JP4179217B2 - 新規ベクター及びこのベクターを用いて行う植物形質転換体の作出方法 - Google Patents

Description

本発明は新規なベクター、及び、このベクターを用いて行う植物形質転換体の作出方法に関する。

近年、遺伝子組換え植物の開発も実用段階に達するものが現われ、作出された組換え植物を、実際に野外で生育させるケースも生じてきた。しかし、この場合、組換え遺伝子を含む花粉が野性種と交配する可能性があるため、花粉の飛散が問題となる。そこで、これを防止するため、かかる組換え植物の開発と並行する形で、植物の花粉形成を阻害する技術、即ち、不稔化技術の研究も進められている。また、近年スギ花粉などによる花粉症が社会問題化しており、スギ等の植物については、花粉症の防止のためにも、この不稔化技術の研究が進められている。さらに、花卉園芸においては、種子形成に伴う植勢の低下を防止して、花咲きを良くしたり、開花期間を延長させる等の目的でも、不稔化の研究は進められている。

このように、不稔化植物の研究に対する社会的な需要は非常に大きなものである。従来より、植物への不稔形質の導入は、主として、交配や遺伝子工学的手法を用いて行われてきた。交配による不稔形質の導入は、特別な装置や施設が必要なく、簡易な手段で行うことができるというメリットがあるが、その反面、適用できる植物種が限られるというデメリットがある。即ち、現在、不稔形質を持つ個体が確認されている栽培植物としては、イネ、コムギ、トウモロコシ、ナタネ等があるが、これらの植物と交配可能な植物でなければ、この方法によって不稔化された植物を作製することができない。

一方、遺伝子工学的手法による不稔形質の導入は、交配による方法とは異なり、広範な植物種に適用が可能というメリットがある。現在までのところ、遺伝子工学的手法により不稔化に成功した植物としては、トウモロコシ、キャベツ、ブロッコリー、レタス、メロンなどが知られており、例えば、国際公開公報ＷＯ８９／１０３９６には、タバコ葯組織のタペータム細胞に特異的な発現プロモーターの下流に、バーナーゼ遺伝子を連結して雄性不稔遺伝子を作成し、これを植物に導入して、不稔化植物を得た旨の報告がされている。

ＷＯ８９／１０３９６

しかし、遺伝子工学的手法により不稔遺伝子を植物に導入し、不稔化植物を作成するにあたっては、通常、その過程でカルスを経由する。ところが、いわゆる組織又は器官特異的なプロモーター（以下、単に組織特異的プロモーターという。）とされるものであっても、植物細胞において機能するプロモーターは、ほぼ全てがカルスで活性化する。これは、カルスが脱分化した細胞の塊であり、細胞の分裂活性が高い上に、組織特異的な発現制御から逸脱したもので、組織又は器官特異性を司る転写調節因子が作用しないためと考えられる。上記バーナーゼ遺伝子を始め、不稔化に用いられる遺伝子は、多くの場合、何らかの形で細胞機能を阻害する遺伝子が、花芽分裂細胞で特異的に働くプロモーターの制御下に配されて形成されるが、これらのプロモーターも同様で、花芽分裂細胞や葯だけではなく、カルスにおいても活性化する。このため、遺伝子導入処理後の植物細胞から不稔化植物を作成する過程において、細胞機能阻害遺伝子がカルス細胞中で発現し、細胞が枯死したり、その増殖が妨げられて、目的とする不稔化植物が得られないという現象が見られた。

以上のような、組換え植物作成過程における、カルス細胞での目的遺伝子の発現は、目的遺伝子として、不稔化植物を作成するための細胞機能阻害遺伝子を、花芽分裂細胞特異的プロモーターと共に用いる場合に限らず、他の有用遺伝子を組織特異的プロモーターと共に用いる場合でも、不定芽再分化の阻害等、好ましくない影響をもたらす。現実に、これが原因となって、組換え植物の作成に失敗したと考えられるケースも多く知られている。

以上の問題点を踏まえ、本発明は、遺伝子工学的手法により目的遺伝子を植物細胞に導入し、これを培養して組換え植物を作成する場合に、その培養ステージに応じて、また、その培養組織又は器官に応じて、目的遺伝子の発現を適正に制御する技術を提供することを目的してなされたものである。

