CN115768898A - 用于顽拗型植物的快速基因组修饰的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列进行的靶向修饰，以获得至少一个经修饰的细胞的方法，其中通过提供基因组修饰或编辑系统以及至少一种再生加强剂或再生加强剂的组合来实现细胞的修饰，所述再生加强剂在细胞中瞬时活化和/或带有至少一种表观遗传调控化学物质。优选，借助于粒子轰击引入效应分子。此外，再生经修饰的植物细胞以获得植物，所述植物将修饰遗传给其后代。另外，提供了方法、工具、构建体和策略来有效地修饰植物细胞的基因组或植物细胞中的至少一个基因组靶位点，以获得所述经修饰的细胞并从经修饰的细胞再生植物组织、器官、植物或种子。最后，本发明还涉及一种从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的改进方法。

Description

用于顽拗型植物的快速基因组修饰的方法

技术领域

本发明涉及从单细胞来源，特别是与植物细胞的基因组工程或基因编辑组合来再生植物的领域。本发明提供了一种方法，其中通过提供基因组修饰或编辑系统以及至少一种再生加强剂或再生加强剂的组合来实现细胞的修饰，所述再生加强剂在细胞中瞬时活化和/或带有至少一种表观遗传调控化学物质。优选，借助于粒子轰击引入效应分子。此外，再生经修饰的植物细胞以获得植物，所述植物将修饰遗传给其后代。另外，提供了方法、工具、构建体和策略来有效地修饰植物细胞的基因组或植物细胞中的至少一个基因组靶位点，以获得所述经修饰的细胞并从经修饰的细胞再生植物组织、器官、植物或种子。最后，本发明还涉及一种从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的改进方法。

背景技术

为了应对气候变化、食品安全和世界人口增长带来的日益严峻的挑战，必须通过新的分子生物学新技术来改善通常相当耗时的传统植物育种，从而以安全方式提供具有期望性状但需要更少发育时间的新作物植物。

手头拥有越来越多的潜在合适的位点特异性核酸酶工具、转化或转染以及随后的再生仍然是植物基因组工程的主要瓶颈技术，如转基因插入或基因组编辑(GE)。为了获得经修饰的植物，这两个事件必须落在同一细胞上。一些植物或植物基因型特别难以进行转化和/或随后的再生，这使得使用GE方案引入性状并繁殖它们变得非常具有挑战性。迄今为止，粒子轰击和农杆菌(Agrobacterium)介导的生物分子递送是最有效的植物转化方法。在农杆菌转化中，农杆菌首先找到合适的细胞并附着于植物细胞壁，这通常称为“接种”。接种后，农杆菌在合适的条件下与植物细胞一起生长一段时间(从几小时至几天)以允许T-DNA转移。农杆菌-植物相互作用、植物组织结构、植物细胞类型等制约农杆菌转化。受植物细胞易感性和可接近性的限制，普遍认为农杆菌介导的转化依赖于植物物种、植物组织类型和植物细胞类型。相反，基于物理作用力，粒子轰击(至少在理论上)不依赖于植物物种和植物细胞类型，并且能够在施加适当压力时转化任何细胞。尽管如此，许多植物细胞，特别是根据发育阶段和来源组织从植物中新鲜分离出来的植物细胞，在受到各种微观或纳米粒子的物理轰击时，会遭受严重的压力或甚至细胞死亡。此外，轰击可能与由严重的细胞损伤或破裂引起的低转化和/或整合频率相关。然而，物理轰击本身提供了很大的优势，因为其简单、快速和通用，并且允许所插入分子的瞬时和稳定表达，如果需要的话。可以避免转染或细菌转化所需的潜在毒性化学物质。

普遍认为转化细胞的再生能力低于野生型细胞。鉴于在引入GE工具后转化/转染的材料可能不足够可行这一事实，这些情况可能会导致基因组修饰(如基因编辑)的速率较低。例如，由于在这些细胞之内存在外源DNA，因此转化细胞易受程序性细胞死亡的影响。另外，由递送引起的压力(例如轰击损伤)也可能引发细胞死亡。因此，促进细胞增殖对于转化细胞的再生尤为重要。

植物再生依赖于细胞增殖和发育。除直接芽和胚培养之外，器官发生和胚发生也是两种替代的植物再生途径，这些途径涉及到重新编程和激活体细胞的增殖。器官发生和胚发生分别通过器官(例如芽)和胚形成，并且最终发育成完整的小植物。

基因组修饰效率在很大程度上受宿主细胞状态的控制。经受快速细胞分裂的细胞是遗传修饰的最合适受体。因此，促进细胞分裂可以增加DNA复制和分裂过程期间的DNA可接近性，并且因此增加遗传修饰效率。为了刺激细胞分裂和再生，可以将所谓的再生加强剂与基因组修饰工具共同递送到细胞中。然而，再生加强剂的持续活性可能会对转化植物的分化以及随后的发育产生负面影响。后一点的原因在于，天然存在的加强剂蛋白通常是以精确的方式指导不同位置处细胞分化的进展的转录因子，并且因此在植物发育中具有核心作用。

如Lowe et al.(Plant Cell,2016,28(9))中所公开的，与在植物基因组修饰的人工环境中使用天然存在的再生加强剂相关的问题是：再生加强剂通常具有刺激生长的作用，如果没有像在自然环境中那样受到精确的控制，其中转录因子只以严格受控的时空方式表达，则用于植物基因组修饰的再生加强剂的异位表达容易导致对植物生长和育性的多效性效应。然而，这些不确定性和负面影响并不是靶向基因组编辑所期望的。为了解决此问题，Lowe et al.提出了一种相当繁琐的技术，即通过去除相关的表达盒来整合并随后灭活加强剂活性。Lowe et al.(In Vitro Cellular&Developmental Biology–Plant 54(8)2018)描述了另一方案，其依赖于特定的启动子，这些启动子仅在某些组织中具有活性。

总之，植物，特别是顽拗型植物或植物基因型的有效基因组修饰以及随后的再生受到若干因素的限制。首先，必须建立一种有效方式以将期望的修饰引入到靶细胞中。值得注意的是，当引入用于基因组修饰的工具时，靶细胞可能会遭受压力或损伤，从而使得靶细胞无法重新获得。如果携带期望修饰的细胞确实存活下来，则从单细胞来源再生植物通常是困难的。此问题可以通过共同引入再生加强剂来解决，所述再生加强剂在再生的早期阶段刺激细胞增殖。然而，加强剂的持续和未受控活性会对分化产生负面影响，并且阻碍进一步发育成植物。此外，多效性效应可能会影响植物生长和育性。

为了克服上文描述的问题，需要新型技术来有效地修饰植物基因组并再生植物，特别是携带期望修饰的植物。具体地，此类方法应所述可应用于难以转化和/或再生的顽拗型植物/植物基因型。因此，本发明的目的是提供手段和方法，以直接在顽拗型优良植物系中使用单细胞来源来实现快速且高效的基因组修饰。通过可靠的分化从经修饰的细胞再生植物且不会对进一步发育产生不利影响应所述是可行的。经修饰的T0植物应所述是无转基因的、能育的，并且修饰应所述完全遗传给T1后代。

发明简述

在第一方面，本发明提供了一种用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰，以获得至少一个经修饰的细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)提供至少一个植物细胞或单个植物细胞；

(b)将以下引入到所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞中：

(i)至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列，以及可选地至少一种引导分子或编码其的序列；

(ii)至少一种再生加强剂或编码其的序列和/或至少一种表观遗传调控化学物质，其中所述至少一种再生加强剂在所述植物细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达；

(iii)以及，可选地至少一种修复模板或编码其的序列；以及

(c)在允许表达和/或组装和/或激活所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及可选地所述至少一种再生加强剂，以及可选地所述至少一种引导分子和/或可选地所述至少一种修复模板的条件下，培养所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞；以及

(d)获得至少一个经修饰的植物细胞；和/或

(e)获得从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子；以及

(f)任选地：在携带期望靶向修饰的T0和/或T1代中筛选从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

在本发明的各个方面的一个实施方式中，在上文描述的方法中，步骤(i)和(ii)同时或随后发生，以促进植物细胞增殖和/或协助至少一个基因组靶序列的靶向修饰。

在本发明的各个方面的进一步实施方式中，在根据上述任何实施方式的方法中，在步骤(ii)中引入至少一种再生加强剂并且

(a)所述再生加强剂促进植物细胞增殖和/或协助靶向修饰和/或为至少一个瞬时转化的细胞提供正选择以用于基因组修饰和/或用于再生成至少一种经修饰的植物，和/或

(b)如果细胞被稳定转化，则所述再生加强剂抑制植物细胞分化并为至少一个稳定转化的细胞提供负选择以用于再生成一种转基因植物，和/或

(c)所述再生加强剂为至少一个转化细胞提供根据(a)和(b)的双重选择。

在本发明的各个方面的另一实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，所述至少一个植物细胞是未成熟胚细胞或分生组织细胞，特别是合子或体细胞胚或分生组织的细胞，或所述单个植物细胞是二倍体细胞或单倍体细胞，优选单倍体小孢子。

在本发明的各个方面的一个实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，所述至少一种再生加强剂包含至少一种再生加强剂蛋白(RBP)，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

在本发明的各个方面的另一实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，所述至少一种再生加强剂进一步包含至少一种PLT或RKD4，其中所述至少一种PLT或RKD4包含选自SEQ ID NO：28、29、30和31的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或所述至少一种PLT或RKD4由以下编码：选自SEQ ID NO：16、17、18和19的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

在本发明的各个方面的进一步实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，引入至少一种进一步的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂或编码其的序列选自BBM、WUS、WOX、GRF、LEC或其变体，或所述进一步的再生加强剂是如上述任何实施方式中所定义的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂不同于第一再生加强剂。

在本发明的各个方面的又另一实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，所述至少一种再生加强剂包含至少一种RBP，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ IDNO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQID NO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列，并且所述至少一种再生加强剂包含PLT5，其中所述PLT5包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述PLT5由以下编码：SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的进一步实施方式中，在步骤ii)中引入至少一种表观遗传调控化学物质，并且所述至少一种表观遗传调控化学物质是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)，特别是曲古抑菌素A(TSA)或TSA样化学物质。

在本发明的各个方面的一个实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，通过由基因枪轰击介导的转化或转染、农杆菌介导的转化、微米或纳米粒子递送，或通过化学转染，或其组合将所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及所述至少一种再生加强剂或编码其的序列和/或所述至少一种表观遗传调控化学物质的序列引入到细胞中，优选通过基因枪轰击引入所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及至少一种再生加强剂和/或所述至少一种表观遗传调控化学物质，优选其中所述基因枪轰击包含在轰击之前和/或之后的渗透处理步骤。

在本发明的各个方面的另一实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列被引入，并且选自CRISPR/Cas系统，优选选自CRISPR/MAD7系统、CRISPR/Cfp1系统、CRISPR/MAD2系统、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cas13系统或CRISPR/Csm系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样核酸酶系统或大范围核酸酶系统，或其任何组合、变体或催化活性片段。

在本发明的各个方面的进一步实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，引入至少一种基因组编辑系统，其中所述至少一种基因组编辑系统进一步包含至少一种逆转录酶和/或至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶，优选其中所述至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶独立地选自载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶，优选大鼠衍生的APOBEC、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、ACF1/ASE脱氨酶、ADAT家族脱氨酶、ADAR2脱氨酶或PmCDA1脱氨酶、TadA衍生的脱氨酶和/或转座子，或编码上述至少一种酶的序列，或其任何组合、变体或催化活性片段。

在本发明的各个方面的一个实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，引入至少一种基因组编辑系统，其中所述至少一种基因组编辑系统包含至少一种修复模板，并且所述至少一种修复模板包含或编码双链和/或单链核酸序列。

在本发明的各个方面的另一实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，所述至少一种修复模板包含对称或不对称同源臂和/或所述至少一种修复模板包含至少一种经化学修饰的碱基和/或骨架。

在本发明的各个方面的进一步实施方式中，在根据上文描述的任何实施方式的方法中，引入至少一种基因组编辑系统，其中瞬时地或稳定地或以其组合的方式引入所述至少一种基因组编辑系统和可选地所述至少一种修复模板或编码其的相应序列。

在一个方面，本发明涉及再生加强剂或再生加强剂组合，优选如上文描述的任何实施方式中所定义的再生加强剂或再生加强剂组合在用于靶向植物基因组修饰的方法中，优选在根据上文描述的任何实施方式的方法中的用途，以

