CN107119069B - 一种玉米自交系茎尖活体转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，涉及一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法，该方法是以玉米自交系SL1303为受体材料进行农杆菌介导的茎尖活体转化转入外源基因，获得转基因玉米。该方法与传统的农杆菌介导转基因方法相比，具有许多不可比拟的优势：成本低，操作简便，不受季节、植物发育时期等因素的限制，而且当代即可获得转基因的种子，T₂代可获得纯合的转基因株系，无需组培再生阶段，对于保持主栽品种的生产力而改善其某一性状具有特殊的优势，有望发展为玉米转基因的常规技术，在提高玉米的品质性状和抗逆性能等方面的品种改良中发挥重要作用。

Description

一种玉米自交系茎尖活体转化方法

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种玉米自交系茎尖活体转化方法。我们将玉米PIFs基因在玉米自交系SL1303中进行农杆菌介导的茎尖活体转化，将含有除草剂筛选标记的外源基因ZmPIF1和ZmPIF3转入到玉米茎尖，通过除草剂草丁膦筛选获得了阳性植株，并进行PCR检测，通过正交实验对转化条件进行综合研究，创建了适合玉米自交系SL1303农杆菌介导的茎尖活体转化的最优方案。农杆菌介导的茎尖活体转化与传统的农杆菌介导转基因方法相比，具有许多不可比拟的优势：成本低，操作简便，不受季节、植物发育时期等因素的限制，有望发展为玉米转基因的常规技术，为今后利用该方法进行玉米的转基因提供坚实的基础。

背景技术

1植物转基因的方法

植物转基因是利用重组DNA技术将克隆到的优良目的基因导入植物细胞或组织，并在其中进行表达，从而获得具新性状的植物。这一技术绕过了物种生殖隔离的障碍，使基因交流的范围扩大到整个生物界，可将从细菌、病毒、动物、远缘植物甚至人工合成的基因导入植物(魏松红等，2002)。自1984年，世界第一例转基因植物——烟草问世以来，转基因植物产生至今仅20多年时间，其研究和应用得到了非常迅猛的发展，常规的植物转基因方法已日趋成熟。大体可分为物理诱导DNA直接插入法、化学诱导DNA直接插入法以及载体转化法三种转化方法。

1.1物理诱导DNA直接插入法

物理诱导DNA直接插入法包括电激法、超声波介导法、子房注射法、花粉管通道法和基因枪法等。1986年Fromm等人首次成功用电激法转化了玉米原生质体(Fromm et al.,1986)。张宏等人利用超声波法转化玉米愈伤组织获得转基因植株(张宏等，1997)。1993年丁群星等用子房注射法把Bt基因导入玉米，成功获得了转基因植株(丁群星等，1993)。

基因枪法是植物遗传转化比较常用的方法之一，基因枪法由美国Cornell大学的Sanford等研究提出(Sanford et al.,1987)。其原理是通过亚精胺、CaCl₂等试剂将DNA包被在重金属颗粒(如钨粉、金粉等)上制成微弹，利用基因枪产生的高压冲力将携带外源目的基因的微弹直接导入受体细胞，外源基因随机整合到植物染色体中，从而实现外源基因在被转化植物中的表达和稳定遗传(李宝山，2008)。1987年,Klein等首次将基因枪法应用于植物转基因研究，并于1989年第一次使用基因枪法转化玉米获得成功(Klein et al.,1989)。

1.2化学诱导DNA直接插入法

化学诱导DNA直接插入法主要包括PEG介导法和脂质体介导法。PEG介导法主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L‐鸟氨酸、磷酸钙及存在高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子(刘俊等，2005)。PEG介导法目前在玉米中得到了应用(Liang et al.,2014)。脂质体介导法是通过植物原生质体的吞噬或与细胞膜的融合作用把被脂质体包装成球状的外源DNA转入受体细胞中。脂质体介导法一般应用动物细胞转化，植物细胞转化的应用还比较少。王瓞等人利用烟草研究过脂质体介导基因转染的最优条件(王瓞等，1997)。脂质体介导法和PEG法都是以植物的原生质体为受体材料，因此这两种方法对于原生质体再生困难的植物来说，受到了一定的限制。

