CN105284626A - 玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法 - Google Patents
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Abstract
玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法属生物工程领域，本发明包括下列步骤：1.将玉米自交系成熟种子进行消毒、接种；2.将玉米种子萌发幼苗茎节进行遗传转化；3.将遗传转化的玉米茎节转移到共培养基中；4.将玉米茎节从共培养基中转移到诱导培养基中；5.将玉米茎节再生苗进行炼苗和室内移栽；6.将玉米茎节再生苗向田间移栽。与传统的玉米体细胞胚胎发生途径相比，本发明通过器官发生途径直接成苗，可在短期内迅速获得大量再生植株，且不受基因类型和季节限制，取材方便，不易污染、成苗率高，为玉米遗传转化产业化研究奠定了坚实基础。
Description
技术领域
本发明属生物工程技术领域，涉及利用玉米自交系无菌苗的茎节直接成苗的方法，并将其与农杆菌介导的玉米遗传转化方法相结合建立起的一套新的玉米遗传转化方法，此方法可快速、高效的获得完整的转基因植株。
背景技术
玉米是一种重要的粮食和饲料作物，其遗传改良工作一直倍受关注。转基因受体系统的建立是进行玉米转基因操作的关键。良好的受体系统要符合五个条件：再生能力高且稳定；遗传稳定性好；受体材料很容易获得；农杆菌能转化受体材料；转化后的材料能够筛选。由幼胚诱导的愈伤组织是目前应用最广泛的受体材料，但是幼胚诱导愈伤组织受到很多因素的限制，基因型是其中一个关键的因素，培养基和光照条件等影响也较大。为了免去愈伤组织的诱导、分化等复杂的过程，我们以玉米自交系成熟种子幼苗茎节为外植体，通过对诱导培养基中激素浓度、茎节大小等若干因素进行研究，建立了一套不受季节限制、高效稳定的遗传转化受体系统，此过程不需要诱导愈伤组织，时间短，取材方便，更容易获得再生植株。目前为止未见玉米茎节遗传转化直接成苗的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法。
本发明的一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法包括下列步骤：
(1)将玉米自交系成熟种子进行消毒、接种，包括下列步骤：
1.1将玉米自交系成熟种子用70％乙醇和0.1％HgCl2依次消毒12min，无菌水冲洗3-5次；
1.2将经步骤1.1处理后的玉米种子接种到种子萌发培养基中，24-26℃完全黑暗条件下萌发；
1.3待幼苗高度达到1cm-2cm时，置光下生长；
(2)将玉米种子萌发幼苗的茎节进行遗传转化，包括下列步骤：
2.1当玉米幼苗高度达到3-5cm时，在无菌条件下切取茎节，茎节以上保留0.5cm，茎节以下保留0.5cm，作为遗传转化受体使用，将茎节接种于重悬培养基中准备进行遗传转化；
2.2制备重悬液，包括下列步骤：
2.2.1收集菌体：采用农杆菌菌株EHA105，将经过划线活化、含有目的基因载体的农杆菌菌液扩摇到10mlYEP培养基中，28℃，180rpm扩摇过夜，再将扩摇过夜的农杆菌菌液扩摇到40mlYEP培养基中，28℃，180rpm扩摇到OD600在0.8-1.0的范围内，4℃，10000rpm离心10min收集菌体；
2.2.2重悬菌液：向步骤2.2.1收集的菌体中加入重悬培养基，重悬菌液OD600在0.6-0.7的范围内，重悬菌液在两小时内使用；
(3)将经步骤(2)遗传转化的玉米茎节转移到共培养培养基中：将侵染后的茎节在无菌纸上放置5分钟以吸附其表面的水分，然后将玉米茎节垂直放到共培养基上散光培养，共培养温度为24-26℃，共培养时间为48-72h；
(4)将玉米茎节从共培养基中转移到诱导培养基中：将步骤(3)中经过共培养的玉米茎节垂直接种到诱导培养基上，成苗的光照强度为7500lux，温度为24-26℃，湿度为80％；
(5)将玉米茎节再生苗进行炼苗和室内移栽，包括下列步骤：
5.1选取经诱导形成的健壮玉米幼苗，进行开盖壮苗处理，壮苗时将诱导培养基表面覆盖5-10ml的无菌水，且每日更换无菌水，炼苗的光照强度为7500lux，炼苗的温度为24-26℃，开盖炼苗的时间为5-7d；
5.2将经步骤5.1开盖炼苗的玉米幼苗取出，洗净琼脂，光照培养室内移栽于按草炭土：蛭石：珍珠岩＝3:1:1配制的土壤中，并进行覆膜保湿；
5.3移栽后的2-3天内避免阳光直接照射，4-5天后置光下培养，移栽炼苗的玉米幼苗的培养温度为24-26℃；
(6)玉米茎节再生苗向田间移栽：将步骤(5)中经室内炼苗的茎节再生苗连同盆内的土，在避免阳光直接照射的情况下，移栽到田间或温室中，移栽前3天避免浇水，移栽后每天浇灌1次，每次200ml。
步骤(1)所述种子萌发培养基的成分和浓度为：1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)6.5g/L。
步骤(2)所述重悬培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L，pH为6.0。
步骤(3)所述共培养培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)6.5g/L，pH为6.0。
