CN102934607A

CN102934607A - 以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法

Info

Publication number: CN102934607A
Application number: CN2012104481463A
Authority: CN
Inventors: 沈亚欧; 潘光堂; 江舟; 杨珊; 林海建; 彭焕伟; 张志明; 罗旭; 马浪浪; 李婉蓉; 张兵
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2032-11-12
Also published as: CN102934607B

Abstract

本发明公开了以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，其包括：1.单倍体材料的获得及前处理；2.单倍体材料的培养；3.目的基因转化单倍体茎尖；4.转化苗的移栽和加倍处理。本发明的方法避免了玉米组织培养及再生过程，适用于大多数基因型玉米的遗传转化；以单倍体玉米茎尖为转基因受体的遗传转化技术是简易高效、省时省力、广泛适用的一种快速获得转基因玉米纯合体的新方法。

Description

以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法

技术领域

本发明属于农业育种领域，具体而言，涉及一种以单倍体玉米茎尖为受体的转基因玉米育种方法。

背景技术

转基因育种已经成为现代分子育种的一种重要手段。从80年代后期科学家开始进行玉米转基因研究，至今已经取得一些重要成果。国外已经有部分商业化种植的玉米转基因品种，例如高赖氨酸转基因玉米，抗玉米螟转基因玉米，抗除草剂转基因玉米等。而国内成功的例子还相对较少，转基因育种进程远远落后于美国等发达国家。在玉米转基因领域常用的遗传转化方法是以幼胚和幼胚诱导的胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导法。此类方法的特点是受体为二倍体的玉米材料，且须经历幼胚脱分化和再分化等复杂的组织培养过程。存在以下缺点：(1)不同基因型玉米幼胚的脱分化和再分化能力具有很大差异，很多生产上使用的骨干自交系由于甚至不能诱导出胚性愈伤组织，或者再分化效率极低，而不能作为转化受体，这限制了转基因玉米受体基因型的选择范围；(2)基因转化效率低，如果没有庞大的受体系统难以获得足够的转化事件，筛选出目的基因高效表达的转化体几率非常小；(3)目的基因遗传不稳定，基因沉默和基因丢失现象比较常见，难以获得目标性状稳定的转基因株系；(4)以二倍体玉米作为受体材料获得的当代转基因植株其目的基因在同源染色体上处于杂合状态，必须经过2代以上的自交才能获得纯合稳定的转基因株系，导致获得转基因纯合的株系周期太长。

近年来也开展了以植物单配体为受体系统的转基因研究。在烟草和大麦的上，以雌雄配子体及其培养形成的单倍体愈伤组织为受体已成功获得了阳性转化事件；利用组织培养技术进行花粉和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，进一步分化发育成单倍体植株，建立单倍体转基因受体系统。该技术在水稻和烟草上也有成功应用的报道。

无论以花粉、卵细胞等雌雄配子体作为受体的转基因技术都必须经历愈伤组织诱导和分化等组培过程，而单倍体的组培系统尚不成熟，培养再生植株非常困难，直接影响了阳性转化事件的获得；同时，在单倍体诱导愈伤组织的整个过程历时长，容易发生自然加倍现象，导致单倍体受体本身产生效率低；另外，此类技术的取材时间只能局限在植物生殖生长期，受到严重的季节限制。

发明内容

本发明针对以上存在问题，建立了单倍体玉米茎尖生长点直接分化受体系统，用农杆菌介导法将目的基因导入受体，再将阳性转基因植株进行加倍获得转基因二倍体玉米的方法。

为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，包括如下步骤：

(1)用单倍体诱导系stock6做为父本，以西南地区玉米骨干自交系18-599作为母本，进行杂交组配并收获F1代杂交种，从获得的种子中挑选胚乳顶部为紫色而胚为白色的种子，该种子大部分为单倍体；弃去胚乳顶部和胚均为紫色的二倍体种子；

(2)对获得的单倍体种子进行消毒，然后在培养箱中进行黑暗条件下培养，待胚芽生长到2～4cm：

(3)以含目的基因的表达载体制备含目的基因表达载体的转化农杆菌，筛选转化的农杆菌并制备成侵染液；

(4)切单倍体茎尖：在超净工作台上垫上提前灭过菌的滤纸，然后从培养基上用镊子取出步骤(2)中待转化的发芽植株，用手术刀先切去种子胚根，在茎节鼓起处以上1毫米左右的部分横向微切，轻轻剥去胚芽鞘露出茎尖生长点，再从中部纵向切伤茎尖生长点，伤口深度约1mm；

