CN101808503A - 在农作物中引入多种基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于在农作物中整合两种或多种遗传因子的基于单倍体的育种方法。

Description

在农作物中引入多种基因的方法

申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2007年8月29日提交的美国临时申请60/968,666的优先权，该临时申请的全部公开内容在此引入作为参考。

发明领域

本发明属于植物育种领域。更具体地说，本发明涉及在农作物中有效引入两种或多种遗传因子的方法。

发明背景

将转基因性状整合到植物中的传统方法涉及回交育种策略。但是，由于出现了每个植物引入多种转基因的产品概念，需要新的方法来以及时的方式产生包含多种或“堆积的(stacked)”性状的种子。回交方法的两种变化形式是已知的，涉及使用多转基因供体，然后回交，并对所有性状和轮回亲本进行选择，或者堆叠(pyramiding)，即启动和继续使用单转基因供体的多个单转基因程序，直到产品概念的所有转基因性状都得到满足。这两种方法都需要大量的时间和可能的大样本大小，来确保恢复所有转基因和与轮回亲本等价。模拟研究提示这些回交方法可能需要8-9代才能产生引入四种转基因性状的4-堆积产品。因此，本领域需要缩短使堆积转基因性状杂种上市所需的时间，以及提供减少产生包含两种或多种转基因性状的优良农作物所需的样地数目的可能性。

发明概述

本发明涉及在农作物中整合两种或多种遗传因子的基于单倍体的育种系统和方法。

在一个实施方案中，本发明提供一种将至少两种遗传因子引入至少一个植物中的方法。该方法包括使包含至少两种遗传因子的供体植物与该至少一个植物杂交，以获得多个后代植物。该多个后代植物与单倍体诱导系(inducer line)杂交，以产生包括单倍体后代的诱导的后代。然后从诱导的后代中选择单倍体后代，并根据是否存在所述至少一种遗传因子的至少一种标记和所述至少一个植物的基因组的至少一种标记进行筛查，其中可以根据筛查结果选择优选的单倍体后代。

本发明包括一种农作物育种方法，所述农作物例如是玉米(Zeamays)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium hirsutum)、花生(Arachis hypogaea)、大麦(Hordeum vulgare)；燕麦(Avenasativa)；鸭茅(Dactylis glomerata)；水稻(Oryza sativa，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)变种)；高粱(Sorghum bicolor)；甘蔗(Saccharum sp)；高羊茅(Festuca arundinacea)；草皮草物种(例如物种：四季青(Agrostis stolonifera)、草地早熟禾(Poapratensis)、钝叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(Triticumaestivum)、苜蓿(Medicago sativa)、芸苔属的成员、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆、茄子、茴香、青刀豆、葫芦、韭菜、莴苣、甜瓜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、萝卜、菠菜、笋瓜、甜玉米、西红柿、西瓜、观赏植物以及其它水果、蔬菜、块茎和块根农作物，遗传因子包括至少一种感兴趣的表型，进一步限定为赋予选自下组的优选特性：除草剂耐受性、抗病性、昆虫或害虫抗性、改变的脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢、提高的谷物产量、增加的油、增加的营养含量、增加的生长速度、增强的应激耐受性、优选的成熟度、增强的感官特性、改变的形态特征、不育性、其它农学性状、用于工业应用的性状或用于提高消费者吸引力的性状。

发明详述

本文提供的定义和方法限定本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，应当根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。在分子生物学中的常用术语的定义也可以在以下文献中找到：Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第3版，Garland Publishing，Inc.：New York，1994；Rieger等人，Glossary ofGenetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；和Lewin，Genes IX，Oxford University Press：New York，1994。使用如37CFR§1.822所述的DNA碱基命名法。

“等位基因”是指特定的基因座处的替代序列；等位基因的长度可以小到1个核苷酸碱基，但通常较大。等位基因序列可以表示为核酸序列或由该核酸序列编码的氨基酸序列。

“基因座”是在通常由参照点发现的基因组序列上的位置；例如，作为基因或基因部分或基因间区域的短DNA序列。基因座可以指染色体上参照点处的核苷酸位置，例如距染色体末端的位置。对于特定基因组已知的基因座的顺序列表被称为遗传图谱。给定基因座处DNA序列的变体被称为等位基因，基因座处的变异，即两个或多个等位基因，构成多态性。任何核酸序列的多态性位点可以通过比较两份或多份种质中一个或多个基因座处的核酸序列来确定。

如本文所用的“核酸序列”包括基因组内基因座处的核苷酸的连续区域。基因座是染色体上固定的位置，并且可以代表基因组区域内的一个核苷酸、少数核苷酸或大量核苷酸。对于特定基因组已知的基因座的顺序列表被称为遗传图谱。给定基因座处DNA序列的变体被称为多态性。任何核酸序列的多态性位点可以通过比较两份或多份种质中一个或多个基因座处的核酸序列来确定。

如本文所用的“多态性”是指在一个或多个个体的群体中在一个或多个基因座处存在核酸序列的一种或多种变异。变异可以包括但不限于一个或多个碱基的变化、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性的产生可能是由于核酸复制中的随机过程，通过诱变，由于移动的基因组元件，拷贝数变异，和减数分裂过程，如不等交换、基因组复制和染色体断裂和融合。在群体中，变异可能经常被发现或可能以低频率存在，前者在普通植物育种中具有更大的应用，而后者则可能与罕见但重要的表型变异有关。有用的多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性以及标签SNP。遗传标记、基因、DNA衍生序列、单元型、RNA衍生序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、microRNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录模式以及甲基化模式可能包括多态性。另外，上述这些的存在、不存在或拷贝数的变化可能包括多态性。

如本文所用的术语“单核苷酸多态性”，也缩写为“SNP”，是指单个位点上的多态性，其中，所述多态性构成单碱基对改变、一个或多个碱基对的插入或一个或多个碱基对的缺失。

如本文所用的“标记”是指可用于区别生物体的可检测的特征。这样的特征的例子可包括遗传标记、蛋白质组成、蛋白质水平、油组成、油水平、碳水化合物组成、碳水化合物水平、脂肪酸组成、脂肪酸水平、氨基酸组成、氨基酸水平、生物聚合物、药品、淀粉组成、淀粉水平、可发酵的淀粉、发酵产量、发酵效率、能量产量、次生化合物、代谢物、形态特征和农艺学特征。如本文所用的“遗传标记”是指多态性核酸序列或核酸特征。

如本文所用的“标记分析”指使用特定方法检测特定基因座处的多态性的方法，例如，至少一种表型(如种子颜色、花的颜色或其它视觉可检测的性状)的测定、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸测序技术等。

如本文所用的“基因型”是指表型的遗传部分，且可以使用标记间接表征，或通过核酸测序直接表征。合适的标记包括表型特性、代谢谱、遗传标记或一些其它类型的标记。基因型可以构成至少一个遗传标记基因座的等位基因或至少一个单元型窗口的单元型。在某些实施方案中，基因型可以代表单个基因座，而在其它实施方案中，它可以代表整个基因组宽的一组基因座。在另一实施方案中，基因型可以反映染色体的一部分、整个染色体、基因组的一部分和整个基因组的序列。如本文所用的“轮回亲本百分比”是指一个或多个后代相对于轮回亲本的相似性百分比。相似性可以通过测定一种或多种标记来分析。

如本文所用的“相似性百分比”是指基于一种或多种标记，来自一个群体的至少一个植物与来自第二群体的至少一个植物之间的相似性的百分比。

如本文所用的被称为“单倍体”的植物具有一套(基因组)染色体，并且单倍体植物中减少的染色体数等于配子的染色体数。

如本文所用的被称为“二倍体”的植物具有两套(基因组)染色体，并且染色体数目(2n)等于合子的染色体数。

如本文所用的被称为“加倍单倍体”的植物是通过将染色体的单倍体组加倍而开发的。从自交任何代数的加倍单倍体植物获得的植物或种子可能仍然被确定为加倍单倍体植物。加倍单倍体植物被认为是纯合植物。植物如果是能育的，则被认为是加倍单倍体，即使该植物的整个营养部分不是由具有加倍染色体组的细胞组成的；即，如果植物含有可成活的配子，即使是嵌合的，也被认为是加倍单倍体。