特に、本発明は、しばしば、組換え植物の作成に失敗をもたらす、カルスでの目的遺伝子の発現を抑制する技術を提供することを目的とする。

更に、本発明は、不稔化植物の作成に大きな効果をもたらす技術を提供することを目的とする。

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、以下の構成単位Ａ及びＢを、同一ＤＮＡ分子上に又は異なるＤＮＡ分子上に配したベクターであって、プロモーター１及びプロモーター２が、シロイヌナズナのＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）遺伝子、ＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）遺伝子、ＬＥＡＦＹ（ＬＦＹ）遺伝子及び／若しくはＳＥＰＡＬＬＡＴＡ３（ＳＥＰ３）遺伝子の発現を制御するプロモーター、又はタバコＴＡ２９プロモーターであり、プロモーター３が、植物のヒストンＨ３プロモーター、ヒストンＨ４プロモーター、又はシロイヌナズナのＳＨＯＯＴ ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ（ＳＴＭ）遺伝子及び／若しくはＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ ＣＯＴＹＬＥＤＯＭ（ＣＵＣ）遺伝子の発現を制御するプロモーターであることを特徴とするベクターにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成した。
Ａ．プロモーター１、発現抑制配列としてオペレーター配列、及び、プロモーター１により発現が促進され、かつ、前記オペレーター配列により発現が抑制される目的遺伝子としてＢａｘ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ又はＤＡＭメチラーゼをコードする遺伝子からなるＤＮＡ配列。
Ｂ．プロモーター２、プロモーター２により発現が促進されて前記オペレーター配列による発現抑制を機能せしめるオペレーター配列結合タンパク質をコードする遺伝子、プロモーター３、前記オペレーター配列、及び、プロモーター３により発現が促進され、かつ、前記オペレーター配列により発現が抑制される脱離反応触媒酵素遺伝子として部位特異的組換え系の組換え酵素遺伝子からなり、該部位特異的組換え系の組換え酵素遺伝子の発現により脱離するＤＮＡ配列。

本発明は、目的遺伝子として、植物の表現型に効果を及ぼすことができる構造遺伝子をカスケード的に作用する調節因子の制御下に配したベクターを提供する。本発明においては、かかるベクターを用いて目的遺伝子を植物細胞に導入し、これを培養して組換え植物を作成することで、その培養ステージに応じて、また、その培養組織又は器官に応じて、目的遺伝子の発現を適正に制御することができる。

即ち、本発明により提供される上記ベクターによれば、組換え植物の作成に失敗をもたらす、カルスでの目的遺伝子の発現を抑制することができる。

特に、本発明は、不稔化植物の作成に大きな効果を発揮する。

以下に本願発明を詳細に説明する。

（１）本発明のベクター
本発明のベクターは、図１に示すように大きく２つの構成単位から成る。１つは構成単位Ａであって、プロモーター１、発現抑制配列、及び、プロモーター１により発現が促進され、かつ、前記発現抑制配列により発現が抑制される目的遺伝子からなるＤＮＡ配列である。もう一つは構成単位Ｂであって、プロモーター２、プロモーター２により発現が促進されて前記発現抑制配列による発現抑制を機能せしめる発現抑制遺伝子、プロモーター３、前記発現抑制配列、及び、プロモーター３により発現が促進され、かつ、前記発現抑制配列により発現が抑制される脱離反応触媒酵素遺伝子からなり、該脱離反応触媒酵素遺伝子の発現により脱離するＤＮＡ配列である。

なお、本発明においてベクターとは、必ずしも一つのＤＮＡ分子からなるものには限定されず、２つのＤＮＡ分子からなるものをも意味している。従って、上記構成単位Ａ及びＢは、必ずしも同一ＤＮＡ分子上にある必要はなく、それぞれ異なるＤＮＡ分子上に配されていてもよい。

次に、上記構成要素のそれぞれについて説明する。

ここでプロモーター１としては、少なくともカルス及び目的遺伝子を発現させようとする植物組織において活性を示し、その制御下にある目的遺伝子の発現を促進するものを使用する。前記したように、植物細胞において働く大抵のプロモーターは、組織特異的プロモーターと呼ばれるものも含め、カルスで活性を示す。従って、プロモーター１としては、これの制御下におく目的遺伝子を発現させようとする植物組織を基準に、この植物組織で活性を示すプロモーターを選択して使用すればよい。

また、プロモーター２に関しては、少なくともカルスにおいて活性を示し、その制御下にある遺伝子の発現を促進するものを使用する。また、プロモーター３は、プロモーター１及びプロモーター２が活性を示さない植物組織において活性を示すプロモーターを使用する。

なお、かかるベクターにおいて、プロモーター１として、花芽分裂細胞及びカルスにおいて活性を示し、芽の分裂細胞において活性を示さないプロモーター、プロモーター２して、少なくともカルスにおいて活性を示し、芽の分裂細胞において活性を示さないプロモーター、プロモーター３として、少なくとも芽の分裂細胞において活性を示すプロモーターを用い、かつ、プロモーター１の制御下に置く目的遺伝子としてＢａｘ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ又はＤＡＭメチラーゼをコードする遺伝子を用いることにより、不稔化植物の作成に有用なベクターを得ることができる。

この場合において、プロモーター１、即ち、花芽分裂細胞及びカルスにおいて活性を示し、芽の分裂細胞において活性を示さないプロモーターとしては、花芽分裂細胞で働く、シロイヌナズナのＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）遺伝子、ＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）遺伝子、ＬＥＡＦＹ（ＬＦＹ）遺伝子及び／又はＳＥＰＡＬＬＡＴＡ３（ＳＥＰ３）遺伝子の発現を制御するプロモーターや、花芽分裂細胞の中でも葯で特異的に働く、タバコＴＡ２９プロモーターを使用する。また、これらはいずれも、プロモーター２として使用することもできる。