(a)促进植物细胞增殖和/或协助靶向修饰和/或为至少一个瞬时转化的细胞提供正选择以用于基因组修饰和/或用于再生成至少一种经修饰的植物，和/或

(b)如果植物细胞被稳定转化，则抑制所述细胞分化，并且为至少一个稳定转化的细胞提供负选择以用于再生成一种转基因植物，和/或

(c)为至少一个转化细胞提供根据(a)和(b)的双重选择。

在另一方面，本发明涉及一种能通过或通过根据上文描述的任何实施方式的方法获得的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

在上文描述的植物细胞、组织、器官、植物或种子的一个实施方式中，所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于单子叶植物或双子叶植物。

在上文描述的植物细胞、组织、器官、植物或种子的另一实施方式中，所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的属：大麦属(Hordeum)、高粱属(Sorghum)、甘蔗属(Saccharum)、玉蜀黍属(Zea)、狗尾草属(Setaria)、稻属(Oryza)、小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)、黑小麦属(Triticale)、苹果属(Malus)、短柄草属(Brachypodium)、山羊草属(Aegilops)、胡萝卜属(Daucus)、甜菜属(Beta)、桉属(Eucalyptus)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、咖啡属(Coffea)、葡萄属(Vitis)、Erythrante、螺旋狸藻属(Genlisea)、黄瓜属(Cucumis)、Marus、拟南芥属(Arabidopsis)、须弥芥属(Crucihimalaya)、碎米荠属(Cardamine)、独行菜属(Lepidium)、荠属(Capsella)、Olmarabidopsis、南芥属(Arabis)、芸苔属(Brassica)、芝麻菜属(Eruca)、萝卜属(Raphanus)、柑橘属(Citrus)、麻疯树属(Jatropha)、杨属(Populus)、苜蓿属(Medicago)、鹰咀豆属(Cicer)、木豆属(Cajanus)、菜豆属(Phaseolus)、大豆属(Glycine)、棉花属(Gossypium)、紫云英属(Astragalus)、百脉根属(Lotus)、蝴蝶草属(Torenia)、葱属(Allium)、菠菜属(Spinacia)或向日葵属(Helianthus)，优选所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的物种：大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeumbulbusom)、高丹草(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉蜀黍属(Zeaspp.)，包括玉米(Zea mays)、粟(Setaria italica)、小粒野生稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、小黑麦(Triticale)、苹果(Malus domestica)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Betaspp.)，包括甜菜(Beta vulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、虾衣花(Erythrante guttata)、Genlisea aurea、黄瓜(Cucumis sativus)、川桑(Marus notabilis)、Arabidopsisarenosa、深山南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、须弥芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、Cardaminenexuosa、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜花(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、Arabis hirsute、甘蓝型油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassicaoleracea)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、印度芥菜(Brassicajuncacea)、黑芥(Brassica nigra)、芝麻菜(Eruca vesicaria subsp.sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、桐油树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Cicer yamashitae、野生鹰嘴豆(Cicer bijugum)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、Cicer reticulatum、Cicer judaicum、Cajanus cajanifolius、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉花属(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、大蒜(Alliumsativum)、韭菜(Allium tuberosum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthustuberosus)和/或菠菜(Spinacia oleracea)。

在进一步的方面，本发明涉及一种表达构建体组装件，其包含

(i)编码至少一种基因组修饰系统的至少一种载体，所述至少一种基因组修饰系统包含至少一种感兴趣的基因，优选感兴趣的外源基因，和/或所述至少一种基因组修饰系统优选是至少一种基因组编辑系统，所述至少一种基因组编辑系统包含基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选其中所述基因组编辑系统如上文描述的任何实施方式中所定义，以及

(ii)编码至少一种再生加强剂的至少一种载体，优选其中所述再生加强剂或多种加强剂如上文描述的任何实施方式中所定义，以及

(iii)任选地，当基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶是核酸引导的核酸酶时：编码至少一种引导分子的至少一种载体，所述至少一种引导分子将所述至少一种核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶引导到至少一个感兴趣的基因组靶位点；以及

(iv)任选地：编码至少一种修复模板的至少一种载体；

其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)在相同的或不同的载体上编码。

在上文描述的表达构建体组装件的一个实施方式中，所述组装件进一步包含编码至少一种标记的载体。

在又另一方面，本发明涉及一种包含如上文和下文进一步所描述的至少一种再生加强剂和/或如上文描述的任何实施方式中所定义的表达构建体组装件的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

在进一步的方面，本发明涉及一种用于选择经修饰的植物细胞、植物组织、器官、植物或种子的方法，其中所述方法包括如上文描述的方法的任何实施方式中所定义的步骤(a)至(c)，并且进一步包含以下步骤：

(d1)筛选携带靶向修饰的至少一个植物细胞，或

(d2)在携带期望靶向修饰的T0或T1代中筛选从至少一个经修饰的植物细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

在另一方面，本发明涉及一种用于从至少一个植物细胞或从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法，其中所述方法包括：

(i)将至少一种再生加强剂或编码其的序列引入到所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞中，其中所述至少一种再生加强剂在所述植物细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达，优选其中所述至少一种再生加强剂如上文描述的任何实施方式中所定义，以及

(ii)从至少一个植物细胞或所述单个植物细胞再生植物组织、器官或植物。

在如上文所描述的用于从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法的一个实施方式中，所述至少一个植物细胞是未成熟胚细胞或分生组织细胞，特别是合子或体细胞胚或分生组织的细胞，其中所述单个植物细胞是二倍体细胞或单倍体细胞。

在如上文所描述的用于从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法的另一实施方式中，所述单个植物细胞是单倍体小孢子。

附图说明

每当图示出原始荧光图像的黑白图片时，较亮的点代表相应荧光蛋白的累积。

图1示出了基因组编辑核酸酶MAD7表达构建体pGEP837的图。本实施例中使用绿色荧光标记(指示为GEP)。取决于要转化和可视化的植物靶细胞/组织，可以使用任何类型的荧光蛋白编码标记基因。MAD7定义了直肠真杆菌(Eubacterium rectale)CRISPR/MAD7基因的玉米密码子优化CDS(Inscripta)。BdUBI10定义了短柄草属泛素(BrachypodiumUbiquitin)10启动子。Tnos定义了nos终止子

图2示出了基因组编辑sgRNA构建体pGEP842的图。m7GEP1定义了靶向玉米HMG13基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图3示出了玉米PLT5表达构建体pABM-BdEF1_ZmPLT5的图。ZMPLT5由来自短柄草属的强组成型EF1基因启动子(BdEF1)驱动。

图4示出了KWS_RBP2表达构建体pABM-BdEF1_RBP2的图。KWS_RBP2由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BdEF1)驱动。

图5示出了KWS_RBP3表达构建体pABM-BdEF1_RBP3的图。KWS_RBP3由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BdEF1)驱动。

图6示出了KWS_RBP4表达构建体pABM-BdEF1_RBP4的图。KWS_RBP4由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BdEF1)驱动。

图7示出了KWS_RBP5表达构建体pABM-BdEF1_RBP5的图。KWS_RBP5由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BdEF1)驱动。

图8示出了KWS_RBP6表达构建体pABM-BdEF1_RBP6的图。KWS_RBP6由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BdEF1)驱动。

图9示出了KWS_RBP7表达构建体pABM-BdEF1_RBP7的图。KWS_RBP7由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BdEF1)驱动。

图10示出了KWS_RBP8表达构建体pABM-BdEF1_RBP8的图。KWS_RBP8由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BdEF1)驱动。

图11示出了在基因组编辑构建体pGEP837(图1)和pGEP842(图2)与加强剂的共同轰击并在胚性愈伤组织诱导培养基中培养4天之后，不同的再生加强剂如何刺激玉米未成熟胚的盾片表面的细胞增殖。(A)至(H)：来自仅用基因组编辑构建体轰击的(A)、或用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP2(B)、ZmPLT5和KWS_RBP3(C)、ZmPLT5和KWS_RBP4(D)、ZmPLT5和KWS_RBP5(E)、ZmPLT5和KWS_RBP6(F)、ZmPLT5和KWS_RBP7(G)或ZmPLT5和KWS-RBP8(H)共同轰击的玉米顽拗型优良16V-2015的胚。(I)至(L):来自仅用基因组编辑构建体轰击的(I)、或用加强剂ZmPLT5和RBP2(J)、ZmPLT5和RBP5(K)或ZmPLT5和RBP8(L)共同轰击的玉米顽拗型优良品种4V-40214的胚。

图12示出了在基因组编辑构建体pGEP837(图1)和pGEP842(图2)与加强剂的共同轰击并在胚性愈伤组织诱导培养基中培养4天之后，不同的再生加强剂如何促进玉米未成熟胚的快速基因组转化。(A)至(C):来自仅用基因组编辑构建体轰击的(A)、或用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP2(B)或ZmPLT5和KWS_RBP8(C)共同轰击的玉米顽拗型优良品种WA4-29814的胚。(D)至(G):来自仅用基因组编辑构建体轰击的(D)、或用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP2(E)、ZmPLT5和KWS_RBP5(F)或ZmPLT5和KWS_RBP8(G)共同轰击的玉米顽拗型优良品种4V-40214的胚。

图13示出了基因组编辑核酸酶LbCpf1表达构建体pGEP359的图。tDT定义了tdTomato基因。ZmLpCpf1定义了毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)CRISPR/Cpf1(LbCpf1)基因的玉米密码子优化CDS。

图14示出了细胞分化和随后的再生如何受到ZmPLT5(图3)和KWS_RBP4(图6)的持续加强活性的负面影响，如由来自玉米优良品种4V-40171的构建体pGEP359(图13)中的共同递送报告基因tDTomato所指示的。tDTomato阴性胚性愈伤组织发育成成熟胚(A)，而在(B)和(C)中，tDTomato阳性愈伤组织在胚成熟培养基中孵育10天之后，胚成熟受到抑制。在(B)和(C)中，组织的灰色阴影指示红色着色，这是由于tDTomato表达所致。

图15示出了基因组编辑核酸酶MAD7表达构建体pGEP1054的图。tdTomato定义了tdTomato报告基因。MAD7定义了MAD7核酸酶的玉米密码子优化CDS(Inscripta)。BdUBI10定义了短柄草属泛素10启动子。Tnos定义了nos终止子。

图16示出了轰击后16小时玉米A188未成熟胚的tDTomato荧光图像。仅用含有CRISPR核酸酶MAD7和tDTomato表达盒的质粒pGEP1054轰击(A)、或用含有crRNA m7GEP1表达盒的质粒pGEP1054和pGEP842共同轰击(B)、或用质粒pGEP1054、pGEP842和加强剂KWS_RBP2共同轰击(C)未成熟胚。

图17示出了在如所指示的时间处取样的受轰击玉米A188未成熟胚的SDN-1效率(三次实验的平均值)。仅用含有CRISPR核酸酶MAD7和tDTomat表达盒(仅MAD7)的200ng质粒pGEP1054轰击、或用含有引导RNA m7GEP1表达盒(MAD7/sgRNA)的200ng质粒pGEP1054和300ng质粒pGEP842共同轰击、或用200ng质粒pGEP1054和300ng质粒pGEP842加上100ng质粒KWS_RBP2(MAD7/sgRNA/RBP2)共同轰击未成熟胚。在如所指示的时间处对受轰击胚进行取样，并且通过ddPCR分析SDN-1。HPB：轰击后小时数；DPB：轰击后天数。

图18示出了不同的再生加强剂如何增强玉米A188的再生T0植物的基因组编辑。A：每再生T0事件的SDN-1效率；B：每最初使用的未成熟胚(IE)的SDN-1效率。通过粒子轰击将再生加强剂与基因组编辑核酸酶MAD7构建体pGEP837(图1)和sgRNA构建体pGEP842(图2)共同递送到玉米A188未成熟胚中。

图19示出了用于通过粒子轰击来自玉米顽拗型优良品种4V-40290的未成熟胚(IE)的快速植物再生和基因组修饰的工作流程。A：未成熟胚(IE)在渗透培养基中放置4小时，并且准备好进行粒子轰击；B：在用加强构建体pABM-BdEF1_ZmPLT5和pABM-BdEF1_RBP8共同轰击并在胚性愈伤组织诱导培养基上培养6天之后，从IE的盾片表面诱导出胚性愈伤组织；(C)：胚性愈伤组织在成熟培养基上培养10天之后成熟；(D)：成熟胚在胚萌发培养基上生长7天之后发育成T0小植株；(E)：生长在温室中的T0植物；(F)：14天大的T1胚在MSO培养基上萌发3天；G：温室中的T1植物。