如本文所用的“诱导系”是当与另一株系杂交时促进单倍体胚形成的株系。诱导系在杂交中可以用作雄性或雌性。

如本文所用的术语“植物”包括整个植物、植物器官(即叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的后代。“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

如本文所用的“表型”是指作为基因表达的表现的细胞或生物体的可检测的特征。

如本文所用的“连锁”是指杂交产生配子类型的相对频率。例如，如果基因座A具有基因“A”或“a”，基因座B具有基因“B”或“b”，具有AABB的亲本I与具有aabb的亲本B之间的杂交将产生4种可能的配子，其中基因分离为AB、Ab、aB和ab。空预期为独立相等地分离成4个可能的基因型中的每一个，即，如果没有连锁，每个基因型将会有1/4的配子。配子分离成基因型不等于1/4是由于连锁。

此处所使用的术语“转基因”是指DNA如cDNA或基因组DNA形式的核酸分子，以及RNA如mRNA或微RNA形式的核酸分子，它们可以是单链或双链。

此处所使用的术语“遗传因子”可以指感兴趣的核酸、遗传标记、基因、基因部分、DNA-衍生的序列、单元型、RNA-衍生的序列、启动子、基因的5’非翻译区、基因的3’非翻译区、microRNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录模式、甲基化模式和上述任一个的存在、不存在或拷贝数的变化。

此处所使用的术语“近交系”是指为了遗传同质性而选育的株系。得到近交系的育种方法的例子包括但不限于谱系育种、轮回选择、单粒传法、回交和单倍体加倍。

此处所使用的术语“杂种”是指至少两个遗传上相异的亲本间杂交的后代。杂交方案的例子包括但不限于单杂交、改良单杂交、双改良单杂交、三元杂交、改良的三元杂交和双杂交，其中改良的杂交中的至少一个亲本为姐妹系间杂交的后代。

此处所使用的术语“测交系”是指在与另一株系测交中使用的株系，其中测交系和测试的株系来自不同的种质库。测交系可以是等基因的或非等基因的。

此处所使用的术语“玉米”是指玉米(Zea mays)或玉米，并包括可用玉米选育的所有植物变种，包括野生玉米种。更具体而言，来自玉米种和Zea mays L.ssp.mays玉米亚种的玉米植物可通过使用本发明的组合物和方法进行基因型分型。另一方面，玉米植物来自Zeamays L.subsp.mays Indentata，也被称为马齿型玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.mays Indurata，也被称为硬质玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.mays Saccharata，也被称为甜玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.maysAmylacea，也被称为面粉玉米。另一方面，玉米植物来自Zea mays L.subsp.mays Everta，也被称为爆裂种玉米。可以使用在此描述的组合物和方法进行基因型分型的玉米属或玉米植物包括杂种、近交系、部分近交系、或者定义或未定义的群体的成员。

此处所使用的术语“植物及其部分”包括植物、叶、维管组织、花、荚、根、茎、种子或其部分。

此处所使用的术语“包括”是指“包括但不局限于”。

如本文所用的“优良株系”是指通过针对优异的农艺学表现进行育种和选择而产生的任何株系。优良植物是来自优良株系的任何植物。

本发明提供使用单倍体育种方法产生包含两种或多种遗传因子的转基因农作物的方法。转基因性状整合的目的是将一种或多种转基因性状传递到优良近交系中，并且典型的回交方法涉及多代，每一代选择一个或多个转基因性状，结合选择优良近交系，被称为轮回亲本。随着产品概念转移到转基因性状堆积，包含两种或多种转基因性状，性状整合方法变得更加复杂，因为为了回收具有转基因性状和相关的、理想百分比的轮回亲本基因组(即95％轮回亲本)和最小百分比的供体亲本基因组(即降低连锁累赘)的后代，必须筛查数目增加的后代。此处包括的方法相对于现有技术具有以下优点：缩短了使堆积转基因性状杂种上市所需的时间，以及提供了减少产生包含两种或多种转基因性状的优良农作物所需的样地数的可能性。这些方法可以在育种程序的任何时间点应用，其中“轮回”亲本可以是分离的。在其它方面，轮回亲本包含一种或多种遗传因子。此外，根据起始材料中的分离程度，姐妹系的产生可以与性状整合平行地发生。

单倍体加倍

使用加倍单倍体(DH)植物大大促进了植物育种。DH植物的产生使得植物育种者不需要多代近交就能够获得近交系，从而缩短了产生纯合植物所需的时间。由于纯合系基本上快速产生，不需要多代常规近交，因此节省了大量时间。

特别是，因为DH植物是完全纯合的，它们非常适合数量遗传学研究。加性方差和加性x加性遗传方差都可以从DH群体估计。其它应用包括上位性和连锁效应的确定。而且，在测试和评价用于植物育种程序的纯合系中具有价值。所有遗传方差都在育种杂交的后代之间，这提高了选择增益。

产生DH植物的传统方法需要高资源输入。DH植物在自然中极少存在；因此，需要使用人工生产方法。首先，使一个或多个株系与诱导亲本杂交，产生单倍体种子。玉米的许多诱导系是本领域所知的，包括，例如，Stock 6、RWS、KEMS、KMS和ZMS，和不确定的配子体(ig)突变。在其它方面，通过其它本领域已知的方法产生单倍体材料，包括应用无融合生殖剂(apomictic agent)或其它化学物质、花药培养、小孢子培养等。

单倍体种子的选择可以通过各种筛选方法基于表型或基因型特征来实现。在一种方法中，用可见标记基因筛选材料，该可见标记基因只能在单倍体细胞的胚乳细胞中诱导，从而允许目视鉴定和分离单倍体与二倍体种子。可见标记基因的例子包括GFP、GUS、花色素苷基因如R-nj、萤光素酶、YFP、CFP或CRC。其它筛选方法包括染色体计数、流式细胞术、遗传标记评价来推断拷贝数，等等。

得到的单倍体种子具有单倍体胚和正常的三倍体胚乳，然后必须进行加倍。本领域已知有几种方法来实现染色体加倍。单倍体细胞、单倍体胚、单倍体种子、单倍体幼苗或单倍体植物可以用加倍剂化学处理。已知的加倍剂的非限制性例子包括一氧化氮气体、抗微管除草剂、抗微管剂、秋水仙素、拿草特和有丝分裂抑制剂。

标记技术

标记的发展以及标记与表型的关联或用于标记辅助育种的数量性状基因座(QTL)定位(mapping)已在近年来取得了进展。遗传标记的例子为限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失多态性(Indel)、可变数目串联重复(VNTR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)和本领域普通技术人员已知的其它标记。农作物中标记的发现和发展为将其应用到标记辅助育种活动中提供了最初的构架(美国专利申请2005/0204780、2005/0216545、2005/0218305和2006/00504538)。得到的“遗传图谱”表示表征的基因座(DNA标记或其等位基因可被鉴别的任何其它基因座)沿染色体的相对位置。该图谱上距离的测量与处于减数分裂的姐妹染色单体之间的交换事件的频率相关。

作为一套使用，多态性标记可作为指纹分析植物以获得株系或变种的同一性程度的有用的工具(美国专利6,207,367)。这些标记构成了确定与表型的关联性的基础，并可用于促进遗传增益。标记辅助选择的实现取决于检测个体间内在遗传差异的能力。

本发明的遗传标记包括“显性”或“共显性”标记。“共显性标记”揭示了存在两个或更多个等位基因(每个二倍体个体有两个)。“显性标记”揭示了仅存在一个等位基因。显性标记表型的存在(例如DNA带)指示一个等位基因在纯合或杂合条件下存在。不存在显性标记表型(例如不存在DNA带)仅证明了存在“某些其它”未限定的等位基因。在其中个体主要为纯合的且基因座主要为二态性的群体中，显性和共显性标记可以具有相同的价值。当群体变得更加杂合和多等位基因时，共显性标记通常比显性标记更能提供关于基因型的信息。

