于检测标记-性状的关联性(Stich等人2006Theor.Appl.Genet.113：1121-1130)。

传统QLT定位的替代方法包括相对于个体遗传标记通过定位单元型来获得较高的分辨率(Fan等人2006Genetics 172：663-686)。该方法追踪由多态性遗传标记限定的、被称为单元型的DNA区组，假定它们在定位群体中是来源相同的。该假设导致较大的有效样本大小，提供了更好的QTL分辨率。用于确定表型与基因型(在此情况下为单元型)之间的关系的统计学显著性的方法可通过本领域已知的任何统计学检验来确定，并使用所需的统计学显著性的任何可接受的阈值。特定方法和显著性阈值的使用是本领域普通技术人员已知的。

合适的定位群体的选择对图谱的构建是重要的。合适的定位群体的选择取决于使用的标记系统的类型(Tanksley等人，Molecularmapping in plant chromosomes.chromosome structure and function：Impact of new concepts J.P.Gustafson and R.Appels(eds.).PlenumPress，New York，pp.157-173(1988))。必需考虑在定位群体中使用的亲本的来源(适应的对比外来的)。染色体配对和重组率在远缘杂交(适应的x外来的)中可能被严重地干扰(抑制)，并通常产生显著减小的连锁距离。远缘杂交通常会为分离群体提供与窄源杂交(narrow cross)(适应的x适应的)中的后代相比相对大量的多态性。

F₂群体为产生杂种种子之后自交的第一代。通常使单个F₁植物自交，以产生所有的基因都以孟德尔(1∶2∶1)方式分离的群体。最大的遗传信息是通过使用共显性遗传标记系统从完全分类的F₂群体中获得的(Mather，Measurement of Linkage in Heredity：Methuenand Co.，(1938))。在显性标记的情况中，需要后代测试(例如F₃、BCF₂)来鉴别杂合子，因此使其等同于完全分类的F₂群体。但是，由于后代测试中涉及的成本和时间，这种方法通常是禁止的。F₂个体的后代测试通常在图谱构建中采用，其中表型并不能一贯地反映基因型(例如抗病性)或其中性状表达是由QTL控制的。来自后代测试群体(例如F₃或BCF₂)的分离数据可用于图谱构建中。然后可基于标记-性状图谱关联性(F₂、F₃)，对杂交后代应用标记辅助的选择，其中，连锁基团并未通过重组事件完全分离(即最大不平衡)。

重组近交系(RIL)(遗传相关种系；通常＞F₅，从连续自交F₂系向纯合性发展)可用作定位群体。使用RIL可以使从显性标记获得的信息最大化，因为所有的基因座都是纯合的或几乎如此。在紧密连锁的条件下(即大约＜10％重组)，RIL群体中评价的显性和共显性遗传标记提供了比回交群体中的任一标记类型更多的个体的信息(Reiter等人1992Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：1477-1481)。但是，当标记间的距离变大时(即基因座变得更加独立时)，RIL群体中的信息显著减少。

回交群体(例如由成功的变种(轮回亲本)与携带前者中不存在的性状的另一变种(供体亲本)之间的杂交产生)可用作定位群体。可以进行一系列与轮回亲本的回交，以恢复大部分其理想的性状。因此产生了由基本上与轮回亲本相似的个体组成的群体，但是每个个体携带不同量的来自供体亲本的基因组区域。如果轮回亲本中的所有基因座均为纯合的且供体和轮回亲本具有对比的多态性标记等位基因，则回交群体可用于定位显性遗传标记(Reiter等人1992Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：1477-1481)。使用共显性或显性标记从回交群体中获得的信息少于从F₂群体中获得的信息，因为每种植物采样了一个而不是两个重组配子。但是，与RIL相比，回交群体提供更多的信息(在低标记饱和度时)，因为RIL群体中连接的基因座之间的距离增大(即大约.15％重组)。增加的重组有益于紧密连锁的解析，但是在具有低标记饱和度的图谱构建中可能是不希望的。

通过可产生除了所研究的性状或基因组区域以外在遗传组成上几乎相同的大量个体的多次回交产生的近等基因系(NIL)可用作定位群体。使用NIL定位时，仅多态性基因座的一部分预期能够定位到选择的区域上。

集群分离分析(Bulk segregant analysis)(BSA)是为了快速鉴别遗传标记与目的性状之间的连锁而发展的一种方法(Michelmore等人1991Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：9828-9832)。在BSA中，从来自单个杂交的分离群体中抽取两个集群(bulked)DNA样品。这些集群包含特定性状(耐受或易感特定病害)或基因组区域相同但是在非连锁区域任意的(即杂合的)个体。在BSA中许多个体的集群样品之间，与目标区域不连锁的区域没有不同。

在另一实施方案中，可以使用高通量、非破坏性种子采样，针对与至少一个转基因调控基因座相关的一个或多个标记筛选植物。已经描述了高通量、非破坏性种子采样的装置和方法，其通过允许个体种子分析克服了统计学样本的障碍。例如，公布的美国专利申请US 2006/0042527、US 2006/0046244、US 2006/0046264、US2006/0048247、US 2006/0048248、US 2007/0204366和US2007/0207485公开了用于种子的自动化采样的装置和系统以及种子的采样、测试和膨胀(bulking)方法，这些美国申请在此全文引入作为参考。因此，在一个优选实施方案中，本发明的方法包括筛选群体的个体种子中的标记，其中只开发具有至少一个目的基因型的种子。

3.植物育种

本发明的植物可以是育种程序的部分或从育种程序产生。育种方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改进的性状的遗传性和商业使用的栽培变种的类型(例如F₁杂种栽培变种、纯系栽培变种等)。栽培变种是有意建立或选择并通过选育维持的植物物种的品种或变种。

本发明提供了本发明的植物的部分。

选择的用于选育本发明植物的非限定性方法如下所述。可对任何杂交的后代使用标记辅助选择(MAS)来提高育种程序。应当理解本发明的核酸标记可在MAS(育种)程序中使用。应当进一步理解任何商业和非商业栽培变种可在育种程序中使用。例如发芽活力、生长活力、应激耐受性、抗病性、分枝、开花、结籽、种子大小、种子密度、可直立性和脱粒性(threshability)等因素通常将会决定其选择。

对于高遗传性的性状而言，在单个位点评价的优良个体植物的选择将是有效的，而对于低遗传性的性状而言，选择应该基于对相关植物家族的重复评价中获得的平均值。普遍的选择方法通常包括谱系选择、改良的谱系选择、质量选择和轮回选择。在一个优选方面，采用回交或轮回育种程序。

遗传的复杂性影响了育种方法的选择。可以使用回交育种将高遗传性性状的一个或几个有利的基因转入理想的栽培变种中。该方法已经广泛用于选育抗病性栽培变种。利用不同的轮回选择技术改良由多个基因控制的数量遗传性状。

可以测试育种系，并将其与代表商业目标区的环境中的适当的标准比较两代或更多代。最佳种系是新的商业栽培变种的候选系；那些缺乏性状的种系可用作亲本来产生用于进一步选择的新群体。

对于杂种农作物而言，新的优良杂种的发展需要发展和选择优良的近交系、这些种系的杂交，以及优良杂交杂种的选择。通过选择的雄性可育亲本间的人工杂交或通过使用雄性不育系统可以产生杂种种子。关于亲本系的其它数据以及杂种的表型影响了育种者关于是否继续特定杂种杂交的决定。

谱系育种和轮回选择育种方法可用于从育种群体发展栽培变种。育种程序将来自两个或更多个栽培变种或不同的广泛来源的理想性状组合成育种库，通过自交和选择理想的表型从该育种库发展栽培变种。可以评价新的栽培变种以确定哪个具有商业潜力。

回交育种已被用于将简单遗传的、高遗传性的性状的基因转入作为轮回亲本的理想的纯合栽培变种或近交系中。待转移的性状的来源被称为供体亲本。最初的杂交之后，选择具有供体亲本的表型的个体，并与轮回亲本反复杂交(回交)。得到的植物预期具有轮回亲本(例如栽培变种)的大多数属性并且另外还具有从供体亲本转移的希望的性状。

单粒传法严格意义上来说是指种植分离群体，每个植物收获一个种子样品，以及使用单种子样品来种植下一代。当群体已从F₂发展到希望的近交水平时，种系所来源的植物将会分别追溯到不同的F₂个体。由于某些种子不能发芽或者某些植物不能产生至少一个种子，所以群体中植物的数目逐代减少。因此，当世代进化完成时，并不是群体中最初取样的所有F₂植物都有后代代表。

加倍单倍体(DH)方法在较短的时间内产生等基因植物。DH植物为植物育种者提供了无价的工具，特别是对于产生近交系和数量遗传研究而言。对于育种者，DH群体特别用于QLT定位、细胞质转化和性状渗入中。此外，其在测试和评价用于植物育种程序的纯合系中也是有价值的。所有的遗传变异出现在育种杂交的后代中，其提高了选择增益。

大多数研究和育种应用依赖于人工DH生产方法。最初的步骤包括植物的单倍体化，其导致含单倍体种子的群体的产生。非纯合系与诱导亲本杂交，造成了单倍体种子的产生。选取包含单倍体胚、但是包含正常的三倍体胚乳的种子进入第二阶段。也就是说，单倍体种子和植物是包含单倍体胚的任何植物，而与胚乳的倍性水平无关。

从群体中选择单倍体种子之后，选择的种子经历染色体加倍，以产生加倍的单倍体种子。细胞谱系中自发的染色体加倍导致了从单倍体细胞谱系中产生正常的配子或产生未减少的配子。化合物(例如秋水仙素)的应用可用于增加二倍体化的速度。秋水仙素与微管蛋白结合并阻止其聚合成微管，因而在中期抑制了有丝分裂，可用于增加二倍体化的速度，即加倍染色体数目。让这些嵌合植物自花传粉，以产生二倍体(加倍的单倍体)种子。栽培这种DH种子，然后评价，并用于产生杂种测交系。

通常用于不同的性状和农作物的其它育种方法的描述可见于以下几本参考书的一种中(Allard，“Principles of Plant breeding，”JohnWiley&Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles of crop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“Plant breeding perspectives，”Wageningen(ed)，Center for Agricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，In：Soybeans：Improvement，Production and Uses，2nd Edition，Monograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles of variety development，”Theory andTechnique，(Vol.1)和Crop Species Soybean(Vol.2)，Iowa State Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY，360-376，1987)。

在本发明的一个实施方案中，当保守的基因片段或单元型窗口与已鉴定其转基因调控QTL的片段一致时，本发明的方法使得本领域技术人员可以以高可能性将QTL推断外推至在该单元型窗口内包含相同的单元型或遗传标记等位基因的其它种质。这一先验信息为在特定群体中QTL定位之前选择有利的QTL提供了基础。在一个优选的实施方案中，QTL与转基因表现和表达相关。

例如，本发明的方法使得本领域技术人员能够做出关于转基因调控基因座的植物育种决定，包括：

a)在新的育种群体中进行选择以确定哪些群体具有最高频率的有利的单元型或遗传标记等位基因，其中基于与之前的QTL定位的一致性，单元型和标记等位基因被认为是有利的；或

b)在该群体中QLT定位之前或取代QTL定位，在育种群体中选择含有有利的单元型或遗传标记等位基因的后代，其中可在育种的任何阶段做出选择，且选择还可用于推动多代轮回选择；或

c)预测特定的育种杂交的后代表现；或

d)基于所述有利的单元型或遗传标记等位基因选择用于种质改良活动的种系(如PCT专利申请公开WO 2008/021413中公开的)，包括种系发展、杂种发展、基于与转基因连锁的单元型的育种值在转基因事件中选择(如美国专利申请No.11/441,91中公开的)、进行育种杂交、通过自花授粉来测试和改进植物、纯化种系或亚系、使用植物或其部分进行转化、使用植物或其部分作为表达构建体的候选物，以及使用植物或其部分进行诱变。

此外，当本发明的方法与综合物理和遗传图谱以及不同的核酸测序方法一起使用来用于基因鉴定时，本领域技术人员可以实施组合方法来选择特定的基因或等位基因。例如，当单元型窗口与其中已鉴定基因的片段一致时，本领域技术人员可以将基因推断外推至在该单元型窗口内包含相同的一种或多种遗传标记等位基因或单元型的其它种质。这一先验信息为在特定群体中基于单元型或标记等位基因鉴定来选择有利的基因或等位基因提供了基础。

例如，本发明的方法使得本领域技术人员能够做出植物育种决定，包括：

a)在新的育种群体中进行选择以确定哪些群体具有最高频率的有利的单元型或遗传标记等位基因，其中基于与之前的基因定位的一致性，单元型或标记等位基因被认为是有利的；或

b)在育种群体中选择包含有利的单元型或遗传标记等位基因的后代，其中可在育种的任何阶段进行选择，且选择还可用于推动多代轮回选择；或

c)预测特定的育种杂交的后代表现；或

d)基于所述有利的单元型或遗传标记等位基因来选择用于种质改良活动的种系(如PCT专利申请公开WO 2008/021413中公开的)，包括种系发展、杂种发展、基于与转基因连锁的单元型的育种值在转基因事件中选择(如美国专利申请No.11/441,91所公开的)、进行育种杂交、通过自花授粉来测试和改进植物、纯化种系或亚系、使用植物或其部分进行转化、使用植物或其部分作为表达构建体的候选物，以及使用使用植物或其部分进行诱变。

本发明的另一优选实施方案提供了QTL组合物的选择，其中每个QTL与用于转基因表现或表达的表型相关。

本发明的另一实施方案为通过在种质中积累一种或多种单元型来改进育种群体的方法。定义为单元型窗口的基因组区域包括遗传信息，并为植物提供表型性状。遗传信息的差异会造成表型性状的差异，并且可以确定表型值。单元型窗口的基因定位使得能够确定单元型上的连锁。目的单元型具有在后代植物基因组中为新型的且其自身可作为目的单元型的遗传标记的DNA序列。特别地，这一标记还可用作基因或QTL的标识物。例如，如果多个性状或性状效应与单元型相关，只有一个遗传标记是选择所必需的。此外，目的单元型还可以提供选择具有连锁的单元型区域的植物的手段。该选择可能是由于对使用的植物毒性化合物(例如除草剂或抗生素)的耐受性或病原体抗性。该选择可能是由于表型选择手段，例如容易观察的形态学表型，例如种子颜色、种子发芽特征、幼苗生长特征、叶子外观、植物结构、植物高度以及花和果实形态。

使用这一方法，本发明预期目的单元型选自一大群植物，这些单元型可在农作物的种质中具有协同的育种值。此外，这些单元型可在所述的育种方法中用来积累其它有益的和优选的单元型区域以及在育种群体中维持它们以提高农作物的总体种质。考虑在该方法中使用的农作物包括但不限于玉米(玉米(Zea mays))、大豆(大豆(Glycine max))、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、大麦(大麦(Hordeum vulgare))；燕麦(燕麦(Avena sativa))；野茅(鸭茅(Dactylis glomerata))；水稻(稻(Oryza sativa)，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)变种)；高粱(双色高粱(Sorghum bicolor))；甘蔗(甘蔗属的种(Saccharum sp))；高羊茅(苇状羊茅(Festuca arundinacea))；草皮草物种(例如物种：四季青(Agrostis stolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、钝叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、芸苔属的成员、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆、茄子、茴香、青刀豆、葫芦、韭菜、莴苣、甜瓜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、萝卜、菠菜、笋瓜、甜玉米、西红柿、西瓜、观赏植物以及其它水果、蔬菜、块茎和块根农作物。