また、プロモーター３、即ち、芽の分裂細胞において活性を示すプロモーターとしては、植物のヒストンＨ３プロモーターやヒストンＨ４プロモーター、シロイヌナズナのＳＨＯＯＴ ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ（ＳＴＭ）遺伝子及び／又はＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ ＣＯＴＹＬＥＤＯＭ（ＣＵＣ）遺伝子の発現を制御するプロモーター等を使用する。

さらに、目的遺伝子としては、Ｂａｘ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ、ＤＡＭメチラーゼをコードする遺伝子を使用する。なお、本発明の実施例では、目的遺伝子としてＢａｘ遺伝子を用いたが、これは、アポトーシスを引き起こすほ乳動物のＢａｘをコードする遺伝子である。

本発明のベクターにおいて、発現抑制配列としてオペレーター配列を、発現抑制遺伝子としてオペレーター配列結合タンパク質をコードする遺伝子を用いる。

なお、オペレーター配列結合タンパク質をコードする遺伝子としては、大腸菌由来のラクトースオペロンの使用が、オペレーター配列としては、このラクトースオペロンの認識可能なＤＮＡ配列が好ましい。植物由来の遺伝子は、内在性のパラログ遺伝子が目的遺伝子の発現制御に影響を及ぼすおそれがある。また、より効果的にオペレーター配列結合タンパク質をオペレーター配列に結合させるため、このオペレーター配列を並列に２つ以上配してもよい。

脱離反応触媒酵素遺伝子と、この脱離反応触媒酵素遺伝子の発現により前記構成単位Ｂを脱離させるための機構は、既に当業者に公知となっており、本発明のベクターにおいては、特許第３２５６９５２号等に記載されるように、部位特異的組換え系（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を利用する。本発明の実施例においても、部位特異的組換え系を利用し、脱離反応触媒酵素遺伝子として部位特異的組換え系の組換え酵素遺伝子を用い、構成単位Ｂ全体を、この組換え酵素遺伝子が認識し、しかも互いに同じ方向を向いている２つの認識配列に挟むことによって、この構成単位Ｂを脱離させる。

ここで、部位特異的組換え系とは、組換え酵素と、この組換え酵素が認識して作用する認識配列との働きにより、この認識配列に挟まれた領域の脱離又は組換えを起こす系である。即ち、この認識配列が同一ＤＮＡ分子上に、同一方向を向いてある一定の間隔で二つ存在している場合には、これに挟まれた領域がこのＤＮＡ分子から脱離し、また、この配列が対向する方向を向いて二つ存在している場合には、この領域が反転するので、本発明では、この前者の脱離作用を利用する。

現在、部位特異的組換え系はファージ、細菌（例えば大腸菌）、酵母等の微生物から分離されたＣｒｅ／ｌｏｘ系、Ｒ／ＲＳ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系、ｃｅｒ系、ｆｉｍ系等が知られているが（総説として、Ｎ．Ｌ．Ｃｒａｉｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：１７、１９８８）、植物その他の高等生物ではまだその存在を知られていない。しかし、これらの微生物から分離された部位特異的組換え系も、その由来する生物種と異なる生物種（植物を含む）に導入された場合に、そのそもそもの生物内における挙動と同一の挙動をとることが明らかとなっている。これらの中でも、酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）の部位特異的組換え系であるＲ／ＲＳ系（Ｈ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２：６１０、１９９０）は、脱離効率が高いので、本発明において用いる部位特異的組換え系として好ましい。

本発明のベクターにおいては、さらに、これらの構成要素以外にも、選抜マーカー遺伝子や、ＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡ配列、不活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列等を配してもよい。

選抜マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子や除草剤耐性遺伝子など、汎用のものが使用できる。例えば、このような遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する耐性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。このような選抜マーカー遺伝子を本発明のベクター中に組込むことは、目的とする形質転換細胞の効率的な選抜のために有効である。

特に構成単位Ｂに、負の選抜マーカー遺伝子として植物ホルモン合成遺伝子、例えばサイトカイニンを合成する酵素をコードするイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子、オーキシンを合成する酵素をコードするインドールアセトアミドヒドロキシラーゼ（ｉａａＨ）遺伝子等の植物ホルモン合成遺伝子や、植物ホルモンのシグナル伝達に関与するｍｓｈ１，ｃｋｉ１等の遺伝子を導入し、利用すると、この構成単位Ｂの脱離の有無を、植物組織又は器官の奇形の発生の有無として肉眼で検出できるので、本発明の方法を効率的に実施することができる。