在另一实施方案中，可以使用与本发明的QTL的等位基因遗传连锁或相关的标记，例如单序列重复标记(SSR)、AFLP标记、RFLP标记、RAPD标记、表型标记、同工酶标记、单核苷酸多态性(SNP)、插入或缺失(Indel)、单特征多态性(SFP，例如，如Borevitz等人2003Gen.Res.13：513-523所述)、微阵列转录模式、DNA衍生序列和RNA衍生序列。

在一个实施方案中，用于判断是否存在遗传多态性的基于核酸的分析可用于在育种群体中选择种子。用于分析遗传多态性的多种遗传标记是可获得的，也是本领域技术人员公知的。该分析可用于选择包含遗传标记或与遗传标记连锁的基因、QTL、等位基因或基因组区域(单元型)。

在此，核酸分析方法是本领域已知的，包括但不限于基于PCR的检测方法(例如TaqMan分析)、微阵列方法和核酸测序方法。在一个实施方案中，使用核酸扩增方法可有利于DNA、RNA或cDNA样品中多态性位点的检测。这些方法特异性地增加了横跨多态性位点或者包括该位点和位于其远侧或近侧的序列的多核苷酸的浓度。这些扩增的分子可以很容易地通过凝胶电泳、荧光检测方法或其它方式进行检测。

实现这种扩增的方法利用了聚合酶链反应(PCR)(Mullis等人1986 Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-273；欧洲专利50,424；欧洲专利84,796；欧洲专利258,017；欧洲专利237,362；欧洲专利201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；和美国专利4,683,194)，使用能够与以其双链形式限定多态性的近侧序列杂交的引物对。

DNA序列中的多态性可通过多种本领域公知的有效方法进行检测或分型，这些方法包括但不限于美国专利5,468,613和美国专利No.5,217,863；美国专利No.5,210,015；美国专利5,876,930；美国专利6,030,787；美国专利6,004,744；美国专利6,013,431；美国专利5,595,890；美国专利5,762,876；美国专利5,945,283；美国专利5,468,613；美国专利6,090,558；美国专利5,800,944；和美国专利5,616,464中公开的那些方法，这些专利全部在此引入作为参考。但是，本发明的组合物和方法可与任何多态性分型方法一起使用，以对玉米基因组DNA样品中的多态性进行分型。这些使用的玉米基因组DNA样品包括但不限于直接从玉米植物中分离的玉米基因组DNA、克隆的玉米基因组DNA或扩增的玉米基因组DNA。

例如，DNA序列中的多态性可通过与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交进行检测，如美国专利5,468,613和5,217,863中所公开的。美国专利5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中核酸序列中的单个或多个核苷酸变异可通过一方法在核酸中进行检测，在该方法中，扩增含有核苷酸变异的序列，点样在膜上，并使用标记的序列特异性寡核苷酸探针进行处理。

还可以使用美国专利5,800,944中公开的探针连接方法来检测目标核酸序列，其中，扩增目的序列，与探针进行杂交，然后再进行连接，以检测探针的标记部分。

微阵列也可用于多态性检测，其中寡核苷酸探针组以重叠的方式装配以代表单序列，这样目标序列在某一点上的差异将会导致部分探针杂交(Borevitz等人，Genome Res.13：513-523(2003)；Cui等人，Bioinformatics 21：3852-3858(2005))。在任何一个微阵列上，预期将会存在多个目标序列，这些目标序列可以代表基因和/或非编码区，其中各目标序列由一系列重叠的寡核苷酸而不是单个探针表示。这一平台可以高通量筛选多种多态性。单特征多态性(SFP)为由寡核苷酸阵列上的单个探针检测到的多态性，其中特征为阵列上的探针。通过基于微阵列的方法的目标序列分型在美国专利6,799,122、美国专利6,913,879和美国专利6,996,476中公开。

还可以使用美国专利5,616,464中公开的探针连接方法来检测目标核酸序列，该方法使用至少一对探针，该探针具有与目标核酸序列的邻近部分同源的序列并且具有在所述探针与所述目标核酸序列碱基配对时非共价连接以形成茎的侧链。至少一个侧链带有能与茎上的其它侧链成员形成共价交联的光活化基团。

用于检测SNP和Indel的其它方法包括单碱基延伸(SBE)方法。SBE方法的例子包括但不限于美国专利6,004,744、美国专利6,013,431、美国专利5,595,890、美国专利5,762,876和美国专利5,945,283中公开的那些方法。SBE方法是基于直接邻近多态性的核苷酸引物的延伸，以在引物延伸时引入可检测到的核苷酸残基。在某些实施方案中，SBE方法使用3种合成的寡核苷酸。2种寡核苷酸作为PCR引物，并与玉米基因组DNA的基因座序列互补，该序列的侧翼为包含待分析的多态性的区域。在包含多态性的玉米基因组区域扩增之后，PCR产物与第三种寡核苷酸(被称为延伸引物)混合，该第三种寡核苷酸被设计为在DNA聚合酶和两个差异标记的双脱氧核苷三磷酸的存在下可与直接邻近多态性的扩增DNA杂交。如果模板上存在多态性，标记的双脱氧核苷三磷酸中的一个可在单碱基链延伸中被添加到引物中。然后可以通过确定两个差异标记中的哪一个被加入到延伸引物上来推断存在的等位基因。纯合样品将会造成两个标记的碱基中仅有一个被引入，因此将只会检测到两个标记中的一个。杂合样品存在两个等位基因，因此将会引入两个标记(到延伸引物的不同分子中)，因此两个标记都会被检测到。

在用于检测多态性的一种优选方法中，SNP和Indel可通过美国专利5,210,015、美国专利5,876,930和美国专利6,030,787中公开的方法进行检测，其中寡核苷酸探针带有共价连接到探针5’和3’末端的5’荧光报告染料和3’猝灭染料。当探针完整时，报告染料接近猝灭染料抑制了报告染料的荧光，例如通过福斯特型能量转移(Forster-typeenergy transfer)。在PCR过程中，正向和反向引物与位于多态性侧翼的目标DNA的特定序列杂交，而杂交探针与扩增PCR产物内含多态性的序列杂交。在后续的PCR循环中，具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶切割探针并将报告染料与猝灭染料分离，导致报告染料的荧光增强。

标记辅助的育种

通过基于个体的表型记录及其在分子遗传学应用中的相关性来鉴别具有有价值的遗传性状的基因组区域，在植物和动物中选择经济上重要的性状已经改进了育种。与仅基于表型数据得到的结果相比，在育种程序中使用遗传标记加速了有价值的性状向种质中的遗传积累。此处的“种质”包括育种种质、育种群体、优良近交系的集合、随机杂交个体的群体和双亲杂交。遗传标记等位基因(“等位基因”为基因座处的可替换序列)被用于鉴别在多个基因座处包含理想的基因型以及预期能将理想的基因型和理想的表型一起转移给它们的后代的植物。遗传标记等位基因可用于鉴别在一个标记基因座、几个基因座或单元型处包含理想的基因型以及预期能将理想的基因型和理想的表型一起转移给它们的后代的植物。这一方法已被广泛引用，并通过加速有利等位基因的固定和消除每一代表型分型的需求而使植物育种极大地节约。

分子育种通常被称为标记辅助选择(MAS)和标记辅助育种(MAB)，其中MAS是指基于分子标记基因型作出育种决定，MAB是表示在植物育种中使用分子标记的通用术语。在这些类型的分子育种程序中，遗传标记等位基因可用于鉴别在一个标记基因座、几个基因座或单元型处包含理想的基因型以及预期能将理想的基因型和理想的表型一起转移给它们的后代的植物。标记在植物育种中是非常有用的，因为一旦建立，它们就不会受到环境或上位相互作用。此外，特定类型的标记适合高通量检测，能够以成本有效的方式快速鉴定。