农民可在商业上获得的优良玉米近交系的非限定性的例子包括ZS4199、ZS02433、G3000、G1900、G0302、G1202、G2202、G4901、G3601、G1900(Advanta Technology Ltd.，Great Britain)；6TR512、7RN401、6RC172、7SH382、MV7100、3JP286、BE4207、4VP500、7SH385、5XH755、7SH383、11084BM、2JK221、4XA321、6RT321、BE8736、MV5125、MV8735、3633BM(Dow，Michigan，USA)；8982-11-4-2、8849、IT302、9034、IT201、RR728-18、5020、BT751-31(FFR Cooperative，Indiana，USA)；1874WS、X532Y、1784S、1778S、I880S(Harris Moran Seed Company，California，USA)；FR3351、FR2108、FR3383、FR3303、FR3311、FR3361(Illinois Foundation Seeds，Inc.，Illinois，USA)；NR109、JCRNR113、MR724、M42618、CI9805、JCR503、NR401、W60028、N16028、N10018、E24018、A60059、W69079、W23129(J.C.Robinson Seed Company，Nebraska，USA)；7791、KW4773、KW7606、KW4636、KW7648、KW4U110、KWU7104、CB1、CC2(KWS Kleinwanzlebener Saatzucgt AG，Germany)；UBB3、TDC1、RAA1、VMM1、MNI1、RII1、RBO1(Limagrain Genetics GrandeCulture S.A.，France)；LH284、7OLDL5、GM9215、90LDI1、90LDC2、90QDD1、RDBQ2、01HG12、79314N1、17INI20、17DHD7、83INI8、83InI14、01INL1、LH286、ASG29、ASG07、QH111、09DSQ1、ASG09、86AQV2、86ISI5、ASG25、01DHD16、ASG26、ASG28、90LCL6、22DHD11、ASG17、WDHQ2、ASG27、90DJD28、WQCD10、17DHD5、RQAA8、LH267、29MIFI2、RQAB7、LH198Bt810、3DHA9、LH200BT810、LH172Bt810、01IZB2、ASG10、LH253、86ISI27、91ISI5、22DHQ3、91INI12、86ISI26、01IUL6、89ADH11、01HGI4、16IUL2、F307W、LH185Bt810、F351、LH293、LH245、17DHD16、90DHQ2、LH279、LH244、LH287、WDHQ11、09DSS 1、F6150、17INI30、4SCQ3、01HF13、87ATD2、8M116、FBLL、17QFB1、83DNQ2、94INK1A、NL054B、6F545、F274、MBZA、I389972、94INK1B、89AHD12、I889291、3323、16IUL6、6077、I014738、7180、GF6151、WQDS7、I465837、3327、LH176Bt810、181664、I362697、LH310、LH320、LH295、LH254、5750、I390186、I501150、I363128、I244225、LH246、LH247、LH322、LH289、LH283BtMON810、85DGD1、I390185、WDDQ1、LH331(Monsanto Co.，Missouri，USA)；PH1B5、PH1CA、PHOWE、PH1GG、PH0CD、PH21T、PH224、PH0V0、PH3GR、PH1NF、PH0JG、PH189、PH12J、PH1EM、PH12C、PH55C、PH3EV、PH2V7、PH4TF、PH3KP、PH2MW、PH2N0、PH1K2、PH226、PH2VJ、PH1M8、PH1B8、PH0WD、PH3GK、PH2VK、PH1MD、PH04G、PH2KN、PH2E4、PH0DH、PH1CP、PH3P0、PH1W0、PH45A、PH2VE、PH36E、PH50P、PH8V0、PH4TV、PH2JR、PH4PV、PH3DT、PH5D6、PH9K0、PH0B3、PH2EJ、PH4TW、PH77C、PH3HH、PH8W4、PH1GD、PH1BC、PH4V6、PH0R8、PH581、PH6WR、PH5HK、PH5W4、PH0KT、PH4GP、PHJ8R、PH7CP、PH6WG、PH54H、PH5DR、PH5WB、PH7CH、PH54M、PH726、PH48V、PH3PV、PH77V、PH7JB、PH70R、PH3RC、PH6KW、PH951、PH6ME、PH87H、PH26N、PH9AH、PH51H、PH94T、PH7AB、PH5FW、PH75K、PH8CW、PH8PG、PH5TG、PH6JM、PH3AV、PH3PG、PH6WA、PH6CF、PH76T、PH6MN、PH7BW、PH890、PH876、PHAPV、PHB5R、PH8DB、PH51K、PH87P、PH8KG、PH4CV、PH705、PH5DP、PH77N、PH86T、PHAVN、PHB6R、PH91C、PHCWK、PHC5H、PHACE、PHB6V、PH8JR、PH77P、PHBAB、PHB1V、PH3PR、PH8TN、PH5WA、PH58C、PH6HR、PH183、PH714、PHA9G、PH8BC、PHBBP、PHAKC、PHD90、PHACV、PHCEG、PHB18、PHB00、PNCND、PHCMV(Pioneer Hi-Bred International，Inc.，Iowa，USA)；GSC3、GSC1、GSC2、NP2138、2227BT、ZS02234、NP2213、2070BT、NP2010、NP2044BT、NP2073、NP2015、NP2276、NP2222、NP2052、NP2316、NP2171、WICY418C、NP2174、BX20010、BX20033、G6103、G1103、291B、413A、G1704(Syngenta Participations AG，Switzerland)。优良植物为来自优良种系的代表性植物。

农民或大豆育种者可在商业上获得的优良大豆变种的例子包括，例如HARTZ^TM变种H4994、HARTZ^TM变种H5218、HARTZ^TM变种H5350、HARTZ^TM变种H5545、HARTZ^TM变种H5050、HARTZ^TM变种H5454、HARTZ^TM变种H5233、HARTZ^TM变种H5488、HARTZ^TM变种HLA572、HARTZ^TM变种H6200、HARTZ^TM变种H6104、HARTZ^TM变种H6255、HARTZ^TM变种H6586、HARTZ^TM变种H6191、HARTZ^TM变种H7440、HARTZ^TM变种H4452Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H4994Roundup Ready^TM、HART^TMZ变种H4988Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5000Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5147Roundup Ready^TM、HARTZ变种^TMH5247RoundupReady^TM、HARTZ^TM变种H5350Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5545Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5855Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5088Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5164Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5361Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5566Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5181RoundupReady^TM、HARTZ^TM变种H5889Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H5999Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H6013Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H6255Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H6454Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H6686Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H7152Roundup Ready^TM、HARTZ^TM变种H7550 RoundupReady^TM、HARTZ^TM变种H8001Roundup Ready^TM(HARTZ SEED、Stuttgart、Arkansas、USA)；A0868、AG0202、AG0401、AG0803、AG0901、A1553、A1900、AG1502、AG1702、AG1901、A1923、A2069、AG2101、AG2201、AG2205、A2247、AG2301、A2304、A2396、AG2401、AG2501、A2506、A2553、AG2701、AG2702、AG2703、A2704、A2833、A2869、AG2901、AG2902、AG2905、AG3001、AG3002、AG3101、A3204、A3237、A3244、AG3301、AG3302、AG3006、AG3203、A3404、A3469、AG3502、AG3503、AG3505、AG3305、AG3602、AG3802、AG3905、AG3906、AG4102、AG4201、AG4403、AG4502、AG4603、AG4801、AG4902、AG4903、AG5301、AG5501、AG5605、AG5903、AG5905、A3559、AG3601、AG3701、AG3704、AG3750、A3834、AG3901、A3904、A4045AG4301、A4341、AG4401、AG4404、AG4501、AG4503、AG4601、AG4602、A4604、AG4702、AG4703、AG4901、A4922、AG5401、A5547、AG5602、AG5702、A5704、AG5801、AG5901、A5944、A5959、AG6101、AJW2600C0R、FPG26932、QR4459和QP4544(AsgrowSeeds，Des Moines，Iowa，USA)；DKB26-52、DKB28-51、DKB32-52、DKB08-51、DKB09-53、DKB10-52、DKB18-51、DKB26-53、DKB29-51、DKB42-51、DKB35-51DKB34-51、DKB36-52、DKB37-51、DKB38-52、DKB46-51、DKB54-52和DeKalb变种CX445(DeKalb、Illinois、USA)；91B91、92B24、92B37、92B63、92B71、92B74、92B75、92B91、93B01、93B11、93B26、93B34、93B35、93B41、93B45、93B51、93B53、93B66、93B81、93B82、93B84、94B01、94B32、94B53、94M80RR、94M50RR、95B71、95B95、95M81RR、95M50RR、95M30RR、9306、9294、93M50、93M93、94B73、94B74、94M41、94M70、94M90、95B32、95B42、95B43和9344(Pioneer Hi-bredInternational，Johnston，Iowa，USA)；SSC-251RR、SSC-273CNRR、AGRA 5429RR、SSC-314RR、SSC-315RR、SSC-311STS、SSC-320RR、AGRA5432RR、SSC-345RR、SSC-356RR、SSC-366、SSC-373RR和AGRA5537CNRR(Schlessman Seed Company，Milan，Ohio，USA)；39-E9、44-R4、44-R5、47-G7、49-P9、52-Q2、53-K3、56-J6、58-V8、ARX A48104、ARX B48104、ARX B55104和GP530(Armor Beans，Fisher，Arkansas，USA)；HT322STS、HT3596STS、L0332、L0717、L1309CN、L1817、L1913CN、L1984、L2303CN、L2495、L2509CN、L2719CN、L3997CN、L4317CN、RC 1303、RC 1620、RC 1799、RC 1802、RC1900、RC1919、RC2020、RC2300、RC2389、RC2424、RC2462、RC2500、RC2504、RC2525、RC2702、RC2964、RC3212、RC3335、RC3354、RC3422、RC3624、RC3636、RC3732、RC3838、RC3864、RC3939、RC3942、RC3964、RC4013、RC4104、RC4233、RC4432、RC4444、RC4464、RC4842、RC4848、RC4992、RC5003、RC5222、RC5332、RC5454、RC5555、RC5892、RC5972、RC6767、RC7402、RT0032、RT0041、RT0065、RT0073、RT0079、RT0255、RT0269、RT0273、RT0312、RT0374、RT0396、RT0476、RT0574、RT0583、RT0662、RT0669、RT0676、RT0684、RT0755、RT0874、RT0907、RT0929、RT0994、RT0995、RT1004、RT1183、RT1199、RT 1234、RT1399、RT1413、RT1535、RT1606、RT1741、RT1789、RT1992、RT2000、RT2041、RT2089、RT2092、RT2112、RT2127、RT2200、RT2292、RT2341、RT2430、RT2440、RT2512、RT2544、RT2629、RT2678、RT2732、RT2800、RT2802、RT2822、RT2898、RT2963、RT3176、RT3200、RT3253、RT3432、RT3595、RT3836、RT4098、RX2540、RX2944、RX3444和TS466RR(Croplan Genetics，Clinton，Kentucky，USA)；4340RR、4630RR、4840RR、4860RR、4960RR、4970RR、5260RR、5460RR、5555RR、5630RR和5702RR(Delta Grow，England，Arkansas，USA)；DK3964RR、DK3968RR、DK4461RR、DK4763RR、DK4868RR、DK4967RR、DK5161RR、DK5366RR、DK5465RR、DK55T6、DK5668RR、DK5767RR、DK5967RR、DKXTJ446、DKXTJ448、DKXTJ541、DKXTJ542、DKXTJ543、DKXTJ546、DKXTJ548、DKXTJ549、DKXTJ54J9、DKXTJ54X9、DKXTJ554、DKXTJ555、DKXTJ55J5和DKXTJ5K57(Delta King SeedCompany，McCrory，Arkansas，USA)；DP 3861RR、DP 4331RR、DP 4546RR、DP 4724RR、DP 4933RR、DP 5414RR、DP 5634RR、DP 5915RR、DPX 3950RR、DPX 4891RR、DPX 5808RR(Delta&PineLand Company，Lubbock，Texas，USA)；DG31T31、DG32C38、DG3362NRR、DG3390NRR、DG33A37、DG33B52、DG3443NRR、DG3463NRR、DG3481NRR、DG3484NRR、DG3535NRR、DG3562NRR、DG3583NRR、DG35B40、DG35D33、DG36M49、DG37N43、DG38K57、DG38T47、SX04334、SX04453(Dyna-gro line，UAP-MidSouth，Cordova，Tennessee，USA)；8374RR CYSTX、8390NNRR、8416RR、8492NRR和8499NRR(Excel Brand，Camp Point，Illinois，USA)；4922RR、5033RR、5225RR和5663RR(FFR Seed，Southhaven，Mississippi，USA)；3624RR/N、3824RR/N、4212RR/N、4612RR/N、5012RR/N、5212RR/N和5412RR/STS/N(Garst SeedCompany，Slater，Iowa，USA)；471、4R451、4R485、4R495、4RS421和5R531(Gateway Seed Company，Nashville，Illinois，USA)；H-3606RR、H-3945RR、H-4368RR、H-4749RR、H-5053RR和H-5492RR(Golden Harvest Seeds，Inc.，Pekin，Illinois，USA)；HBK 5324、HBK5524、HBK R4023、HBK R4623、HBK R4724、HBK R4820、HBKR4924、HBK R4945CX、HBK R5620和HBK R5624(Hornbeck Seed Co.Inc.，DeWitt，Arkansas，USA)；341RR/SCN、343RR/SCN、346RR/SCN、349RR、355RR/SCN、363RR/SCN、373RR、375RR、379RR/SCN、379+RR/SCN、380RR/SCN、380+RR/SCN、381RR/SCN、389RR/SCN、389+RR/SCN、393RR/SCN、393+RR/SCN、398RR、402RR/SCN、404RR、424RR、434RR/SCN和442RR/SCN(Kruger Seed Company，Dike，Iowa，USA)；3566、3715、3875、3944、4010和4106(Lewis Hybrids，Inc.，Ursa，Illinois，USA)；C3999NRR(LG Seeds，Elmwood，Illinois，USA)；Atlanta 543、Austin RR、ClevelandVIIRR、Dallas RR、Denver RRSTS、Everest RR、Grant 3RR、OlympusRR、Phoenix IIIRR、Rocky RR、Rushmore 553RR和Washington IXRR(Merschman Seed Inc.，West Point，Iowa，USA)；RT 3304N、RT 3603N、RT 3644N、RT 3712N、RT 3804N、RT 3883N、RT 3991N、RT 4044N、RT 4114N、RT 4124N、RT 4201N、RT 4334N、RT 4402N、RT 4480N、RT 4503N、RT 4683N、RT 4993N、RT 5043N、RT 5204、RT 5553N、RT 5773、RT4731N和RTS 4824N(MFA Inc.，Columbia，Missouri，USA)；9A373NRR、9A375XRR、9A385NRS、9A402NRR、9A455NRR、9A485XRR和9B445NRS(Midland Genetics Group L.L.C.，Ottawa，Kansas，USA)；3605nRR、3805nRR、3903nRR、3905nRR、4305nRR、4404nRR、4705nRR、4805nRR、4904nRR、4905nRR、5504nRR和5505nRR(Midwest Premium Genetics，Concordia，Missouri，USA)；S37-N4、S39-K6、S40-R9、S42-P7、S43-B1、S49-Q9、S50-N3、S52-U3和S56-D7(Syngenta Seeds，Henderson，Kentucky，USA)；NT-3707RR、NT-3737RR/SCN、NT-3737+RR/SCN、NT-3737sc RR/SCN、NT-3777+RR、NT-3787RR/SCN、NT-3828RR、NT-3839RR、NT-3909RR/SCN/STS、NT-3909+RR/SCN/ST、NT-3909sc RR/SCN/S、NT-3919RR、NT-3922RR/SCN、NT-3929RR/SCN、NT-3999RR/SCN、NT-3999+RR/SCN、NT-3999sc RR/SCN、NT-4040RR/SCN、NT-4040+RR/SCN、NT-4044RR/SCN、NT-4122RR/SCN、NT-4414RR/SCN/STS、NT-4646RR/SCN和NT-4747RR/SCN(NuTech SeedCo.，Ames，Iowa，USA)；PB-3494NRR、PB-3732RR、PB-3894NRR、PB-3921NRR、PB-4023NRR、PB-4394NRR、PB-4483NRR  和PB-5083NRR(Prairie Brand Seed Co.，Story City，Iowa，USA)；3900RR、4401RR、4703RR、4860RR、4910、4949RR、5250RR、5404RR、5503RR、5660RR、5703RR、5770、5822RR、PGY 4304RR、PGY4604RR、PGY 4804RR、PGY 5622RR和PGY 5714RR(Progeny AgProducts，Wynne，Arkansas，USA)；R3595RCX、R3684Rcn、R3814RR、R4095Rcn、R4385Rcn和R4695Rcn(Renze Hybrids Inc.，Carroll，Iowa，USA)；S3532-4、S3600-4、S3832-4、S3932-4、S3942-4、S4102-4、S4542-4和S4842-4(Stine Seed Co.，Adel，Iowa，USA)；374RR、398RRS(Taylor Seed Farms Inc.，White Cloud，Kansas，USA)；USG5002T、USG 510nRR、USG 5601T、USG 7440nRR、USG 7443nRR、USG 7473nRR、USG 7482nRR、USG 7484nRR、USG 7499nRR、USG7504nRR、USG 7514nRR、USG 7523nRR、USG 7553nRS和USG7563nRR  (UniSouth  Genetics  Inc.，Nashville，Tennessee，USA)；V38N5RS、V39N4RR、V42N3RR、V48N5RR、V284RR、V28N5RR、V315RR、V35N4RR、V36N5RR、V37N3RR、V40N3RR、V47N3RR、and V562NRR(Royster-Clark Inc.，Washington C.H.，Ohio，USA)；RR2383N、2525NA、RR2335N、RR2354N、RR2355N、RR2362、RR2385N、RR2392N、RR2392NA、RR2393N、RR2432N、RR2432NA、RR2445N、RR2474N、RR2484N、RR2495N和RR2525N(WillcrossSeed，King City Seed，King City，Missouri，USA)；1493RR、1991NRR、2217RR、2301NRR、2319RR、2321NRR、2341NRR、2531NRR、2541NRR、2574RR、2659RR、2663RR、2665NRR、2671NRR、2678RR、2685RR、2765NRR、2782NRR、2788NRR、2791NRR、3410RR、3411NRR、3419NRR、3421NRR、3425NRR、3453NRR、3461NRR、3470CRR、3471NRR、3473NRR、3475RR、3479NRR、3491NRR、3499NRR、WX134、WX137、WX177和WX300(Wilken Seeds，Pontiac，Illinois，USA)。优良植物为来自优良种系的代表性植物。

表1.农民或育种者可在商业上获得的优良油菜变种的例子。优良植物为来自优良变种的代表性植物。

油菜变种	供应商
		500	Agriprogress Inc.
601	Agriprogress Inc.
		1492	Agriprogress Inc.
1604	Agriprogress Inc.
		1841	Agriprogress Inc.
1768S	Agriprogress Inc.
		1878V	Agriprogress Inc.