(5)农杆菌侵染茎尖：摆放好茎尖的培养皿置于真空干燥器中，并垫上泡沫塑料使其向茎尖一边倾斜，然后农杆菌侵染液滴加在培养皿中茎尖一方，使茎尖能完全接触菌液，完全盖上真空干燥器盖子，在30-70kPa压力下侵染6-12min；

(6)共培养：侵染结束后，用吸管快速吸净培养皿上多余的菌液，置于21～25℃继续暗培养4～6天，直至长出新叶，且节根长至1～2cm；

(7)共培养结束后，将长出新叶的转化苗用室温下的自来水洗掉表面的培养基和菌体，然后将其整齐的移栽到土壤中，先置于人工气候室避光生长2～3d，然后让植株在日温22～28℃、夜温15～21℃的条件下生长，直至植株3叶1心期；

(8)阳性单倍体植株的加倍处理：待步骤(7)中的阳性单倍体植株和对照植株生长至四叶一心期时，用除草剂进行加倍，具体方法为：将二甲基亚砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至单倍体植株的心叶处，每株约0.5-1.5ml，重复2-4次；

(9)阳性纯合转基因二倍体种子的获得

加倍处理后，待植株长至5叶期将其移栽到温室或大田，花期能正常散粉的均为加倍成功的阳性植株，将它们进行套袋自交，收获的种子即为纯合的转基因二倍体种子。

在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤(2)中的消毒过程包括如下步骤：将筛选得到的紫顶白胚的单倍体种子，在超净工作台上用75％乙醇消毒8分钟、0.1％氯化汞水溶液灭菌6分钟、无菌水洗涤3次；然后加1.5倍种子体积无菌水在24～26℃浸泡6小时；再用0.1％氯化汞水溶液灭菌10分钟、无菌水洗涤5次。

在本发明的一个优选实施方式中，培养所使用的培养基为改良的MS培养基，改良的MS培养基配方如下表所示：

在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体优选为以含目的基因Incw2的表达载体3300-27KD-Incw2-bar。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所属的侵染液的制备包括如下步骤：挑取农杆菌阳性单克隆置于含Kan和Rif的YEP液体培养基中于25～30℃避光振荡培养10～15h，使细菌处于对数生长期，离心收集菌体，将菌体用等体积的添加100μmo/LAS的浸染培养基重悬。

本发明的方法避免了玉米组织培养及再生过程，不受玉米基因型限制，适用于大多数基因型玉米的遗传转化；加倍后的转基因二倍体即属于转基因纯合体，可以直接用作为亲本自交系用于转基因玉米品种的组配，大大缩短了转基因玉米的育种年限；以单倍体茎尖作转化受体其转化效率大大提高，能获得大量的遗传转化事件，为筛选出目的基因高效表达的转化体奠定了材料基因；因此以单倍体玉米茎尖为转基因受体的遗传转化技术是简易高效、省时省力、广泛适用的一种快速获得转基因玉米纯合体的新方法。

具体实施方式

1.单倍体材料的获得及前处理

(1)用单倍体诱导系stock6做为父本，以西南地区玉米骨干自交系18-599作为母本，进行杂交组配并收获F1代杂交种用于下一步鉴定；

(2)从上述方法获得的种子中挑选胚乳顶部为紫色而胚为白色(紫顶白胚)的种子，该种子大部分为单倍体；弃去胚乳顶部和胚均为紫色(紫顶紫胚)的二倍体种子。

(3)单倍体种子的消毒：将筛选得到的紫顶白胚的单倍体种子，在超净工作台上用75％乙醇消毒8分钟、0.1％氯化汞水溶液灭菌6分钟、无菌水洗涤3次(第一次用2倍种子体积的无菌水洗1分钟，第二次用3倍种子体积无菌水洗2～3分钟，第三次用2倍种子体积无菌水洗1分钟)；然后加1.5倍种子体积无菌水在24～26℃浸泡6小时；再用0.1％氯化汞水溶液灭菌10分钟、无菌水洗涤5次(第一次用1倍种子体积无菌水洗1分钟，第二次用2倍种子体积无菌水洗1分钟，第三次用2～3倍种子体积无菌水洗2～3分钟，第四次用1～2倍种子体积无菌水洗5分钟，第五次用0.5倍种子体积无菌水洗1分钟)。