また、一般に、導入遺伝子は、宿主植物のゲノム中、様々な位置に導入され、その導入位置によって異なる発現を示すことが知られ、位置効果と呼ばれている。本発明のベクターに恒常的に発現する適当なプロモーターとレポーター遺伝子、例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）やルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする遺伝子等を組込むことで、この位置効果により、目的遺伝子等、本発明のベクターの構成要素が効果的に発現する形質転換体を容易に選抜することができるようになる。なお、本発明において形質転換体とは、本発明のベクターにより目的遺伝子が導入された細胞からなる植物体全体、植物器官又は植物組織をいう。

さらに、植物体内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の下流に植物用のターミネーター等を配置させる必要がある。従って、本明細書において、単に遺伝子というときは、構造遺伝子及びそのターミネーター配列を指している。上記した構成単位Ａ及びＢを形成する各遺伝子にしても、その構造遺伝子の下流にターミネーター配列を有するものである。なお、ターミネーター配列としては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等が挙げられる。但し、植物体内で機能することが知られているターミネーターであれば、これらのものに限定されることなく、本発明において使用できる。

（２）本発明のベクターの植物宿主への導入
本発明のベクターは、公知の遺伝子導入方法を用いて宿主植物の細胞に導入することができる。代表的な遺伝子導入方法としては、アグロバクテリウム感染法等の間接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等の直接導入法などを挙げることができる。例えば、アグロバクテリウム感染法を用いる場合、以下のようにして、本発明のベクターをアグロバクテリウムに導入すればよい。

まず、本発明のベクターを、定法により、植物細胞用のクローニングベクターに挿入して植物への遺伝子導入用組換えベクターを得る。このときクローニング用ベクターとしては、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドや、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００等の中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。

例えば、バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクター中の境界配列ＬＢとＲＢとに挟まれたＴ−ＤＮＡ領域に、本発明のベクターの構成単位Ａ及び／又はＢを挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅したベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｍｓ、以下、単にＡ．ツメファシエンスと略記する。）Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：８７１１、１９８４）等により導入し、該アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることで、本発明のベクターをその植物に導入する。

なお、バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合において、本発明のベクターを構成する構成単位Ａ及びＢは、同一Ｔ−ＤＮＡ領域に配するのが望ましいが、異なるＴ−ＤＮＡ領域に配してもよい。また、これらを、それぞれ異なるプラスミドに挿入してもよい。

本発明において、宿主となる植物の種類に制限はない。例えば、シロイヌナズナ、タバコ、イネ、トウモロコシ、ポプラ、ユーカリ、スギ等を宿主とすることができる。上記した遺伝子導入方法は、これらの植物の培養細胞、植物体全体、器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、又は組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれをも対象として行うことができる。また、エレクトロポレーション法を用いる場合には、プロトプラストを対象として行うこともできる。

（３）形質転換体の作出
本発明において遺伝子導入処理後の植物細胞は、まず、適当なカルス誘導培地にて培養し、カルスを増殖させる。これにより、カルスにおいて活性を示すプロモーター２の働きにより、発現抑制遺伝子が発現して、発現抑制配列による発現抑制作用を機能せしめ、目的遺伝子及び脱離反応触媒酵素遺伝子の発現は抑制される。従って、カルス中において目的遺伝子が発現することも、構成単位Ｂが脱離することもない。

次いで、このカルスを適当な再分化培地に移植し、プロモーター３が活性を示す植物組織又は器官を再分化させる。かかる組織や器官においては、プロモーター１及びプロモーター２は活性を示さないので、目的遺伝子が発現することはなく、また、脱離反応触媒酵素遺伝子の発現が発現抑制配列によって妨げられることはない。従って、脱離反応触媒酵素遺伝子が発現し、構成単位Ｂが脱離する。

目的とする形質転換体は、この後、目的遺伝子を発現させようとする組織又は器官を再分化させることにより得られる。このとき、構成単位Ｂは既に脱離してしまっているので、目的遺伝子の発現が、発現抑制配列に妨げられることはない。

即ち、本発明のベクターは、目的遺伝子の発現が、カスケード的に作用するプロモーター、発現抑制遺伝子及び脱離反応触媒酵素遺伝子よりなる調節因子の下に制御されているので、本発明のベクターを用いて目的遺伝子を植物細胞に導入すれば、目的遺伝子の発現は、その培養ステージに応じて、また、その培養組織又は器官に応じて適正に制御される。従って、遺伝子導入処理後の細胞を培養し、この細胞からカルスを経由して植物組織又は器官を再分化させるだけで、目的遺伝子のカルスにおける発現を抑制しつつ、この目的遺伝子が、特定の組織又は器官にて発現している形質転換体を作出することができる。