油菜变种	供应商
		99CH01	Agriprogress Inc.
Baldur	Agriprogress Inc.
		BIANCA	Agriprogress Inc.
BIANCA II	Agriprogress Inc.
		DS-Roughrider	Agriprogress Inc.
Goliath	Agriprogress Inc.
		Hudson	Agriprogress Inc.
HY-PER Star 100	Agriprogress Inc.
		Kronos	Agriprogress Inc.
LG3220	Agriprogress Inc.
		LG3222	Agriprogress Inc.
Manor	Agriprogress Inc.
		Reaper	Agriprogress Inc.
Rugby	Agriprogress Inc.
		2463	Bayer CropScience Canada Co.
2473	Bayer CropScience Canada Co.
		2563	Bayer CropScience Canada Co.
2573	Bayer CropScience Canada Co.
		2643	Bayer CropScience Canada Co.
2663	Bayer CropScience Canada Co.

油菜变种	供应商
		2673	Bayer CropScience Canada Co.
2733	Bayer CropScience Canada Co.
		2763	Bayer CropScience Canada Co.
5003	Bayer CropScience Canada Co.
		5020	Bayer CropScience Canada Co.
5030	Bayer CropScience Canada Co.
		5070	Bayer CropScience Canada Co.
5108	Bayer CropScience Canada Co.
		5440	Bayer CropScience Canada Co.
8440	Bayer CropScience Canada Co.
		9590	Bayer CropScience Canada Co.
1007	Bonis and Co.Ltd.
		73P01RR	Bonis and Co.Ltd.
74P00LL	Bonis and Co.Ltd.
		84S00LL	Bonis and Co.Ltd.
CASH	Bonis and Co.Ltd.
		Casino	Bonis and Co.Ltd.
DEFENDER	Bonis and Co.Ltd.
		EAGLE	Bonis and Co.Ltd.
FAIRVIEW	Bonis and Co.Ltd.

油菜变种	供应商
		FOOTHILLS	Bonis and Co.Ltd.
IMPULSE	Bonis and Co.Ltd.
		Legacy	Bonis and Co.Ltd.
LoLinda	Bonis and Co.Ltd.
		NORWESTER	Bonis and Co.Ltd.
OAC Hurricane	Bonis and Co.Ltd.
		OAC Tornado	Bonis and Co.Ltd.
SENATOR	Bonis and Co.Ltd.
		SPONSOR	Bonis and Co.Ltd.
SW 5001	Bonis and Co.Ltd.
		SW ARROW	Bonis and Co.Ltd.
SW BadgeRR	Bonis and Co.Ltd.
		SW GladiatoRR	Bonis and Co.Ltd.
SW High Level	Bonis and Co.Ltd.
		SWPeak RR	Bonis and Co.Ltd.
SWRazoR	Bonis and Co.Ltd.
		SW RideR	Bonis and Co.Ltd.
SW Spirit River	Bonis and Co.Ltd.
		SW WaRRior	Bonis and Co.Ltd.
Valleyview	Bonis and Co.Ltd.

油菜变种	供应商
		WESTWIN	Bonis and Co.Ltd.
MillenniUM 03	Bunge Canada
		Red River 1826	Bunge Canada
Red River 1852	Bunge Canada
		v1035	Cargill Limited
v2010	Cargill Limited
		v2015	Cargill Limited
Canterra 1867	Cargill Specialty Canola Oils
		Heritage	Carggill Specialty Canola Oils
IMC02	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC03	Cargill Specialty Canola Oils
IMC104	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC105	Cargill Specialty Canola Oils
IMC106RR	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC109RR	Cargill Specialty Canola Oils
IMC111RR	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC130	Cargill Specialty Canola Oils
IMC140	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC201	Cargill Specialty Canola Oils
IMC203RR	Cargill Specialty Canola Oils

油菜变种	供应商
		IMC204	Cargill Specialty Canola Oils
IMC205	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC206RR	Cargill Specialty Canola Oils
IMC207	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC208RR	Cargill Specialty Canola Oils
IMC209RR	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC302	Cargill Specialty Canola Oils
IMC303	Cargill Specialty Canola Oils
		IMC304RR	Cargill Specialty Canola Oils
Magellan	Cargill Specialty Canola Oils
		v1010	Cargill Specialty Canola Oils
v1030	Cargill Specialty Canola Oils
		v1031	Cargill Specialty Canola Oils
v1032	Cargill Specialty Canola Oils
		CANTI CS	CAUSSADE SEMENCES S.A.
CHELSI	CAUSSADE SEMENCES S.A.
		CINDI CS	CAUS SADE SEMENCES S.A.
JESPER	CEBECO SEMENCES S.A.
		ARAWAK	CPB TWYFORD LTD
COMMANCHE	CPB TWYFORD LTD

油菜变种	供应商
		HC 1217	CPB TWYFORD LTD
HURON	CPB TWYFORD LTD
		MOHICAN	CPB TWYFORD LTD
MS 692161	CPB TWYFORD LTD
		MSCOMANCHE	CPB TWYFORD LTD
MS INCA	CPB TWYFORD LTD
		NAVAJO	CPB TWYFORD LTD
NAVAJO MS	CPB TWYFORD LTD
		RAPIER	CPB TWYFORD LTD
RPC 550	CPB TWYFORD LTD
		WH2112	CPB TWYFORD LTD
CANNON	DANISCO SEED A/S
		HERALD	DANISCO SEED A/S
INDUSTRY	DANISCO SEED A/S
		MARINKA	DANISCO SEED A/S
SAHARA	DANISCO SEED A/S
		ABILITY	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
BILLY	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		BRISE	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
charLY	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG

油菜变种	供应商
		DR 12	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
EXOCET	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		FABIA	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
FUCHS	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		LIAISON	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
LIBOMIR	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		LICONGO	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
LICORNE	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		LICOSMOS	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
LICROWN	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		LIGHTNING	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
LIMBO	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		LIMPET	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
LION	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		LIONESS	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
LIPTON	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		LIZARD	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
OASE	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
		QUEEN	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG
V 140OL	DEUTSCHE SAATVEREDELUNG AG

油菜变种	供应商
		BRITTA	DLF-TRIFOLIUM A/S
CHANG	DLF-TRIFOLIUM A/S
		CYCLONE	DLF-TRIFOLIUM A/S
HANSEN	DLF-TRIFOLIUM A/S
		HELIOS	DLF-TRIFOLIUM A/S
JAZZ	DLF-TRIFOLIUM A/S
		NIMBUS	DLF-TRIFOLIUM A/S
OLE	DLF-TRIFOLIUM A/S
		OLSEN	DLF-TRIFOLIUM A/S
ORION	DLF-TRIFOLIUM A/S
		PLUTO	DLF-TRIFOLIUM A/S
SI HANSEN	DLF-TRIFOLIUM A/S
		SPOK	DLF-TRIFOLIUM A/S
STAR	DLF-TRIFOLIUM A/S
		TAROK	DLF-TRIFOLIUM A/S
TRItop	DLF-TRIFOLIUM A/S
		UNICA	DLF-TRIFOLIUM A/S
Nex 500	Dow AgroSciences
		Nex 700	Dow AgroSciences Canada Inc.
Nex 710	Dow AgroSciences Canada Inc.

油菜变种	供应商
		Nex 715	Dow AgroSciences Canada Inc.
Nex 720	Dow AgroSciences Canada Inc.
		Nex 822CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
Nex 824CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
		Nex 827CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
Nex 828CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
		Nex 830CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
Nex 840CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
		Nex 842CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
Nex 845CL	Dow AgroSciences Canada Inc.
		NEX170	DOW AGROSCIENCES DENMARK A/S
NEX160	DOW AGROSCIENCES LTD
		1812	DSV Canada Inc.
458RR	DSV Canada Inc.
		6045CL	DSV Canada Inc.
624RR	DSV Canada Inc.
		811RR	DSV Canada Inc.
829RR	DSV Canada Inc.
		Agassiz	DSV Canada Inc.
Ascent	DSV Canada Inc.

油菜变种	供应商
		LBD279(USA 279)	DSV Canada Inc.
LBD449RR	DSV Canada Inc.
		LBD561RR	DSV Canada Inc.
LBD588RR	DSV Canada Inc.
		LBD612RR	DSV Canada Inc.
LBD644RR	DSV Canada Inc.
		Prairie 715RR	DSV Canada Inc.
Prairie 717RR	DSV Canada Inc.
		Prairie 719RR	DSV Canada Inc.
Thunder	DSV Canada Inc.
		C2157	EURALIS SEMENCES SAS
CALUMET	EURALIS SEMENCES SAS
		ELBE	EURALIS SEMENCES SAS
ELEONORE	EURALIS SEMENCES SAS
		ELLA	EURALIS SEMENCES SAS
ES ANTIGONE	EURALIS SEMENCES SAS
		ES ASTRID	EURALIS SEMENCES SAS
ES BOURBON	EURALIS SEMENCES SAS
		ES NECTAR	EURALIS SEMENCES SAS
H19381	EURALIS SEMENCES SAS

油菜变种	供应商
		OLIVINE	EURALIS SEMENCES SAS
OLPHI	EURALIS SEMENCES SAS
		OLPOP	EURALIS SEMENCES SAS
R0029	EURALIS SEMENCES SAS
		R0435	EURALIS SEMENCES SAS
R0437	EURALIS SEMENCES SAS
		R0438	EURALIS SEMENCES SAS
R0440	EURALIS SEMENCES SAS
		R9609	EURALIS SEMENCES SAS
R9925	EURALIS SEMENCES SAS
		MIKONOS	EURO GRASS B.V.
BIOS	HODOWLA ROSLIN STRZELCE SP.Z O.O.GRUPA IHAR
		HUZAR	HODOWLA ROSLIN STRZELCE SP.Z O.O.GRUPA IHAR
MARKIZ	HODOWLA ROSLIN STRZELCE SP.Z O.O.GRUPA IHAR
		LUTIN	INRA
CASTILLE	JEAN PIERRE DESPEGHEL
		DOROTHY	JOHN A.TURNER
SUMMIT	JOHN A.TURNER
		GRIFFIN	JOHN TURNER SEED DEVELOPMENTS
KABEL	KOIPESOL SEMILLAS S.A.

油菜变种	供应商
		LUCIA	KOIPESOL SEMILLAS S.A.
TRACIA	KOIPESOL SEMILLAS S.A.
		ADDER	KWS SAAT AG
ALASKA	KWS SAAT AG
		ALIGATOR	KWS SAAT AG
FORMAT	KWS SAAT AG
		KW1519	KWS SAAT AG
PIROLA	KWS SAAT AG
		RAMANO	KWS SAAT AG
REMY	KWS SAAT AG
		ROBUST	KWS SAAT AG
RODEO	KWS SAAT AG
		AC Sunbeam	Lacombe Research Centre
AC Sungold	Lacombe Research Centre
		AKAMAR	LIMAGRAIN ADVANTA NEDERLAND B.V.
COURAGE	LIMAGRAIN ADVANTA NEDERLAND B.V.
		DECATHLON	LIMAGRAIN ADVANTA NEDERLAND B.V.
PICASSO	LIMAGRAIN ADVANTA NEDERLAND B.V.
		COLVERT	LIMAGRAIN VERNEUIL HOLDING S.A.
RAPID	LIMAGRAIN VERNEUIL HOLDING S.A.

油菜变种	供应商
		1818	Monsanto Canada Inc.
1849	Monsanto Canada Inc.
		1862	Monsanto Canada Inc.
3235	Monsanto Canada Inc.
		3311	Monsanto Canada Inc.
3345	Monsanto Canada Inc.
		9550	Monsanto Canada Inc.
225RR	Monsanto Canada Inc.
		30-55	Monsanto Canada Inc.
32-75	Monsanto Canada Inc.
		33-95	Monsanto Canada Inc.
34-55	Monsanto Canada Inc.
		34-65	Monsanto Canada Inc.
35-85	Monsanto Canada Inc.
		Ebony	Monsanto Canada Inc.
RR Champion	Monsanto Canada Inc.
		110	Monsanto Canada Inc.
111	Monsanto Canada Inc.
		330	Monsanto Canada Inc.
401	Monsanto Canada Inc.

油菜变种	供应商
		420	Monsanto Canada Inc.
1000	Monsanto Canada Inc.
		223RR	Monsanto Canada Inc.
243CL	Monsanto Canada Inc.
		289CL	Monsanto Canada Inc.
292CL	Monsanto Canada Inc.
		357RR	Monsanto Canada Inc.
71-20CL	Monsanto Canada Inc.
		71-25RR	Monsanto Canada Inc.
71-45RR	Monsanto Canada Inc.
		71-85RR	Monsanto Canada Inc.
AV 9440	Monsanto Canada Inc.
		AV 9505	Monsanto Canada Inc.
AV 9512	Monsanto Canada Inc.
		D1035	Monsanto Canada Inc.
G0118	Monsanto Canada Inc.
		MB41001	Monsanto Canada Inc.
MB41007	Monsanto Canada Inc.
		S0097	Monsanto Canada Inc.
SP 442CL	Monsanto Canada Inc.

油菜变种	供应商
		Y0276	Monsanto Canada Inc.
Z0712	Monsanto Canada Inc.
		Z1845	Monsanto Canada Inc.
ZSC 4042	Monsanto Canada Inc.
		CALIX	MONSANTO PLC
CABRIOLET	MONSANTO SAS
		CAPVERT	MONSANTO SAS
CARACAS	MONSANTO SAS
		CARTOON	MONSANTO SAS
CR 18	MONSANTO SAS
		CS12	MONSANTO SAS
MLCH079	MONSANTO SAS
			MONSANTO SAS
ARIAL	MONSANTO SAS
		BRISTOL	MONSANTO SAS
BRISTOL MS	MONSANTO SAS
		CABARET	MONSANTO SAS
CADDY	MONSANTO SAS
		CADILLAC	MONSANTO SAS
CADOMA	MONSANTO SAS

油菜变种	供应商
		CALIDA	MONSANTO SAS
CALIFORNIUM	MONSANTO SAS
		CALISTO	MONSANTO SAS
CAMELIE	MONSANTO SAS
		CANARY	MONSANTO SAS
CANASTA	MONSANTO SAS
		CANBERRA	MONSANTO SAS
CANDO	MONSANTO SAS
		CAPITOL	MONSANTO SAS
CAPTAIN	MONSANTO SAS
		CARIBOU	MONSANTO SAS
CAROLUS	MONSANTO SAS
		CAROUSEL	MONSANTO SAS
CARTEX	MONSANTO SAS
		CARUSO	MONSANTO SAS
CASTILLE	MONSANTO SAS
		CATALINA	MONSANTO SAS
CATONIC	MONSANTO SAS
		CAVIAR	MONSANTO SAS
COHORT	MONSANTO SAS

油菜变种	供应商
		COLUMBUS	MONSANTO SAS
COMODOR	MONSANTO SAS
		CONTACT	MONSANTO SAS
CR02	MONSANTO SAS
		CR09	MONSANTO SAS
CR10	MONSANTO SAS
		CR11	MONSANTO SAS
CR12	MONSANTO SAS
		CR15	MONSANTO SAS
CR16	MONSANTO SAS
		CRP 40-01	MONSANTO SAS
CS 08	MONSANTO SAS
		CS 09	MONSANTO SAS
CS 11	MONSANTO SAS
		CS 13	MONSANTO SAS
CSH 01	MONSANTO SAS
		CSH23	MONSANTO SAS
CSHP001	MONSANTO SAS
		CSHP008	MONSANTO SAS
CSP 401	MONSANTO SAS