农作物中的标记发现和发展提供了用于MAB的初始框架(美国专利5,437,697；美国专利申请2005/0204780，美国专利申请2005/0216545，美国专利申请2005/0218305)。得到的“遗传图谱”表示表征的基因座(DNA标记或其等位基因可被鉴别的任何其它基因座)沿染色体的相对位置。该图谱上距离的测量与处于减数分裂的姐妹染色单体之间的交换事件的频率相关。作为一套使用，多等位基因标记可作为指纹分析植物以获得株系或变种的同一性程度的有用的工具(美国专利6,207,367)。这些标记构成了确定与表型的关联性的基础，并可用于促进遗传增益。MAS(其中选择决定基于标记基因型)的实现取决于检测个体间内在遗传差异的能力。

许多个人和公司已经开发了各种形式的分子育种。一个常用的方案是分子育种依赖标记来报告差异，然后利用该差异进行选择。但是，这些标记不能提供或者提供非常有限的关于DNA序列水平上的差异的信息；例如，典型的双等位基因SNP标记只提供了一个碱基对位置上的信息，并且它可能只区别2个而不是4个核苷酸。使用表达概况分析提供了根据包含靶核酸序列的指导在核酸序列内的任一给定位置处查询4个核苷酸的能力。此外，这种能力可用于指纹分析植物群体或谱系，以允许有用变异的基因组宽的发现、建立谱系或计算育种值。

此外，本发明涉及鉴定含有至少一个目的基因型的优选植物用于改进转基因性状整合，其中使用PCT/US07/18101(2007年8月15日提交)公开的方法，该申请要求美国临时申请60/837,864(2006年8月15日提交)的优先权，这两篇申请均在此引入作为参考，其中目的基因型可以对应于QTL或单元型，并且与至少一个目的表型相关联。在其它方面，如美国专利申请US2006/0282911(在此引入作为参考)所公开的，基于对至少一个表型性状即产量的预测的表现，基于与一个或多个优选单元型的连锁，选择优选的转基因事件。另一方面，目的基因型对应于转基因调节基因座，如2008年6月23日提交的共同拥有的美国专利申请12/144,278所公开的，在此引入作为参考。

这些方法包括将至少一个单元型与至少一个表型关联起来，其中这种关联由数值表示，并且该数值用在育种计划的决定中。数值的非限制性的例子包括单元型效果评估值、单元型频率和育种值。在本发明中，特别有用的是基于至少一个基因型鉴定感兴趣的单倍体植物，使得只有这些株系加倍，这节约了资源。得到的包含至少一个目的基因型的加倍单倍体植物然后在育种程序中开发，用于与种质改良有关的活动中。另一方面，特别有用的是实施这些方法以鉴定感兴趣的受体株系，即轮回亲本。

可以通过高通量、非破坏性种子采样使基因型分型进一步节约。在一个实施方案中，可以使用高通量、非破坏性种子采样，针对一个或多个标记如遗传标记筛选植物。在一个优选方面，单倍体种子以这种方式采样，并且只选择具有至少一个目的标记基因组的种子进行加倍。已经描述了高通量、非破坏性种子采样的装置和方法，其通过允许个体种子分析克服了统计学样本的障碍。例如，共同拥有的美国专利申请11/213,430(2005年8月26日提交)；美国专利申请11/213,431(2005年8月26日提交)；美国专利申请11/213,432(2005年8月26日提交)；美国专利申请11/213,434(2005年8月26日提交)；美国专利申请11/213,435(2005年8月26日提交)，美国专利申请11/680,611(2007年3月2日提交)和美国专利申请12/128,279(2008年5月28日提交)公开了用于种子的自动化采样的装置和系统以及种子的采样、测试和膨胀(bulking)方法，这些美国申请在此全文引入作为参考。

在本发明的一个优选实施方案中，例如，如共同拥有的美国专利申请11/680,611和美国专利申请12/128,279所述的高通量、非破坏性种子采样用于本发明植物的采样。这种采样平台允许快速鉴定含有优选基因型或表型特征的种子，使得只种植优选的或目标种子，节约温室和/或田间样地的资源。特别是，当使用高通量、非破坏性种子采样方法采集单倍体种子时，只选择优选的种子进行加倍，例如选择包含供体的转基因性状和希望的轮回亲本基因组百分比的种子，从而节约了资源。

植物育种

本发明的植物可以是育种程序的部分或从育种程序产生。育种方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改进的性状的遗传性和商业使用的栽培变种的类型(例如F₁杂种栽培变种、纯系栽培变种等)。栽培变种是有意建立或选择并通过选育维持的植物物种的品种或变种。

本发明提供了本发明的植物的部分。

选择的用于选育本发明植物的非限定性方法如下所述。可对任何杂交的后代使用标记辅助选择(MAS)来提高育种程序。应当理解本发明的核酸标记可在MAS(育种)程序中使用。应当进一步理解任何商业和非商业栽培变种可在育种程序中使用。例如发芽活力、生长活力、应激耐受性、抗病性、分枝、开花、结籽、种子大小、种子密度、可直立性和脱粒性(threshability)等因素通常将会决定其选择。

在一个方面，MAB程序使用多种标记来鉴定较佳表现的选择，其在一个或多个基因座处平均具有较高频率的有利等位基因。发展了指纹分析来确定基因组宽的标记分布。使用得到的两个或多个株系之间的标记距离和/或标记相似性指数，能够建立谱系并计算评价的所有基因座的育种值。在此，育种值是基于表达概况效果评估值和表达概况(即等位基因)频率来计算的，其中表达概况育种值代表在群体中的表达概况下固定特定核酸序列(即等位基因)的效果，从而提供基于相应的表达概况进行核酸序列排序的基础。

对于高遗传性的性状而言，在单个位点评价的优良个体植物的选择将是有效的，而对于低遗传性的性状而言，选择应该基于对相关植物家族的重复评价中获得的平均值。普遍的选择方法通常包括谱系选择、改良的谱系选择、质量选择和轮回选择。在一个优选方面，采用回交或轮回育种程序。

遗传的复杂性影响了育种方法的选择。可以使用回交育种将高遗传性性状的一个或几个有利的基因转入理想的栽培变种中。该方法已经广泛用于选育抗病性栽培变种。利用不同的轮回选择技术改良由多个基因控制的数量遗传性状。

可以测试育株系，并将其与代表商业目标地区的环境中的适当的标准比较两代或更多代。最佳株系是新的商业栽培变种的候选系；那些缺乏性状的株系可用作亲本来产生用于进一步选择的新群体。

对于杂种农作物而言，新的优良杂种的发展需要发展和选择优良的近交系、这些株系的杂交，以及优良杂交杂种的选择。通过选择的雄性能育亲本间的人工杂交或通过使用雄性不育系统可以产生杂种种子。关于亲本系的其它数据以及杂种的表型影响了育种者关于是否继续特定杂种杂交的决定。

谱系育种和轮回选择育种方法可用于从育种群体发展栽培变种。育种程序将来自两个或更多个栽培变种或不同的广泛来源的理想性状组合成育种库，通过自交和选择理想的表型从该育种库发展栽培变种。可以评价新的栽培变种以确定哪些具有商业潜力。

回交育种已被用于将简单遗传的、高度遗传性的性状的基因转入作为轮回亲本的理想的纯合栽培变种或近交系中。待转移的性状的来源被称为供体亲本。最初的杂交之后，选择具有供体亲本的表型的个体，并与轮回亲本反复杂交(回交)。得到的植物预期具有轮回亲本(例如栽培变种)的大多数属性并且另外还具有从供体亲本转移来的希望的性状。

单粒传法严格意义上来说是指种植分离群体，每个植物收获一个种子样品，以及使用单种子样品来种植下一代。当群体已从F₂发展到希望的近交水平时，株系所来源的植物将会分别追溯到不同的F₂个体。由于某些种子不能发芽或者某些植物不能产生至少一个种子，所以群体中植物的数目逐代减少。因此，当世代进化完成时，并不是群体中最初取样的所有F₂植物都有后代代表。