2.单倍体材料的培养

(1)将上述单倍体种子放入底部垫有滤纸并加无菌水浸湿的萌发盒，置于28℃黑暗条件下培养箱3天左右直到种子出芽；

(2)种子发芽后，在超净工作台上将发芽的种子按照发芽大小一致的标准转到改良的MS培养基(表1)上，置于28℃黑暗条件下的培养箱中，待胚芽生长到2～4cm，此时玉米茎尖处于易感受状态。

表1改良的MS培养基配方

3.目的基因转化单倍体茎尖

(1)以含目的基因Incw2的表达载体3300-27KD-Incw2-bar(其制备方法为：将商业化pCambia3300载体在37℃条件下经过Hind III和EcoR I双酶切1.5小时，然后回收载体骨架，与两端分别带有Hind III和EcoR I粘性末端的27KD-Incw2-nos基因表达盒在16℃条件下通过T₄DNA连接酶连接12小时，最后形成Incw2基因的玉米表达载体3300-27KD-Incw2-bar。)为例制备含目的基因表达载体的转化农杆菌：取2μl表达载体质粒加入到装有农杆菌感受态细胞的离心管，冰浴30min，37℃水浴3～5min，再冰浴5min，加入800μL无抗生素的YEP培养液，28℃振荡培养4～5h。4℃，5,000r/min离心5min后，倒掉部分上清至剩余菌液约200μl，涂布于含有Kan和Rif的抗性YEP培养基上，28℃暗培养2d左右至单菌落出现。

(2)侵染液的制备：挑取上述阳性单克隆置于含有2mL含50mg/LKan和50mg/LRif的YEP液体培养基中于28℃避光振荡培养12h，使细菌处于对数生长期(OD₆₀₀值为0.8～1.0)。在4℃、3,000r/min离心5min，收集菌体，将菌体用等体积的添加100μmo/LAS的浸染培养基重悬。

(3)切单倍体茎尖：在超净工作台上垫上提前灭过菌的滤纸，然后从培养基上用镊子取出步骤2中待转化的发芽植株，用手术刀先切去种子胚根(将切下的胚根对应原植株进行编号，用饱和α-溴萘溶液约25℃黑暗处理根尖2～3h。用蒸馏水或超纯水洗涤根尖2～3次，并不断用胶头滴管吹，洗约7min后，用新鲜固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)对根尖进行固定保存，用于下一步镜检观察染色体条数)，在茎节鼓起处以上1毫米左右的部分横向微切，轻轻剥去胚芽鞘露出茎尖生长点，再从中部纵向切伤茎尖生长点，伤口深度约1mm，摆放到灭过菌的直径为15cm的培养皿中，使茎尖一致朝向培养皿外侧缘壁，并盖上培养皿的盖子。

(4)农杆菌侵染茎尖：将真空干燥器放在超净工作台上，用75％的酒精擦拭消毒一遍并接上电源，将上述步骤(3)中摆放好茎尖的培养皿置于真空干燥器中，并垫上泡沫塑料使其向茎尖一边倾斜30°左右，然后将步骤(2)中准备好的农杆菌重悬液滴加在培养皿中茎尖一方，使茎尖能完全接触菌液。完全盖上真空干燥器盖子，在50kPa压力下侵染10min左右。在相同条件下设置对照组实验，茎尖用阴性菌液(即不含表达载体转化的农杆菌)侵染，其它条件完全一样。

(5)共培养：侵染结束后，用吸管快速吸净培养皿上多余的菌液，在超净工作台上将侵染过的材料按照原编号放在原MS培养基上，然后置于22～23℃继续暗培养4～6天，直至长出新叶，且节根长至1～2cm。

4.转化苗的移栽和加倍处理

(1)共培养结束后，将长出新叶的转化苗用室温下的自来水洗掉表面的培养基和菌体，然后将其整齐的移栽到花盆(花盆中的土壤装置离花盆边缘1～2厘米处，用温自来水浇透土壤，然后再覆盖一层大约1～2厘米的蛭石与花盆边缘平行，用温自来水浇透蛭石中)，先置于人工气候室避光生长2～3d，然后让植株在日温22～28℃、夜温15～21℃的条件下生长，隔天浇灌1/2MS培养基的无机盐溶液，直至植株3叶1心期。对照组做同样的处理。

(2)根尖镜检进一步筛选阳性单倍体

由于通过种子胚的颜色来鉴定其是否为单倍体，在一定程度上带有主观性，为了确保用于遗传转化的材料是单倍体，须对第7步中获得的阳性转化植株进行染色体数目鉴定。具体采用胚根压片镜检确定其是否为单倍体，方法如下：