油菜变种	供应商
		DCH 23	MONSANTO SAS
DCH33	MONSANTO SAS
		ENVOL	MONSANTO SAS
IDOL	MONSANTO SAS
		M 133	MONSANTO SAS
MLCH077	MONSANTO SAS
		MLCH089	MONSANTO SAS
MLCH093	MONSANTO SAS
		MLCP30	MONSANTO SAS
R 88421	MONSANTO SAS
		SPARK	MONSANTO SAS
SPIRAL	MONSANTO SAS
		SPLIT	MONSANTO SAS
	MONSANTO SAS
		CAMPO	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
CARACO	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		CARIOCA	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
CATANA	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		CR 25	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
CR 26	MONSANTO TECHNOLOGY LLC

油菜变种	供应商
		CR 27	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
CR 28	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		CS 28	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
EXAGONE	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		MLCH 111	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
MLCH 126	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		MLCH 128	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
MLCH 129	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		MLCH 149	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
PBIF 03.1	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		SPECIAL	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
SPLENDOR	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
		V 141 OL	MONSANTO TECHNOLOGY LLC
CACTUS	MONSANTO UK LTD
		CAIMAN	MONSANTO UK LTD
CAMERA	MONSANTO UK LTD
		CAMPALA	MONSANTO UK LTD
CANCAN	MONSANTO UK LTD
		CAPRICORN MS	MONSANTO UK LTD
CAPTURE	MONSANTO UK LTD

油菜变种	供应商
		CORNICHE	MONSANTO UK LTD
CORONET	MONSANTO UK LTD
		ECUDOR	MONSANTO UK LTD
FRISBEE	MONSANTO UK LTD
		HEARTY	MONSANTO UK LTD
MONARCH	MONSANTO UK LTD
			MONSANTO UK LTD
	MONSANTO UK LTD
		SW Hymark 3944	Newfield Seeds Co.Ltd.
ADRIANA	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		AGAPAN	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
AMPTON	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		ATLANTIC	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
BOSTON	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		CADWELL	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
COOPER	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		ESCORT	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
KARUN	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		LADOGA	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
LROC1132	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE

油菜变种	供应商
		M94284B	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
M9442B	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		M981022	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
MANITOBA	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		MONTEGO	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
OEJJ13982	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		ONTARIO	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
PACIFIC	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		POTOMAC	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
SAVAN NAH	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		SPR63	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
SPR75	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		TASMAN	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
TENNESSEE	NICKERSON INTERNATIONAL RESEARCH GEIE
		NIC 1-95MS	NICKERSON S.A.
ACCORD	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		AHL810797	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKEKG
ARTUS	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG

油菜变种	供应商
		BAROS	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
BL643196	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		CAMPINO	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
DAKINI	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		EXPRESS	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
HI 734802	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		JAGUAR	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
JETTON	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		JOCKEY	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
LORENZ	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		MENDEL	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
MSL 004C	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		MSL 011C	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG

油菜变种	供应商
		MSL 501C	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
MSL 506C	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		MSL007C	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
OLYMP	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		PRONTO	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
VIKING	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		WOTAN	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
ZEUS	NORDDEUTSCHE    PFLANZENZUCHT    HANS-GEORGLEMBKE KG
		ACROPOLIS	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
EXPLORER	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
		HOMER	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
NW1582	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
		NW1712M	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
PHOENIX	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
		PR45D01	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
PR45W04	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.

油菜变种	供应商
		PR46W07	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
PR46W09	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
		PR46W10	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
PR46W31	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
		ROLLER	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
较好的	PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL INC.
		41P55	Pioneer Hi-Bred Ltd
44A04	Pioneer Hi-Bred Ltd
		44A53	Pioneer Hi-Bred Ltd
45A51	Pioneer Hi-Bred Ltd
		45A54	Pioneer Hi-Bred Ltd
45A71	Pioneer Hi-Bred Ltd
		45H20	Pioneer Hi-Bred Ltd
45H21	Pioneer Hi-Bred Ltd
		45H22	Pioneer Hi-Bred Ltd
46A65	Pioneer Hi-Bred Ltd
		46A76	Pioneer Hi-Bred Ltd
46H02	Pioneer Hi-Bred Ltd
		43A56	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
43H57	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.

油菜变种	供应商
		45H24	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
45H25	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
		45H26	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
45H72	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
		45H73	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
45P70	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
		46H23	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
46H70	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
		46P50	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
46W09	Pioneer Hi-Bred Production Ltd.
		NW 4020	PIONEER OVERSEAS CORPORATION
NW1931M	PIONEER OVERSEAS CORPORATION
		NW4193BC	PIONEER OVERSEAS CORPORATION
NW4201BC	PIONEER OVERSEAS CORPORATION
		NW4202BC	PIONEER OVERSEAS CORPORATION
CORPORAL	PLANT BREEDING INTERNATIONAL CAMBRIDGE LTD
		PISCES	PLANT BREEDING INTERNATIONAL CAMBRIDGE LTD
SCORPIO	PLANT BREEDING INTERNATIONAL CAMBRIDGE LTD
		GRIZZLY	RAGT 2N S.A.S.
DANTE	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD

油菜变种	供应商
		FREDERIC	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
HEROS	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
		HUNTER	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
MO13392	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
		PO1331	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
SISKA	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
		SLOGAN	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
WINNER	RAPS GBR SAATZUCHT LUNDSGAARD
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Amulet	Saskatchewan Wheat Pool
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AC Tristar	Saskatoon Research Centre
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Profit	Saskatoon Research Centre
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AC Excel	SeCan
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NKFAIR	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
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RNX4002	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
		RNX4201	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
RNX4401	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
		RNX4801	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
RNX4901	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
		RNX5002	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
RNX5902	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
		RNX6001	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
RNX6101	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
		ROXET	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
SMART	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
		ZENITH	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
ALAMO	SYNGENTA SEEDS GMBH
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ETHNO	SYNGENTA SEEDS GMBH
		GAMMA	SYNGENTA SEEDS GMBH
NEPAL	SYNGENTA SEEDS GMBH
		RACER	SYNGENTA SEEDS GMBH
Roper	TEC Edmonton

NKFAIR	SYNGENTA CROP PROTECTION AG
		Conquest	University of Alberta
Cougar CL	University of Alberta
		Hi-Q	University of Alberta
Kelsey	University of Alberta
		Peace	University of Alberta
Q2	University of Alberta
		Apollo	University of Manitoba
BE800397	W.VON BORRIES-ECKENDORF GMBH&CO.KG
		PLANET	W.VON BORRIES-ECKENDORF GMBH&CO.KG

农民可在商业上获得的优良棉花变种的非限定性的例子包括AFD Seed AFD 2485、AFD Seed AFD 3070F、AFD Seed AFD 3074F、AFD Seed AFD 3511RR、AFD Seed AFD 3602RR、AFD Seed AFD5064F、AFD Seed AFD 5065B2F、AFD Seed AFD 5062LL、AFD SeedEXPLORER、All-Tex Atlas、All-Tex Atlas RR、All-Tex Apex B2RF、All-Tex Excess RR、All-Tex Marathon B2RF、All-Tex Patriot、All-TexPatriot RR、All-Tex Summit B2RF、All-Tex Titan B2RF、All-TexTop-Pick、All-Tex Warrior、All-Tex Xpress、All-Tex Xpress RR、All-Tex 45039BGRF、Americot AMX 262R、Americot AMX 427R、Americot AMX  821R、Americot AMX 1504B2RF、Americot AMX1532B2RF、Americot AMX 1621、Americot AMX 8120、BayerCropScience-Fibermax FM 800B2R、Bayer CropScience-Fibermax FM800RR、Bayer CropScience-Fibermax FM 832、BayerCropScience-Fibermax FM 832B、Bayer CropScience-Fibermax FM832LL、Bayer CropScience-Fibermax FM 955LLB2、BayerCropScience-Fibermax FM 958、Bayer CropScience-Fibermax FM958B、Bayer  CropScience-Fibermax FM 958LL、BayerCropScience-Fibermax FM 960B2、Bayer CropScience-Fibermax FM960B2R、Bayer CropScience-Fibermax FM 960BR、BayerCropScience-Fibermax FM 960RR、Bayer CropScience-Fibermax FM965LLB2、Bayer CropScience-Fibermax FM 966、BayerCropScience-Fibermax FM 966LL、Bayer CropScience-Fibermax FM981LL、Bayer CropScience-Fibermax FM 988LLB2、BayerCropScience-Fibermax FM 989、Bayer CropScience-Fibermax FM989B2R、Bayer CropScience-Fibermax FM 989BR、BayerCropScience-Fibermax FM 989RR、Bayer CropScience-Fibermax FM991B2R、Bayer CropScience-Fibermax FM 991BR、BayerCropScience-Fibermax FM 991RR、Bayer CropScience-Fibermax FM5024BXN、Bayer CropScience-Fibermax FM 5035LL、BayerCropScience-Fibermax FM 9058F、Bayer CropScience-Fibermax FM9060F、Bayer CropScience-Fibermax FM 9063B2F、BayerCropScience-Fibermax FM 9068F、Beltwide Cotton Genetics BCG 24R、Beltwide Cotton Genetics BCG 28R、Beltwide Cotton Genetics BCG30R、Beltwide Cotton Genetics BCG 50R、Beltwide Cotton GeneticsBCG 245、Beltwide Cotton Genetics BCG 520R、Beltwide CottonGenetics BW-1505RF、Beltwide Cotton Genetics BW-2038B2F、Beltwide Cotton Genetics BW-3255B2F、Beltwide Cotton GeneticsBW-4021B2F、Beltwide Cotton Genetics BW-4630B2F、BeltwideCotton Genetics BW-6896B2F、Beltwide Cotton GeneticsBW-8391B2F、Beltwide Cotton Genetics BW-9775B2F、CPCSD AcalaDaytona RF、CPC SD Acala Fiesta RR、CPC SD Acala NemX、CPC SDAcala Riata RR、CPCSD Acala Sierra RR、CPCSD Acala Ultima、CPCSD Acala Ultima EF、CPCSD Acala Ultima RF、Croplan GeneticsCG 3020B2RF、Croplan Genetics CG 3520B2RF、Croplan Genetics CG4020B2RF、Deltapine DeltaPEARL、Deltapine Deltapine Acala、Deltapine DP 20B、Deltapine DP 108RF、Deltapine DP 110RF、Deltapine DP 113B2RF、Deltapine DP 117B2RF、Deltapine DP 143B2RF、Deltapine DP 147RF、Deltapine DP 156B2RF、Deltapine DP164B2RF、Deltapine DP 167RF、Deltapine DP 388、Deltapine DP 393、Deltapine DP 422B/RR、Deltapine DP 424BGII/RR、Deltapine DP 432RR、Deltapine DP 434RR、Deltapine DP 436RR、Deltapine DP 444BG/RR、Deltapine DP 445BG/RR、Deltapine DP 448B、Deltapine DP449BG/RR、Deltapine DP 451B/RR、Deltapine DP 454BG/RR、Deltapine DP 455BG/RR、Deltapine DP 458B/RR、Deltapine DP 468BGII/RR、Deltapine DP 488BG/RR、Deltapine DP 491、Deltapine DP493、Deltapine DP 494RR、Deltapine DP 515BG/RR、Deltapine DP 543BG II/RR、Deltapine DP 555BG/RR、Deltapine DP 565、Deltapine DP655B/RR、Deltapine DP 2379、Deltapine DP 5415、Deltapine DP 5415RR、Deltapine DP 5690、Deltapine DP 5690RR、Dyna-Gro DG OA265BR、Dyna-Gro DG 2100B2RF、Dyna-Gro DG 2215B2RF、Dyna-GroDG 2242B2RF、Dyna-Gro DG 2520B2RF、Paymaster PM HS 26、Paymaster PM 280、Paymaster PM 1199RR、Paymaster PM 1218BG/RR、Paymaster PM 1560BG/RR、Paymaster PM 2140 B2RF、Paymaster PM 2145RR、Paymaster PM 2167RR、Paymaster PM 2266RR、Paymaster PM 2280BG/RR、Paymaster PM 2326BG/RR、Paymaster PM 2326RR、Paymaster PM 2344BG/RR、Paymaster PM2379RR、Phytogen NM 1517-99W Acala、Phytogen PHY 72Acala、Phytogen PHY 78Acala、Phytogen PHY 125RF、Phytogen PHY 310R、Phytogen PHY 370WR、Phytogen PHY 410R、Phytogen PHY 425RF、Phytogen PHY 440W、Phytogen PHY 470WR、Phytogen PHY 480WR、Phytogen PHY 485WRF、Phytogen PHY 510R、Phytogen PHY710R Acala、Phytogen PHY 715RF、Phytogen PHY 725RF、PhytogenPHY 745WRF、Stoneville BXN 47、Stoneville MCS 0419B2RF、Stoneville MCS 0420B2RF、Stoneville MCS 0423B2RF、StonevilleMCS 0426B2RF、Stoneville NG 1553R、Stoneville NG 2448R、Stoneville NG 3273B2RF、Stoneville NG 3550RF、Stoneville NG 3969R、Stoneville ST 457、Stoneville ST 474、Stoneville ST 1553R、Stoneville ST 2448R、Stoneville ST 2454R、Stoneville ST 3539BR、Stoneville ST 3636B2R、Stoneville ST 4357B2RF、Stoneville ST 4554B2RF、Stoneville ST 4575BR、Stoneville ST 4646B2R、Stoneville ST4664RF、Stoneville ST 4700B2RF、Stoneville ST 4793R、StonevilleST 4686R、Stoneville ST 4892BR、Stoneville ST 5007B2RF、Stoneville ST 5454B2R、Stoneville ST 5242BR、Stoneville ST 5303R、Stoneville ST 5599BR、Stoneville ST 6611B2RF、Stoneville ST 6622RF、Stoneville ST 6848R、Sure-Grow SG 96、Sure-Grow SG 105、Sure-Grow SG 215BG/RR、Sure-Grow SG 501BR、Sure-Grow SG 521R和Sure-Grow SG 821。优良植物为来自优良变种的代表性植物。

B.转基因育种

1.用于重组核酸的方法和组合物

本发明中公开的有用的用于蛋白质的核酸可以通过将其可操作地连接到在植物中具有功能的启动子上而在植物细胞中进行表达。组织特异性的和/或诱导型启动子可用于适当地表达特定性状的核酸。3’非翻译序列、3’转录终止区或多腺苷酸化区域是指与决定性状的结构性多核苷酸分子相连并且位于其下游的DNA分子，并且包括提供能够影响转录、mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化信号和其它调控信号的多核苷酸。多腺苷酸化信号在植物中起作用，以将多腺苷酸核苷酸添加到mRNA前体的3’末端。多腺苷酸化序列可来自天然基因、来自多种植物基因或来自T-DNA基因。作为翻译前导序列起作用的5’UTR为位于启动子序列和编码序列之间的DNA遗传元件。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录物向mRNA的加工、mRNA的稳定性或翻译效率。

编码转基因性状的蛋白质的核酸可操作地连接到不同的表达元件上，产生表达单元。这样的表达单元通常包含(从5’到3’方向)：启动子、用于表达性状的核酸、3’非翻译区(UTR)。为了促进性状的表达，可以加入几种其它表达元件，例如5’UTR、细胞器转运肽序列和内含子。

在一些实施方案中，决定特定性状的核酸的蛋白质产物靶向细胞器，以发挥适当的功能。例如，将蛋白质靶向叶绿体是通过使用叶绿体转运肽序列实现的。这些序列可从由叶绿体靶向基因编码的核(例如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基(RbcS2)、铁氧化还原蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合物蛋白I和II以及硫氧还蛋白F蛋白)的氨基酸或核酸序列中分离或合成出来。叶绿体靶向序列的其它例子包括玉米cab-m7信号序列(Becker，等人，1992；PCTWO 97/41228)、豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(Creissen，等人，1995；PCT WO 97/41228)和烟草核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基叶绿体转运肽的CTP(NtSSU-CTP)(Mazur，等人，1985)。

术语“内含子”是指可从基因的基因组拷贝的间插序列中分离或鉴别出来的多核苷酸分子，通常可定义为在翻译之前的mRNA加工过程中剪接的区域。或者，内含子可以合成制备。内含子本身可以包含实现可操作地连接的基因转录的亚元件，例如顺式元件或增强子结构域。“植物内含子”为在植物细胞内具有功能的天然或非天然内含子。植物内含子可用作调控可操作地连接的一个基因或多个基因的表达的调控元件。转化构建体中的多核苷酸分子序列可以包含内含子。内含子相对于可转录的多核苷酸分子序列而言可以是异源的。内含子的例子包括玉米肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子(美国专利5,859,347，在此引入作为参考)。