图20示出了再生加强剂如何促进从玉米顽拗型优良品种4V-40171诱导胚性愈伤组织。(A)至(G)：来自仅用基因组编辑构建体pGEP837和pGEP842轰击的(A)、或用加强剂KWS_RBP2(B)、KWS_RBP4(C)、KWS_RBP5(D)、ZmPLT5和KWS_RBP5(E)、ZmPLT5和KWS_RBP6(F)或ZmPLT5和KWS_RBP7(G)共同轰击的胚的愈伤组织诱导培养基中胚性愈伤组织诱导4天的图像。(H)至(K)：来自仅用基因组编辑构建体pGEP837和pGEP842轰击的(H)、或用ZmPLT5和KWS_RBP2(I)、ZmPLT5和ZmPLT5和KWS_RBP3(J)或ZmPLT5和KWS_RBP4(K)共同轰击的胚的愈伤组织诱导培养基中胚性愈伤组织诱导7天的图像。

图21示出了用如所指示的加强剂共同轰击后顽拗型玉米优良品种4V-40171未成熟胚的胚性愈伤组织诱导和植物再生率。(A)胚性愈伤组织诱导率(100个最初使用的胚中具有至少一个胚性愈伤组织的胚的数量；轰击后12天记录的结果；(B)植物再生率(根据100个最初使用的未成熟胚中的总再生T0事件计算)。

图22示出了再生加强剂促进荧光报告基因tDTomato在玉米顽拗型优良品种4V-40171中的稳定转化。(A)在仅用tDToma构建pGEP359(图13)轰击(A)、或用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP2(B)、ZmPLT5和KWS_RBP3(C)、ZmPLT5和KWS_RBP4(D)、ZmPLT5和KWS_RBP5(E)、ZmPLT5和KWS_RBP6(F)或ZmPLT5和KWS-RBP7(G)共同轰击之后，未成熟胚在胚性愈伤组织诱导培养基中8天的荧光图像。(H)tDTomato报告基因的稳定转化频率(100个最初使用的胚中具有至少一个tDTomat阳性结构的胚的数量)。在用如所指示的加强剂共同轰击之后8天记录结果。

图23示出了不同的加强剂如何促进顽拗型玉米优良品种4V-40171的基因组编辑。A：每再生T0事件的SDN-1效率(每100个再生T0事件的SDN-1事件的数量)；B：每未成熟胚的SDN-1效率(每100个最初使用的未成熟胚的SDN-1事件的数量)。通过粒子轰击将再生加强剂与基因组编辑构建体pGEP837(图1)和pGEP842(图2)共同递送到玉米未成熟胚中。

图24示出了再生加强剂如何促进从玉米顽拗型优良品种2V-20195的未成熟胚诱导胚性愈伤组织。在仅用基因组编辑构建体pGEP837轰击(A)、或用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP2(B)、ZmPLT5和KWS_RBP3(C)、ZmPLT5和KWS_RBP4(D)、ZmPLT5和KWS_RBP5(E)或ZmPLT5和KWS-RBP6(F)共同轰击之后，将胚在愈伤组织诱导培养基中培养8天。轰击后8天拍摄图像。

图25示出了用如所指示的加强剂共同轰击之后顽拗型玉米优良品种2V-20195未成熟胚的胚性愈伤组织诱导和植物再生率。(A)胚性愈伤组织诱导率(100个最初使用的胚中具有至少一个胚性愈伤组织的胚的数量；在培养基中培养14天之后记录结果；(B)植物再生率(根据100个最初使用的未成熟胚中的总再生T0事件计算)。

图26示出了再生加强剂如何促进绿色荧光报告基因(GEP)在玉米顽拗型优良品种2V-20195中的稳定转化。(A)在仅用GEP构建体pGEP837轰击(A)、或用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP2(B)、ZmPLT5和KWS_RBP3(C)、ZmPLT5和KWS_RBP4(D)、ZmPLT5和KWS_RBP5(E)或ZmPLT5和KWS-RBP6(F)共同轰击之后，未成熟胚在愈伤组织诱导培养基中8天的荧光图像。(H)GEP报告基因在未成熟胚中的稳定转化频率(100个最初使用的胚中具有至少一个tDTomat阳性结构的胚的数量)。在用如所指示的加强剂共同轰击之后14天记录结果。

图27示出了不同的加强剂如何促进顽拗型玉米优良品种2V-20195的基因组编辑。A：每再生事件的SDN-1效率(100个再生T0事件中的SDN-1事件)；B：每未成熟胚的SDN-1效率(每100个最初使用的未成熟胚的SDN-1事件)。通过粒子轰击将再生加强剂与pGEP837和pGEP842的基因组编辑构建体共同递送到玉米未成熟胚中。

图28示出了不同的加强剂如何促进玉米顽拗型优良品种4V-40290的T₀植物的基因组编辑。A：每再生T0事件的SDN-1效率(每100个再生T0事件的SDN-1T0事件的数量)；B：每胚的SDN-1效率(每100个最初使用的未成熟胚的SDN-1T0事件的数量)。

图29示出了不同的加强剂如何直接在玉米顽拗型优良品种中实现高效的基因组编辑。

图30示出了经编辑的温室T0玉米优良植物。来自玉米顽拗型优良品种4V-4071(A)、2V-20195(B)或4V-40290(C)的再生T0植物。

图31示出了生长在温室中的玉米顽拗型优良品种4V-4071的T1后代。

图32示出了基因组编辑引导RNA构建体pGEP1067的图。m7GEP22定义了靶向玉米HMG13基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图33：再生加强剂在与编辑构建体被共同引入到玉米A188未成熟胚(n＝6)中之后48小时促进了基因组编辑SDN-1效率。A：示出了CRISPR靶标m7GEP1处的基因组编辑SDN-1效率，或B示出了靶标m7GEP22处的效率。无加强剂：仅用编辑质粒轰击(A中100ng质粒pGEP1054和150ng质粒pGEP842，或B中100ng质粒pGEP1054和150ng质粒pGEP1067)。用与“无加强剂”中所使用的相同量的CRISPR质粒并加上200ng质粒ZmPLT5(ZmPLT5)或100ng质粒KWS_RBP2(KWS_RBP2)、或200ng质粒ZmPLT5和100ng质粒KWSRBP2(PLT5/RBP2)共同轰击未成熟胚。误差条＝标准偏差。通过Taqman ddPCR分析SDN-1。

图34：曲古抑菌素A(TSA)在与编辑质粒(n＝6)被共同引入之后48小时促进了基因组编辑SDN-1效率。A：示出了CRISPR靶标m7GEP1处的SDN-1效率，并且B示出了靶标m7GP22处的SDN-1效率。CK：仅用编辑构建体轰击未成熟胚(A中100ng质粒pGEP1054和150ng质粒pGEP842，或B中100ng质粒pGEP1054和150ng质粒pGEP1067)。TSA：用编辑质粒和15ng TSA共同轰击未成熟胚。误差条＝标准偏差。通过Taqman ddPCR分析SDN-1。

序列描述

SEQ ID NO 简要描述

1 A188-HMG13-WT全

2 玉米_HMG13_CDS_B73 CM000781.3

3 玉米_HMG13_蛋白AFW69593.1高迁移率族蛋白1[玉米(Zea mays)]

4 BdEF1_TaRKD4表达盒

5 BdEF1_ZmPLT3表达盒

6 BdEF1_ZmPLT5表达盒

7 BdEF1_ZmPLT7表达盒

8 BdEF1_KWS_RBP1表达盒

9 BdEF1_KWS_RBP2表达盒

10 pABM-BdEF1_RBP3表达盒

11 pABM-BdEF1_RBP4表达盒

12 pABM-BdEF1_RBP5表达盒

13 pABM-BdEF1_RBP6表达盒

14 pABM-BdEF1_RBP7表达盒

15 pABM-BdEF1_RBP8表达盒

16 TaRKD4_CDS(编码序列)

17 ZmPLT3-17207_CDS(编码序列)

18 ZmPLT5_CDS(编码序列)

19 ZmPLT7_CDS(编码序列)

20 RBP1_CDS(编码序列)

21 RBP2_CDS(编码序列)

22 RBP3_CDS(编码序列)

23 RBP4_CDS(编码序列)

24 RBP5_CDS(编码序列)

25 RBP6_CDS(编码序列)

26 RBP7_CDS(编码序列)

27 RBP8_CDS(编码序列)

28 TaRKD4_PRT(蛋白质)

29 ZmPLT3_PRT(蛋白质)

30 ZmPLT5_PRT(蛋白质)

31 ZmPLT7_PRT(蛋白质)

32 RBP1_PRT(蛋白质)

33 RBP2_PRT(蛋白质)

34 RBP3_PRT(蛋白质)

35 RBP4_PRT(蛋白质)

36 RBP5_PRT(蛋白质)

37 RBP6_PRT(蛋白质)

38 RBP7_PRT(蛋白质)

39 RBP8_PRT(蛋白质)

40 pABM-BdEF1_TaRKD4

41 pABM-BdEF1_ZmPLT3

42 pABM-BdEF1_ZmPLT5(图3)

43 pABM-BdEF1_ZmPLT7

44 pABM-BdEF1_KWS_RBP1

45 pABM-BdEF1_KWS_RBP2(图4)

46 pABM-BdEF1_KWS_RBP3(图5)

47 pABM-BdEF1_KWS_RBP4(图6)

48 pABM-BdEF1_KWS_RBP5(图7)

49 pABM-BdEF1_KWS_RBP6(图8)

50 pABM-BdEF1_KWS_RBP7(图9)

51 pABM-BdEF1_KWS_RBP8(图10)

52 pGEP837(图1)

53 pGEP842(图2)

54 pGEP359(图13)

55 pGEP1054(图15)

56 pGEP1067(图32)

定义

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

如本文所用，“碱基编辑器”是指具有与其所源自的蛋白质相同的催化活性的蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段单独地或当作为分子复合物(在本文中被称为碱基编辑复合物)提供时，具有介导靶向碱基修饰的能力，即感兴趣的碱基的转换导致感兴趣的点突变，如果所述碱基转换不导致沉默突变，而是由包含要用碱基编辑器转换的位置的密码子编码的氨基酸的转换，则所述点突变转而会导致靶向突变。通常，碱基编辑器因此用作分子复合物。包括例如CBE(介导C向T转换的碱基编辑器)和ABE(介导A向G转换的腺嘌呤碱基编辑器)在内的碱基编辑器是引入直接和可编程突变而无需双链切割的强有力工具(Komoret al.,Nature,2016,533(7603),420-424；Gaudelli et al.,Nature,2017,551,464-471)。一般而言，碱基编辑器由至少一种DNA靶向模块以及使胞苷或腺嘌呤脱氨基的催化结构域构成。DNA的所有四种转变(A→T向G→C以及C→G向T→A)都是可能的，只要碱基编辑器可以被引导到靶位点即可。BE和ABE两者最初被开发用于在哺乳动物细胞系统中工作，它们均已被最优化并应用于植物细胞系统。多种植物物种中均示出了有效的碱基编辑(Zong etal.,Nature Biotechnology,vol.25,no.5,2017,438-440；Yan et al.,Molecular Plant,vol.11,4,2018,631-634；Hua et al.,Molecular Plant,vol.11,4,2018,627-630)。碱基编辑器已被用于在植物和动物的具有已知或预测表型效应的基因组序列中引入特定的定向替换。但它们尚未用于靶向一个遗传基因座或若干基因座内的多个位点的定向诱变，以识别新型或优化性状。

如本文所用，“CRISPR核酸酶”是位点定向的核酸酶的特殊形式，并且是指已经在天然存在的CRISPR系统中鉴定的任何核酸引导的核酸酶，其随后已经从其天然背景中分离，并且其优选已被修饰或组合成感兴趣的的重组构建体以适合作为靶向基因组工程的工具。任何CRISPR核酸酶均可被使用，并任选地被重编程或另外突变以适于根据本发明的各种实施方式，只要原始野生型CRISPR核酸酶提供DNA识别(即结合特性)即可。CRISPR核酸酶还包含天然存在的CRISPR效应子序列的突变体或催化活性片段或融合体，或编码其的相应序列。CRISPR核酸酶还可以特别地是指在其自然环境中具有内切核苷酸功能的CRISRP切口酶或甚至是CRISRP多肽的核酸酶失效变体。同时，多种不同的CRISPR核酸酶/系统及其变体对于熟练技术人员是已知的，并且尤其包括CRISPR/Cas系统，包括CRISSPR/Cas9系统(EP2771468)、CRISPR/Cpf1系统(EP3009511B1)、CRIPRP/C2C2系统、CRISRP/CasX系统、CRIPPR/CasY系统、CRISOPR/Cmr系统、CRISPR/MAD系统，包括例如CRIPSPR/MAD7系统(WO2018236548A1)和CRISPR/MAD2系统、CRSPSR/CasZ系统和/或其任何组合、变体或催化活性片段。核酸酶可以是DNAse和/或RNAse，特别地考虑到某些CRISPR效应子核酸酶只具有RNA切割活性，或除DNA切割活性之外还具有RNA切割活性。