1.3载体转化法

载体转化法主要有病毒介导法和农杆菌介导法两种。病毒介导法主要是以双链DNA病毒作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物，病毒介导法曾被用于油菜的转化研究(王苏燕等，1997)。农杆菌介导法是一种天然的基因转化方法。目前，农杆菌介导法是玉米转基因最常用的方法，本研究玉米中的转化也是采用的农杆菌介导法，因此将在下文作更为详细的说明。农杆菌介导法与其他方法相比，具有转化效率较高、插入外源DNA片段大小明确、造成最小的DNA重排、多拷贝整合现象较少、不易发生基因沉默、能够导入大片段DNA、成本较小、操作简便等几大优势。

2农杆菌介导法的原理

农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)细菌，用于植物转化的农杆菌分为根瘤农杆菌和发根农杆菌。根瘤农杆菌应用更广，根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导(Ti)质粒，Ti质粒上含有可转移DNA(T‐DNA)区、毒性区(Vir区)以及冠廖碱代谢基因编码区。T‐DNA两端是两个25bp的重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘦碱合成基因。Vir区中也含有多个基因段，如virA、virB、virC、virD、virE、virG、virH等，每个基因段都含有多个基因。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因(chvA、chvB等)介导的趋化性促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面；另一方面则被Ti质粒上由virA和virG组成的双组分调节系统识别，从而诱导其他vir基因的表达。vir基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌T‐DNA两端25bp序列，进而将T‐DNA以单链的形式切割下来，同时，Vir基因编码的virE2能够与单链T‐DNA结合，形成T‐复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质(Juhas et al.,2008)。之后便是宿主细胞的转运过程，激活Ti质粒上处于反式位置上的一段T‐DNA的转移，并插入到植物基因组中，使其携带的目的基因在植物中得以表达。反应过程主要包括以下几步:(1)农杆菌对植物伤口的识别与吸附；(2)virG的信号传导及vir基因的诱导表达；(3)T‐DNA复合物的形成并通过农杆菌进入植物细胞；(4)T‐DNA复合物的成熟；(5)T‐DNA整合进植物基因组并进行表达(Gelvin，2010)。

3农杆菌介导法的发展历史

发展一种成熟的方法用于农杆菌介导的遗传转化是一个非常复杂的任务，因为必须了解影响T‐DNA传递到愈伤组织的所有因素，然后还要诱导愈伤组织再分化形成再生植株。植株再生后，还需要进行进一步的分析，以检查T‐DNA的结合及稳定性，并获得最终转化效率参数。

农杆菌介导法从1983年创建以来，在双子叶植物遗传转化中得到广泛应用，但玉米起初却一直难以运用这种方法进行转化。因为单子叶植物并不是农杆菌的天然宿主，Portrykus曾认为农杆菌转化单子叶植物是不可能的(Potrykus，1990，1991)。禾谷科作物如水稻、小麦、玉米都是单子叶植物，是人类重要的粮食作物，利用基因工程技术对这类植物进行研究具有十分重要的价值。随着对农杆菌转化植物细胞的原理进行系统研究，发现农杆菌对单子叶植物浸染的不敏感性，可能是因为单子叶植物创伤后，在伤口附近往往发生木质化或硬化，而且没有明显的细胞分裂发生，内源信号分子相对不足，不能形成足量的诱导vir区基因表达的酚类化合物(Amoah et al.,2001)。

1984年，Hernalstenns等通过农杆菌介导法成功转化单子叶植物石刁柏的应用报道，首次证实了根癌农杆菌是可以转化单子叶植物的，并为根癌农杆菌转化单子叶植物的研究提供了理论依据和技术支撑，为近年来单子叶植物的转化研究的不断发展奠定了坚实基础(Hernalsteens et al.,1984)。从20世纪90年代早期开始，研究者为了通过农杆菌介导法获得能够稳定遗传的转基因玉米而进行了许多努力。