由于性状沉默化或相关的影响，避免各表达单元中任何表达元件的复制。仅当它们不互相干扰或不会造成性状沉默时，才可以使用在各表达单元中的复制的元件。

本领域中已知以下方法：以一定方式装配构建体和将构建体引入细胞中，使得性状的核酸分子被转录为功能性mRNA分子，然后该功能性mRNA分子被翻译和表达为蛋白质产物。为了实施本发明，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员公知的，参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rdedition Volumes 1，2，and 3(2000)J.F.Sambrook，D.W.Russell，和N.Irwin，Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于制备特别适于植物转化的转化构建体的方法包括但不限于美国专利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011中描述的那些方法，所述专利全部在此引入作为参考。这些载体类型已被综述(Rodriguez等人，Vectors：A Surveyof Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston，1988；Glick等人，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1993)。

一般而言，在转化构建体上的一个或多个T-DNA边界之间提供表达单元。转化构建体允许将T-DNA边界间的表达单元整合到植物细胞的基因组中。该构建体还可以包含在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA片段，例如大肠杆菌复制起点(例如ori322)、宽宿主范围的复制起点(例如oriV或oriRi)，以及选择性标记的编码区(例如Spec/Strp)，该编码区编码赋予壮观霉素或链霉素或庆大霉素(Gm，Gent)选择性标记基因抗性的Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)。对于植物转化而言，宿主细菌菌株通常为携带具有表达单元转运功能的质粒的根瘤土壤杆菌ABI、C58、LBA4404、EHA101和EHA105。本领域技术人员已知的用于植物转化的其它菌株也可以在本发明中起作用。

另一方面，目的核酸的表达可被双链RNA介导的基因抑制(也被称为RNA干扰(″RNAi″))改变，其包括由小干扰RNA(″siRNA″)、反式作用小干扰RNA(″ta-siRNA″)或微RNA(″miRNA″)介导的抑制。适于植物中使用的RNAi方法的例子在美国专利申请公开2006/0200878和2007/0011775中有详细描述。本领域中已知以下方法：以一定方式装配构建体和将构建体引入细胞中，使得性状的核酸分子被转录为功能性mRNA分子，然后该功能性mRNA分子再被翻译和表达为蛋白质产物。

本发明的转基因通过植物组织培养和转化领域的技术人员已知的转化方法被引入到近交系中。用于将表达单元引入植物中的本领域已知的任何技术都可根据本发明使用。这样的方法的例子包括美国专利5,384,253中描述的电穿孔；美国专利5,015,580、美国专利5,550,318、美国专利5,538,880、美国专利6,160,208、美国专利6,399,861和美国专利6,403,865中描述的微粒轰击；美国专利5,508,184中描述的原生质体转化；和美国专利5,635,055、美国专利5,824,877、美国专利5,591,616、美国专利5,981,840和美国专利6,384,301中描述的土壤杆菌介导的转化。

在实现了表达单元向受体细胞的转运之后，下一步通常涉及鉴别用于进一步培养和植物再生的转化的细胞。为了提高鉴别转化体的能力，人们可能希望使用可选择的或可筛选的标记基因以及根据本发明制备的转化构建体。在这种情况下，人们通常会通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来分析可能转化的细胞群体，或者人们会针对希望的标记基因性状筛选细胞。各种可选择或可筛选的标记的例子在Miki和McHugh，2004，Selectable marker genes in transgenicplants：applications，alternatives and biosafety，Journal of Biotechnology，107，193中公开。

暴露于选择剂之后存活的细胞或在筛选分析中被评分为阳性的细胞可在支持植物再生的培养基中培养。在示例性的实施方案中，任何合适的植物组织培养基(例如MS和N6培养基)可通过进一步加入物质(例如生长调节剂)进行改良。组织可以维持在含有生长调节剂的基础培养基中，直到可以获得足够的组织来开始植物的再生努力，或者重复多轮人工选择直到组织的形态学适于再生，然后转移到有益于形成芽的培养基中。定期转移培养物直到发生足够的芽形成。一旦形成了芽，将其转移到适于形成根的培养基中。一旦形成了足量的根，可将植物转移到土壤中进一步生长和成熟。

为了证实再生植物中决定转基因性状的DNA的存在，可以进行多种分析。这样的分析包括例如“分子生物学”分析，例如DNA印迹法和RNA印迹法和PCR^TM；“生化”分析，例如检测蛋白质产物的存在，如通过免疫方式(ELISA和蛋白质印迹法)或通过酶的功能；植物部分分析，例如叶或根的分析；以及通过分析整个再生植物的表型。

本发明的示例性的转基因示于表2中。

表2.可根据本发明的方法使用以鉴别优选的种质和转基因组合的转基因性状的非限制性例子。

2.性状整合

本发明预期到，本领域技术人员可以使用本发明的方法在已获得转化体之后筛选任何位点上的转基因表现。可评价使用至少一种转基因转化的种质或已转换的种质(即回交转换)。在另一方面，种质可与转基因测交系进行杂交，然后对其进行评价。在某些方面，评价了两种或更多种转基因事件。在其它方面，评价了两份或更多份具有一种或更多种转基因事件的种质。在其它方面，评价了两种或更多种转基因，即集合(stack)。转基因表现的评价是通过使用标记-性状关联技术来测试一个或多个转基因调控基因座的存在或者通过测试种质的转基因表现(即使用两份或更多份种质)实现的。

一旦决定性状的转基因已被引入到植物中，该基因可通过杂交被引入到与第一植物性亲和的(sexually compatible)任何植物中，而不需要直接转化第二植物。因此，此处所使用的术语“后代”是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。因此，“转基因植物”可为任何代。

通常对于不同性状和农作物的育种方法的描述可见于几本参考书中的一本(Allard，“Principles of Plant breeding，”John Wiley&Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles ofcrop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“Plant breeding perspectives，”Wageningen(ed)，Center forAgricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，In：Soybeans：Improvement，Production and Uses，2nd Edition，Manograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles of variety development，”Theory and Technique，(Vol 1)和Crop Species Soybean(Vol 2)，Iowa State Univ.，MacmillianPub.Co.，NY，360-376，1987))中。

一般而言，使用两个截然不同的育种阶段用于商业化发展具有转基性状的优良栽培变种。第一阶段包括评价和筛选优良的转基因事件，而第二阶段包含将选择的转基因事件整合到商业种质中。

在典型的转基因育种程序中，决定性状的转化构建体通过转化方法被引入到基因组中。通常对每个转化体产生大量独立的转化体(事件)。评价这些事件来选择具有优异表现的那些事件。事件评价方法是基于几项标准，包括：1)性状的转基因表达/效力、2)性状的分子表征、3)性状的分离、4)发展的事件的农业经济学和5)转基因性状表达的稳定性。独立事件的大群体的评价以及更彻底的评价使得成功的几率更大。本发明预期到，在此提供的方法对于比较两种或更多种事件的表现特别有用。

通过评价事件的插入位点、转基因拷贝数、转基因的完整性、转基因的接合性、与基因型相关的近交水平和环境条件，选择显示出对应正确表型(效力)的正确蛋白质表达水平的事件以用于进一步的使用。通过进行关于拷贝数、插入数、插入复杂性、载体骨架的存在和事件特异性分析的发展的分子分析，发现了显示出干净的单个完整插入的事件，并用于进一步发展中。测试性状的分离来选择遵循单基因座分离模式的转基因事件。一种直接的方法是评价性状的分离。一种间接的方法是评估选择性标记的分离(与转基因性状相关)。

事件在世代中的不稳定性通常是由于因多个转基因拷贝、接合性水平、高甲基化插入位点或应激水平造成的转基因失活而引起的。因此，转基因性状表达的稳定性通过在不同的代、环境和不同的遗传背景中进行测试得以确定。放弃显示转基因性状沉默的事件。

一般而言，具有作为单个显性基因遗传的并且遵循孟德尔分离比的单个完整插入的事件在商业性状整合策略(例如回交和正向育种)中使用。

在一优选实施方案中，本发明的方法提供了性状整合策略，包括评价至少一种事件在至少两种不同的遗传背景中的至少一种转基因，用于评价基因型与一种或多种转基因之间的相互作用。在其它方面，在至少一份种质中评价两种或更多种事件的特定转基因。在一个实施方案中，一个或多个转基因在定位群体即分离的后代中进行评价，转基因的表型分型伴随着评价农学性状和涉及多个SNP标记的基因组范围内指纹分析。然后，使用关联性研究来确定对种质的一个或多个转基因而言一个或多个转基因调控基因座的存在。在另一个实施方案中，其它标记可以在与至少一个转基因调控基因座相关的选择决定中使用，并且可以通过目视分析、化学或分析试验或一些其它类型的表型分析进行检测。然后可使用与一个或多个转基因调控基因座直接或间接相关的一个或多个标记选择带有这些基因座的种系，或者用于将转基因调控基因座渗入到不带有转基因调控基因座的优选等位基因的种系中。

另一方面，测试可以扩大到在至少两个不同的位置处在至少两种不同的遗传背景中评估至少一种先导事件，用于评价在两个或多个位点处与一个或多个转基因的基因型相互作用。

另一方面，测试可以扩大到在对于至少一个环境因素的至少两种不同的条件下在至少两种不同的遗传背景中评估至少一种先导事件，用于评价基因在一种或多种条件下与一个或多个转基因之间的相互作用。

在另一个实施方案中，性状的整合是通过使用回交来使优良近交系的基因型恢复具有其它转基因性状而实现的。在每个回交代中，鉴别包含转基因的植物，并与优良轮回亲本杂交。商业育种者通常使用包括选择轮回亲本表型的几个回交代来使优良亲本的基因型恢复具有其它转基因性状。在回交过程中，转基因处于半合子状态。因此，在回交结束时，使植物自交或近缘授粉，以使转基因固定为纯合状态。分子辅助的回交(MABC)可以减少回交代数。MABC方法使用遗传标记来鉴别在每个回交代中与轮回亲本最相似的植物。通过使用MABC和适当的群体大小，可以鉴别出仅在两个或三个回交代后即恢复超过98％的轮回亲本基因组的植物。通过消除几个回交代，商业转基因产品通常可以比通过常规回交产生的产品早一年投放到市场上。

在一个优选实施方案中，MABC还针对之前从对于转基因调节物质分离的一组种质中的标记-性状作图鉴别的、在至少一个转基因调控基因座处对应的标记。在另一个实施方案中，MAS在与种系发展相关的活动中使用，来发展带有优选的转基因调控基因型的优良种系。在另一方面，其它标记也可以在与转基因调控基因座相关的选择决定中使用，并可通过目视分析、化学或分析试验或其它类型的表型分析来鉴别。

正向育种为目标是发展与用于发展改进的基因型的亲本在基因型上不同并且更优良的转基因变种、近交系或杂种的任何育种方法。当正向选育转基因农作物时，在育种程序的各代中，通常施加对于转基因效力的选择压力。此外，在育种过程中尽快将转基因固定为纯合状态通常是有利的，以评价转基因x基因型相互作用。

在一个优选实施方案中，本发明提供了不进行直接正向育种评在一代中的杂种农作物中的转基因x基因型相互作用的方法。优良近交系与具有至少一个转基因的至少一种测交系杂交，并评价后代的基因型相互作用，其中在不需要MABC的时间和成本的情况下，可以鉴别优选的基因型-转基因组合。

在将转基因性状整合到商业种质中之后，在多个位点处测试最终的近交系和杂种。测试通常包括在性状中性环境和目标市场的典型环境中的产率实验。如果新的转基因系已通过回交获得，通常通过将其与所有环境中的非转基因形式进行比较来测试相同性。

在本发明的另一方面，选择转基因事件用于进一步发展，其中将编码能降低成本的性状和/或终端使用者性状的核酸插入并连接到据发现能为农作物提供其它益处的基因座区域(定义为单元型)。转基因和单元型包含T-类型的基因组区域。使用单元型和T-类型的基因组区域提高育种的方法在美国专利申请11/441,915中公开。

本发明还提供了本发明植物的部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明的优选实施方案中，植物部分为种子。本发明还包括和提供了包含本发明的核酸分子的转化的植物细胞。

C.商业应用

在其它实施方案中，本发明提供了用于从育种活动中获得商业价值的方法。例如，本发明的方法使得能够许可转基因和特定的基因型的组合。不是仅许可转基因，单位可以许可带有至少一种基因型的至少一个转基因的包装，其中，基因型可以包括用于检测至少一个转基因调控基因座的试剂盒、用于发展至少一个转基因的种质建议，和/或用于转换以渗入至少一个转基因调控基因座的种质资源。

实施例

下面的实施例用于说明本发明的实施方案。本领域技术人员应当理解，这些实施例中公开的技术代表了本发明人发现的、在实施本发明中工作良好的技术。但是，本领域技术人员应该理解，在本发明的公开内容的基础上，还可以对公开的特定实施方案做出许多改变，并仍然会得到相同或相似的结果，而不会偏离本发明的概念、精神和范围。更特别地，应该理解，在化学和生理学上均相关的某些制剂可以替代在此描述的制剂，并仍会得到相同或相似的结果。本领域技术人员明白的所有这些相似的替换或修改都包含在由附加的权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念中。

实施例1

用于选择玉米中优选的种质-转基因组合的转基因调控基因座的定位

Monsanto研发了被称为LY038的转基因事件，提高了玉米粒中游离赖氨酸的浓度(美国专利No.7,157,281)。该事件是通过工程化对赖氨酸反馈抑制不敏感的细菌二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS)而实现的。当与LY038事件杂交时，关于游离赖氨酸的差异已在不同的近交系转化中观察到。近交系种质之间的相互作用相对于近交系背景的影响较小。因此，观察到的赖氨酸水平的差异大概由近交系种质的基因组中的一个或多个调控基因座控制，因此包括可被检测和鉴别的基因型。为了说明观察到的赖氨酸差异，建立了定位(即分离)群体来检测基因型和表型差异以确定一种或多种遗传标记与赖氨酸水平之间的可能的关联性。

发现赖氨酸调控基因型的最初阶段为进行连锁和性状定位实验，该实验中具有高赖氨酸的近交系与具有低赖氨酸的近交系杂交，以鉴别调控赖氨酸表达效果的基因座。赖氨酸水平间的差异如美国专利No.7,157,281所述检测，该专利在此全文引入作为参考，该差异表示为代表近交系种质的不同遗传背景的LY038事件的多个近交系转化之间的ppm(百万分率)。

下面为使用表明不同赖氨酸表型的近交系转化来检测转基因调控基因座的定位方法的例子。每个实验均使用了大约100-200个SNP标记的标记密度。QTL基于大约5-20cM窗口表示。在此报道的所有标记总结在表3中，并参考表3中的序列表。

表3.影响赖氨酸浓度和/或白种子表型的、与LY038的转基因调控QTL相关的遗传标记的总结。

A.LY038近交系与高或低赖氨酸表型的杂交中与赖氨酸浓度相关的LY038转基因调控基因座的定位

在此称为“高1”的近交系转换(inbred conversion)“高赖氨酸”显示700.7ppm(标准差为228.5)的赖氨酸水平，在此称为“低1”的近交系转换“低赖氨酸”显示167.6ppm(标准差为87.9)的赖氨酸水平。

一方面，使高1和低1近交系转换杂交，并收集F1杂交种子来测试调控基因座。种植F1种子，使F1后代植物自花传粉，得到和收集F2后代种子。因此，这一群体的LY038转基因被固定，但是调控赖氨酸水平、因而调控转基因性状表现的基因座分离。

F2个体自花传粉并与杂种进行测交。对定位群体的F2并且对F3种子(在授粉的自交的F2植物的穗上)和由各F2授粉的测交种子(在杂种的穗上)测定以ppm表示的赖氨酸水平。分离的定位群体中的每个F2包含168个个体，用一组100个遗传标记进行分析。设计了可以区分高1和低1近交系的专用标记。在基因组中以20cM的间隔选择标记，并对所有个体进行基因型分型。产生的F2的后代包含重组群体，其中来自任一亲本的不同基因组区域改组为独特的组合。得到的一组重组后代允许测试赖氨酸ppm与各标记基因座的基因型分离的关系。通过单因素变量分析(ANOVA)和通过MAPMAKER/QTL分析数据；后者进行与在标记间内插的其它检验类似的相关性检验。所有检验的无效假设均为赖氨酸水平基因型类型平均值相等。

对于测交数据而言，使用ANOVA检验的100个标记中的7个在P＜0.05的水平上显示出显著的关联性，这些标记中的2个在P＜0.01的水平上显示出显著的关联性。这7个显著的关联性代表了独立的基因组区域。测交数据的基因型类型平均值之间的显著性LSD(最小显著性差异)为106-111ppm。测交数据的显著性R²值的范围为4.0％-7.5％。MAPMAKER/QTL分析基本上验证了ANOVA的结果，显著性LOD得分＞2.0(100∶1比率)，在P＜0.01时与单因素ANOVA检测相同的区域。