加倍单倍体(DH)方法在较短的时间内产生等基因植物。DH植物为植物育种者提供了无价的工具，特别是对于产生近交系和数量遗传研究而言。对于育种者，DH群体特别可用于QLT定位、细胞质转换和性状渗入中。此外，其在测试和评价用于植物育种程序的纯合系中也具有价值。所有的遗传方差在育种杂交的后代之间，其提高了选择增益。

通常用于不同的性状和农作物的其它育种方法的描述可见于以下几本参考书的一种中(Allard，“Principles of Plant breeding，”JohnWiley&Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles of crop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“Plant breeding perspectives，”Wageningen(ed)，Center for Agricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，In：Soybeans：Improvement，Production and Uses，2nd Edition，Monograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles of variety development，”Theory andTechnique，(Vol.1)和Crop Species Soybean(Vol.2)，Iowa State Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY，360-376，1987)。

转基因育种

1.用于重组核酸的方法和组合物

本发明中公开的用于蛋白质的核酸可以通过将其可操作地连接到在植物中具有功能的启动子上而在植物细胞中进行表达。组织特异性的和/或诱导型启动子可用于适当地表达特定性状的核酸。3’非翻译序列、3’转录终止区或多腺苷酸化区域是指与决定转基因性状的结构性多核苷酸分子相连并且位于其下游的DNA分子，并且包括提供能够影响转录、mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化信号和其它调控信号的多核苷酸。多腺苷酸化信号在植物中起作用，以将多腺苷酸核苷酸添加到mRNA前体的3’末端。多腺苷酸化序列可来自天然基因、来自多种植物基因或来自T-DNA基因。作为翻译前导序列起作用的5’UTR为位于启动子序列和编码序列之间的DNA遗传元件。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录物向mRNA的加工、mRNA的稳定性或翻译效率。

编码转基因性状的蛋白质的核酸可操作地连接到不同的表达元件上，产生表达单元。这样的表达单元通常包含(从5’到3’方向)：启动子、用于表达性状的核酸、3’非翻译区(UTR)。为了促进性状的表达，可以加入几种其它表达元件，例如5’UTR、细胞器转运肽序列和内含子。在一些实施方案中，决定特定转基因性状的核酸的蛋白质产物靶向细胞器，以发挥适当的功能。例如，将蛋白质靶向叶绿体是通过使用叶绿体转运肽序列实现的。这些序列可从由叶绿体靶向基因编码的核(例如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基(RbcS2)、铁氧化还原蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合物蛋白I和II以及硫氧还蛋白F蛋白)的氨基酸或核酸序列中分离或合成出来。叶绿体靶向序列的其它例子包括玉米cab-m7信号序列(Becker，等人，1992；PCT WO 97/41228)、豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(Creissen，等人，1995；PCT WO 97/41228)和烟草核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基叶绿体转运肽的CTP(NtSSU-CTP)(Mazur，等人，1985)。

术语“内含子”是指可从基因的基因组拷贝的间插序列中分离或鉴别出来的多核苷酸分子，通常可定义为在翻译之前的mRNA加工过程中剪接的区域。或者，内含子可以合成制备。内含子本身可以包含实现可操作地连接的基因转录的亚元件，例如顺式元件或增强子结构域。“植物内含子”为在植物细胞内具有功能的天然或非天然内含子。植物内含子可用作调控可操作地连接的一个基因或多个基因的表达的调控元件。转化构建体中的多核苷酸分子序列可以包含内含子。内含子相对于可转录的多核苷酸分子序列而言可以是异源的。内含子的例子包括玉米肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子(美国专利5,859,347，在此引入作为参考)。

由于转基因性状沉默化或相关的效应，避免各表达单元中任何表达元件的复制。仅当它们不互相干扰或不会造成转基因性状沉默时，才可以使用在各表达单元中的复制的元件。

本领域中已知以下方法：以一定方式装配构建体和将构建体引入细胞中，使得转基因性状的核酸分子被转录为功能性mRNA分子，然后该功能性mRNA分子被翻译和表达为蛋白质产物。为了实施本发明，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员公知的，参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition Volumes 1，2，and 3(2000)J.F.Sambrook，D.W.Russell，和N.Irwin，Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于制备特别适于植物转化的转化构建体的方法包括但不限于美国专利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011中描述的那些方法，所述专利全部在此引入作为参考。这些载体类型已有综述(Rodriguez等人，Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston，1988；Glick等人，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1993)。

一般而言，在转化构建体上的一个或多个T-DNA边界之间提供表达单元。转化构建体允许将T-DNA边界间的表达单元整合到植物细胞的基因组中。该构建体还可以包含在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA片段，例如大肠杆菌复制起点(例如ori322)、宽宿主范围的复制起点(例如oriV或oriRi)，以及选择性标记的编码区(例如Spec/Strp)，该编码区编码赋予壮观霉素或链霉素或庆大霉素(Gm，Gent)选择性标记基因抗性的Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)。对于植物转化而言，宿主细菌菌株通常为携带具有表达单元转运功能的质粒的根瘤土壤杆菌ABI、C58、LBA4404、EHA101和EHA105。植物转化领域技术人员已知的其它菌株也可以在本发明中起作用。

本发明的转基因性状通过植物组织培养和转化领域的技术人员已知的转化方法被引入到近交系中。用于将表达单元引入植物中的本领域已知的任何技术都可根据本发明使用。这样的方法的例子包括美国专利5,384,253中描述的电穿孔；美国专利5,015,580、美国专利5,550,318、美国专利5,538,880、美国专利6,160,208、美国专利6,399,861和美国专利6,403,865中描述的微粒轰击；美国专利5,508,184中描述的原生质体转化；和美国专利5,635,055、美国专利5,824,877、美国专利5,591,616、美国专利5,981,840和美国专利6,384,301中描述的土壤杆菌介导的转化。

在实现了表达单元向受体细胞的转运之后，下一步通常涉及鉴别用于进一步培养和植物再生的转化的细胞。为了提高鉴别转化体的能力，人们可能希望使用可选择的或可筛选的标记基因以及根据本发明制备的转化构建体。在这种情况下，人们通常会通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来分析可能转化的细胞群体，或者人们会针对希望的标记基因性状筛选细胞。各种可选择或可筛选的标记的例子在Miki和McHugh，2004，Selectable marker genes in transgenic plants：applications，alternatives and biosafety，Journal of Biotechnology，107，193中公开。

暴露于选择剂之后存活的细胞或在筛选分析中被评分为阳性的细胞可在支持植物再生的培养基中培养。在示例性的实施方案中，任何合适的植物组织培养基，例如MS和N6培养基，可通过加入其它物质如生长调节剂进行改良。组织可以维持在含有生长调节剂的基础培养基中，直到可以获得足够的组织来开始植物的再生努力，或者重复多轮人工选择直到组织的形态学适于再生，然后转移到有益于形成芽的培养基中。定期转移培养物直到发生足够的芽形成。一旦形成了芽，将其转移到适于形成根的培养基中。一旦形成了足量的根，可将植物转移到土壤中进一步生长和成熟。

为了证实再生植物中决定转基因性状的DNA的存在，可以进行多种分析。这样的分析包括例如“分子生物学”分析，例如DNA印迹法和RNA印迹法和PCR^TM；“生化”分析，例如检测蛋白质产物的存在，如通过免疫方式(ELISA和蛋白质印迹法)或通过酶的功能；植物部分分析，例如叶或根的分析；以及通过分析整个再生植物的表型。

表1.可根据本发明的方法使用以鉴定优选种质和转基因组合的转基因性状的非限制性实例

2.转基因性状整合

一旦决定性状的转基因已被引入到植物中，该基因可通过杂交被引入到与第一植物性亲和的(sexually compatible)任何植物中，而不需要直接转化第二植物。因此，此处所使用的术语“后代”是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。因此，“转基因植物”可为任一代的植物。