特に、プロモーター１が、少なくとも花芽分裂細胞及びカルスにおいて活性を示し、芽の分裂細胞において活性を示さないプロモーター、プロモーター２が、少なくともカルスにおいて活性を示し、芽の分裂細胞において活性を示さないプロモーター、プロモーター３が、少なくとも芽の分裂細胞において活性を示すプロモーター、更に、目的遺伝子が細胞機能阻害遺伝子である場合には、遺伝子導入処理後の植物細胞を培養してカルスを増殖させ、次いで、このカルスから芽を再分化させてから、花芽の再分化が起こるようにするようにすれば、細胞機能阻害遺伝子がカルス増殖中に発現することはなく、花芽の再分化が始まった時点で発現し、花芽の分裂細胞を死に到らしめて花芽形成を阻害するので、不稔化植物を得ることができる。再分化した芽から花芽、正確には花芽の原基を得るには、この芽を伸長させて切取り、これを適当な発根培地に挿しつけて発根させることで幼植物体を再生し、この幼植物体を生長させて花芽の再分化が起こるようにすればよい。

なお、植物細胞からのカルス増殖に用いるカルス誘導培地、カルスからの植物組織や器官の再分化に用いる再分化培地は、植物の組織培養培地として公知の培地に、サイトカイニンやオーキシン等の植物ホルモン等を適宜添加することによって調製することができる。また、選抜マーカー遺伝子として、前記したような抗生物質耐性遺伝子や農薬耐性遺伝子を用いた場合には、形質転換体の選抜のため、これらの耐性遺伝子に対応する抗生物質や農薬を培地中に添加すればよい。

（４）形質転換体の検出と確認
本発明のベクターにより作出された形質転換体の検出、及び、その後代における安定性の確認は、これらの細胞や組織から常法に従ってＤＮＡを抽出した後、これを、ＰＣＲ法やサザンブロッティング法等、公知の手段を用いて分析することにより行えばよい。

また、本発明のベクターにより導入される目的遺伝子が、不稔形質の付与等、植物体の外形に影響を及ぼすものである場合には、遺伝子導入処理後の植物細胞から、最終的に幼植物体を再生して、あるいは、この幼植物体を更に生長させ、その外形を調べることによって形質転換体を検出し、確認することもできる。例えば、本発明のベクターにより、不稔化植物を作成した場合には、前記のようにして得られた幼植物体を、メトロミックス３５０等の培養土を入れた植木鉢に植えて生長させ、一定期間経過後の花芽の形成を調べることによって形質転換体を検出し、確認することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

［実施例１］
１．ＰＩプロモーターのタバコでの発現
花芽分裂細胞及びカルスにおいて活性を示し、芽の分裂細胞において活性を示さないプロモーターの一つとして、シロイヌナズナのＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）が知られている（Ｇｏｔｏら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｖｏｌ．８、１５４８−１５６０、１９９４）。本実施例においては、まず、タバコにおいて、このプロモーターがシロイヌナズナと同様な活性を示すかどうか検討を行うため、京都大学化学研究所の後藤弘爾博士（現岡山県立大学）より譲り受けたＰＩプロモーターとＧＵＳ遺伝子の融合遺伝子をもつバイナリーベクター系の組換えプラスミドを、エレクトロポレーション法により、Ａ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入した。

次いで、このＡ．ツメファシエンスをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地で２８℃、一晩培養した培養液に、無菌条件下、種子から約４週間生育させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ−１）の葉を５ｍｍ角に切断した切片を、葉の表皮が下になるようにして１〜３分間浸漬し、滅菌した紙タオル等でその表面に付着している培養液を除いてから、カルス誘導培地（ＭＳ無機塩、３％しょ糖、０．８％寒天、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、０．１ｍｇ／ｌベンジルアデニン）に置床し、２５℃連続照明下で共存培養を行った。

カルス誘導培地での共存培養から３日後、上記切片をシュート形成用培地（ＭＳ無機塩、３％しょ糖、０．２５％ゲランガム、０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｌベンジルアデニン、１００ｍｇ／ｌカナマイシン、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン）に移稙して培養を続け、約４週間後、分化してきた茎葉を切り取り、この茎葉を１００ｍｇ／ｌカナマイシン及び５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むＭＳ基本培地の入った培養ビン（４０φ×１３０ｍｍ）に移植して、約４週間培養することにより発根させ、ＰＩプロモーター：：ＧＵＳ融合遺伝子を持つ形質転換タバコの発根個体を得た。

こうして得られた発根個体は、更に、バーミキュライト（日本耐火工業社）／ピートモス（和泉農材）混合用土（１：２）を入れたポットに植え換えて、２５℃の温室で生育させ、花芽、花器官、茎頂点、茎、葉及び根を採取して、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、ｖｏｌ．５、ｐ．３８７−４０５、１９８７）により、これらの組織を構成している細胞のＧＵＳ活性を調査した。また、こうして得られた発根個体よりカルスを取得し、このカルスについても、同様にＧＵＳ活性を調査した。その結果、花芽形成初期の花芽分裂細胞、雄しべ及びカルスで強いＧＵＳ活性が検出され、上記ＰＩプロモーターは、これらの組織において活性を示すことが確認された。