对于自交数据，使用ANOVA检验的100个标记中的10个在P＜0.05水平上显示出显著的关联性(表4)。测交数据的基因型类型平均值之间的显著性LSD的范围为138-158ppm。自交数据的显著性R²值的范围为3.4-7.2％。自交数据中的10个显著相关区域中，4个与测交数据相同。MAPMAKER/QTL分析基本上验证了ANOVA的结果，LOD得分＞2.0(100∶1比率)，在P＜0.01时与单因素ANOVA检测相同的区域。

表4.在高1*低1群体的F2杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

QTL	标记	染色体	位置	显著性	Fav亲本	效应
							1	NC0036685	1	45.8	0.0218	高1	177.23
3	NC0039298	1	194.6	0.0165	高1	174.985
							4	NC0015344	1	221.1	0.0281	高1	167.19
6	NC0060879	2	97.7	0.0312	高1	128.335

QTL	标记	染色体	位置	显著性	Fav亲本	效应
							10	NC0108727	3	77.4	0.0037	高1	126.35
10	NC0024631	3	83.2	0.0002	高1	132.35
							10	NC0008900	3	97.6	0.0005	高1	121.895
11	NC0002905	3	123.9	0.0147	高1	721.705
							14	NC0009057	4	21.7	0.0206	高1	167.19
15	NC0019003	4	45.3	0.0244	高1	104.47

在下面的实施例中，报道了基于单标记对LY038转基因调控基因座评价的其它群体的结果。F2定位群体被评价为LY038转基因纯合的，但是在所有其它遗传背景区域为分离的。F2定位群体由之前被表征为“高”遗传背景或“低”遗传背景亲本的杂交产生。两个新评价的F2群体包括高1*低2群体和高1*高2群体。这些实验描述了数目、位置、量级和效应的亲本等位基因贡献。比较在不同群体中检测的效应的图谱位置共同性和排他性。其它定位群体被评价为来自于非转基因系的杂交，但是与纯合的LY038转换体测交。这提供了半合子状态的LY038的评价。

对于高1*低2群体和高1*高2群体而言，对个体采样、使用大约200个标记进行基因型分型，并进行赖氨酸的评价。对一个自交穗的50个谷粒进行游离赖氨酸评价。结果分别示于表5和表6中。所有三个群体的显著性标记的结果总结在表7中。

表5.在高1*高2群体的F2杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。显著性(LOD＞2.4)效应的范围为190.19-624.69ppm，并在染色体1、2、3、4、5、6、8和10上进行检测。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

表6.在高1*低2群体的F2杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

QTL	标记	染色体	位置	显著性	Fav亲本	效应
							1	NC0036685	1	45.8	0.0218	高1	177.23
3	NC0039298	1	194.6	0.0165	高1	174.985
							4	NC0015344	1	221.1	0.0281	高1	167.19
6	NC0060879	2	97.7	0.0312	高1	128.335
							10	NC0108727	3	77.4	0.0037	高1	126.35
10	NC0024631	3	83.2	0.0002	高1	132.35
							10	NC0008900	3	97.6	0.0005	高1	121.895
11	NC0002905	3	123.9	0.0147	高1	721.705
							14	NC0009057	4	21.7	0.0206	高1	167.19
15	NC0019003	4	45.3	0.0244	高1	104.47
							15	NC0024647	4	52.5	0.0052	高1	112.29
15	NC0034325	4	63.7	0.0016	高1	164.215
							16	NC0033667	4	73.7	0.017	高1	167.19
16	NC0104785	4	83.9	0.0004	高1	207.19
							16	NC0005018	4	94.8	＜.0001	高1	202.215
17	NC0009620	4	109.2	＜.0001	高1	308.225
							17	NC0039511	4	121.5	＜.0001	高1	255.195
18	NC0005295	4	135.1	0.0002	高1	120.67
							18	NC0048567	4	146.9	＜.0001	高1	207.42
18	NC0036534	4	147.9	0.0176	高1	166.215
							19	NC0032049	4	162.6	0.0393	高1	198.85
19	NC0060681	4	164.4	0.002	高1	104.47
							19	NC0109283	4	175.5	0.0001	高1	138.8
26	NC0112604	6	38.4	0.038	低2	315.1

QTL	标记	染色体	位置	显著性	Fav亲本	效应
							26	NC0032034	6	57.6	0.0185	高1	151.625
33	NC0015146	8	84	＜.0001	高1	350.11
							33	NC0104858	8	96.2	＜.0001	高1	310.515
33	NC0031025	8	108.5	0.0033	高1	150.4
							34	NC0059764	8	118.8	0.0006	高1	108.9
35	NC0025198	9	45.7	0.0525	高1	162.085
							35	NC0023779	9	56.1	0.0225	低2	140.575
37	NC0054661	10	57.1	0.0158	高1	150.23
							37	NC0027447	10	75.6	0.0495	高1	108.35

表7.高1*低1、高1*低2和高1*高2与赖氨酸浓度相关的LY038转基因调控基因座的区间定位的遗传位点和显著性(LOD＞2.4)的总结。报道的累加效应相对于高1亲本而言。

B.在具有高或低赖氨酸表型的LY038近交系的杂交中，与白色幼苗表型相关的LY038转基因调控基因座的定位。

也对这些F2群体的每个群体中的个体亚组进行白色幼苗颜色的附加相关性状的打分。在高1*低2群体的F₂中，大约一半植物为绿色的，一半植物为绿色加白色斑纹，但是偶然也有全白色的植物(大约5％的频率)。在高1*高2群体中，不同颜色类型的分布几乎相同：1/3为全绿色、1/3为绿色加白色斑纹、1/3为全白色。对颜色表型赋予类型号(1、2或3)，并相对于标记数据进行分析。特别地，这种特征代表了作为能够用作育种决定基础的表型的标记。

此外，对群体进行基因型分型，以鉴别与白色幼苗表型相关的LY038转基因调控基因座相关的一个或多个遗传标记。高1*高2和高1*低2群体的数据示于表8和表9中。所有三个群体的显著性标记的结果总结在表10中。

表8.在高1*高2群体的F2杂交体中，白色幼苗表型的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

表9.在高1*低2群体的F2杂交体中，白色幼苗表型的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

表10.高1*低1、高1*低2和高1*高2与白色幼苗表型相关的LY038转基因调控基因座的区间定位的遗传位点和显著性(LOD＞2.4)的总结。报道的累加效应相对于高1亲本而言。

为了有助于理解群体间赖氨酸调控的遗传相关性，在三个F2定位群体(高1*高2、高1*低1、高1*低2)中进行累加效应值的关联。为此，在10cM窗口的图谱位置的基础上分配效应，在普通窗口中对效应估计值进行关联。评价白色幼苗颜色性状和赖氨酸的效应的相关性(表11)。

表11.在F2群体累加效应间赖氨酸和幼苗颜色表型性状的相关性。

		颜色高1*高2	颜色高1*高2	赖氨酸ppm高1*高2	赖氨酸ppm高1*低2	赖氨酸ppm高1*低2
							颜色高1*高2		1	0.06930.444124	-0.1350.128129	-0.1890.0347124	-0.0860.454578
颜色高1*高2			1	0.1660.0648124	-0.0680.4475124	0.07540.526173
							赖氨酸ppm高1*高2				1	0.3597＜0.0001124	0.312960.005378
赖氨酸ppm高1*低2					1	0.5293＜0.000173
							赖氨酸ppm高1*低2						1

在相同的染色体区域中发现了群体间显著的调节物效应，表明了共同的遗传控制(所有三个群体中的染色体#4、三个群体中的2个群体中的染色体1和8)。群体中的累加效应之间的显著相关性进一步指示了遗传控制的共同性。但是，数据还显示出存在群体特异性的调节物。针对赖氨酸性状优化特定的遗传背景可能需要与多于一个的修饰的基因座一起育种，而经验显示一些效应比其它效应有更大的效果。

C.在LY038近交系与LY038无效近交系的杂交中，与赖氨酸浓度相关的LY038转基因调控基因座的定位，以评价LY038半合子的效应。

另一方面，拷贝数可能影响转基因调控基因座。当转基因处于半合子状态时，评价其它群体(不带有LY038的低1转换或不带有LY038的F2:F3与LY038测交系高1或低2测交)的赖氨酸浓度和LY038转基因调控QTL的存在。

关于游离赖氨酸的标记基因型相关性的数据分析包括SAS中的单因素ANOVA和多元回归分析和QTL CARTOGRAPHER的区间定位。在之前表征的高1*低1杂交中，显著性(LOD＞2.4)效应的范围为115.58-219.00ppm，并在染色体1、4和9上被发现(表4)。在新评价的高1*低1杂交中，使用低1的非-LY038形式，显著性(LOD＞2.4)效应的范围为121.44-364.34ppm，并在染色体3、4和8上检测到(表12)。

表12.在不包含LY038的低1转换对高1的杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

QTL	标记	染色体	位置	显著性	Fav亲本	效应
							1	NC0036685	1	45.8	0.0049	低1	-102
2	NC0077749	1	79.6	6E-05	高1	133.2
							3	NC0106296	1	181	0.0403	高1	67.99
5	NC0080705	2	68.5	0.0222	高1	75.98
							5	NC0009364	2	71.6	0.012	高1	83.34
6	NC0005467	2	94.3	0.0114	高1	82.95
							6	NC0108013	2	115.3	0.0052	高1	96.37
7	NC0009102	2	130	0.0098	高1	90.08
							10	NC0108727	3	77.4	0.0088	高1	90.74
12	NC0009473	3	168.4	0.0272	高1	75.65
							14	NC0002739	4	11.8	0.0399	高1	66.97
15	NC0019003	4	45.3	0.0002	高1	127.4
							15	NC0040371	4	67.8	0.0008	高1	112.7
16	NC0069570	4	92.4	0.0015	高1	108.1
							17	NC0036239	4	112.1	0.002	高1	107.3

QTL	标记	染色体	位置	显著性	Fav亲本	效应
							18	NC0054460	4	131.7	0.0015	高1	116.1
18	NC0030576	4	153.8	0.0032	高1	105
							26	NC0027095	6	38.8	0.0348	低1	-66.9
29	NC0021734	6	145.4	0.0406	高1	68.42
							31	NC0155829	7	99	0.0588	高1	-66.6
32	NC0034552	8	51.8	0.0522	高1	-54.1
							35	NC0012830	9	33.1	0.0068	高1	84.19
35	NC0027914	9	45	0.0007	高1	104.1
							35	NC0104195	9	68.5	0.0327	高1	72.72
36	NC0108275	9	91.6	0.0553	高1	67.51
							37	NC0020502	10	30.3	0.0203	高1	-74.8

还进行了其它的定位实验，其中赖氨酸转基因处于半合子条件。评价了在此被称为群体1-4的四个F2:F3群体，并与低2或高1进行杂交。来自分离系和纯合转基因赖氨酸测交系的测交后代在两个位点上进行评价。关于游离赖氨酸的标记基因型相关性的数据分析包括SAS中的单因素ANOVA和多元回归分析。由于一些群体在一个或多个染色体上存在单个标记，区间定位并未在所有的群体中完成。结果示于表13、14、15和16中。

表13.在群体1与高1测交的杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

QTL	标记	染色体	位置	显著性	效应
						23	NC0017678	5	103.8	0.0236	74.65
23	NC0016868	5	122.6	0.0248	74.2
						24	NC0143380	5	148.1	0.0416	-67.4
26	NC0106341	6	29.5	0.0482	-66.2

QTL	标记	染色体	位置	显著性	效应
						34	NC0108962	8	139.7	0.0435	-67.6

表14.在群体2与高1测交的杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

QTL	标记	染色体	位置	显著性	效应
						3	NC0038475	1	168.3	0.0194	65.309
5	NC0080705	2	68.5	0.0045	-86.78
						6	NC0021092	2	93.4	0.0031	-86.05
6	NC0105696	2	94.3	0.0122	-74.58
						6	NC0146130	2	94.6	0.0083	-78.99
12	NC0004371	3	164.2	0.0174	-72.87
						13	NC0112644	3	181.8	0.0477	-58.27
13	NC0143969	3	187.5	0.0097	-75.35
						21	NC0111388	5	66.6	0.0019	86.473
29	NC0021734	6	145.4	0.0409	60.545

表15.在群体3与高1测交的杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

QTL	标记	染色体	位置	显著性	效应
						2	NC0004176	1	116.3	0.0408	42.639
6	NC0053097	2	102.6	0.0167	-48.61
						6	NC0057210	2	104.1	0.0305	-44.49

QTL	标记	染色体	位置	显著性	效应
						11	NC0008900	3	97.6	0.0287	-43.2
11	NC0108089	3	106.3	0.0038	55.301
						11	NC0111959	3	117.6	0.0032	58.613
14	NC0002739	4	11.8	0.0209	45.248
						18	NC0070533	4	130.2	0.0218	-46.01
21	NC0111388	5	66.6	0.0229	48.783
						21	NC0143216	5	67.7	0.0082	-55.32
22	NC0146546	5	71.2	0.0198	51.257
						22	NC0040571	5	88.4	0.0006	-68.96
23	NC0012480	5	99.4	8E-05	77.314
						24	NC0036210	5	145.2	0.0005	-70.21
24	NC0104963	5	159.8	0.0009	-65
						25	NC0021585	5	175	0.0169	48.054
27	NC0067075	6	98.9	0.0015	68.252
						31	NC0148208	7	126.9	0.0339	45.265
35	NC0012830	9	33.1	0.0276	48.615
						35	NC0107905	9	63.4	0.0016	-67.34
35	NC0109526	9	66.5	0.0002	-80.14
						36	NC0013086	9	87.3	0.0081	54.565

QTL	标记	染色体	位置	显著性	效应
						36	NC0108275	9	91.6	0.0152	-49.3

表16.在群体4与高1测交的杂交体中，赖氨酸浓度的单核苷酸多态性标记相关的LY038转基因调节物QTL及其图谱位置。表明了位置、关联显著性和与阳性效应相关的等位基因。

QTL	标记	染色体	位置	显著性	效应
						4	NC0009701	1	207.9	0.0447	24.109
4	NC0015344	1	221.1	2E-05	53.089
						4	NC0002635	1	254.8	7E-08	62.67
5	NC0032200	2	71.6	2E-16	100.14
						6	NC0005467	2	94.3	1E-08	62.6
6	NC0151288	2	107.6	7E-10	70.406
						7	NC0031474	2	141.4	7E-06	51.529
8	NC0110974	2	185.5	0.0477	21.952
						16	NC0022725	4	91.3	0.0164	29.784
22	NC0156284	5	74.1	0.0151	-29.75
						23	NC0028110	5	90.2	0.0167	-28.68
27	NC0070996	6	81.9	0.0151	-27.27
						33	NC0015146	8	84	0.0409	24.173
33	NC0004504	8	95.6	0.0037	35.068

在半合子测交群体中检测到显著的效应。在四个群体的共同和排他性区域中都发现到累加效应。显著的单因素ANOVA效应的范围为35.06-100.14。在染色体2和染色体5上发现了效应的两个半合子群体的共同区域。

D.用于检测与转基因调控基因座相关的遗传标记的示例性方法

还可利用寡核苷酸通过基于杂交的SNP检测方法来检测或分型此处公开的与转基因调控基因座相关的多态性。提供了能够与包含多态性的分离的核酸序列杂交的寡核苷酸。本领域技术人员知道如何设计具有通过实验确定的严格性的分析，以区别在此所述的多态性的等位基因状态。示例性的分析包括DNA印迹法、RNA印迹法、微阵列、原位杂交和基于杂交的其它多态性检测方法。基于杂交的SNP检测中使用的示例性的寡核苷酸在表17中提供。通过使用本领域已知的方法，这些寡核苷酸可用放射性标记、荧光团或其它化学发光物质可检测地标记，以有助于检测与来自一种或多种植物的基因组或扩增的核酸样品之间的杂交。

表17.用于扩增和检测本发明的SNP的示例性寡核苷酸。对于类型，F＝正向引物，P＝探针，以及R＝反向引物。本领域技术人员知道通过使用在此描述的参考文献来设计用于此处所描述的其它多态性的类似的寡核苷酸，以及设计用于检测SNP的替代分析。