如上所述，通常用于不同性状和农作物的育种方法的描述可见于几本参考书中的一本(Allard，“Principles of Plant breeding，”JohnWiley&Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles of crop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“Plant breeding perspectives，”Wageningen(ed)，Center for Agricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，In：Soybeans：Improvement，Production and Uses，2nd Edition，Manograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles of variety development，”Theory andTechnique，(Vol 1)和Crop Species Soybean(Vol 2)，Iowa State Univ.，Macmillian Pub.Co.，NY，360-376，1987))中。

一般而言，使用两个截然不同的育种阶段用于商业化发展具有转基因性状的优良栽培变种。第一阶段包括评价和筛选优良的转基因事件，而第二阶段包含将选择的转基因事件整合到商业种质中。

在典型的转基因育种程序中，决定转基因性状的转化构建体通过转化方法被引入到基因组中。通常对每个转化体产生大量独立的转化体(事件)。评价这些事件来选择具有优异表现的那些事件。事件评价方法是基于几项标准，包括：1)转基因表达/转基因性状的效力、2)性状的分子表征、3)性状的分离、4)发展的事件的农业经济学和5)转基因性状表达的稳定性。独立事件的大群体的评价以及更充分的评价使得成功的几率更大。

通过评价事件的插入位点、转基因拷贝数、转基因的完整性、转基因的接合性、与基因型相关的近交水平和环境条件，选择显示出对应正确表型(效力)的正确蛋白质表达水平的事件以用于进一步的使用。通过进行关于拷贝数、插入数、插入复杂性、载体骨架的存在和事件特异性分析的发展的分子分析，发现了显示出干净的单个完整插入的事件，并用于进一步发展中。测试性状的分离来选择遵循单基因座分离模式的转基因事件。分离可以通过评价转基因性状的分离进行直接评价，也可以通过评估选择性标记的分离(与转基因性状相关)进行间接评价。

事件在世代中的不稳定性通常是由于因多个转基因拷贝、接合性水平、高甲基化插入位点或应激水平造成的转基因失活而引起的。因此，转基因性状表达的稳定性通过在不同的代、环境和不同的遗传背景中进行测试得以确定。放弃显示转基因性状沉默的事件。

一般而言，具有作为单个显性基因遗传的并且遵循孟德尔分离比的单个完整插入的事件在商业性状整合策略(例如回交和正向育种)中使用。

另一方面，测试可以扩大到在至少两个不同的位置处在至少两种不同的遗传背景中评估至少一种先导事件，用于评价在两个或多个位点处与一个或多个转基因的基因型相互作用。

另一方面，测试可以扩大到在对于至少一个环境因素的至少两种不同的条件下在至少两种不同的遗传背景中评估至少一种先导事件，用于评价基因型在两种或多种环境条件下与一个或多个转基因之间的相互作用。

在一个实施方案中，转基因性状的整合是通过使用回交来恢复具有其它转基因性状的优良近交系的基因型而实现的。在每一回交代中，鉴别包含转基因的植物，并与优良轮回亲本杂交。商业育种者通常使用包括选择轮回亲本表型的几个回交代来恢复具有其它转基因性状的优良亲本的基因型。在回交过程中，转基因处于半合子状态。因此，在回交结束时，使植物自交或近缘授粉，以使转基因固定为纯合状态。分子辅助的回交(MABC)可以减少回交代数。MABC方法使用遗传标记来鉴别在每个回交代中与轮回亲本最相似的植物。通过使用MABC和适当的群体大小，可以鉴别出仅在两个或三个回交代后即恢复超过98％的轮回亲本基因组的植物。通过减少几个回交代，商业转基因产品通常可以比通过常规回交产生的产品早一年投放到市场上。

在一个优选实施方案中，MABC还针对之前通过对于转基因调节物质分离的一组种质中的标记-性状作图鉴别的、对应于至少一个转基因调控基因座的标记。在另一个实施方案中，MAS在与株系发展相关的活动中使用，来发展带有优选的转基因调控基因型的优良株系。在另一方面，其它标记也可以在与转基因调控基因座相关的选择决定中使用，并可通过目视分析、化学或分析试验或其它类型的表型分析来鉴别。

正向育种为目标是发展与用于发展改进的基因型的亲本在基因型上不同并且更优良的转基因变种、近交系或杂种的任何育种方法。当正向选育转基因农作物时，在育种程序的各代中，通常施加对于转基因效力的选择压力。

在一个优选方面，本发明中使用的用于转基因性状整合的近交系使用美国临时申请60/848,952和60/922,013(分别于2006年10月3日和2007年4月5日公开，全文引入本文作为参考)公开的堆积策略方法来制备，以产生转基因近交亲本，以开发具有优选经济价值的杂种产品概念。

实施例

已经说明和描述了本发明的原则，本领域技术人员应当明白，可以在不偏离这些原则的情况下在排列和细节上修改本发明。我们请求保护所附权利要求书的精神和范围内的所有修改。

本说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件都引入本文作为参考，如同每一单独的出版物或专利申请具体且分别地引入作为参考。

实施例1.使用单倍体方法堆积至少两种遗传因子

在杂种玉米市场上，具有至少两种转基因性状如除草剂耐受性和昆虫抗性的产品有着巨大的价值。但是，仅依赖回交育种的传统方法导致获得具有两种或多种遗传因子的杂种所需的资源，在上市所需年数、需要的样地等方面大大增加。在本实施例中，详细描述了本发明的方法，其中提供了涉及使用DH过程的加速的育种和转基因性状整合方法。本发明提供育种方法的组合，其涉及恢复至少两种感兴趣的遗传因子，轮回亲本的最大恢复率为至少95％，在优选方面为至少98％。

在一个实施方案中，可以开发新的株系，例如“株系A”，并且准备用于转基因性状整合，以开始标记辅助的回交。供体系含有至少2种彼此不连锁的转基因性状；特别是，在其它方面，针对4种或更多的转基因性状，在另一方面，两种或多种转基因性状遗传连锁。在一个方面，供体和新株系彼此相关，并且相似性系数为80％。在另一方面，供体与新株系之间的相似性大于50％且小于100％。在一些方面，任一供体与任一新株系之间的相似性为60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。

在其它方面，株系A可能不完全近交，并且在一个或多个基因座处分离。因此，不仅根据是否存在感兴趣的遗传因子筛选F 1后代，而且也可以对在株系开发和随后的姐妹系产生方面的育种决定进行评价。

本发明预期，可以获得具有不同数目和类型的遗传因子的两个或多个供体，以及可以产生不同的遗传背景，以利于不同基因组合的加工和转移，以避免无效转基因问题，并且促进不同的产品概念。此外，还可以对特定成熟组以及相似性产生供体组(即，用于种质库中遗传簇的供体组)。在某些方面，供体是转化系，而在其它方面，供体是转变系(conversion)。

在另一方面，开发对应于种质库的遗传多样性的一组供体，使得可以用至少75％相似的供体和轮回亲本启动转变。在其它方面，两个株系至少85％相似。在其它方面，两个株系至少95％相似。较大的相似性具有恢复轮回亲本需要较少MABC循环的优点。

本实施例提供堆积性状整合程序的阶段，其中发明人预期在第二阶段及以外，为了使轮回亲本(为了说明目的在此称为“亲本A”)恢复达到最大的目的，可引入一个或多个回交代。

在一个实施方案中，在第一阶段，通过使具有四种转基因性状的供体与“株系A”杂交产生F1，其中供体和株系A有80％相同。为了说明目的，这一杂交产生500个谷粒(kernel)。然后，在第二阶段，F 1可以与轮回亲本进行至少一代回交，随后选择具有最大百分比的轮回亲本的后代。在本发明的一个方面，在第二阶段，使用F1作为雌性并且使用单倍体诱导系作为雄性，在母本诱导杂交情况下种植F1。另一方面，使用F1作为雌性，并且在父本诱导杂交中与雄性单倍体诱导系杂交。本发明预期使用各种本领域已知的方法可以产生单倍体植物。为了说明目的，如果种植上述500个谷粒，保守地估计将产生75,000个种子(500株植物x 150个种子每穗＝75,000个种子)，其中推断接近3,500-4,000个为单倍体(75,000个诱导的种子x 0.05诱导＝3,750个推断的单倍体)。