２．目的遺伝子の分離
目的遺伝子として、細胞のエネルギー生産を司るミトコンドリアの機能を損なう働きを持ち、植物においても、これを高発現させると細胞を死滅させることが既に報告されている（Ｌａｃｃｏｍｍｅら、ＰＮＡＳ、ｖｏｌ．９６、７９５６−７９６１、２０００）、ヒト由来のＢａｘ遺伝子を用いるため、これをＰＣＲ法で分離した。

即ち、ＤＤＢＪから入手したＢａｘ遺伝子の配列情報を基に、制限酵素ＳｍａＩの認識部位を含むｈＢＡＸ１プライマー（ＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧ ＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧ ＧＴＧＡＴＧＧＣＧ：配列番号１）と、制限酵素ＳａｃＩの認識部位を含むｈＢＡＸ２プライマー（ＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧ ＣＣＡＴＡＡＴＴＴＡ ＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ：配列番号２）を合成し、これらのプライマーを用い、ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、その反応物をアガロースゲル電気泳動により分離した。その結果、ヒトＢａｘ遺伝子と推定される６５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出されたので、このＤＮＡ断片を回収し、一部を取り分けて、その塩基配列をシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣＥＱ２０００ＸＬ）で調べ、ヒトＢａｘ遺伝子と完全に一致していることを確認した。なお、このときＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ社製）を用いて行った。

３．構成単位Ａの構築
プロモーター１として前記ＰＩプロモーター、発現抑制配列として、大腸菌のＬａｃＩ遺伝子産物が認識し、結合するオペレーター配列、目的遺伝子として上記Ｂａｘ遺伝子を用い、構成単位Ａを構築した
まず、５’側をリン酸化処理した２種類のオリゴＤＮＡ、−ＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴ ＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣ ＡＡＴＡＣＧＴＡＴＴ ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣ ＡＣＡＡＴ−（配列番号３）及び−ＧＡＴＣＡＴＴＧＴＧ ＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡ ＡＴＡＣＧＴＡＴＴＧ ＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡ ＣＡＡＴＴ−（配列番号４）を合成し、９４℃から徐々に室温まで低下させてアニーリング処理を行い、これらを対合させて、オペレーター配列を含む二本鎖ＤＮＡ（以下、単にオペレーター配列ともいう。）を得た。この二本鎖ＤＮＡにおいて、その５’側末端と３’側末端とは、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩが認識する突出部位を形成する。

次いで、この合成二本鎖ＤＮＡをＰＩプロモーターとＢａｘ遺伝子の間に連結することにより、構成単位Ａを構築した（図２（Ａ））。この構成単位Ａでは、ＰＩプロモーターの働きにより、カルス、花芽分裂細胞においてＢａｘ遺伝子の発現が促進されるが、上記オペレーター配列にＬａｃＩ遺伝子産物が結合すると、これらの細胞においても、Ｂａｘ遺伝子の発現は抑制されることとなる。

４．構成単位Ｂの構築
ＰＩプロモーターに、上記３で作成したオペレーター配列を認識し、結合するタンパク質をコードする発現抑制遺伝子であるＬａｃＩ遺伝子を連結し、また、芽の分裂細胞及びカルスで活性を示すユーカリ由来のヒストンＨ３プロモーターに、ＬａｃＩ遺伝子産物が認識し、結合するオペレーター配列及び組換え酵素Ｒの遺伝子をこの順で連結して、更にこれらの構成要素を、組換え酵素Ｒが認識して作用する、同一方向を向いた２つの認識配列ＲＳに挟まれたカセット内の、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ認識部位に挿入して、構成単位Ｂを構築した（図２（Ｂ））。

なお、上記ヒストンＨ３プロモーターと組換え酵素Ｒ遺伝子との間に連結されたオペレーター配列は、２種類のオリゴＤＮＡ、−ＣＴＡＧＡＡＴＴＧＴ ＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣ ＡＡＴＡＣＧＴＡＴＴ ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣ ＡＣＡＡＴ−（配列番号５）及び−ＣＴＡＧＡＴＴＧＴＧ ＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡ ＡＴＡＣＧＴＡＴＴＧ ＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡ ＣＡＡＴＴ−（配列番号６）を、アニーリング処理して二本鎖ＤＮＡとしたものであり、その５’側末端と３’側末端とが、制限酵素ＸｂａＩが認識する突出部位を形成している点でのみ、上記３で作成したオペレーター配列と異なっている。しかし、このオペレーター配列も、ＬａｃＩ遺伝子産物が結合することにより、その下流に連結された遺伝子の発現を抑制し、構成単位Ｂの発現抑制配列として機能する。また、組換え酵素Ｒと認識配列ＲＳとは、醤油酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）の部位特異的組換え系Ｒ／ＲＳに由来するものである。