步骤(4)和(5)所述诱导培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)500-600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)5.5-6.5g/L、头孢噻肟钠400mg/L，pH为6.0。
所述改良MS有机成分和浓度为：VB110mg/L、VB61mg/L、烟酸1mg/L、甘氨酸0.05mg/L、肌醇100mg/L、生物素0.05mg/L。
本发明具有以下优点：
第一，玉米成熟种子切取的茎节直接成苗，不受季节限制，取材方便，只要有成熟的种子就可进行工作。
第二，与玉米胚胎发生途径相比，通过器官发生途径直接成苗，可在较短的时间内获得大量的再生植株。本发明无疑为利用基因工程技术改良玉米种质提供了一个良好的受体体系。另外茎节培养外植体是来自无菌的组培苗,因此有不易污染的优点。
第三，本发明的受体系统成苗率高达91.2％，畸形苗出现概率极低。
第四，本发明与农杆菌介导的玉米遗传转化方法相结合，能够快速、有效的将目的基因导入到玉米受体细胞内。
第五，本发明以玉米茎节为外植体，研究了通过直接器官发生途径获得再生植株并且进行遗传转化的过程，为进一步开展玉米的遗传转化奠定基础。
附图说明
图1为玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗方法的流程图
图2为玉米自交系种子消毒、接种的照片
图3为玉米植株生长至出现茎节的照片
图4为切取的玉米茎节外植体的照片
图5为玉米茎节经遗传转化后共培养的照片
图6为玉米茎节置于再分化培养基培养7天时大小的照片
图7为将玉米茎节接种于再分化培养基的照片
图8为室内开口壮苗的照片
图9为移栽后室内炼苗的照片
图10为田间移栽、生长以及成活的照片
图11为玉米套袋授粉后种子收获的照片
具体实施方式
本发明的一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法包括下列步骤：
(1)将玉米自交系成熟种子进行消毒、接种，包括下列步骤：
1.1将玉米自交系成熟种子用70％乙醇和0.1％HgCL2依次消毒12min，无菌水冲洗3-5次；
1.2将经步骤1.1处理后的玉米种子接种到种子萌发培养基中，24-26℃完全黑暗条件下萌发；
1.3待幼苗高度达到1cm-2cm时，置光下生长；
(2)将玉米种子萌发幼苗的茎节进行遗传转化，包括下列步骤：
2.1当玉米幼苗高度达到3-5cm时，在无菌条件下切取茎节，茎节以上保留0.5cm，茎节以下保留0.5cm，作为遗传转化受体使用，将茎节接种于重悬培养基中准备进行遗传转化；
2.2制备重悬液，包括下列步骤：
2.2.1收集菌体：采用农杆菌菌株EHA105，将经过划线活化、含有目的基因载体的农杆菌菌液扩摇到10mlYEP培养基中，28℃，180rpm扩摇过夜，再将扩摇过夜的农杆菌菌液扩摇到40mlYEP培养基中，28℃，180rpm扩摇到OD600在0.8-1.0的范围内，4℃，10000rpm离心10min收集菌体；
2.2.2重悬菌液：向步骤2.2.1收集的菌体中加入重悬培养基，重悬菌液OD600在0.6-0.7的范围内，重悬菌液在两小时内使用；
(3)将经步骤(2)遗传转化的玉米茎节转移到共培养培养基中：将侵染后的茎节在无菌纸上放置5分钟以吸附其表面的水分，然后将玉米茎节垂直放到共培养基上光照培养，共培养温度为24-26℃，共培养时间为48-72h；
(4)将玉米茎节从共培养基中转移到诱导培养基中：将步骤(3)中经过共培养的玉米茎节垂直接种到诱导培养基上，成苗的光照强度为7500lux，温度为24-26℃，湿度为80％；
(5)将玉米茎节再生苗进行炼苗和室内移栽，包括下列步骤：
5.1选取经诱导形成的健壮玉米幼苗，进行开盖壮苗处理，壮苗时将诱导培养基表面覆盖5-10ml的无菌水，且每日更换无菌水，炼苗的光照强度为7500lux，炼苗的温度为24-26℃，开盖炼苗的时间为5-7d；
5.2将经步骤5.1开盖炼苗的玉米幼苗取出，洗净琼脂，光照培养室内移栽于按草炭土：蛭石：珍珠岩＝3:1:1配制的土壤中，并进行覆膜保湿；
5.3移栽后的2-3天内避免阳光直接照射，4-5天后置光下培养，移栽炼苗的玉米幼苗的培养温度为24-26℃；
(6)玉米茎节再生苗向田间移栽：将步骤(5)中经室内炼苗的茎节再生苗连同盆内的土，在避免阳光直接照射的情况下，移栽到田间或温室中，移栽前3天避免浇水，移栽后每天浇灌1次，每次200ml。
步骤(1)所述种子萌发培养基的成分和浓度为：1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)6.5g/L。
步骤(2)所述重悬培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L，pH为6.0。
步骤(3)所述共培养培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)6.5g/L，pH为6.0。
步骤(4)和(5)所述诱导培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)500-600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)5.5-6.5g/L、头孢噻肟钠400mg/L，pH为6.0。