使用本领域已知的方法通过目视筛选、表型筛选和/或基因型筛选鉴定推断的单倍体谷粒。在本发明的优选方面，使用高通量、非破坏性种子采样采集每一个推断的单倍体谷粒，以确定存在供体的每一种转基因性状，并且轮回亲本(RP)在种植前最大化，以节约样地。理论上，产生的推断的单倍体谷粒中有1/16含有全部四种转基因性状(4,000个推断的单倍体/16＝250个具有全部4种性状的推断的单倍体谷粒)，并且其中平均一半大于90％RP(125个推断的单倍体谷粒)。例如，在该实施例中，首先对4,000个推断的单倍体谷粒针对四种性状进行筛选，以缩小范围，然后对剩余的250个含有全部四种性状的推断的单倍体谷粒进行轮回亲本检查，这将具有成本效益。

尤其是，单倍体谷粒是转基因性状整合的理想材料，因为这些区域是纯合的，并且消除了在回交计划中通常处理的半合条件。这在回交方法中提供了极大的优点。可以准确地确定哪些区域是固定的，以及哪些区域在下一杂交中需要改变。在这一步骤后可以进行可能的标记优化，以降低转变成本。

在这种情况下，由于RP和供体有80％谱系相同，并且第二阶段的目的是只选择那些含有所有四种性状并且大于95％RP的谷粒，因此提高产生的单倍体谷粒的数目可能是优选的。因此，在一个方面，第二阶段提供了诱导更多植物以提高理想后代的可能性的机会(即，所有转基因性状和优选的RP百分比)。例如，诱导1000株而不是500株植物可能实际上导致足够多的含有所有四种转基因性状并且高于98％RP的谷粒。可以选出这些产生的谷粒送至加倍苗圃。

在四性状模型的情况中，可以消除对后续世代的需要。另一方面，如果开始时使用的供体与RP更相似，所需要的单倍体谷粒的数目可以减少。随着转基因性状的数目提高到4以上，例如8，在单一步骤中所需的单倍体的数量增加。

本实施例说明提高轮回亲本百分比，同时成本较低并且更适应引入较高数目遗传因子的逐步进展。随着有关转基因性状数目的增加，这可能成为必需的。

在第三阶段，在苗圃中紧挨着“株系A”种植选择的推断的单倍体谷粒，其中使用100个或更多的推断的单倍体。后续步骤的非限制性实例如下。

选项1：在一个方面，可能有利地只选择含有所有4种性状和最高数量的轮回亲本的推断的单倍体谷粒，其中这些个体被加倍，然后与株系A杂交。由于已经使用标记选择，通过调节基因型分型和高通量、非破坏性种子采样，在商业化前流程中可以跳过一代。此时，选择的推断的单倍体谷粒经历加倍过程。使用本领域已知的方法对单倍体谷粒进行加倍。

同时，在苗圃中种植“株系A”，在相邻的行中留出移植盆栽幼苗的空间。“株系A”的种植时机最可能发生在单倍体幼苗相当好地恢复时，这说明了“加倍”过程的压力。这样，为了确保适当的时间缺口(nick)，可能需要延迟“株系A”的种植；例如，可能需要在移植日前一点种植“株系A”。

在授粉时，推断的加倍单倍体幼苗将产生有限量的花粉，并且将作为雄性供体用于“株系A”。杂交只在这一方向上进行。基于历史存活率，本领域技术人员将会知道一部分移植物将会在田间存活，并且通常这一部分有一半以上释放花粉。只使用2-13K行，在该方法中可能产生足够的谷粒(即，至少500个谷粒)，进展到第4阶段。在轮回亲本特别高的个体中，传粉的单倍体谷粒也可能自交。

如果时间缺口关闭，通过如以下选项2所述的方式进行杂交可以降低风险；唯一的差别是单倍体植物将释放有限量的花粉。

选项2：在第二个实施方案中，本发明设想来自第二阶段的单倍体后代将直接与株系A回交。在这种情况下，选择的单倍体谷粒用作雌性，并且被“株系A”杂交。单倍体植物通常具有少量的雄性能育性，但是容易产生穗丝。植物将结籽，但是数量有限。例如，在125个植物中有90个授粉的情况下，这些授粉中有1/3将产生种子(90个授粉x0.33＝30个穗)，并且平均每个穗10个种子(30个穗x10个种子＝300个种子)。这些种子中的每一个含有所有四种转基因性状和最少95％的轮回亲本。这种方法不产生象选项1那么多的种子，但是它具有只需很少的管理和错过时间缺口(miss-nick)的风险最小的优点。

选项3：在另一实施方案中，将推断的单倍体种子加倍并且与株系A进行正反交。加倍的单倍体植物将产生有限量的花粉，并且容易产生穗丝。可能与“株系A”进行正反交，以提高可以用于下一筛选步骤的个体数。以每个方向进行杂交(与单倍体植物和与“株系A”)，以使产生的种子数最大化。相比与单倍体植物杂交，与“株系A”正反交将产生大量的谷粒。例如，理论上正反交将产生：“株系A”x单倍体＝500-1,000个谷粒，单倍体x“株系A”＝300个谷粒，将产生800-1,300个谷粒进行开发。

接下来，在第四阶段，目的是使轮回亲本百分比最大化，并且重复第二阶段的选项。在一个实施方案中，至少与株系A进行一代回交，然后选择具有最大RP百分比的后代。在一个优选方面，使用高通量、非破坏性的种子采样采集个体种子或集群(bulks)，以证实每个转基因性状的存在和鉴定具有最大RP百分比的种子，以节约样地并加快实现产品概念。

在另一实施方案中，重复在第二阶段引入的单倍体诱导过程。更多植物的诱导可以以类似于第二阶段的方式进行，但是平均RP更高。本发明预期，使用足够的样本大小，可以鉴定含有所有四种转基因性状并且大于98％RP的个体进行开发。在一个方面，这些个体将进行如上所述的诱导。涉及的性状数目越大，在该步骤中用于诱导的植物数目越大。例如，如果诱导选项1或选项3中产生的1000个谷粒，则发生以下情况：1,000个谷粒x150＝150,000个种子产生；150,000个种子x 0.05诱导＝7500个单倍体；7500个单倍体/16＝470个具有4种转基因性状；470/2＝235个具有全部4种转基因性状和大于98％的轮回亲本。使用本领域已知的方法通过目视筛选、表型筛选和/或基因型筛选鉴定推断的单倍体谷粒。在本发明的优选方面，使用高通量、非破坏性种子采样采集每一个推断的单倍体谷粒，以确定存在供体的每一种转基因性状，并且轮回亲本(RP)在种植前最大化，以节约样地。理论上，产生的推断的单倍体谷粒中有1/16含有全部四种性状(2250/16＝140个推断的单倍体谷粒具有全部4种转基因性状的)，并且其中平均至少一半大于95％RP(70个推断的单倍体谷粒)。

如果第四阶段包括诱导，则在第五阶段使用本领域已知的方法通过目视筛选、表型筛选和/或基因型筛选鉴定选择的推断的单倍体。在本发明的优选方面，使用高通量、非破坏性种子采样采集每一个推断的单倍体谷粒，以确定存在供体的每一种转基因性状，并且轮回亲本(RP)在种植前最大化，以节约样地和加倍化。得到的株系在育种流程中开发。例如，得到的株系可以用于株系和变种开发和杂种开发中。可以对它们进行评价，以基于单元型效应估计值选择一个或多个优选的转基因事件。一个或多个得到的株系可以在转基因性状整合中作为转基因性状供体使用。在其它方面，得到的株系可以在育种杂交和通过自体受精测试和开发植物中使用。在另一方面，选出得到的至少一个基因座分离的株系作为姐妹系。在其它方面，得到的株系及其部分可以用于转化，作为表达构建体的候选物以及用于诱变。