この構成単位Ｂでは、カルス、花芽分裂細胞において、ＰＩプロモーターの働きによりＬａｃＩ遺伝子の発現が促進される。一方、ヒストンＨ３プロモーターは、カルス、芽の分裂細胞において働くが、カルス細胞においては、これに連結されたオペレーター配列にＬａｃＩ遺伝子産物が結合するため、その下流にあるＲ遺伝子は発現が抑制される。しかし、芽の分裂細胞においては、ＰＩプロモーターが働かないためＬａｃＩ遺伝子は発現せず、このヒストンＨ３プロモーターの働きによりＲ遺伝子の発現が促進されて組換え酵素Ｒが生産され、認識配列Ｒｓに挟まれたカセットが脱離する。

５．植物遺伝子導入用ベクターｐＭＳ−Ｂａｘ１の構築
上記のようにして構築した構成単位Ａ（図２（Ａ））及び構成単位Ｂ（図２（Ｂ））を連結し、植物遺伝子導入用ベクターｐＢＩ１２１のＲＢサイトとＬＢサイトとの間に挿入して、本発明のベクターを組込んだ植物への遺伝子導入用ベクターｐＭＳ−Ｂａｘ１（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８３５２）を得た（図２）。

６．ｐＭＳ−Ｂａｘ１のタバコへの導入
前記１と同様にして、ｐＭＳ−Ｂａｘ１をＡ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入し、次いで、このｐＭＳ−Ｂａｘ１導入Ａ．ツメファシエンスをタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ−１）に感染させ、感染したタバコからカルスを誘導し、不定芽を再分化して発根させた後、育苗することにより、本発明のベクターが導入された形質転換タバコを得た。

７．花芽組織の形態
上記のようにして得られた形質転換タバコについて、その花芽の形態を肉眼で観察したところ、花芽組織は、１２個体中５個体で死滅していることが明らかとなった（図３）。

さらに、この観察結果より、花芽組織が死滅し、不稔化したと考えられる形質転換タバコの葉について、組換え酵素Ｒの遺伝子、認識配列Ｒｓ及びＢａｘ遺伝子の存在を調査した。即ち、かかる形質転換体の葉から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、上記遺伝子又は認識配列を識別できる特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、その増幅産物を電気泳動法で分析することにより、これらの遺伝子又は認識配列の存在を調査した。

結果を図４に示す。図４に示すように、花芽組織が死滅し、不稔化したと考えられる形質転換タバコの葉では、認識配列ＲｓとＢａｘ遺伝子の増幅産物が検出され、その存在を確認することができたが、Ｒ遺伝子の増幅産物は検出されなかった。

なお、図５は、かかる形質転換体を作出する過程で得られたカルス及び不定芽よりＲＮＡを抽出し、これらのＲＮＡについてノーザンブロッティングを行った結果である。図５に示すように、本発明のベクターを用いて遺伝子導入処理を行った直後に得られたカルスでは、ＬａｃＩ遺伝子の発現と、Ｒ遺伝子の微弱な発現を検出することができたが、Ｂａｘ遺伝子の発現は検出されなかった。一方、このカルスより再分化してきた不定芽では、ＬａｃＩ遺伝子、Ｒ遺伝子及びＢａｘ遺伝子の発現は、いずれも検出されなかった。

以上のことから、このベクターｐＭＳ−Ｂａｘ１は、これが導入されたタバコにおいて、図６に示すように機能したと考えられる。即ち、遺伝子導入処理の直後に得られたカルスでは、ＰＩプロモーターの働きにより発現抑制遺伝子ＬａｃＩが発現してＬａｃＩタンパク質が生産され、これがオペレーター配列に結合して、Ｂａｘ遺伝子とＲ遺伝子の発現が抑制される（図６（Ａ））。しかし、このカルスから不定芽が分化する際は、ＰＩプロモーターが不活化し、ＬａｃＩタンパク質が発現しなくなる。このため、芽の分裂細胞において活性を示すヒストンＨ３プロモーターによりＲ遺伝子の発現が促進され、組換え酵素Ｒが生産されて、Ｒｓ認識配列に挟まれたカセットが脱離する（図６（Ｂ））。さらに、このカセットが脱離した後に得られる花芽の分裂細胞では、ＰＩプロモーターが再び活性化するが、もはや、ＬａｃＩタンパク質を生産するＬａｃＩ遺伝子は存在しないので、Ｂａｘ遺伝子は、このＬａｃＩタンパク質による抑制を受けることなく、ＰＩプロモーターの働きにより発現が促進されて細胞死を誘導することとなる（図６（Ｂ））。

［実施例２］
１．植物遺伝子導入用ベクターｐＭＳ−Ｂａｘ１−ｉｐｔの構築
負の選抜マーカー遺伝子として、サイトカイニン合成酵素をコードするｉｐｔ遺伝子を、構成単位Ｂに導入した本発明のベクターを構築し、これを組込んだ植物遺伝子導入用ベクターｐＭＳ−Ｂａｘ１−ｉｐｔ（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター宛に、平成１６年４月６日付で国際寄託済み。）を得た。