标记               SEQ

SEQ ID  标记       ID   类型     序列                           等位基因

10      NC0004504  177  F        TCCTACCAAAACGATCATAGATCAAG

10      NC0004504  178  P        CTACCAACGCAATCA                 C

10      NC0004504  179  P        ACCAAAGCAATCAT                  A

10      NC0004504  180  R        GACTGTTTTGGCAGGAACCATAC

29      NC0009818  181  F        CGGAGCTCTGTTTGTTGCG

29      NC0009818  182  P        TTTGCTCGGCATGC                  T

29      NC0009818  183  P        TTTGCACGGCATGC                  A

29      NC0009818  184  R        GCGCTATGTGGCGTCAGAA

37      NC0014417  185  F        AGGAGCTATAGCAGCAGCACACT

37      NC0014417  186  P        ACTCATCCCTTACTGCT               G

37      NC0014417  187  P        CTCATCCCTTATTGCT                A

37      NC0014417  188  R        TTCCACCTCCTCCTCATCCA

65      NC0027914  189  F        AAAGCAAAGCAAAAACACAACTGA

65      NC0027914  190  P        AGGAACCACATATGC                 A

65      NC0027914  191  P        AGGAACCACATGTGC                 G

65      NC0027914  192  R        GTCCTGACTATCCCTTTGTTTCTTG

71      NC0030985  193  F        TTGCCTTTTATTTCTCCCTTGATTT

71      NC0030985  194  P        ACGCCTTGTAGCTTA                 ***********

71      NC0030985  195  P        CCTTGTAGACTGTTCC                ACTGTTCCAAG

71      NC0030985  196  R        ACGCATTGTTTATCTTCATAATACTACCA

73      NC0031358  197  F        CAGGGTTTAGTCTGCAATCAGGTT

73      NC0031358  198  P        TGTTGTGTCAAAGGA                 *********

73      NC0031358  199  P        CATGTTGTCATTGTTG                CATTGTTGT

                                 CTATGGTAGTAGTATTTTTTCTTGTTATT

73      NC0031358  200  R        TTGTG

这是第一次尝试定位调控转基因性状的表达或表型表现的区域的遗传性。鉴定和表征了调控转基因性状的非常重要的区域。发现共同区域在评价的自交和测交群体中显著相关。这一方法鉴别了调控区域，并且用其改进任何转基因性状、更特别是该实施例中的赖氨酸转基因性状。用于鉴别转基因调控遗传元件的相关方法包括基因定位、连锁不平衡分析、传递不平衡检测、相同或相关生物合成途径中的关键调控酶的定向修饰和与一种或多种定位方法组合的转录体分析(profiling)。此处的和未来的方法可适用于编码内源编码的生物合成途径中的产物和/或与宿主植物生理学相作用的任何转基因。

E.用于做出与转基因调控基因座相关的育种决定的替代标记。

如已经提到的，表型和遗传标记可用于鉴别转基因调控基因座以及做出关于转基因调控基因座的育种决定。在另一个实施方案中，代谢物可用作标记。一方面，评价不同的组织的至少一种代谢物的概况。在一个优选方面，采样表达至少一种转基因事件的组织。例如，通过采样根组织来评价玉米根虫转基因的相关的代谢标记，且在种子组织中评价谷物性质性状。在另一方面，评估了不同的发展阶段。使用本领域已知的方法制备将要分析的组织，并使用本领域已知的技术(即GC-MS或HPLC)分析该组织。对代谢物概况进行打分，将其作为“标记”进行分析，并且针对群体结构和相应的表型数据进行分析，以使用在此公开的方法鉴别与目的表型(即转基因表现)相关的可遗传的代谢标记。本发明预期这种方法可用来评价2种或更多种事件、和/或两份或更多份种质、和/或2个或更多个转基因(即集合)。

实施例2

遗传背景对性状表现的影响的评价

杂种育种程序的主要目标为通过互补杂交使产率达到最大。导致产率优势的来自不同种质库的杂交体构成了杂种优势群。鉴别杂种优势群有助于杂交体的产率优势。在近交系发展的过程中，选出的近交系与不同的测交系进行杂交，以确定近交系如何在杂种组合中发挥作用。单杂交的效应反映了特殊配合力(SCA)，近交系在与不同测交系(通常在多个位点处)多次杂交中的影响反映了一般配合力(GCA)。

在包含一种或多种转基因性状的杂种育种程序的情况中，评价性状在不同的杂种背景中的配合力可能是有用的。本发明提供了评价“转基因配合力”的方法，及其在观察到性状表现差异时做出育种决定中的应用，其可与杂交的方向、亲本、哪个亲本具有性状和/或转基因的拷贝数相关。

在本实施例中，评价了具有已知的变异的转基因，以确定遗传背景对转基因表现的影响。在与40种不同的“测交系”杂交的赖氨酸转换(“性状亲本”)的不同遗传背景中评价转基因性状表现，以评价LY038在F2谷物中的效力。在该分析中分析了三个“性状亲本”；两个“性状亲本”为近交系转换(高1和低2)，一个为两个近交系转换的杂种(表18)。赖氨酸“性状亲本”与非转基因“测交系”进行杂交，用于检测F1谷物中的LY038效力。两个近交系转换被评价为效力测试(高1和低2)的部分和两个近交系转换的杂种。转换和杂种与代表23个雄性和17个雌性系的40个非转基因测试近交系进行正反交。因此，评价了包括正反交体的240个杂交体。大约四分之一的杂交为重复的。评价了F1谷物的50个谷粒的赖氨酸。

表18.使用三种转基因测交系评价LY038在遗传背景中的表现的实验设计。

对数据进行ANOVA，以评价混合模型中亲本、杂交、测交系和杂种优势群对赖氨酸水平的作用(设计示于表19)。

表19.ANOVA设计、自由度(DF)和F检验。

来源	DF	DF	F检验
				性状亲本	2	TP-1	TP_MS/TP*HG MS
杂种优势群	1	HG-1	HG_MS/TP*HG_MS
				性状亲本*杂种优势群	2	TP-1*HG-1	TP*HG_MS  /CD-1*TP-1*HG-1
杂交方向	1	CD-1	CD_MS/CD*TPMS

来源	DF	DF	F检验
				杂交方向*性状亲本	2	CD-1*TP-1	CD*TPI_MS  /CD*TPI*HGMS
杂交方向*杂种优势群	1	CD-1*HG-1	CD*HG_MS  /CD*TP*HG_MS
				杂交方向*性状亲本*杂种优势群	2	CD-1*TP-1*HG-1	CD*TE*HG_MS  /MSE
测试近交系(杂种优势群)	38	HG(TI-1)	TI(HG)_MS/CT*TI(HG_MS)
				性状亲本*测试近交系(杂种优势群)	76	TP-1*HG(TI-1)	TI(HG)_MS/CD-1*TP-1*HG(TI-1)
杂交方向*测试近交系(杂种优势群)	38	CD-1*HG(TI-1)	TI(HG)_MS/CD-1*TP-1*HG(TI-1)
				杂交方向*性状亲本*测试(近交系杂种优势群)	76	CD-1*TP-1*HG(TI-1)	CD-1*TP-1*HG(TI-1)/MSE

结果表明使用的“性状亲本”为控制赖氨酸效力的最显著的因素(表20)。平均值范围为：低2近交系＝339.6；高1近交系＝872.9；高1*低2杂种＝897.4。

表20.根据测试近交系，性状亲本的正反交的Proc GLM方差分析。

来源	DF	平方	均方	F	P-值
						性状亲本	2	18680835.15	9340417.57	27.70	＜.0001
杂种优势群	1	1840070.85	1840070.85	5.45	＜.010
						性状亲本*杂种优势群	2	674250.14	337125.07	0.25	ns
杂交方向	1	60319.29	60319.29	0.045	ns
						杂交方向*性状亲本	2	2673787.37	1336893.68	23.74	＜.0001
杂交方向*杂种优势群	1	1321063.31	1321063.31	23.46	＜.0001
						杂交方向*性状亲本*杂种优势群	2	112611.01	56305.51	0.887	ns

来源	DF	平方	均方	F	P-值
						测试近交系(杂种优势群)	38	8749843.13	230259.03	4.535	＜.0001
性状亲本*测试近交系(杂种优势群)	76	3858451.52	50769.1	1.344	ns
						杂交方向*测试近交系(杂种优势群)	38	4172015.08	109789.87	2.90	＜.0001
杂交方向*性状亲本*测试(近交系杂种优势群)	76	2870094.09	37764.4	0.595	ns
						总数/MSE		48756263.43	63439.36

一般而言，高1近交系和大多数雌性杂种优势群具有更加有效的种质，低2近交系的效力较低(表21)。低2的降低的效力似乎与基础种质(从“性状亲本”和“测试近交系”的影响看出)和受损的母本相关因素相关，当使用该种系作为雌性时，该因素特别是未达最佳的。这种母本相关的因素的可能的解释包括胚生理学、细胞质或印迹(imprinting)。

表21.根据杂交方向，性状亲本和测试近交系的杂种优势群的组平均值。

性状亲本、测试近交系的杂种优势组和杂交方向雌性X雄性	数目	Proc GLM赖氨酸ppm(标准差)	Proc混合赖氨酸ppm(标准误)	Proc混合组P＜(0.05)
					雄性杂种优势群+低2	22	438(264)	436.45(61)	F
雌性杂种优势群+低2	24	371(178)	390.52(64)	FG
					低2+雄性杂种优势群	27	224(95)	237.53(59)	G
低2+雌性杂种优势群	23	319(71)	324.72(63)	FG
					雄性杂种优势群+高1	31	870(429)	839.71(58)	CD
雌性杂种优势群+高1	23	924(251)	923.79(63)	BC
					高1+雄性杂种优势群	27	642(250)	656.19(59)	E
高1+雌性杂种优势群	23	1050(380)	1055.41(63)	B
					雄性杂种优势群+(高1+低2)	24	683(370)	703.11(58)	E

性状亲本、测试近交系的杂种优势组和杂交方向雌性X雄性	数目	Proc GLM赖氨酸ppm(标准差)	Proc混合赖氨酸ppm(标准误)	Proc混合组P＜(0.05)
					雌性杂种优势群+(高1+低2)	25	781(312)	787.09(62)	DE
(高1+低2)+雄性杂种优势群	27	843(268)	856.97(59)	CD
					(高1+低2)+雌性杂种优势群	23	1219(275)	1224.96(63)	A
平均值		697.5(261.5)

本发明还进一步预期，杂交方案可在位置和环境条件中运行，以评价产品概念所需的位置效应和环境效应。

实施例3

转基因调控基因座的育种

在本实施例中，提供了育种活动来评价转基因表现的变异是否是由于遗传背景造成的。一方面，进行了实验研究，其中通过QTL定位和/或使用分离群体的关联性研究方法确定转基因调控基因座的显著关联性。其它关联性研究方法是本领域已知的。

另一方面，使用历史标记基因型数据和性状表型数据鉴别转基因调控基因座。在另一方面，来自定位群体的历史数据和实验数据都被用于鉴别转基因调控基因座。

与这些基因座相关的标记可用于标记辅助选择程序中，以将至少一个转基因调控基因座积累到至少一种目的玉米近交系中，从而发展带有LY038转基因的优良玉米杂种。在近交系和/或杂种发展过程中，与LY038调控基因座相关的至少一个标记等位基因被用作各代中选择决定的基础。

选择决定可基于对于或针对特定的转基因调控基因座的选择。转基因调控基因座的标记基因型信息可用作确定在育种杂交中使用的大豆变种的基础。此外，与一个或多个转基因调控基因座相关的标记将有助于将一个或多个这样的基因组区域渗入到缺乏该转基因调控基因座的变种中，即具有高农学表现的优良变种。

标记等位基因可包括SNP等位基因、单元型、特定转录模式和特定的核酸序列。此外，可以确定标记等位基因与次要性状之间的关联性，次要性状可以为选择决定提供基础。次要性状包括代谢模式、营养组成模式、蛋白质表达模式和表型特征，例如穗的高度或植物高度。

此外，用于优选的转基因配合力的杂交方案可通过评价正反交和LY038拷贝数对性状表现的影响进行确定。来自种质库的后续杂交体可通过这些初始研究得到信息，使用该信息也能够做出对于优选的LY038产品概念的育种决定。例如，这一信息将会告知当性状化时哪个杂交亲本将会在产品概念上发挥作用，以及要使用多少拷贝数来实现该产品概念。本发明还预期，杂交方案可在位置和环境条件中运行，以评价产品概念所需的位置效应和环境效应。

当产品概念还包括其它转基因性状时，可以进行关联性研究来确定一份或多份种质中的遗传背景中的其它基因座是否调控一个或多个转基因的表现。为了发展与产品概念一致的种质，如上所述确定显著的相互作用，并且使用标记(例如遗传标记或次要性状)作为上述选择的基础。

实施例4

应用转基因测交系评价优选的遗传背景中的至少一种转基因事件

本发明提供了用于评价多个种质背景中至少一种转基因事件的表现的替代方法，包括评价杂种农作物中雄性和雌性种质中的拷贝数影响和表现。此外，本发明使用了转基因测交系来有助于这一测试，而不一定需要缺乏至少一种转基因事件的种质的转基因转换。

对于具有“数量”表型(例如产率或应激耐受性)的转基因，确定特定的转基因事件是否在特定的遗传背景中表现更好是有用的。不幸的是，传统的性状整合依赖回交，然后再经过多代选择来恢复轮回亲本。为了快速评价特定的遗传背景是否在杂种农作物中显示出改进的或优选的转基因表现，新型方法为使杂交系与转基因测交系进行杂交，然后再对杂种植物进行表现评价。这一方法还可用于评价转基因拷贝数对转基因表现的影响。这一方法还可与转基因调控基因座的选择和渗入一起使用。这一方法将会减少转换的近交系的数量，因此降低了调控样地的数量，从而减少了转基因育种这一方面的资源分配。

种质基础和环境条件可以调控转基因表达，例如应激耐受性和谷物产率之间的关联性的情况。例如，基础种质中的次要性状具有增大带有耐旱性转基因的特定种质表现更好的几率的潜力。具体而言，热应激耐受性和应激下ASI(花期抽丝间隔)的降低需要与耐旱性性状配合。因此，确定一种或多种转基因事件是否与特定的背景相作用是有用的，以及如果相作用的话，确定具有最佳表现的背景和事件是有用的。同样，本发明还预期，杂交方案可在位置和环境条件中运行，以评价产品概念所需的位置效应和环境效应。

例如，为了确定优选的遗传背景的转基因事件，11个BC2F3近交系用于评价转基因表现。此外，选择常规系来扩大评估的杂种优势群。本发明预计更少或更多的种质可通过这些方法进行评价，在此选择的种质份的数目仅用于说明的目的。

这一方法检测了纯合、半合子(在杂交的两侧组合)和无效的杂种。这一方法可用于评价杂种优势群间和正反交中的转基因表现。使用大批BC2F2产生了杂交体，并产生了大穗的轮回亲本百分比的基因型数据。此外，可以使用检测启动子存在的分析来测量转基因的等位基因频率。如果使用BC2F3，可以包括来自性状转换的负等值线(negative isoline)作为检查对照。相关分析包括：1)量化和比较特定的种质背景与至少一种转基因之间的相互作用；2)获得所有雄性和雌性近交系的平衡的转基因配合力估计值；3)比较纯合的、半合子的(在杂交的两侧组合)和无效形式的杂种的转基因表现；4)估计转基因表现与相关的农学性状之间的关系。

尽管其它方法也是可能的，在此描述的方法使用了平衡的配对设计。表22显示了双列杂交方案。可选的杂交设计示于表23和表24中。在这些杂交方案中的任一个中，可以评价其中一个、两个或没有亲本带有一个或多个转基因的杂交。特别地，表24向单一背景中引入了两份，其中一个形式为转基因的，另一个为常规的或是转基因的但是缺乏至少一个所评价的转基因。

表22.双列实验。双列实验的杂交方案，其中杂交数＝p(p-1)/2，正反交＝p(p-1)。评价中保持各基因型的自交，并获得了来自GCA和SCA的加性方差的估计值。X＝杂交，S＝自交，和R＝正反交。正反交使得能够评价母本的影响。因此，双列设计使得能够进行杂种优势群内杂交和评价自交。

表23.设计II实验。获得的遗传信息与双列实验类似。使用不同组亲本作为雄性和雌性；特别地，相同的杂交数可以包括是双列实验的两倍的亲本。与双列实验类似，获得了加性方差的两个估计值(雄性和雌性)。

表24.14x14设计II实验。在这个14x14杂交设计中包括28个亲本，但是代表18个近交系背景(9个雄性和9个雌性)，其中“+”表示转基因形式，“-”表示相同近交系的非转基因形式。这一方法包括196个杂交，与自交或杂种优势群内杂交无偏差，在25列x12范围检验中有288份。