实施例2.使用单倍体方法和细胞质不育性回交堆积至少两种遗传因子

值得注意的是，本发明中特定产品概念所需的转基因性状和/或遗传因子的数目将说明为了提高获得包含转基因性状以及(如果相关)希望的轮回亲本百分比的目标个体进行开发的可能性而进行筛查所需的个体数。在杂种玉米市场上，具有至少两种转基因性状如除草剂耐受性和昆虫抗性的产品有着巨大的价值。但是，传统回交方法导致获得具有两种或多种遗传因子的杂种所需的资源在上市所需年数、需要的样地等方面大大增加。在本实施例中，详细描述了本发明的方法，其中提供了调节细胞质雄性不育性(CMS)的用于育种和转基因性状整合的快速方法。

细胞质不育回交在减少物品费用方面是非常重要的。传统上，在考虑引入不育性之前，转基因性状转变几乎已经完成。本发明提供平行整合CMS和感兴趣的遗传因子的方法。

在第一代，通过CMS四性状供体与“株系A”杂交产生F1。为了说明目的，该杂交产生500个谷粒。如果选择了正确的细胞质，产生的所有种子都应当在下一代是雄性不育的。在第二代，使用F1作为雌性，在母本诱导杂交情况下种植雄性不育的F1。如果上述500个谷粒在KHI1分离的情况下种植，估计将产生75,000个种子(500株植物x150个种子每个穗＝75,000个种子)，并且其中大约3,500-4,000个为推断的单倍体(75,000个诱导的种子x0.05诱导＝3,750个推断的单倍体)。使用本领域已知的方法通过目视筛选、表型筛选和/或基因型筛选鉴定推断的单倍体谷粒。在本发明的优选方面，使用高通量、非破坏性种子采样采集每一个推断的单倍体谷粒，以确定存在供体的每一种转基因性状，并且轮回亲本(RP)在种植前最大化，以节约样地。

在第三代，在苗圃中紧挨着“株系A”种植选择的推断的单倍体谷粒。选择的单倍体谷粒用作雌性，因为它们在细胞质上是雄性不育的，并且与“株系A”杂交。未加倍的单倍体植物应当是100％雄性不育的，但是容易产生穗丝。假如正确选择了推断的单倍体，则每个种子都含有所有四种转基因性状，并且至少95％的轮回亲本。如果可用，在此阶段使用“株系A-4性状转变”作为供体将具有优点。

如果同时进行，也可以使用正反交方法产生的花粉作为雄性加至这些推断的单倍体谷粒上，以加速近交和加强四种感兴趣的转基因性状。

第四代是第二代的重复，恢复预期提高的RP百分比。使用F1(细胞质是雄性不育的)作为雌性，在母本诱导杂交情况下种植新的F1。使用本领域已知的方法通过目视筛选、表型筛选和/或基因型筛选鉴定推断的单倍体谷粒。在本发明的优选方面，使用高通量、非破坏性种子采样采集每一个推断的单倍体谷粒，以确定存在供体的每一种转基因性状，并且轮回亲本(RP)在种植前最大化，以节约样地。

在第五代，将推断的单倍体送至杂交苗圃，并紧挨着株系A或者优选地“株系A-4性状转变”种植。单倍体植物被作为保持者的“株系A-4性状转变”杂交。如果“株系A-4性状转变”同时经历加倍过程，则来自加倍单倍体的花粉可以作为供体用于这些雄性不育加倍(或未加倍的)细胞质不育单倍体植物。“株系A-4性状转变”作为保持者，来提高细胞质雄性不育形式。

在第六代，在育种程序中开发具有转基因性状、CMS和至少98％轮回亲本的候选材料。例如，得到的株系可以用于株系和变种开发和杂种开发中。可以对它们进行评价，以基于单元型效应估计值选择一个或多个优选的转基因事件。一个或多个得到的株系可以在转基因性状整合中作为转基因性状供体使用。在其它方面，得到的株系可以在育种杂交和通过自体受精测试和开发植物中使用。在另一方面，选出得到的至少一个基因座分离的株系作为姐妹系。在其它方面，得到的株系及其部分可以用于转化，作为表达构建体的候选物以及用于诱变。

Claims (18)

1.一种将至少两种遗传因子引入至少一个植物中的方法，该方法包括：

使包含至少两种遗传因子的供体植物与所述至少一个植物杂交，以获得多个后代植物；

使所述多个后代植物中的至少一个与单倍体诱导系杂交，以产生包括单倍体后代的多个诱导后代；

从所述多个诱导后代中选择单倍体后代；

针对是否存在用于所述至少两种遗传因子中的至少一种的至少一种标记和用于所述至少一个植物的基因组的至少一种标记，筛查选择的单倍体后代；和

根据筛查结果选择单倍体后代。

2.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括使根据筛查结果选择的单倍体后代加倍，以产生二倍体后代。

3.权利要求1的方法，其中所述供体植物和所述至少一个植物至少50％遗传学相同。

4.权利要求2的方法，其中所述供体植物和所述至少一个植物至少80％遗传学相同。

5.权利要求3的方法，其中所述供体植物和所述至少一个植物至少90％遗传学相同。

6.权利要求1的方法，其中所述筛查选择的单倍体后代的步骤包括针对是否存在至少一种标记筛查单倍体后代，所述标记选自遗传标记、单元型、核酸序列、转录模式、代谢谱、营养组成谱、蛋白质表达谱和表型特征。

7.权利要求1的方法，其中所述筛查选择的单倍体后代的步骤包括使用高通量、非破坏性种子采样法从选择的单倍体后代中取出组织样品。

8.权利要求2的方法，其中所述使选择的单倍体后代加倍的步骤包括使选择的单倍体后代接触选自一氧化氮气体、抗微管除草剂、抗微管剂、秋水仙素、拿草特和有丝分裂抑制剂的加倍处理。

9.权利要求8的方法，其中所述加倍处理应用于植物的一个或多个部分，所述部分选自细胞、组织、种子、胚、幼苗、叶、主干和茎。

10.权利要求1的方法，其中所述至少一个植物是近交系。

11.权利要求1的方法，其中所述至少一个植物在一个或多个基因座处是分离的。

12.权利要求1的方法，其中所述至少一个植物包含至少一种遗传因子。

13.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括在任何杂交后对所述至少一个植物进行至少一代回交选择。

14.权利要求2的方法，其中所述方法进一步包括在一项或多项种质改良活动中使用所述加倍的后代，所述种质改良活动选自株系和变种开发、杂种开发、转基因事件选择、转基因性状供体开发、进行育种杂交、通过自花授粉来测试和改进植物、使用植物或其部分进行转化、使用植物或其部分作为表达构建体的候选物，以及使用植物或其部分进行诱变。

15.权利要求1的方法，其中所述植物是选自下组的农作物：玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypiumhirsutum)、花生(Arachis hypogaea)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa)、鸭茅(Dactylis glomerata)、水稻(Oryzasativa，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)变种)、高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum sp)、高羊茅(Festucaarundinacea)、草皮草物种(例如物种：四季青(Agrostisstolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、钝叶草(Stenotaphrumsecundatum))、小麦(Triticum aestivum)、苜蓿(Medicagosativa)、芸苔属的成员、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆、茄子、茴香、青刀豆、葫芦、韭菜、莴苣、甜瓜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、萝卜、菠菜、笋瓜、甜玉米、西红柿、西瓜、观赏植物以及其它水果、蔬菜、块茎和块根农作物。

16.权利要求1的方法，其中所述至少两种遗传因子中的至少一种提供选自下组的性状：除草剂耐受性、抗病性、昆虫或害虫抗性、改变的脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢、提高的谷物产量、增加的油、增加的营养含量、增加的生长速度、增强的应激耐受性、优选的成熟度、增强的感官特性、改变的形态特征、不育性、其它农学性状、用于工业应用的性状和用于提高消费者吸引力的性状。

17.通过权利要求1的方法产生的植物或其部分。

18.通过权利要求2的方法产生的植物或其部分。