第一株通过农杆菌介导法获得的转基因玉米诞生于1996年，Ishida等在前人探索与研究的基础上，利用农杆菌LBA4404转化玉米自交系A188幼胚，获得了转基因玉米，且转化率达5％‐30％，并且证明了外源基因的成功整合、表达以及稳定遗传(Ishida et al.,1996)。该研究在一定程度上充分证实了玉米通过农杆菌介导进行遗传转化的可行性，并为今后的研究提供了可靠的科学依据。

玉米等单子叶植物非农杆菌天然宿主,遗传转化率低，即使获得少量转基因植株也因遗传稳定性差、基因表达水平低及嵌合体等问题而限制了对后代的选择和利用。因此研究影响农杆菌转化效率的因素，优化转化体系是用农杆菌转化玉米工作的重点。

4玉米茎尖活体转化的研究进展

农杆菌介导的茎尖活体转化，是一种重要的遗传转化方法，这种方法操作简单，不会因为植物组织培养而产生体细胞变异，且不受季节限制，被大量地应用于植物外源基因的转化上。目前在棉花、水稻、高粱、玉米及小麦上均有以茎尖生长点为受体进行农杆菌转化的大量报道。

玉米农杆菌介导的茎尖活体转化，2009年孙传波等以玉米自交系郑58的茎尖为受体，通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米茎尖，经PCR检测，7株转化植株呈阳性，转化率达7.14％，初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中(孙传波等，2009)。2010年余桂容等对10种玉米自交系在茎尖转化过程中最佳的芽生长时间、移栽成活率、除草剂筛选浓度进行了研究，并且成功转化4种玉米自交系(余桂容等，2010)。2011年梁广东等以玉米自交系鲁9801、K10芽尖为受体，采用农杆菌介导法进行转化，获得了转BcWRKY1基因阳性植株(梁广东等，2011)。2012年汪婷婷等研究了玉米自交系天塔五母和7922在茎尖转化过程中最佳真空渗透和共培养时间并成功获得转基因植株(汪婷婷等，2012)。

玉米自交系SL1303是由是研究玉米耐盐的理想材料，其茎尖活体转化方法尚未有报道。

发明内容

本发明目的是提供一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法。

本发明公开了一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法，该方法是以玉米自交系SL1303为受体材料进行农杆菌介导的茎尖活体转化转入外源基因，获得转基因玉米。

具体地，是以玉米自交系SL1303为受体材料的进行农杆菌介导的茎尖活体转化，将含有除草剂筛选标记的外源基因转入到玉米茎尖，通过浓度为50mg/L的除草剂草丁膦筛选获得了抗性植株。

进一步地，所述外源基因包括但不限于ZmPIF1和ZmPIF3。

作为优选的方案，本发明中农杆菌侵染时选用超毒农杆菌菌株EHA105，农杆菌浓度OD₆₀₀值为0.6，乙酰丁香酮浓度为150μg/L时植株阳性率最高。

本发明方法与传统的农杆菌介导转基因方法相比，具有许多不可比拟的优势：成本低，操作简便，不受季节、植物发育时期等因素的限制，而且当代即可获得转基因的种子，T₂代可获得纯合的转基因株系，无需组培再生阶段，对于保持主栽品种的生产力而改善其某一性状具有特殊的优势，有望发展为玉米转基因的常规技术，在提高玉米的品质性状和抗逆性能等方面的品种改良中发挥重要作用。

附图说明

图1同源重组法构建p1011-v-bar-ZmPIF1和p1011-v-bar-ZmPIF3载体简易流程。

图2含p1011-v-bar-ZmPIF1和p1011-v-bar-ZmPIF3质粒农杆菌PCR结果。M：Marker2504，泳道1-4：p1011-v-bar-ZmPIF1转化的农杆菌，泳道6-9：p1011-v-bar-ZmPIF3转化的农杆菌。

图3含p1011-v-bar-ZmPIF1农杆菌ZmPIF1测序A73375_S11_1411036154J：测序农杆菌菌液的序列；ZmPIF1：ZmPIF1基因序列。

图4含p1011-v-bar-ZmPIF3农杆菌ZmPIF3测序。A73375_S01_1411029763J：测序农杆菌菌液的序列；ZmPIF3：ZmPIF3基因序列。