因此，“CRISPR系统”应被理解为CRISPR核酸酶或CRISPR效应子、或所述核酸酶的切口酶或核酸酶失效变体、或其功能活性片段或变体和引导相关CRISPR核酸酶的同源引导RNA(或pegRNA或crRNA)的组合。

如本文所用，术语“(再生)加强剂”、“加强剂基因”、“加强剂多肽”、“加强多肽”、“加强基因”和“加强因子”是指编码蛋白质/多肽的蛋白质/肽或(多)核酸片段，其加速细胞分裂和细胞增殖，并且因此导致改进的植物再生，特别是转化的或经基因编辑的植物细胞，这可能特别适合于改进基因组工程，即基因组工程后经修饰的植物细胞的再生。此种蛋白质/多肽可以增加优选衍生自体细胞组织、胚组织、愈伤组织或原生质体的植物细胞在整个植物(优选可育植物)中再生的能力。由此，它们可以调控体细胞胚形成(体细胞胚发生)和/或它们可以提高植物细胞的增殖率。转化的或经基因编辑的植物细胞的再生可能包括体细胞胚发生的过程，其是一种人工过程，其中植物或胚衍生自单个体细胞或体细胞组。体细胞胚是由通常不参与胚发育的植物细胞形成的，即植物组织，如花蕾、叶、芽等。这一过程的应用可能包括：遗传均匀植物材料的克隆繁殖；病毒的消除；为遗传转化提供源组织；从单个细胞(如原生质体)生成全植物；合成种子技术的发展。可以培养衍生自活性源组织的细胞以形成愈伤组织。此外，术语“再生加强剂”可以是指与未经处理的对照相比，在应用于植物细胞、组织、器官或全植物时具有增殖和/或再生效应的任何种类的化学物质。

如本文所用，“表观遗传调控化学物质”是指参与调控植物细胞表观遗传状态的任何化学物质，例如，DNA甲基化、蛋白质甲基化和乙酰化。用于根据本发明的用途的优选表观遗传调控化学物质是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)。如本文所用，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)是指抑制组蛋白脱乙酰酶活性的任何物质。此种HDACI可以是曲古抑菌素A(TSA)、N-羟基-7-(4-二甲氨基苯甲酰)-氨基庚酰胺(M344)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)或其他。这些HDAC选自基于异羟肟酸(HA)的化学物质，其针对锌依赖HDAC。TSA抑制HDAC活性并增加组蛋白乙酰化(Yoshida et al,1995；Finnin et al.1999)。

如本文所用，“共同递送(co-delivery)”或“共同递送(co-deliver)”和“共同引入(co-introduction)”或“共同引入(co-introduce)”可互换地使用。就本发明而言，这些术语是指将至少两种不同的组件同时递送到同一植物细胞中的过程。因此，将基因组修饰组件和加强组件一起引入到同一植物细胞中。优选，通过单独的构建体引入两种类型的组件，即加强剂和感兴趣的基因。

本文所用，“基因组”应被广泛理解，并且包含活细胞任何区室内的任何种类的遗传信息(RNA/DNA)。在“基因组修饰”的背景下，所述术语因此还包括可以在活细胞内被转录和/或翻译的人工引入的遗传材料，例如，游离型质粒或载体，或被整合到天然存在的基因组中的人工DNA。

如本文所用，术语“基因组工程”是指用于对植物细胞的遗传信息(DNA和RNA)或基因组进行遗传修饰的所有策略和技术，包含基因组转化、基因组编辑，但也包括较少的位点特异性技术，包括TILLING等。因此，“基因组编辑”(GE)更具体地是指一种特殊的基因组工程技术，其中对植物细胞的任何遗传信息或基因组进行靶向特异性修饰。因此，这些术语包含对编码基因或蛋白质的区域进行基因编辑，但还包括对除编码基因组区域的基因以外的区域进行编辑。其进一步包含对植物细胞的核(如果存在)以及其他遗传信息进行编辑或工程化改造，即对内含子序列、非编码RNA、miRNA、调控元件(如启动子、终止子)序列、转录激活因子结合位点、顺式或反式作用元件进行编辑或工程化改造。此外，“基因组工程”还包含表观遗传编辑或工程，即对例如可能导致基因表达中的遗传性变化的DNA甲基化或组蛋白修饰(如组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组蛋白苏素化(sumoylation)、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化)进行靶向修饰。

如本文所用，“基因组修饰系统”是指引入到细胞中、合适载体上和/或涂覆在粒子上和/或直接引入的任何DNA、RNA和/或氨基酸序列。“基因组编辑”系统更具体地是指引入到细胞中、合适载体上和/或涂覆在粒子上和/或直接引入的任何DNA、RNA和/或氨基酸序列，其中“基因组编辑系统”包含至少一种组件，其在修饰和/或修复基因组靶位点中作为、编码或辅助位点定向的核酸酶、切口酶或其灭活变体。

如本文所用，“基因组靶序列”是指植物细胞的核和/或细胞器基因组的任何部分，无论其是否编码基因/蛋白质，所述任何部分是位点定向的基因组编辑或基因编辑实验的靶标。

如本文所用，“植物材料”是指在任何发育阶段期间可以从植物中获得的任何材料。植物材料可以从植物体内获得，也可以从植物或其组织或器官的体外培养中获得。因此，所述术语包含植物细胞、组织和器官以及已发育的植物结构以及亚细胞组件，如核酸、多肽和所有的化学植物物质或代谢物，其可以存在于植物细胞或区室内和/或由植物产生，或可以从处于任何发育阶段的任何植物细胞、组织或植物的提取物中获得。所述术语还包含植物材料的衍生物，例如原生质体，其衍生自所述植物材料所包含的至少一个植物细胞。因此，所述术语还包含植物的分生组织细胞或分生组织。

如本文所用，“预选位点”、“预定位点”或“预定义位点”指示基因组(例如核基因组或细胞器基因组，包括线粒体或叶绿体基因组)中的特定核苷酸序列，在所述位置处，期望插入、替换和/或缺失一个或多个核苷酸。因此，预定位点位于感兴趣的“基因组靶序列/位点”中，并且可以使用位点或序列特异性基因组编辑系统以位点定向的方式来进行修饰。

如本文所用，术语“植物”、“植物器官”、“植物细胞”是指植物生物体、植物器官、分化和未分化的植物组织、植物细胞、种子及其衍生物和后代。植物细胞包括但不限于例如来自种子、来自成熟和未成熟胚、分生组织、幼苗、处于不同分化状态的愈伤组织、叶、花、根、茎芽、雄性或雌性配子体、孢子体、花粉、花粉管和小孢子、原生质体、巨藻和微藻的细胞。不同的真核细胞，例如动物细胞、真菌细胞或植物细胞，可以具有任何程度的倍性，即它们可以是单倍体、二倍体、四倍体、六倍体或多倍体。

如本文所用，术语“植物部分”包括但不限于分离和/或预处理的植物部分，包括器官和细胞，包括原生质体、愈伤组织、叶、茎、根、根尖、花药、雌蕊、种子、谷物、果皮、胚、花粉、孢子母细胞、胚珠、雄性或雌性配子或配子体、子叶、下胚轴、穗、小花、芒、外稃、芽、组织、叶柄、细胞和分生组织细胞。

如本文所用，“Prime Editing系统”是指一种如Anzalone et al.(2019).Search-and-replace genome editing without double-strand breaks(DSBs)or donorDNA.Nature,1-1)中所公开的系统。如上文中所详述的碱基编辑并不会切割双链DNA，而是使用CRISPR靶向机制将额外的酶穿梭到期望的序列中，在此将一个单核苷酸转换为另一个。植物的许多遗传性状以及对植物病原体所引起的疾病的某些易感性都是由单核苷酸变化引起的，因此碱基编辑为GE提供了一种强有力的替代方案。但是所述方法具有固有的局限性，并且据说会引入脱靶突变，而这通常不是高精度GE所期望的。相比之下，PrimeEditing(PE)系统通过对Cas9蛋白和引导RNA进行重度修饰，克服了早期基于CRISPR的GE技术的缺点。已改变的Cas9只“刻痕”双螺旋的一条单链，而不是切割两条。新的引导RNA被称为pegRNA(prime编辑扩展的引导RNA)，包含一种用于要被添加到靶位置处的基因组中的新DNA序列的RNA模板。这需要第二种蛋白质，其附着于Cas9或一种不同的CRISPR效应子核酸酶：一种逆转录酶，所述酶可以从RNA模板生成新的DNA链并将其插入已刻痕的位点。为此，鉴于需要靶标特异性核酸::核酸杂交的进一步步骤这一事实，因此将额外的特异性水平引入到GE系统中。这可以显著降低脱靶效应。进一步地，鉴于以下事实：由于相应系统的本质而导致BE不能覆盖所有预期的核苷酸转变/突变(C→A、C→G、G→C、G→T、A→C、A→T、T→A和T→G)，并且如BE所支持的转变可能需要许多细胞类型和生物体中的DSB，因此PE系统可以显著增加相应GE系统的靶向范围。

如本文所用，“调控序列”或“调控元件”是指不属于蛋白质编码核苷酸序列的一部分，但介导蛋白质编码核苷酸序列的表达的核苷酸序列。调控元件包括例如启动子、顺式调控元件、增强子、内含子或终止子。取决于调控元件的类型，其位于蛋白质编码核苷酸序列之前(即5')或之后(即3')的核酸分子上。调控元件在活的植物细胞中具有功能性。

“RNA引导的核酸酶”是一种位点特异性核酸酶，其需要RNA分子，即引导RNA，来例如在基因组DNA中或在作为靶标的RNA中识别和切割特异性靶位点。RNA引导的核酸酶与引导RNA一起形成核酸酶复合物，然后识别并切割序列依赖性物质中的靶位点。因此，通过设计引导RNA序列，RNA引导核酸酶可以经编程以靶向特异性位点。RNA引导的核酸酶可以选自CRISPR/Cas系统核酸酶，包括CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/C2C2系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cmr系统、CRISPR/Cms系统、CRISPR/MAD7系统、CRISPR/MAD2系统和/或其任何组合、变体或催化活性片段。此类核酸酶可能会留下钝的或交错的末端。进一步包括RNA引导的核酸酶的切口酶或核酸酶失效变体，其可与融合蛋白或蛋白质复合物组合使用，以例如在碱基编辑器或Prime Editor中改变和修饰此种融合蛋白的功能性。

如本文所用，术语“SDN-1”、“SDN-2”和“SDN-3”分别是平台技术“位点定向的核酸酶”1、2或3的缩写，所述核酸酶如由任何感兴趣的位点定向的核酸酶引起，包括例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR核酸酶。在不添加外源DNA的情况下，SDN-1在植物基因组中造成双链或单链断裂。因此，“位点定向的核酸酶”能够任选地借助于进一步分子来识别和切割基因组中的特异性序列或感兴趣的分离基因组序列。对于SDN-2和SDN-3，在基因编辑期间将外源性核苷酸模板提供给细胞。然而，对于SDN-2，未将重组外源DNA插入到靶细胞的基因组中，但内源性修复过程复制，例如，如模板中所存在的突变，以诱导(点)突变。相比之下，SDN-3机制在修复DNA断裂期间使用引入的模板，以便将遗传材料引入到基因组材料中。

“位点特异性核酸酶”在本文中是指核酸酶或其活性片段，所述核酸酶或其活性片段能够在特定位置处特异性识别并切割DNA。所述位置在本文中也被称为“靶序列”。此类核酸酶通常产生双-链断裂(DSB)，然后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组n(HR)修复。位点特异性核酸酶包括大范围核酸酶、归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样核酸酶和CRISPR核酸酶、或包括切口酶或其核酸酶失效变体的变体。

术语“转化”、“转染”、“转化的”和“转染的”在本文中可互换地用于通过任何种类的引入相关至少一种材料的物理(例如，轰击)、化学或生物(例如，农杆菌)方式，将包括核酸(DNA/RNA)、氨基酸、化学物质、代谢物、纳米粒子、微粒子等在内的材料以任意方式引入到至少一个感兴趣的细胞中。