所述改良MS有机成分和浓度为：VB110mg/L、VB61mg/L、烟酸1mg/L、甘氨酸0.05mg/L、肌醇100mg/L、生物素0.05mg/L。
所涉及的MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐和改良MS有机成分的详细内容如下：
MS大量元素
备注：配制1000ml培养基时，吸取20×母液50ml。
MS微量元素
备注：配制1000ml培养基时，吸取200×母液5ml。
MS铁盐
备注：配制1000ml培养基时，吸取200×母液5ml。
保存于棕色磨口瓶中。
改良MS有机成分
备注：配制1000ml培养基时，吸取200×母液5ml。
Claims (6)
1.一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)将玉米自交系成熟种子进行消毒、接种，包括下列步骤：
1.1将玉米自交系成熟种子用70％乙醇和0.1％HgCl2依次消毒12min，无菌水冲洗3-5次；
1.2将经步骤1.1处理后的玉米种子接种到种子萌发培养基中，24-26℃完全黑暗条件下萌发；
1.3待幼苗高度达到1cm-2cm时，置光下生长；
(2)将玉米种子萌发幼苗的茎节进行遗传转化，包括下列步骤：
2.1当玉米幼苗高度达到3-5cm时，在无菌条件下切取茎节，茎节以上保留0.5cm，茎节以下保留0.5cm，作为遗传转化受体使用，将茎节接种于重悬培养基中准备进行遗传转化；
2.2制备重悬液，包括下列步骤：
2.2.1收集菌体：采用农杆菌菌株EHA105，将经过划线活化、含有目的基因载体的农杆菌菌液扩摇到10mlYEP培养基中，28℃，180rpm扩摇过夜，再将扩摇过夜的农杆菌菌液扩摇到40mlYEP培养基中，28℃，180rpm扩摇到OD600在0.8-1.0的范围内，4℃，10000rpm离心10min收集菌体；
2.2.2重悬菌液：向步骤2.2.1收集的菌体中加入重悬培养基，重悬菌液OD600在0.6-0.7的范围内，重悬菌液在两小时内使用；
(3)将经步骤(2)遗传转化的玉米茎节转移到共培养培养基中：将侵染后的茎节在无菌纸上放置5分钟以吸附其表面的水分，然后将玉米茎节垂直放到共培养基上散光培养，共培养温度为24-26℃，共培养时间为48-72h；
(4)将玉米茎节从共培养基中转移到诱导培养基中：将步骤(3)中经过共培养的玉米茎节垂直接种到诱导培养基上，成苗的光照强度为7500lux，温度为24-26℃，湿度为80％；
(5)将玉米茎节再生苗进行炼苗和室内移栽，包括下列步骤：
5.1选取经诱导形成的健壮玉米幼苗，进行开盖壮苗处理，壮苗时将诱导培养基表面覆盖5-10ml的无菌水，且每日更换无菌水，炼苗的光照强度为7500lux，炼苗的温度为24-26℃，开盖炼苗的时间为5-7d；
5.2将经步骤5.1开盖炼苗的玉米幼苗取出，洗净琼脂，光照培养室内移栽于按草炭土：蛭石：珍珠岩＝3:1:1配制的土壤中，并进行覆膜保湿；
5.3移栽后的2-3天内避免阳光直接照射，4-5天后置光下培养，移栽炼苗的玉米幼苗的培养温度为24-26℃；
(6)玉米茎节再生苗向田间移栽：将步骤(5)中经室内炼苗的茎节再生苗连同盆内的土，在避免阳光直接照射的情况下，移栽到田间或温室中，移栽前3天避免浇水，移栽后每天浇灌1次，每次200ml。
2.按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特征在于步骤(1)所述种子萌发培养基的成分和浓度为：1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)6.5g/L。
3.按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特征在于步骤(2)所述重悬培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L，pH为6.0。
4.按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特征在于步骤(3)所述共培养培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)6.5g/L，pH为6.0。
5.按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特征在于步骤(4)和(5)所述诱导培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白(CH)500-600mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L、蔗糖(sugar)30g/L、琼脂(agar)5.5-6.5g/L、头孢噻肟钠400mg/L，pH为6.0。
6.按权利要求2、3、4、5所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特征在于所述改良MS有机成分和浓度为：VB110mg/L、VB61mg/L、烟酸1mg/L、甘氨酸0.05mg/L、肌醇100mg/L、生物素0.05mg/L。
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