图5玉米茎尖活体转化过程。A：种子萌发；B：茎尖剥离；C：真空侵染。

图6农杆菌介导玉米茎尖活体转化草丁膦处理前后图。A：草丁膦处理前；B：草丁膦处理后。

图7转基因玉米Bar基因部分PCR鉴定结果。M：Marker2501；-：SL1303；+：质粒；H：超纯水；1-20：编号为ZmPIF1-SL1303-1至ZmPIF1-SL1303-20再生植株。

图8转基因玉米Bar基因部分PCR鉴定结果。M：Marker2501；-：SL1303；+：质粒；H：超纯水；1-20：编号为ZmPIF3-SL1303-1至ZmPIF3-SL1303-20再生植株

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合具体参数、生物材料、附图进行具体说明，不应理解为对本发明保护范围的进一步限定。

实施例1：实验材料

1植物材料

玉米自交系SL1303，该受体是对盐敏感的玉米自交系材料(Gao Y,Lu Y,Wu M,Liang E,Li Y,Zhang D,Yin Z,Ren X,Dai Y,Deng D,Chen J.Ability to Remove Na⁺andRetain K⁺Correlates with Salt Tolerance in Two Maize Inbred LinesSeedlings.Frontiers in Plant Science,2016,7,1716)。

2菌株与质粒

双T超毒载体p1011-v-bar由本实验室陈云构建(陈云，含virG基因双T-DNA表达载体的构建及转化小麦的研究.扬州大学硕士学位论文，2015)，大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌EHA105、根癌农杆菌LBA4404原始菌株购自上海生工生物工程技术服务公司，其感受态细胞由本实验室制备并保存。

3实验试剂

BamHⅠ酶和T4DNA连接酶购自New England Biolabs有限公司。同源重组酶

II购自南京诺唯赞生物科技有限公司。胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒与质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。普通Taq酶与Taq-Plus酶购自TAKARA生物科技有限公司。LB培养基、草丁膦除草剂、氨苄青霉素和卡那霉素购自上海生工生物工程技术服务公司。

4PCR引物

该方法应用同源重组原理进行连接，在同源重组中为了保证目的片段插入载体的方向，上、下游引物的5’端分别加入BamHⅠ及该酶切位点前后约15个碱基的载体序列。同源重组方法使用的引物为：ZmPIF1-F-TY、ZmPIF1-R-TY和ZmPIF3-F-TY、ZmPIF3-R-TY。根据BAR基因的序列设计检测引物BAR-F-490和BAR-R-490，引物序列见表1.1，引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成，序列测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

表1.1引物序列

实施例2：同源重组法构建玉米转基因载体

1目的基因ZmPIF1、ZmPIF3的扩增

以p19S-ZmPIF1和p19S-ZmPIF3为模板，用同源重组特异引物扩增目的基因。扩增产物大小分别为1746bp和1983bp，PCR反应体系与反应程序参照TAKARA Taq-Plus酶的说明书，扩增后的PCR反应产物用1％的琼脂糖电泳检测，大小正确的条带切胶回收-20℃保存。

2载体酶切

在同源重组构建载体的方法中，用BamHⅠ限制性内切酶对p1011-v-bar载体切割。酶切体系：1μl BamHⅠ，2μl Buffer M，17μl p1011-v-bar，总体系为20μl。酶切体系置37℃反应2h。酶切产物进行DNA纯化。

3目的片段与表达载体同源重组

将ZmPIF1和ZmPIF3的PCR扩增产物同源重组入p1011-v-bar。同源重组反应体系：2μl Exnase TM II，4μl 5×CE II buffer，3.5μl p1011-v-bar，1μl目的片段，9.5μlddH2O，总体系为20μl。连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，转化菌涂布含卡那霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序，获得重组的表达载体，其构建简易流程如图1。扩摇测序正确的菌液并保存，获得重组载体p1011-v-bar-ZmPIF1和p1011-v-bar-ZmPIF3，-20℃保存。