如根据本公开所使用的术语“转基因的”是指包含基因或遗传构建体的植物、植物细胞、组织、器官或材料，其包含通过自然手段或借助于来自另一生物体的转化技术转移到植物、植物细胞、组织器官或材料中的“转基因”。术语“转基因”包含核酸序列(包括DNA或RNA)或氨基酸序列或其组合或混合物。因此，术语“转基因”并不局限于通常被鉴定为“基因”的序列，即编码蛋白质的序列。例如，其也可以是指非蛋白质编码DNA或RNA序列，或序列的一部分。因此，术语“转基因的”通常意味着各自的核酸或氨基酸序列不是自然地存在于各自的靶细胞中，包括植物、植物细胞、组织、器官或材料。因此，如本文所用，术语“转基因”或“转基因的”是指取自一种生物体的基因组的或合成产生的核酸序列或氨基酸序列，并且然后通过分子生物学、遗传学等人工技术以瞬时或稳定的方式将所述核酸序列或氨基酸序列引入到另一生物体中。

如本文所用，术语“瞬时”意味着仅暂时引入和/或表达和/或激活包括各种基于核酸(RNA和/或DNA)和多肽的分子(任选地包括化学载体分子)在内的效应子，并且所述效应子例如随后被细胞降解，而“稳定”意味着所述效应子中的至少一个被整合到要被修饰的细胞的核和/或细胞器基因组中，并且因此被遗传给后代。“瞬时表达”是指以下现象：转移的蛋白质/多肽和/或编码所述蛋白质/多肽的核酸片段在细胞中瞬时表达、存在和/或活化，并且随着细胞生长而不久会关闭和/或降解。因此，瞬时表达也意味着例如在作为调控元件的诱导型启动子的控制下，稳定整合的构建体通过打开或关闭表达以微调的方式调节表达。

术语“载体”或“质粒(载体)”是指尤其包含质粒或(质粒)载体、粘粒、人工酵母或细菌人工染色体(YAC和BAC)、噬菌体、基于细菌噬菌体的载体、农杆菌相容载体、表达盒、分离的单链或双链核酸序列(包含线性或循环型序列)或氨基酸序列、病毒载体、病毒复制子(包括经修饰的病毒)及其组合或混合物的构建体，其用于引入或转化、转染或转导到任何真核细胞，包括根据本发明的植物、植物细胞、组织、器官或材料。例如，“核酸载体是一种DNA或RNA分子，其用于将外源遗传材料递送到细胞，在此所述外源遗传材料可以被转录并任选地被翻译。优选，所述载体是一种包含多个克隆位点的质粒。所述载体可以进一步包含“独特的克隆位点”，所述克隆位点仅在载体中出现一次，并且允许通过使用特异性限制酶来插入DNA序列，例如核酸盒或其组件。“柔性插入位点”可以是多克隆位点，其允许以一定的布置插入根据本发明的核酸盒的组件，这促进组件的同时转录并允许RNA激活单元的激活。

每当本公开涉及核酸或氨基酸序列彼此相对于彼此要被比较的整个序列长度的同源性或相同性百分比时，其中这些相同性或同源性值定义了如通过使用用于核酸的EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments(核苷酸)程序www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)或用于氨基酸序列的EMBOSS Water Pairwise SequenceAlignments(蛋白质)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/prump_Water/)获得的值。由欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory，EMBL)欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)提供的用于局部序列比对的那些工具使用改进的Smith-Waterman算法(参见www.ebi.ac.uk/Tools/psa/and Smith,T.F.&Waterman,M.S.“Identification of common molecular subsequences”Journal of MolecularBiology,1981 147(1):195-197)。当进行比对时，使用由EMBL-EBI定义的默认参数。(i)对于氨基酸序列，这些参数是：矩阵＝BLOSUM62，空位开放罚分＝10，并且空位扩展罚分＝0.5；或(ii)对于核酸序列，这些参数是：矩阵＝DNAfull，空位开放罚分＝10，并且空位扩展罚分＝0.5。

发明详述

本发明提供了用于单个细胞的快速且高效的基因组修饰以及从单个细胞再生植物的方法。本发明描述了再生加强剂的核苷酸/蛋白质以及提高植物细胞再生能力的方法；当与基因组修饰体系共同递送时，基因组修饰得到了促进。使用再生加强剂或再生加强剂组合，有可能在再生期间正选择加强剂的瞬时表达递送，并且负选择持续表达加强剂的稳定转基因细胞。这种“双重选择”允许一方面从由再生加强剂提供的提高的基因组修饰效率和增强的增殖和再生中获益，另一方面排除持续表达对分化和随后发育产生负面影响的加强剂的植物。将修饰稳定地遗传给再生植物的后代，而修饰工具优选只在要被修饰的细胞中瞬时存在或表达，并且不再存在于再生植物中。因此，有可能获得一种能育的无转基因植物，其携带具有最小的体细胞变异的修饰。

可以促进基因修饰并增加基因组编辑SDN-1效率的另一类型效应子是表观遗传调控化学物质。

遗传材料的基本结构和功能单元是核小体，其中带负电荷的DNA包裹在带正电荷的组蛋白八聚体和相关的接头组蛋白周围。核小体单元进一步折叠并堆积成染色质(Andrews,A.J.,and Luger,K.2011.Nucleosome structure(s)and stability:Variations on atheme.Annu.Rev.Biophys.40:99–117.)。DNA可接近性在很大程度上取决于核小体和染色质的紧密度。染色质重构酶动态地修饰组蛋白的赖氨酸或其他氨基酸，这导致它们的电荷变化以及与DNA和其他蛋白质相互作用，并且导致染色质折叠或展开(Bannister AJ,Kouzarides T.2011,Regulation of chromatin by histonemodifications.Cell Res.21:381–95.)。通过添加或去除乙酰基基团，组蛋白中赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化通常参与真核生物中染色质结构的可逆调节，并且介导染色质可接近性和基因表达。组蛋白脱乙酰酶(HDAC)是可以从组蛋白N端尾部的赖氨酸中去除乙酰基基团，使组蛋白带更多正电荷，从而允许组蛋白更紧地包裹DNA的酶。因此，抑制HDAC可能有助于染色质展开，并且使DNA变得更容易接近。

据推测，当将组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HADCI)与引入细胞中的修饰组件共同递送时，组蛋白脱乙酰酶抑制剂会放松植物染色质结构，并且促进DNA对基因组修饰体系的可接近性，因而促进基因组修饰，例如基因组编辑效率。本文描述了在存在至少一种所选表观遗传调控化学物质，优选组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)的情况下，增加基因组修饰效率，特别是基因组编辑SDN-1效率的方法。

在一个方面，本发明提供了一种用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰，以获得至少一个经修饰的细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)提供至少一个植物细胞或单个植物细胞；

(b)将以下引入到所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞中：

(i)至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列，以及可选地至少一种引导分子或编码其的序列；

(ii)至少一种再生加强剂或编码其的序列和/或至少一种表观遗传调控化学物质，其中所述至少一种再生加强剂在所述植物细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达；

(iii)以及，可选地至少一种修复模板或编码其的序列；以及

(c)在允许表达和/或组装和/或激活所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及可选地所述至少一种再生加强剂，以及可选地所述至少一种引导分子和/或可选地所述至少一种修复模板的条件下，培养所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞；以及

(d)获得至少一个经修饰的植物细胞；和/或

(e)获得从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子；以及

(f)任选地：在携带期望靶向修饰的T0和/或T1代中筛选从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

在根据本发明的方法中，再生加强剂的使用提供了增加的基因组编辑效率，并且增强了经编辑的细胞的增殖以再生植物。其中再生加强剂仅在细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达的细胞进一步发育成成熟植物。

通过将加强剂或编码加强剂的核酸序列引入到靶细胞中来实现加强剂在细胞中的瞬时表达、瞬时存在或瞬时活化，从而导致基因表达和/或活性而无需将编码序列整合到靶细胞的基因组中。再生加强剂基因优选在强组成型启动子下瞬时表达，然后关闭和/或降解。例如，来自短柄草属EF1基因的强组成型启动子可以用于驱动加强剂基因表达以进行瞬时转化。加强剂基因被瞬时翻译和活化，并且随着植物细胞的发育或如果表达条件被去除，加强剂基因不久会被关闭和降解。

除再生加强剂之外，还可以任选地引入表观遗传调控化学物质，或也可以在没有任何再生加强剂的情况下引入表观基因调控化学物质以提高基因组编辑效率。

在一个实施方式中，通过如下文进一步所描述的细胞预处理将表观遗传调控化学物质递送到外植体细胞中。

在另一实施方式中，通过共同轰击将表观遗传调控化学物质与基因组编辑组件共同递送到外植体细胞中。这代表优选的方法，其为共同递送的细胞提供选择性机制以实现基因组编辑和再生。

在又另一实施方式中，通过共同轰击将表观遗传调控化学物质与基因组编辑组件和至少一种再生加强剂基因构建体共同递送到外植体细胞中。这代表一种用于顽拗型基因型的高度优选的方法，其为递送的细胞提供高度选择性机制以实现基因组编辑和再生。

在另一实施方式中，通过预处理和共同轰击二者递送表观遗传调控化学物质。

在上文描述的方法的一个实施方式中，步骤(i)和(ii)同时或随后发生，以促进植物细胞增殖和/或协助至少一个基因组靶序列的靶向修饰。

优选，同时或随后提供基因组或基因编辑系统的所有外源性地提供的元件或工具，以及再生加强剂或编码其的序列和/或表观遗传调控化学物质，以及任选地提供的修复模板序列，其中术语同时和随后是指引入相关元件的时间顺序，条件是同时和随后引入都保证同一细胞将以有活性和/或可表达的方式包含相关元件。最终，所有基因组或基因编辑系统元件实际上都因此存在于一个细胞中。具体地，在基因组编辑期间存在并活化的加强剂有助于使其更有效的靶向修饰，并且随后增强经修饰的细胞的增殖再生。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，在步骤(ii)中引入至少一种再生加强剂并且

(a)所述再生加强剂促进植物细胞增殖和/或协助靶向修饰和/或为至少一个瞬时转化的细胞提供正选择以用于基因组修饰和/或用于再生成至少一种经修饰的植物，和/或

(b)如果细胞被稳定转化，则所述再生加强剂抑制植物细胞分化并为至少一个稳定转化的细胞提供负选择以用于再生成一种转基因植物，和/或

(c)所述再生加强剂为至少一个转化细胞提供根据(a)和(b)的双重选择。

如上文所解释，再生加强剂增加基因组编辑效率，并且同时促进瞬时转化细胞的增殖，而抑制稳定转化的细胞的植物细胞分化。这种双重选择有利地允许再生经修饰的植物，其不会将基因组编辑工具传递给后代，而仅仅是携带期望的修饰。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，所述至少一个植物细胞是未成熟胚细胞或分生组织细胞，特别是合子或体细胞胚或分生组织的细胞，或所述单个植物细胞是二倍体细胞或单倍体细胞，优选单倍体小孢子。

未成熟胚代表一种可以引入靶向基因组修饰的合适发育状态，并且可以从胚细胞再生出经修饰的植物。可以使用衍生自任何类型的植物材料、芽、下胚轴、子叶、茎、叶、叶柄、根、花、配子体或其部分的合子胚或体细胞胚。

在合适的条件下培养已引入基因组修饰/编辑组件的植物细胞，从而允许在存在至少一种再生加强剂和/或至少一种表观遗传调控化学物质的情况下，通过基因组修饰/编辑组件的活性在所述植物细胞中发生基因组修饰。可以将经遗传修饰的植物细胞再生成全植物。因此，植物细胞的遗传修饰之后是再生植物的步骤。