分析包括确定性状化近交系对比常规近交系的配合力影响，以及不同的杂种优势群间的平衡比较。通过确定至少一个目的转基因的关键的遗传背景，对于具有表现变异的性状，转基因育种活动可涉及最佳遗传背景。此外，对于具有表现变异的转基因，在育种程序结束之前评价遗传背景的影响可以通过降低待转换的种系的数目、控制样地的数目和最终产生优良的转基因产物使得育种程序更加经济。

实施例5

用于在大豆中选择优选的种质-转基因组合的转基因调控基因座的定位

当使用具有定量表型的转基因进行育种时，确定某些遗传背景是否将会显示优选的转基因表达是有用的。在此，对于大豆中的产量转基因概述了这一方法。

使用常规的回交方法或正向育种将转基因育种到遗传学不同的(即分离的)大豆群体中。形成为转基因无效的(作为对照)、半合子的和纯合的转基因群体。使群体生长，对转基因表现和附加的农学性状进行表型分型。此外，使用以20cM的间隔在整个基因组中分布的多个标记对种系进行基因型分型。在一优选方面，标记以5-20cM的间隔分布。在一更优选方面，标记以0-8cM的间隔分布。

在另一方面，使用历史标记基因型数据和性状表型数据鉴别转基因调控基因座。在另一方面，来自定位群体的历史数据和实验数据都被用于鉴别转基因调控基因座。

接下来，通过使用例如ANOVA、MAPMAKER/QTL、基因和本领域已知的其它相关性研究方法等方法分析基因型和表型数据，分析特定基因座至少与转基因表现之间的关联性。

接下来，转基因调控基因座的显著关联性(即LOD大于2，p值小于0.05)可在这些基因座分离的大豆群体中确认。与这些基因座相关的标记可在标记辅助的选择程序中使用，从而将至少一个转基因调控基因座积累到至少一个目的大豆变种中，用于发展优良的转基因大豆变种。

在变种发展过程中，与转基因调控基因座相关的至少一个标记等位基因可用作每代的选择决定的基础。选择决定可基于对于或针对特定的转基因调控基因座的选择。转基因调控基因座的标记基因型信息可用作确定在育种杂交中使用的大豆变种的基础。此外，与一个或多个转基因调控基因座相关的标记将有助于将一个或多个这样的基因组区域渗入到缺乏该转基因调控基因座的变种中，即具有高农学表现的优良变种。

标记等位基因可包括SNP等位基因、单元型、特定的转录模式和特定的核酸序列。此外，可以确定等位基因与次要性状之间的关联性，次要性状可以为选择决定提供基础。次要性状包括代谢模式、营养组成模式、蛋白质表达模式和表型特征，例如豆荚的颜色或植物高度。

当产品概念还包括其它转基因性状时，可以进行关联性研究来确定一份或多份种质中的遗传背景中的其它基因座是否调控一个或多个转基因的表现。在另一方面，可以在位置和环境条件下进行测试，以评价产品概念所需的位置效应和环境效应。如上所述确定显著的相互作用，并且使用例如遗传标记或次要性状等标记作为上述选择的基础，以发展与产品概念一致的种质。

实施例6

定位与基因抑制构建体相关的转基因调控基因座的方法

本发明进一步预期到，基因抑制构建体可受转基因调控基因座的影响。下面的方法提供了用于选择能够抑制α-玉米醇溶蛋白基因的DNA构建体的转基因调控基因座的方法和组合物，如分别于2008年3月31日和2008年4月1日提交的美国专利申请61/041035和61/072633中提供的。

一方面，当包含提供减少的α-玉米醇溶蛋白储存蛋白含量的转基因或其它基因座时，玉米种子的某些基因型显示出不透明的谷粒表型。可以提供减少的α-玉米醇溶蛋白储存蛋白含量的多种转基因可用于降低一个或多个内源α-玉米醇溶蛋白基因的表达。特别适合抑制19-kD和22kD α-玉米醇溶蛋白基因的DNA构建体在公开号为2006/0075515的美国专利申请中公开。仅抑制19-kDα-玉米醇溶蛋白的DNA构建体在公开号为2006/0075515的美国专利申请中描述。

在本实施例中被称为“不透明调节基因座”的转基因调控基因座可以将玻璃质表型恢复为不透明的玉米种子，包括遗传标记和种质来源，在美国专利申请61/041035和61/072633中提供。一个或多个不透明调节基因座可从多种玉米种质来源获得，包括但不限于杂种、近交系、部分近交系或限定的或未限定的群体的成员。以高谷粒密度为特征的种质为不透明调节基因座的一个来源。特征为种子密度至少为大约1.24克/毫升的种质被认为具有高谷粒密度。某些近交系还显示包含一个或多个不透明调节基因座，这些基因座单独作用或组合作用，以在α-玉米醇溶蛋白储存蛋白含量减少的不透明种子上恢复玻璃质表型。在实施本发明的方法中，包含减少α-玉米醇溶蛋白储存蛋白含量的转基因的玉米系通常与遗传学上不同的玉米系进行杂交。应当理解，在本发明的方法中，包含转基因的玉米系和遗传学上不同的玉米系可各自作为花粉供体或花粉受体。

可用作本发明的一种或多种不透明调节基因座的来源的玉米种质还可通过使用分子标记进行鉴别。更特别地，与美国专利申请61/041035和61/072633中鉴别的分子标记连接的不透明调节基因座可通过确定特定种质是否包含与连接的不透明调节基因座相关的标记的等位基因来鉴别。

进一步预期，将玻璃质表型恢复为不透明的种子并且与分子标记连接的不透明调节基因座可与不会导致玻璃质表型恢复的来源种质中存在的其它基因座分开。不透明调节基因座与其它不需要的基因座的分离可以通过分子育种技术完成，其中使用了来自来源种质的不需要的基因区域的其它标记。因此预期包含一个或多个不透明调节基因座的种子可以仅包含一个基因座或多个基因座、也可以包含一个或多个基因座以及相关的分子标记。

一旦获得了包含不透明谷粒表型和减少α-玉米醇溶蛋白储存蛋白表达的转基因的玉米系与遗传学上不同的玉米系之间杂交的后代，选择包含玻璃质谷粒表型和能够减少α-玉米醇溶蛋白储存蛋白含量的转基因的种子。选择这样的种子可通过多种方式进行。玻璃质表型通常可以通过目视筛选进行选择。将杂交种子置于光源上有助于这一目视筛选。还可以通过其它方法完成玻璃质表型的选择，包括但不限于选择密度增加的种子。密度可通过多种方法进行确定，包括但不限于近红外透射(NIT)。进一步预期，本文还涉及基于密度、透光率或其它物理特征筛选和选择玻璃质种子的手工、半自动化或全自动化方法。

另一方面，美国专利申请61/041035和61/072633中提供了用于使在缺乏调节基因座时显示不透明表型的玉米种子谷粒具有玻璃质表型的一个或多个不透明调节基因座的遗传标记和方法。

标记辅助的渗入包括将由一个或多个标记限定的染色体区域从一个种质转移到第二种质中。该方法中的第一步骤为之前描述的不透明调节基因座的基因定位。当作为QTL(数量性状基因座)的不透明调节基因座已被定位在分子标记附近时，那些标记可用于选择性状的改良值，而不需要在每个选择循环中进行表型分析。可与由不透明调节物赋予的玻璃质表型相关的数值包括但不限于透光率测量值或密度确定值。在标记辅助的育种和标记辅助的选择中，最初使用历史上的或新的基因型和表型数据通过基因定位分析建立QTL与标记之间的关联性。

分子标记也可用于加速不透明调节基因座向新的遗传背景(即不同范围的种质)中的渗入。简单的基因渗入包括将不透明调节系与α-玉米醇溶蛋白含量减少的不透明系进行杂交，然后反复地将杂种与不透明系(轮回)亲本进行回交，同时针对不透明调节基因座的保持进行选择。经过多个回交代，原始的不透明调节系的遗传背景通过重组和分离逐渐被不透明系的遗传背景替代。这一方法可通过在来自轮回亲本的分子标记等位基因上进行选择而加速。

或者，赋予不透明表型(和减少的α-玉米醇溶蛋白含量)的转基因可被基因渗入到包含一个或多个不透明调节物的优良近交系的遗传背景中。简单的基因渗入包括将转基因系与具有不透明调节物的优良近交系杂交，然后反复地将杂种与优良近交系(轮回)亲本进行回交，同时针对转基因和不透明调节基因座(即α-玉米醇溶蛋白含量减少时的玻璃质表型和/或连锁的转基因性状)的保持进行选择。在某些实施实施方案中，转基因与可选择或可打分的标记基因的连锁中可进一步有助于转基因向优良近交系的遗传背景中的渗入。经过多个回交代，原始的转基因系的遗传背景通过重组和分离逐渐被不透明系的遗传背景替代。这一方法可通过在来自轮回亲本的分子标记等位基因上进行选择而加速。

Claims (41)

1.一种用于确认植物基因型与一种或多种转基因性状的表现的关联性的方法，包括：

筛选显示至少一种转基因事件的遗传变异的多份转基因种质，其中该遗传变异与至少一种基因型相关联；和

将来自这些转基因种质的至少一种基因型与至少一种转基因事件相关联。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种基因型包含选自遗传标记、单元型、核酸序列、转录模式、代谢模式、营养成分组成模式、蛋白质表达模式和表型特征中的至少一种标记。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种基因型包含具有物理和/或基因图谱位置的至少一种遗传标记，其中调控至少一种转基因事件之表现的至少一个染色体区域被确认。

4.根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括基于所述至少一种基因型与所述至少一种转基因事件之表现的关联性来做出植物育种决定。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物育种决定包括：

基于调控转基因事件表现的至少一种基因型的存在来选择至少一份种质；

使用选择的种质进行育种活动；和

经育种活动产生后代种子及其植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述种质是基于相对于在转基因测交系中测量的事件表现能够提高转基因事件表现的基因型的存在而选择的。

7.根据权利要求5所述的方法，其中选择的种质用于进行育种杂交。

8.根据权利要求5所述的方法，其中选择的种质作为供体用于将基因组区域渗入到至少一份受体种质中。

9.根据权利要求6所述的方法，其中选择的种质与表达一种或多种转基因事件的转基因测交系杂交，以评价性状化的杂种。

10.根据权利要求6所述的方法，其中多份选择的种质与一种或多种转基因测交系杂交，以积累用于评价事件表现的多种性状化的杂种。

11.根据权利要求6所述的方法，其中该方法进一步包括在选择的种质中诱导单倍体化；使单倍体种质加倍，以产生对于与转基因事件的表现相关的至少一种基因型而言固定的等基因群体。

12.根据权利要求6所述的方法，其中选择的种质用于性状整合活动。

13.根据权利要求12所述的方法，其中该方法进一步包括

将选择的种质与转基因供体回交；和

进行轮回选择步骤。

14.根据权利要求12所述的方法，其中该方法进一步包括正向选育所选择的种质。

15.根据权利要求13所述的方法，其中该方法进一步包括选择所述育种活动的后代种子或植物，来确定基因型中的一种或多种和一种或多种转基因事件的组合，其中该组合调控该种子或植物中所述转基因事件的表现。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为选自玉米(Zeamays)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium hirsutum)、花生(Arachis hypogaea)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa)；野茅(Dactylis glomerata)、水稻(Oryza sativa，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)变种)、高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharumsp)、高羊茅(Festuca arundinacea)、草皮草物种(例如物种：四季青(Agrostis stolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、钝叶草(Stenotaphrum secundatum))、小麦(Triticum aestivum)、苜蓿(Medicago sativa)、芸苔属的成员、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆、茄子、茴香、青刀豆、葫芦、韭菜、莴苣、甜瓜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、萝卜、菠菜、笋瓜、甜玉米、西红柿、西瓜、观赏植物以及其它水果、蔬菜、块茎和块根农作物的农作物。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因事件选自除草剂耐受性、抗病性、昆虫或害虫抗性、改变的脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢、提高的谷物产量、增加的油、增加的营养含量、增加的生长速度、增强的应激耐受性、优选的成熟度、增强的感官特性、改变的形态特征、不育性、其它农学性状、用于工业应用的性状或用于提高消费者吸引力的性状。

18.一种确认具有调控转基因性状的表现的基因型的植物种质的方法，该方法包括：

将至少两份种质与包含至少一种转基因性状的测试种质进行杂交；

评价各杂交的后代中至少一种转基因性状的表现。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，在至少一种条件不同的至少两种测试环境中评价杂交后代中至少一种转基因性状的表现。

20.根据权利要求18所述的方法，其中该方法包括将至少两份种质与包含至少一种转基因性状的多份测试转基因种质进行杂交。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多份测试转基因种质包含至少两种转基因性状的集合。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述多份测试转基因种质选自测交系、近交系和杂种。

23.根据权利要求20所述的方法，其中在正反交中评价种质。

24.根据权利要求18所述的方法，其中该方法包括评价不同拷贝数对至少一种转基因性状的影响。

25.根据权利要求18所述的方法，其中所述转基因性状被调控的表现相对于测试转基因种质中测量的性状的表现有提高。

26.根据权利要求18所述的方法，其中该方法进一步包括在植物育种活动中使用与转基因性状被调控的表现相关的植物种质。

27.根据权利要求26所述的方法，其中植物育种活动包括将至少一份优选的种质与具有至少一种转基因性状的种质进行杂交。

28.根据权利要求26所述的方法，其中植物育种活动包括杂交至少两份种质以积累至少两种对于至少一种转基因的表现而言优选的基因型，然后再与含有该至少一种转基因的种质进行杂交。

29.根据权利要求26所述的方法，其中植物育种活动包括将含有至少一种转基因的至少一份优选的转基因种质与含有至少一种转基因的种质进行杂交。

30.根据权利要求26所述的方法，其中植物育种活动包括杂交至少两份优选的转基因种质以积累至少两种对于至少一种转基因的表现优选的基因型，然后再与含有至少一种转基因的转基因种质进行杂交。

31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中杂交产生具有一种或多种转基因性状的杂种种子或植物，其中所述性状的表现在所述种子或植物中得到调控。

32.根据权利要求18所述的方法，其中所述植物种质为选自玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium hirsutum)、花生(Arachis hypogaea)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avenasativa)、鸭茅(Dactylis glomerata)、水稻(Oryza sativa，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)变种)、高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum sp)、高羊茅(Festuca arundinacea)、草皮草物种(例如物种：四季青(Agrostis stolonifera)、草地早熟禾(Poapratensis)、钝叶草(Stenotaphrum secundatum))、小麦(Triticumaestivum)、苜蓿(Medicago sativa)、芸苔属的成员、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆、茄子、茴香、青刀豆、葫芦、韭菜、莴苣、甜瓜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、萝卜、菠菜、笋瓜、甜玉米、西红柿、西瓜、观赏植物以及其它水果、蔬菜、油籽、饮料、森林、块茎和块根农作物的农作物。

33.根据权利要求18所述的方法，其中所述转基因性状选自除草剂耐受性、抗病性、昆虫或害虫抗性、改变的脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢、提高的谷物产量、增加的油、增加的营养含量、增加的生长速度、增强的应激耐受性、优选的成熟度、增强的感官特性、改变的形态特征、不育性、其它农学性状、用于工业应用的性状或用于提高消费者吸引力的性状。

34.含有确认为调控转基因事件之表现的至少一个基因组区域的植物、种子或其部分。

35.含有提高两种或更多种转基因的表现的至少一个基因组区域的植物、种子或其部分。

36.一种将至少一个转基因调控基因座渗入到植物中的方法，包括：

将至少一个第一植物与至少一个第二植物进行杂交以形成群体，

对该群体中的至少一个植物在选自SEQ ID NO：1-176的基因组核酸标记方面进行基因分型，以及

从该群体中选择至少一个包含至少一种选自SEQ ID NO：1-176的核酸分子的植物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中该基因型是基于选自单碱基延伸(SBE)、等位基因特异性引物延伸测序(ASPE)、DNA测序、RNA测序、基于微阵列的分析、通用PCR、等位基因特异性延伸、杂交、质谱法、连接、延伸-连接和Flap核酸内切酶介导的分析的分析方法确定的。

38.根据权利要求36所述的方法，进一步包括将步骤(c)中选择的植物与另一植物进行杂交的步骤。

39.根据权利要求36所述的方法，进一步包括从步骤(c)中选择的植物获得种子的步骤。

40.一种通过以下步骤产生的优良植物：

a)将至少一个含有选自SEQ ID NO：1-176的核酸分子的第一植物与至少一个第二植物进行杂交以形成群体，

b)对该群体中的至少一个植物在选自SEQ ID NO：1-176的基因组核酸标记方面进行基因分型，和

c)从该群体中选择至少一个包含至少一种选自SEQ ID NO：1-176的核酸分子的植物。

41.一种用于检测转基因调控基因座的基本上纯化的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO：1-176及其互补序列的核酸分子。