4制备感受态农杆菌以及农杆菌转化

(1)取感受态农杆菌细胞200μl，加入质粒2-5μl；

(2)冰上10min；

(3)液氮10min；

(4)37℃，10min，300rpm(提前准备)；

(5)加入800μl LB液体培养基，28℃，3h，350rpm；

(6)6000rpm离心，吸去上清800μl，涂板；

(7)28℃，培养48h；

(8)挑取转化子，提取质粒，用ZmPIF1和ZmPIF3基因引物进行PCR鉴定，鉴定为阳性的可直接用于玉米的转化。

结果显示转p1011-v-bar-ZmPIF1的农杆菌在1746bp左右的位置有明亮单一的条带，转p1011-v-bar-ZmPIF3的农杆菌在1983bp左右的位置有明亮单一的条带(图2)，表明p1011-v-bar-ZmPIF1和p1011-v-bar-ZmPIF3载体构建成功，并且已经转入农杆菌EHA105中。菌落PCR产物测序，测序引物为克隆引物，测序结果的序列比对正确(图3和图4)。

实施例3：草丁膦除草剂最适筛选浓度的选定

农杆菌介导玉米茎尖活体转化侵染及共培养完成后，需要对长至2-3叶期的玉米进行草丁膦除草剂筛选处理，参照相关文献，我们最初选用了200mg/L草丁膦除草剂对农杆菌转化后的材料进行筛选处理，结果造成了植株全部死亡的失败案例。因此设计了实验来选定玉米自交系SL1303草丁膦除草剂的最适筛选浓度。

将草丁膦除草剂配成25、50、75mg/L三种不同浓度的水溶液，对2-3叶期的玉米自交系SL1303(90株)用不同浓度的草丁膦除草剂喷洒，以叶片挂液珠为准，喷施蒸馏水作为对照，喷洒后观察叶片变化及植株存活情况，每周统计存活株数，确定转基因植株的最佳筛选浓度。

喷施除草剂三天后，植株停止生长，叶尖开始变黄；七天后，喷施高浓度除草剂的植株有一半已经死亡，低浓度有部分死亡；十五天后喷施75mg/L草丁膦的植株全部死亡，喷施25及50mg/L草丁膦的植株死亡率分别为53.3％、92.2％(表3.1)，而对照组生长正常，由于刚侵染完的植株生命力弱，浓度过高可能会将部分成功转化的植株杀死，因此选用50mg/L草丁膦作为玉米自交系SL1303转基因植株的最适筛选浓度。

表3.1不同浓度草丁膦对SL1303幼苗死亡的影响

实施例4：通过正交实验对转化条件的优化

关于茎尖活体转化的实验方案，我们查阅了大量已报道的相关文献，发现玉米茎尖活体转化过程中由于受体基因型的不同，所采用农杆菌的菌种、菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、浸染及共培养条件等因素也都不相同，转化效果也不相同，因此需要通过正交实验找出适合玉米自交系SL1303的最优转化条件。

正交实验的实验因素包括：农杆菌菌种、菌液浓度、乙酰丁香酮(AS)浓度共3个因素，每个因素设2个水平(表4.1)，实验采用L4_2_3正交表，4个处理，每个处理设3次重复，每个重复转化茎尖100个。除草剂筛选后，初步计算除草剂抗性率，确定玉米SL1303茎尖活体转化的最适条件。

表4.1茎尖活体转化的正交试验方案

试验共处理茎尖1200个，获得成活植株503株，对转化植株进行了抗性鉴定，初步筛选到抗性植株54株，平均转化率为10.7％。选用超毒农杆菌菌株EHA105，农杆菌浓度OD₆₀₀值为0.6，乙酰丁香酮浓度为150μg/L时抗性植株率最高，各处理抗性植株率结果列于表4.2。

表4.2茎尖活体转化各处理实验结果

实施例5：玉米茎尖活体转化的方法

1灭菌和发芽

选择籽粒饱满整齐一致的SL1303自交系种子，放入250ml的三角瓶中加入1.5倍体积的25％次氯酸钠消毒30min，完毕后用无菌水洗涤5次，在4℃条件下吸涨8h。准备底部垫有滤纸的培养皿，提前灭菌，将消毒的种子胚面朝上整齐摆放在培养皿中，于28℃培养箱中发芽3天左右直至芽长为4cm左右的黄化苗用于转化。