因此，根据本发明的方法可以包含以下步骤：

1.制备作为优选未成熟胚(IE)(合子胚或体细胞胚)的一部分的植物细胞。

2.例如通过粒子轰击进入植物细胞来递送基因组修饰组件和再生加强剂和/或至少一种表观遗传调控化学物质。

在再生期间，单个或多个细胞增殖并发育成组织、器官，最终形成整个植物。因此，在递送基因组修饰/编辑组件之后，作为未成熟胚(IE)(合子胚或体细胞胚)的一部分的植物细胞的再生可以包含以下步骤：

a.1-4周、优选1-3周、最优选7-14天的植物细胞增殖和胚性愈伤组织诱导；

b.1-4周、优选1-3周、最优选10-18天的来自(a)的愈伤组织的植物器官/胚发育

c.1-4周、优选4-10天的来自(b)的器官/胚的小植株发育

通常代表在植物发育的不同阶段期间活化的转录因子并还被称为植物中的形态发生调控子的某些再生加强剂序列包括Wuschel(WUS)和babyboom(BBM)类加强剂(Mayer,K.F.et al.Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsisshoot meristem.Cell 95,805–815(1998)；Yadav,R.K.et al.WUSCHEL protein movementmediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.Genes Dev 25,2025–2030(2011)；Laux,T.,Mayer,K.F.,Berger,J.&Jürgens,G.The WUSCHEL gene isrequired for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.Development122,87–96(1996)；Leibfried,A.etal.WUSCHEL controls meristem function by directregulation of cytokinin-inducible response regulators.Nature 438,1172–1175(2005)；对于BBM：Hofmann,A Breakthrough in Monocot Transformation Methods,ThePlant Cell,Vol.28:1989,September 2016)。包括RKD(包括TaRKD4)和LEC转录因子家族在内的其他再生加强剂序列一直在稳步出现，并且同时也为熟练人员所知(Hofmann,ABreakthrough in Monocot Transformation Methods The Plant Cell,Vol.28:1989,September 2016；New Insights into Somatic Embryogenesis:LEAFY COTYLEDON1,BABYBOOM1 and WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX4 Are Epigenetically Regulated in Coffeacanephora,PLos one August 2013,vol.8(8),e72160；LEAFY COTYLEDON1-CASEIN KINASEI-TCP15-PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR4 Network Regulates SomaticEmbryogenesis by Regulating Auxin Homeostasis Plant Physiology_,December2015,Vol.169,pp.2805–2821；A.Cagliari etal.New insights on the evolution ofLeafy cotyledon1(LEC1)type genes in vascular plants Genomics 103(2014)380–387,US6825397B1；US7960612B2,WO2016146552A1)。

转录因子的生长调控因子(GRF)家族对植物具有特异性，也是熟练技术人员所知的。已经在拟南芥中鉴定出至少九种GRF多肽(Kim et al.(2003)Plant J 36:94-104)，并且在水稻中鉴定出至少十二种(Choi et al.(2004)Plant Cell Physiol 45(7):897-904)。GRF多肽的特征是在其N端半存在至少两个高度保守的结构域，它们以各自结构域内最保守的氨基酸命名：(i)QLQ结构域(InterPro登录号IPR014978，PFAM登录号PF08880)，其中所述结构域中最保守的氨基酸是Gln-Leu-Gln；以及(ii)WRC结构域(InterPro登录号IPR014977，PFAM登录号PF08879)，其中所述结构域中最保守的氨基酸是Trp-Arg-Cys。WRC结构域进一步含有两个独特的结构特征，即WRC结构域富含碱性氨基酸Lys和Arg，并且在保守间隔(CX9CX10CX2H)中进一步包含三个Cys和一个His残基，其被指定为Iranscription(ET)结构域的效应子(Ellerstrom et al.(2005)Plant Molec Biol 59:663-681)。ET结构域中半胱氨酸和组氨酸残基的保守间隔形似锌指(锌结合)蛋白。另外，GRF多肽序列中通常包含核定位信号(NLS)。

另一类潜在的再生加强剂是PLETHORS(PLT)转录因子类别，但尚未对这类再生加强剂在人工基因组/基因编辑中的功能进行详细研究(Aida,M.,et al.(2004).ThePLETHORA genes mediate patterning of the Arabidopsis root stem cellniche.Cell 119:109–120；

A.P.,et al.(2014).PLETHORA gradient formationmechanism separates auxin responses.Nature 515:125–129)。动物和植物中的器官形成依赖于对细胞状态转变的精确控制，以将干细胞子代变成完全分化的细胞。在植物中，细胞由于共享细胞壁而无法重新布置。因此，分化进展和伴随的细胞扩增必须在组织间紧密协调。PLETHORA(PLT)转录因子梯度在引导正在生长的拟南芥根的不同位置处的细胞分化进展方面具有独特的能力，这与动物中很好描述的转录因子梯度形成对比，从而在基本静态的背景下指定不同的细胞命运。为了了解PLT梯度的输出，研究了由PLT转录地控制的基因集，并且揭示了PLT梯度如何可以通过细胞增殖基因的区域特异性诱导以及分化的抑制来调控细胞状态。此外，PLT靶标包括主要模式化基因和自动调控反馈组件，从而加强了它们作为器官发育主调控子的作用(Santuari et al.,2016,DOI:https://doi.org/10.1105/tpc.16.00656)。PLT也被称为AIL(AINTEGUMENT-LIKE)基因，是转录调控子AP2家族的成员。转录因子AP2家族的成员在植物的细胞增殖和胚发生方面发挥重要作用(ElOuakfaoui,S.et al.,(2010)Control of somatic embryogenesis and embryodevelopment by AP2 transcription factors.PLANT MOLECULAR BIOLOGY74(4-5):313-326.)。PLT基因主要在芽和根的发育组织中表达，并且是干细胞稳态、细胞分裂和再生以及器官原基模式化所需的。PLT家族包含六个成员的AP2亚分枝(subclade)。四个PLT成员PLT1/AIL3 PLT2/、AIL4、PLT3/A/L6和BBM/PLT4/AIL2在根尖分生组织(RAM)中部分重叠表达，并且是QC(静止中心)标记在干细胞龛内的正确位置处的表达所需的。这些基因在维持细胞分裂和防止根尖分生组织的细胞分化方面发挥冗余功能。三个PLT基因PLT3/AIL6、PLT5/AIL5和PLT7/AIL7在芽顶端分生组织(SAM)中表达，其中它们在侧生器官的定位和外生长方面发挥冗余功能。PLT3、PLT5和PLT7通过控制两个不同的发育事件来调控拟南芥的新芽再生。PLT3、PLT5和PLT7需要在分生组织的外围维持高水平的PIN1表达，并且调控SAM中心区域的局部生长素产生，其是叶序转变的基础。这三个基因功能的累积丧失导致中间细胞团、愈伤组织不能形成芽祖细胞，而PLT5或PLT7的诱导可以以激素非依赖性方式实现芽再生。PLT3、PLT5、PLT7调控并需要芽促进因子CUP-SHAPED COTYLEDON2(CUC2)来完成芽形成程序。PLT3、PLT5和PLT7也在侧根生成细胞中表达，在此它们冗余地激活PLT1和PLT2的表达，并且因此调控侧根的形成。

衍生自天然存在的转录因子(如例如，BBM或WUS)及其变体的再生加强剂可能具有显著的缺点，即植物细胞在特定的时段内不受控制的活性会对植物细胞产生有害影响。因此，本发明人在对各种靶标植物进行一系列多序列比对、结构域混编、截短和密码子优化之后，进行了一系列通过电脑模拟的工作，以创建完全人工再生加强剂蛋白。通过专注于核心共有基序，鉴定自然界中不存在的再生加强剂的新变体成为目的，这些变体特别适用于从单细胞来源的植物再生，特别是在基因组修饰和基因编辑的背景下。在新的加强剂序列的设计过程中，特别考虑了目前不被认为具有所描述加强剂基因和蛋白质的再生加强剂活性的不同物种中的各种裸子植物序列。

基于这项工作，现已发现，人工创建的特异性再生加强剂(参见SEQ ID NO：20至27、32至39，再生加强剂蛋白1至8(RBP1-8)，以及某些经修饰的天然充当转录因子的再生加强剂(SEQ ID NO：16至19、28至31)与本文公开的方法组合时表现得特别好，因为它们促进再生并且额外具有提高基因组或基因编辑效率的能力。进一步地，人工创建、然后逐步选择和测试的再生加强剂未示出多效性效应，并且特别适合于在任何种类的基因组修饰和/或基因编辑期间使用。本文描述的加强剂或加强剂组合允许在再生期间正选择瞬时表达递送，并且负选择持续表达加强剂的稳定转基因细胞。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，所述至少一种再生加强剂包含至少一种RBP，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

人工再生加强剂RBP1至RBP8可以以彼此的任意组合的方式或和/或与其他加强剂组合使用。RBP1可以与RBP2组合使用，或与RBP3组合使用，或与RBP4组合使用，或与RBP5组合使用，或与RBP6组合使用，或与RBP7组合使用，或与RBP8组合使用。RBP2可以与RBP3组合使用，或与RBP4组合使用，或与RBP5组合使用，或与RBP6组合使用，或与RBP7组合使用，或与RBP8组合使用。RBP3可以与RBP4组合使用，或与RBP5组合使用，或与RBP6组合使用，或与RBP7组合使用，或与RBP8组合使用。RBP4可以与RBP5组合使用，或与RBP6组合使用，或与RBP7组合使用，或与RBP8组合使用。RBP5可以与RBP6组合使用，或与RBP7组合使用，或与RBP8组合使用。RBP6可以与RBP7组合使用，或与RBP8组合使用。RBP8可以与RBP7组合使用。人工再生加强剂RBP1至RBP8也可以以加强剂RBP1至RBP8中的两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有的任意组合的方式使用。

优选，RBP1至RBP8或其任意组合与PLT或RKD加强剂中的一种组合。RBP1可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。RBP2可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。RBP3可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。RBP4可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。RBP5可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。RBP6可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。RBP7可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。RBP8可以与PLT3组合使用，或与PLT5组合使用，或与PLT7组合使用，或与RKD4组合使用。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个优选实施方式中，所述至少一种再生加强剂进一步包含至少一种PLT或RKD4，其中所述至少一种PLT或RKD4包含选自SEQ IDNO：28、29、30和31的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种PLT或RKD4由以下编码：选自SEQ ID NO：16、17、18和19的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

人工再生加强剂RBP1至RBP8或其组合也可以与选自BBM、WUS、WOX、GRF或LEC中的一种或多种加强剂组合使用。RBP1可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。RBP2可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。RBP3可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。RBP4可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。RBP5可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。RBP6可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。RBP7可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。RBP8可以与BBM组合使用，或与WUS组合使用，或与WOX组合使用，或与GRF组合使用或与LEC组合使用。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，引入进一步的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂或编码其的序列选自BBM、WUS、WOX、GRF、LEC或其变体，或所述进一步的再生加强剂是选自RBP1至RBP8的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂不同于第一再生加强剂。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，所述至少一种再生加强剂包含至少一种RBP，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列，并且所述至少一种再生加强剂包含PLT5，其中所述PLT5包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述PLT5由以下编码：SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

根据本文公开的各个实施方式和方面，除根据本发明的人工RBP之外，还可以优选使用天然存在的再生加强剂，其中所述天然存在的再生加强剂(例如，BBM、WUS1/2、LEC1/2、GRF或PLT)可以衍生自要被转化的靶标植物或衍生自密切相关的物种。例如，对于单子叶植物修饰，可以优选具有单子叶来源(例如，来自玉米(Zm))的加强剂蛋白，而对于双子叶植物修饰，可以优选具有双子叶来源(例如，源自拟南芥(At)或欧洲油菜(Bn))的加强剂蛋白。通过在已发布的基因组数据内进行序列搜索，可以很容易地鉴定出相关的加强剂序列。值得注意的是，来自一种植物物种的再生加强剂可能示出某种跨物种适用性，使得例如小麦衍生的加强剂基因可以用于玉米，反之亦然，或拟南芥或短柄草衍生的加强剂基因可以用于向日葵，反之亦然。因此，如本文所用的PLT、WUS、WOX、BBM、LEC、RKD4或GRF序列，或具有类似再生加强剂功能的蛋白质，可以衍生自任何植物物种，其基因组中含有编码各自加强剂的相应基因。

因此，根据本文公开的方法，在人工和受控背景下使用至少一种再生加强剂具有促进植物细胞增殖的效果。这种效果对任何种类的植物基因组修饰都非常有利，因为它在通过转化和/或转染将任何质粒或化学物质引入到所述至少一个植物细胞中之后，可以促进细胞再生，因为这些干预必然总是会对植物细胞造成压力。

另外或替代地，根据本文公开的方法的至少一种再生加强剂可以在增强植物基因组编辑效率方面具有特异性作用。具体地，这种由至少一种位点特异性核酸酶、切口酶或其变体引起的干预，会在植物中引起某种修复和压力响应。因此，至少一种再生加强剂的存在也可以通过增加植物基因组修饰后植物细胞的再生率来提高基因组或基因编辑的效率。