对应编号查找阳性植株在步骤3中固定保存的胚根，并用蒸馏水对根尖进行洗涤，将固定液残留量降至最低。将6％纤维素酶与1％果胶酶以1∶1混合作为酶解液，先将根尖分放于凹玻板上，滴入上述酶解液，再用载玻片密封，37℃酶解1.5h，然后25℃下用双蒸水稀释多余的酶液。取一张预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片，滴加适量改良卡宝品红染液、压片。相差显微镜下，将分散效果好且易于观察的细胞分裂相进行显微摄影。随机观察30个细胞，将其中85％以上的细胞具有恒定一致的10条染色体数目的植株认定为单倍体，仅对此类阳性单倍体植株进行下一步的加倍处理。

(3)阳性单倍体植株的加倍处理

待步骤(2)中的阳性单倍体植株和对照植株生长至四叶一心期时，用除草剂进行加倍，具体方法为：用1.5％的二甲基亚砜溶解甲基胺草磷原液将其配制成终浓度为20μmol/L的溶液。将该溶液用滴管滴至单倍体植株的心叶处，每株约1ml，重复3次。

(4)阳性纯合转基因二倍体种子的获得

以含有目的基因Incw2的表达载体转化玉米单倍体茎尖为例，共组配了100个18-599×stock6个F1代，收获100个果穗共计20000粒左右杂交种子，从中筛选出了914颗紫顶白胚的单倍体种子作为转基因受体，最终获得了21个纯合的二倍体转基因玉米，转化效率高。从转基因受体材料的组配到获得纯合的转基因二倍体种子，整个周期不超过10个月，大大缩短了转基因育种进程。

914颗单倍体种子中，正常发芽的713颗，发芽率约78％；切茎尖后经农杆菌侵染和共培养后正常存活349株，即遗传转化后存活率约49％；移栽后存活335株，存活率约96％。

在3叶1心期经PCR鉴定，335株植株中PCR扩增出特异性目的条带的植株有106株，将所有扩增出的目的条带进行测序分析，结果显示均与目的基因序列完全一致，即此方法转化效率高达14.9％(106/713)。

经根尖压片镜检，106株阳性转基因植株中有73株含10条染色体，即单倍体；另外33株含20条染色体，即二倍体。因此通过此方法，获得的阳性转基因单倍体转化效率为10.2％(73/713)。

以上73株阳性单倍体植株经除草剂加倍处理后，花期正常散粉并结实的共21株，加倍率为28.8％，即通过该技术共获得了转Incw2基因的阳性转基因纯合体共21株。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，包括如下步骤：

(5)农杆菌侵染茎尖：摆放好茎尖的培养皿置于真空干燥器中，并垫上泡沫塑料使其向茎尖一边倾斜，然后农杆菌侵染液滴加在培养皿中茎尖一方，使茎尖能完全接触菌液，完全盖上真空干燥器盖子，在30-70kPa压力下侵染6～12min；

(7)共培养结束后，将长出新叶的转化苗用室温下的自来水洗掉表面的培养基和菌体，然后将其整齐的移栽到土壤中，先置于人工气候室避光生长2～3d，然后让植株在日温22～28℃、夜温15～21℃的条件下生长，直至植株3叶1心期；任选的，包括根尖镜检筛选阳性单倍体步骤；

(9)阳性纯合转基因二倍体种子的获得

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于所述步骤(2)中的消毒过程包括如下步骤：将筛选得到的紫顶白胚的单倍体种子，在超净工作台上用75％乙醇消毒8分钟、0.1％氯化汞水溶液灭菌6分钟、无菌水洗涤3次；然后加1.5倍种子体积无菌水在24～26℃浸泡6小时；再用0.1％氯化汞水溶液灭菌10分钟、无菌水洗涤5次。

3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于培养所使用的培养基为改良的MS培养基，改良的MS培养基配方如下表所示：

4.根据权利要求1所述的转基因育种方法，其特征在于所述的载体为以含目的基因Incw2的表达载体3300-27KD-Incw2-ba。

5.根据权利要求1所述的转基因育种方法，其特征在于所属的侵染液的制备包括如下步骤：挑取农杆菌阳性单克隆置于含Kan和Rif的YEP液体培养基中于25-30℃避光振荡培养10-15h，使细菌处于对数生长期，离心收集菌体，将菌体用等体积的添加100μmo/LAS的浸染培养基重悬。