2侵染

在超净工作台上用无菌手术刀切掉黄化苗叶鞘，然后纵向损伤茎尖生长点，整齐摆放于无菌的培养皿中，在50kPa的负压条件下进行浸染，完毕后将茎尖用滤纸吸干，放回原萌发培养皿中，黑暗条件下共培养3‐4天，直到幼苗重新长出新叶。

3除草剂抗性筛选

转化茎尖的幼苗移栽到土壤中，在3叶期对这些植株喷施50mg/L草丁膦溶液进行除草剂抗性筛选，初步计算除草剂抗性率。

农杆菌法介导ZmPIF1、ZmPIF3基因转化玉米SL1303分别共侵染茎尖2400个，获得草丁膦抗性植株数67和55株，草丁膦抗性率分别为5.37％和5.59％(表5.1)。农杆菌介导玉米茎尖活体转化过程见图5，茎尖活体转化后草丁膦处理效果见图6。

表5.1玉米茎尖转化ZmPIF1和ZmPIF3基因转化结果

4转基因植株的检测

4.1转基因玉米的DNA提取

(1)取再生植株两片幼嫩叶片(约0.1g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用筷子捣碎至粉末状；

(2)离心管室温稍放置，加入700μl的缓冲液A(buffer A)，轻轻混匀后，65℃水浴20min(每5min上下颠倒混匀一次)；

(3)取出稍冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿(各350μl)，上下颠倒，充分混匀抽提5min；

(4)12000rpm，离心10min，吸取上清到一新的离心管中；

(5)加等体积的氯仿(约750μl)，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(6)12000rpm，离心10min，吸取上清到一新的离心管中；

(7)加0.7倍体积的异丙醇(约560μl)，混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；12000rpm，离心10min，弃去上清；

(8)加500μl的70％的乙醇洗涤两次，每次2‐3min；室温下晾干；

(9)加20μl的TER溶解，37℃温浴45min；

(10)0.8％琼脂糖电泳，调节其浓度；

(11)‐20℃保存。

4.2转基因玉米的PCR检测

根据载体T‐DNA区的Bar基因序列，通过软件Primer Premier 5.0，设计引物BAR‐F‐490、BAR‐R‐490(表1.1)，产物大小490bp。PCR反应体系与反应程序参照Takara普通Taq酶的说明书。扩增后PCR反应产物用1％的琼脂糖电泳检测，目的片段与阳性对照相同的幼苗就是T0代阳性植株。

再生植株的PCR检测结果如图7、8所示，图7为转ZmPIF1基因玉米Bar基因检测结果，阴性对照水和SL1303中未扩增出目的条带，再生阳性植株在490bp的位置扩增出与阳性对照p1011-v-bar-ZmPIF1质粒中大小一致的条带。图8为转ZmPIF3基因玉米Bar基因的检测结果，阴性对照水和SL1303中未扩增出目的条带，再生阳性植株在490bp的位置扩增出与阳性对照p1011-v-bar-ZmPIF3质粒中大小一致的条带。农杆菌法介导ZmPIF1、ZmPIF3基因转化玉米SL1303，ZmPIF1PCR阳性植株数7株，转化率0.56％。ZmPIF3PCR阳性植株数6株，转化率0.61％(表5.1)。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种玉米自交系茎尖活体转化方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggtcgact ctagaggatc catgtccgac agcaacgac 39

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tactagtcga cgtcaggatc cctatttttg tagtatttg 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggtcgact ctagaggatc catgtccgac agcagcgac 39

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<212> DNA

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<400> 4

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<212> DNA

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<400> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgccagaa accc 14

Claims (1)

1.一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法，其特征在于，以玉米自交系SL1303为受体材料进行农杆菌介导的茎尖活体转化转入外源基因，获得转基因玉米；将含有除草剂筛选标记的外源基因转入到玉米茎尖，通过浓度为50mg/L的除草剂草丁膦筛选获得了抗性植株；农杆菌侵染时选用超毒农杆菌菌株EHA105，农杆菌浓度OD₆₀₀值为0.6，乙酰丁香酮浓度为150μg/L。

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