在一个实施方式中，至少一种再生加强剂或编码其的序列或再生加强剂化学物质，可以与要被插入的其他工具，即至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统同时提供，以减少转化/转染对细胞的潜在压力。因此，对于某些对转化/转染敏感的细胞，再生加强剂可以代表一种合适的选项，其可以在转化/转染进一步的基因组或基因编辑工具之前、与此同时或之后不久提供，以通过稳定细胞并因此通过减少潜在有害的细胞压力响应来减少细胞压力并增加转化和/或编辑效率。

在另一实施方式中，可以随后或顺序提供至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，以及至少一种再生加强剂或编码其的序列。通过分离引入步骤，可以避免位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶编码序列的编辑构建体DNA整合，其中瞬时结果是感兴趣的的。

在某些实施方式中，有利的是，在引入进一步的工具之前，至少一种再生加强剂在细胞中是有活性的，所述工具用于在进行基因组或基因编辑之前将所述细胞置于低细胞压力状态中。

对于至少一种再生加强剂的任何同时或随后引入，再生加强剂和可选地进一步基因组修饰或基因组编辑系统应所述是有活性的，即，存在于活性蛋白质和/或RNA阶段中，存在于一个和同一要被修饰的细胞中，优选存在于所述细胞的细胞核中，或存在于包含要被修饰的基因组DNA的细胞器中。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，在步骤ii)中引入至少一种表观遗传调控化学物质，并且所述至少一种表观遗传调控化学物质是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)，特别是曲古抑菌素A(TSA)或TSA样化学物质。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，通过由基因枪轰击介导的转化或转染、农杆菌介导的转化、微米或纳米粒子递送，或通过化学转染，或其组合将所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及所述至少一种再生加强剂或编码其的序列和/或所述至少一种表观遗传调控化学物质的序列引入到细胞中，优选其中通过基因枪轰击引入所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及至少一种再生加强剂和/或所述至少一种表观遗传调控化学物质，优选其中所述基因枪轰击包含在轰击之前和/或之后的渗透处理步骤。

根据本文公开的方法，优选策略可以是粒子或基因枪轰击，因为其允许以精确的方式来直接和靶向地引入外源性核酸和/或氨基酸材料，而不依赖于生物转化工具(包括农杆菌)的生物扩散和表达。

粒子轰击或基因枪轰击是指一种物理递送方法，其用于将包含感兴趣的构建体的涂覆微粒子或纳米粒子转移到靶细胞或组织中。为了在本发明中使用，感兴趣的构建体包含基因组修饰组件和至少一种再生加强剂。通过粒子轰击进行的转化使用一种覆盖有感兴趣的构建体的金属微粒，然后使用一种被称为“基因枪”(Sandford et al.1987)的设备将其以足够快穿透靶组织的细胞壁但不足以导致细胞死亡的高速度(约1500km/h)射到靶细胞上。轰击后，至少一个微粒上的涂覆组件释放到细胞中。通过高压放电或压缩气体(氦气)来实现微粒的加速。关于所使用的金属粒子，必须是无毒、无反应性的，并且其直径小于靶细胞。最常用的是金或钨。基因枪和相关系统的制造商和供应商提供了大量关于其一般用途的公开可用信息。

微粒子由无毒、无反应性的材料组成。优选，微粒子包含如金或钨等金属。用基因组修饰和加强组件进行的涂覆可以包含一个或多个涂覆层。例如，微粒子可以含有第一涂覆层和第二涂覆层，所述第一涂覆层包含基因组修饰组件，并且所述第二涂覆层包含再生加强剂化合物。可以通过包含金粒子的微载体将再生加强剂与基因组修饰组件共同递送，所述金粒子的尺寸范围为0.4-1.6微米(μm)，优选0.4-1.0μm。可以例如使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪或手持式Helios基因枪系统，将再生加强剂和基因组修饰组件递送到靶细胞中。可以同时将多于一种的化学或加强剂构建体与基因组修饰组件共同递送到靶细胞中。在示例性过程中，每一次轰击(射击)使用涂覆到10-1000μg、优选50-500μg金粒子上的10ng-10ug DNA，优选50-1000ng DNA。当使用PDS-1000/He粒子枪系统时，轰击破裂压力为450psi至2200psi，优选450-1,500psi，更优选450-1,100psi。每一个样品板至多可以进行10次轰击(射击)，优选1-4次射击，以将外源分子递送到植物细胞中。

根据上文描述的方法的优选实施方式，可以任选地通过在含有至少一种表观遗传调控化学物质(例如TSA)的培养基中对植物材料进行体外预处理，将至少一种表观遗传调控化学物质引入到至少一个植物细胞中。因此，用于植物细胞的遗传修饰的方法可以进一步包含预处理用于步骤a)的植物细胞的步骤，所述预处理包含在至少含有表观遗传调控化学物质或其活性衍生物，特别是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)的培养基中培养植物细胞或包含所述植物细胞的植物材料。示例性地，对于组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA，TSA预处理的持续时间为10分钟到2天，优选2.0到24小时。预处理的TSA浓度为1.0nM至10mM，优选10nM至500nM。此后，将处理过的植物材料转移到无TSA的培养基中，并且立即用于TSA与遗传修饰组件的共同引入，因为延长的TSA预处理可能会导致细胞再生的非选择性增强，这可能会增加找回经修饰的细胞的难度。

在可选地预处理步骤之后，从培养基中取出处理过的植物细胞，并且通过微粒轰击将其用于共同引入步骤。

优选的是通过微粒轰击共同引入表观遗传调控化学物质。在所述背景下，本发明提供了一种涂覆有以下的微粒子：

(i)至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列，以及可选地至少一种引导分子或编码其的序列；

(ii)至少一种表观遗传调控化学物质，优选组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)，特别是曲古抑菌素A(TSA)或一种TSA样化学物质，以及

(iii)任选地，至少一种再生加强剂或编码其的序列。

优选，表观遗传调控化学物质和再生加强剂在至少一个转化细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达。

微粒子由无毒、无反应性的材料组成。优选，微粒子包含如金或钨等金属。微粒子的尺寸范围可以为0.4-1.6微米(μm)，优选0.4-1.0μm。基因组修饰材料是DNA、RNA、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)。植物材料是任何组织、器官或细胞的任何或任何部分，例如芽、茎、叶、根、胚、愈伤组织等等。用于与100μg金粒子(大约4.0-5.0x 10⁷ 0.6μm金粒子)进行轰击的TSA量的范围为0.01ng至500ng，优选0.1-50ng。可以使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪或手持式Helios基因枪系统，将TSA和基因组修饰材料递送到靶细胞中。

用组件(i)和组件(ii)进行的涂覆可以包含一个或多个涂覆层。例如，微粒子可以含有第一涂覆层和第二涂覆层，所述第一涂覆层包含基因组修饰组件(i)，并且所述第二涂覆层包含组件(ii)和/或(iii)。替代地，微粒子可以含有包含基因组工程组件(i)以及组件(ii)和(iii)中的至少一种的涂覆层。

可以例如通过接下来的Taqman ddPCR和/或世代测序(NGS)来分析基因组修饰，例如，基因组编辑效率。

根据本发明的另一方面，可以将经遗传修饰的植物细胞再生成全(能育)植物。因此，在本发明的优选方面，植物细胞的遗传修饰之后是再生植物的步骤。因此，本发明提供了一种用于产生经遗传修饰的植物的方法，其包含以下步骤：

a)根据上述用于植物细胞中的遗传修饰的方法对植物细胞进行遗传修饰，以及

b)从步骤a)的经修饰的植物细胞再生植物，

在根据上文描述的任何实施方式的方法的一个实施方式中，至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列被引入，并且选自CRISPR/Cas系统，优选选自CRISPR/MAD7系统、CRISPR/Cfp1系统、CRISPR/MAD2系统、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cas13系统或CRISPR/Csm系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样核酸酶系统或大范围核酸酶系统，或其任何组合、变体或催化活性片段。

在根据上文描述的任何实施方式的方法的另一实施方式中，引入至少一种基因组编辑系统，其中所述至少一种基因组编辑系统进一步包含至少一种逆转录酶和/或至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶，优选其中所述至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶独立地选自载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶，优选大鼠衍生的APOBEC、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、ACF1/ASE脱氨酶、ADAT家族脱氨酶、ADAR2脱氨酶或PmCDA1脱氨酶、TadA衍生的脱氨酶和/或转座子，或编码上述至少一种酶的序列，或其任何组合、变体或催化活性片段。

可以根据本发明的方法采用的多种合适的基因组编辑系统对熟练技术人员而言是可用的，并且可以容易地进行修改以用于本文使用的方法。

在实施方式中，其中位点定向的核酸酶或其变体是一种核酸引导的位点定向核酸酶，至少一种基因组编辑系统额外地包括至少一种引导分子或编码其的序列。“引导分子”或“引导核酸序列”(通常称为并缩写为引导RNA、crRNA、crRNA+tracrRNA、gRNA、sgRNA，这取决于代表原型核酸引导的位点定向核酸酶系统的相应CRISPR系统)，其识别被核酸酶切割下的靶序列。至少一个“引导核酸序列”或“引导分子”包含“支架区域”和“靶区域”。“支架区域”是一种序列，核酸引导的核酸酶与其结合以形成可靶向核酸酶复合物。支架区域可以包含直接重复序列，其被核酸引导的核酸酶识别和加工以提供成熟的crRNA。pegRNA可以包含引导分子内的进一步区域，即所谓的“引物结合位点”。“靶区域”定义了与旨在要被切割的靶位点的互补性。因此，如本文所用，crRNA在本文中可以与术语引导RNA互换地使用，前提是其统一了同时得到确认的CRISPR核酸酶引导RNA功能的效果。某些CRISPR核酸酶(例如Cas9)可以通过以tracrRNA和crRNA的形式提供两个单独的引导核酸序列来使用，这两个引导核酸序列可以分别提供，或通过共价或非共价键/相互作用连接。引导RNA也可以是如下文所进一步公开的Prime Editing系统的pegRNA。至少一种引导分子可以以一个相干分子或编码其的序列的形式提供，或以两个单独的分子(例如，crRNA和tracr RNA)或编码其的序列的形式提供。

在某些实施方式中，基因组编辑系统可以是碱基编辑器(BE)系统。

在又另一实施方式中，基因组编辑系统可以是Prime Editing系统。

本文公开的基因组修饰或基因组编辑系统所包含的或编码其的任何核酸序列或再生加强剂序列可以针对感兴趣的植物靶细胞的密码子使用进行“密码子优化”。这意指序列适应于它在其中表达的生物体中的优选密码子使用，即“感兴趣的靶细胞”可以起源于不同的靶标植物(例如小麦、玉米、向日葵、甜菜)，使得不同的密码子优化可能是优选的，即使蛋白质水平上的经编码的效应子可能是相同的。如果核酸序列在异源系统中表达，则密码子优化显著增加翻译效率。

在根据如本文所公开的方法的某些实施方式中，优选的是实现同源定向修复(HDR)介导的基因组编辑，而不是非同源末端接合(NHEJ)。在根据本文公开的各个方面和方法的某些实施方式中，其中引入至少一种基因组编辑系统，所述至少一种基因组编辑系统包含至少一种修复模板(或供体)，并且所述至少一种修复模板包含或编码双链和/或单链核酸序列。

在根据上文描述的任何实施方式的基因组编辑系统的进一步实施方式中，所述系统因此可以额外地包含至少一种修复模板或编码其的序列。“修复模板”、“修复核酸分子”或“供体(模板)”是指外源性提供的模板，其用于引导细胞修复过程，使得修复结果无错误且可预测。在不存在用于辅助靶向同源重组机制(HDR)的模板序列的情况下，细胞通常尝试通过非同源末端接合(NHEJ)这一易错过程来修复基因组DNA断裂。

在一个实施方式中，所述至少一种修复模板可以包含或编码双链和/或单链序列。

在另一实施方式中，所述至少一种修复模板可以包含对称或不对称同源臂。

在另一实施方式中，所述至少一种修复模板可以包含至少一个经化学修饰的碱基/或骨架(包括经硫代磷酸酯修饰的骨架)、或附着于修复模板的核酸的荧光标记等等。

在一个实施方式中，同时或一个接一个地提供根据上文描述的任何实施方式的基因组修饰或编辑系统，至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列，和/或可选地至少一种引导核酸或编码其的序列，和/或可选地至少一种修复模板或编码其的序列。

在某些实施方式中，瞬时地或稳定地或以其组合的方式引入至少一种基因组编辑系统和可选地至少一种修复模板或编码其的相应序列。鉴于至少一种基因组编辑系统的稳定整合，特别是位点定向的核酸酶或其变体但不一定包括至少一个引导RNA，可以允许所述效应子的稳定表达，因此可以以完全瞬时的方式进行如本文所公开的方法。这意味着，除非使用至少一种修复模板，否则工具本身不会整合到要被修饰的细胞基因组中。这种瞬时方案对于高度可控的基因编辑事件可以是优选的。