即ち、このベクターは、図７に示すように、実施例１で構築した植物遺伝子導入用ベクターｐＭＳ−Ｂａｘ１の構成単位Ｂに、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を両端に持ち、３５Ｓプロモーターに連結したｉｐｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入したものであり、すでにカナマイシン耐性遺伝子等の選抜マーカー遺伝子を用いて有用遺伝子が導入されている植物体を、本発明の方法により不稔化する目的に、効果的に用いることができるものである。

２．ｐＭＳ−Ｂａｘ１−ｉｐｔのタバコへの導入
既に、３５Ｓプロモーターに連結されたＮｔｌｉｍ１遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡが、選抜マーカー遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子と共に導入されているタバコ（Ｎｉｃｏ ｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ−１）Ａ２（Ｋａｗａｏｋａら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２２，２８９−３０１，２０００）に、上記ｐＭＳ−Ｂａｘ１−ｉｐｔを、実施例１の１と同様にして導入し、形質転換体を得た。但し、このｐＭＳ−Ｂａｘ１−ｉｐｔには、ｉｐｔ遺伝子が挿入されているため、このベクターが導入された植物組織においては、不定芽再分化の際、植物ホルモンは必要としない。このため、本実施例においても、シュート形成用培地としてとして、ホルモンフリー培地（ＭＳ無機塩、３％しょ糖、０．２５％ゲランガム、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン）を使用した。また、このとき得られる不定芽も、ｉｐｔ遺伝子の影響により多芽体の形態をしていたため、発根は、この多芽体から伸張してきた茎葉を切り取って、材料とした。

３．花芽組織の形態
上記のようにして得られた形質転換体について、その花芽の形態を肉眼で観察したところ、花芽組織は、１０個体中４個体で死滅していることが明らかとなった。この結果より、本発明のベクターは、既にカナマイシンを選抜マーカー遺伝子として作成された形質転換体にも、効果的に不稔形質を導入できることが確認された。

本発明のベクターの基本的構成を示す説明図である。 ｐＭＳ−Ｂａｘ１の制限酵素地図を示す図である。 実施例１で得られたタバコにおいて観察された、死滅した花芽組織の状態を示す写真である。 実施例１において、花芽組織が死滅したタバコの葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った結果を示す写真である。 実施例１において、花芽組織が死滅した系統のタバコを作出する過程で得られたカルス、及び、その後再分化してきた不定芽からＲＮＡを抽出し、ノーザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す写真である。 ｐＭＳ−Ｂａｘ１の機能を示す説明図である。 ｐＭＳ−Ｂａｘ１−ｉｐｔの制限酵素地図を示す図である。

Claims (4)

1. 以下の構成単位Ａ及びＢを、同一ＤＮＡ分子上に又は異なるＤＮＡ分子上に配したベクターであって、プロモーター１及びプロモーター２が、シロイヌナズナのＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）遺伝子、ＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）遺伝子、ＬＥＡＦＹ（ＬＦＹ）遺伝子及び／若しくはＳＥＰＡＬＬＡＴＡ３（ＳＥＰ３）遺伝子の発現を制御するプロモーター、又はタバコＴＡ２９プロモーターであり、プロモーター３が、植物のヒストンＨ３プロモーター、ヒストンＨ４プロモーター、又はシロイヌナズナのＳＨＯＯＴ ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ（ＳＴＭ）遺伝子及び／若しくはＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ ＣＯＴＹＬＥＤＯＭ（ＣＵＣ）遺伝子の発現を制御するプロモーターであることを特徴とする、ベクター。
   Ａ．プロモーター１、発現抑制配列としてオペレーター配列、及び、プロモーター１により発現が促進され、かつ、前記オペレーター配列により発現が抑制される目的遺伝子としてＢａｘ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ又はＤＡＭメチラーゼをコードする遺伝子からなるＤＮＡ配列。
   Ｂ．プロモーター２、プロモーター２により発現が促進されて前記オペレーター配列による発現抑制を機能せしめるオペレーター配列結合タンパク質をコードする遺伝子、プロモーター３、前記オペレーター配列、及び、プロモーター３により発現が促進され、かつ、前記オペレーター配列により発現が抑制される脱離反応触媒酵素遺伝子として部位特異的組換え系の組換え酵素遺伝子からなり、該部位特異的組換え系の組換え酵素遺伝子の発現により脱離するＤＮＡ配列。
2. オペレーター配列が、ｌａｃＩ遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
3. 構成単位Ｂが、この組換え酵素遺伝子が認識し、互いに同じ方向を向いている２つの認識配列に挟まれていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のベクター。
4. 請求項１に記載のベクターを用いて植物細胞に遺伝子導入を行い、次いで、この植物細胞を培養し、カルスを経由して植物組織又は器官を再分化させることを特徴とする、目的遺伝子のカルスにおける発現を抑制して行う、植物形質転換体の作出方法。

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