本发明的方法可以应用于如下文更详细地描述的单子叶植物或双子叶植物。

单倍体的生成和使用是改良栽培植物的最有力的生物技术手段之一。对育种者而言，单倍体的优势在于，在双单倍体化后的第一代中就可以实现纯合性，从而产生双单倍体植物，而不需要费时费力的回交步骤来获得高度的纯合性。此外，单倍体在植物研究和育种中的价值在于，双倍单倍体的生成细胞是减数分裂的产物，使得所得群体构成了各种重组体的库，并且同时构成了遗传固定个体的库。因此，双单倍体的生成不仅提供了非常有用的遗传变异性以关于作物改良进行选择，而且也是生成定位群体、重组自交系以及即时纯合突变体和转基因株系的宝贵手段。

单倍体植物可以通过种间杂交获得，其中一个亲本基因组在受精后被消除。已示出，受精后的基因组消除可以通过修饰着丝粒蛋白(拟南芥中的着丝粒特异性组蛋白CENH3)来诱导(Ravi and Chan,Haploid plants produced by centromere-mediatedgenome elimination,Nature,Vol.464,2010,615-619)。对于经修饰的单倍体诱导物系，当单倍体诱导物植物与野生型植物杂交时，后代发生单倍体化。有趣地，单倍体诱导系在自交时是稳定的，这表明正在发育的杂交胚中经修饰的着丝粒与野生型着丝粒之间的竞争导致诱导物亲本的着丝粒灭活，并且因此导致单亲染色体消除。

在一个方面，提供了一种产生单倍体或双单倍体植物细胞、组织、器官、植物或种子的方法。

在一个实施方式中，本发明的方法因此包含生成具有单倍体诱导剂活性的至少一个单倍体细胞、组织或器官，优选其中所述单倍体细胞、组织和器官包含愈伤组织、雄配子体或小孢子。在所述实施方式中，如本文所公开的方法可以包含引入编码或作为允许生成单倍体诱导物细胞的序列的核苷酸或氨基酸序列，例如编码包含SANTA结构域的KINETOCHORE NULL2(KNL2)蛋白的序列，其中所述核苷酸序列包含在SANTA域中引起KNL2蛋白氨基酸序列改变的至少一个突变，并且所述改变在用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰，用于获得至少一个植物细胞的修饰的方法中赋予单倍体诱导物(如EP 3 159 413 A1中所公开的)活性。在所述实施方式中，所述至少一种基因组修饰系统不包含基因组编辑系统，而是包含允许生成单倍体诱导物系的序列，所述单倍体引导物系以构成或可诱导的方式被引入到要被稳定或瞬时修饰的植物细胞中。

在另一实施方式中，根据本发明的方法的经修饰的细胞是单倍体细胞，其中所述单倍体细胞通过将基因组编辑系统引入到至少一个要被修饰的细胞中来生成，其中所述基因组编辑系统能够将至少一个突变引入到感兴趣的基因组靶序列中，从而产生具有单倍体诱导物活性的细胞。

在又进一步的方面，提供了一种产生单倍体或双单倍体植物细胞、组织、器官、植物或种子的方法，其中所述方法包括向至少一个要被修饰的细胞提供至少一种再生加强剂或再生加强剂的特异性组合或编码其的序列，其中所述至少一个细胞优选是单倍体细胞，例如，配子体或小孢子。在生殖周期期间产生的这些植物固有的单倍体细胞具有对任何种类的染色体加倍和转化都非常惰性的固有特征。因此，如本文所公开的方法可以有利地用于引入或应用至少一种再生加强剂或编码其的序列，以促进单倍体植物细胞的再生能力，从而提高单倍体细胞在染色体加倍期间进行转换的能力，因为双单倍体材料对于育种和最终培育植物具有特别意义。因此，如本文所公开的方法克服了处理单倍体植物细胞和组织(包括愈伤组织)的困难，因为可以通过提供至少一个加强剂序列或优选的加强剂序列特定性组合来增加诱导和/或自发染色体加倍的频率，如本文所公开的。

用于植物生物技术中加倍染色体的各种方法对研究各种栽培品系的熟练技术人员而言是可用的。在一个实施方式中，可以通过使用秋水仙素(colchicine)处理来实现染色体加倍。用于染色体加倍的其他化学物质可用于根据本文公开的用途，其中这些化学物质可以选自抗微管除草剂，包括甲基胺草磷(amiprophosmethyl，APM)、拿草特(pronamide)、氨磺乐灵(oryzalin)和氟乐灵(trifluralin)，它们都以其染色体加倍活性而闻名。

在一个方面，本发明还涉及再生加强剂或再生加强剂组合，优选如上述任何实施方式中所描述的再生加强剂或再生加强剂组合在用于靶向植物基因组修饰的方法中，优选在根据上文描述的任何实施方式的方法中的用途，以

(a)促进植物细胞增殖和/或协助靶向修饰和/或为至少一个瞬时转化的细胞提供正选择以用于基因组修饰和/或用于再生成至少一种经修饰的植物，和/或

(b)如果植物细胞被稳定转化，则抑制所述细胞分化，并且为至少一个稳定转化的细胞提供负选择以用于再生成一种转基因植物，和/或

(c)为至少一个转化细胞提供根据(a)和(b)的双重选择。

如上文所提及的，再生加强剂增加基因组编辑效率，并且同时促进瞬时转化的细胞的增殖，而抑制稳定转化的细胞的植物细胞分化。这种双重选择有利地允许再生经修饰的植物，其不会将基因组编辑工具传递给后代，而仅仅是携带期望的修饰。

在一个方面，本发明涉及一种能通过或通过根据上文描述的任何实施方式的方法获得的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

在上文描述的植物细胞、组织、器官、植物或种子的一个实施方式中，所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的属的单子叶植物或双子叶植物：大麦属、高粱属、甘蔗属、玉蜀黍属、狗尾草属、稻属、小麦属、黑麦属、黑小麦属、苹果属、短柄草属、山羊草属、胡萝卜属、甜菜属、桉属、烟草属、茄属、咖啡属、葡萄属、Erythrante、螺旋狸藻属、黄瓜属、Marus、拟南芥属、须弥芥属、碎米荠属、独行菜属、荠属、Olmarabidopsis、南芥属、芸苔属、芝麻菜属、萝卜属、柑橘属、麻疯树属、杨属、苜蓿属、鹰咀豆属、木豆属、菜豆属、大豆属、棉花属、紫云英属、百脉根属、蝴蝶草属、葱属、菠菜属或向日葵属，优选，所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的物种：大麦、球茎大麦、高丹草、甘蔗、玉蜀黍属包括玉米、粟、小粒野生稻、水稻、澳洲野生稻、高秆野生稻、普通小麦、硬粒小麦、黑麦、小黑麦、苹果、二穗短柄草、海滨大麦、节节麦、Daucus glochidiatus、甜菜属包括甜菜、小胡萝卜、Daucus muricatus、胡萝卜、巨桉、美花烟草、绒毛状烟草、普通烟草、本氏烟、番茄、马铃薯、中果咖啡、葡萄、虾衣花、Genlisea aurea、黄瓜、川桑、Arabidopsis arenosa、深山南芥、拟南芥、须弥芥、卵叶须弥芥、Cardamine nexuosa、北美独行菜、荠菜花、Olmarabidopsis pumila、Arabis hirsute、甘蓝型油菜、甘蓝、芜菁、萝卜、印度芥菜、黑芥、芝麻菜、甜橙、桐油树、毛果杨、蒺藜苜蓿、Cicer yamashitae、野生鹰嘴豆、鹰嘴豆、Cicerreticulatum、Cicer judaicum、Cajanus cajanifolius、蔓草虫豆、菜豆、大豆、棉花属、紫云英、百脉根、蓝猪耳、洋葱、葱、大蒜、韭菜、向日葵、菊芋和/或菠菜。

在进一步的方面，本发明涉及一种表达构建体组装件，其包含

(i)编码至少一种基因组修饰系统的至少一种载体，所述至少一种基因组修饰系统包含至少一种感兴趣的基因，优选感兴趣的外源基因，和/或所述至少一种基因组修饰系统优选是至少一种基因组编辑系统，所述至少一种基因组编辑系统包含基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选其中所述基因组编辑系统如上文所定义，以及

(ii)编码至少一种再生加强剂的至少一种载体，优选其中所述再生加强剂或多种加强剂如上文描述的任何实施方式中所定义，以及

(iii)任选地，当基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶是核酸引导的核酸酶时：编码至少一种引导分子的至少一种载体，所述至少一种引导分子将所述至少一种核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶引导到至少一个感兴趣的基因组靶位点；以及

(iv)任选地：编码至少一种修复模板的至少一种载体；

其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)在相同的或不同的载体上编码。

在一个实施方式中，所述表达构建体组装件可以进一步包含编码至少一个标记的载体，优选其中以瞬时的方式引入所述标记，参见例如SEQ ID NO：55。

在一个实施方式中，所述表达构建体组装件包含或编码至少一个调控序列，其中所述调控序列选自以下：核心启动子序列、近端启动子序列，顺式调控序列、反调控序列、基因座控制序列、绝缘子序列、沉默子序列、增强子序列、终止子序列、内含子序列和/或其任意组合。

明显地，存在于表达载体组装件的同一载体上的基因组修饰或编辑系统和/或再生加强剂序列和/或引导分子和/或修复模板的不同组件可以包含或编码多于一个的分别控制转录和/或翻译的调控序列。

在上文描述的表达构建体组装件的一个实施方式中，所述构建体包含或编码至少一个调控序列，其中所述调控序列选自以下：核心启动子序列、近端启动子序列，顺式调控序列、反调控序列、基因座控制序列、绝缘子序列、沉默子序列、增强子序列、终止子序列、内含子序列和/或其任意组合。

在上文描述的表达构建体组装件的另一实施方式中，所述调控序列包含或编码选自以下的至少一个启动子：ZmUbi1、BdUbi10、ZmEf1、双35S启动子、水稻U6(OsU6)启动子、水稻肌动蛋白启动子、玉米U6启动子、PcUbi4、Nos启动子、AtUbi10、BdEF1、MeEF1、HSP70、EsEF1、MdHMGR1或其组合。

在上文描述的表达构建体组装件的进一步实施方式中，至少一个内含子选自以下：ZmUbi1内含子、FL内含子、BdUbi10内含子、ZmEf1内含子、AdH1内含子、BdEF1内含子、MeEF1内含子、EsEF1内含子和HSP70内含子。

在根据上文描述的任何实施方式的表达构建体组装件的一个实施方式中，所述构建体包含或编码ZmUbi1启动子和ZmUbi1内含子、ZmUbi1启动子和FL内含子、BdUbi10启动子和BdUbi10内含子、ZmEf1启动子和ZmEf1内含子、双35S启动子和AdH1内含子或双35S启动子和ZmUbi1内含子、BdEF1启动子和BdEF1内含子、MeEF1启动子和MeEF1内含子、HSP70启动子和HSP70内含子的组合，或EsEF1启动器和EsEF1内含子的组合。

另外，所述表达构建体组装件可以包含至少一个终止子，其介导表达构建体或其组件的末端处的转录终止以及转录物从转录复合物中的释放。

在根据上文描述的任何实施方式的表达构建体组装件的一个实施方式中，所述调控序列可以包含或编码选自以下的至少一个终止子：nosT、双35S终止子、ZmEf1终止子、AtSac66终止子、章鱼碱合成酶(ocs)终止子或pAG7终止子或其组合。用于不同植物细胞的表达构建体的多种进一步合适的启动子和/或终止子序列是相关领域的熟练技术人员众所周知的。

本发明的表达载体组装件的示例性元件可以单独组合，可以包含合适的载体骨架，其中多种合适的载体在植物生物技术中可用，表达盒，即编码效应子序列的盒，例如如本文所公开的至少一种再生加强剂，例如根据SEQ ID NO：4至15中的任何一个；表达构建体，即包括表达盒和至少一个进一步载体元件的构建体，例如，如SEQ ID NO：40至51中的任何一个所代表的；包含或编码至少一种位点定向的核酸酶的载体或表达构建体，例如，如SEQ ID NO：52或54中的任何一个所代表的；在使用核酸引导的位点定向核酸酶的情况下，编码引导分子的合适载体，其特定于感兴趣的基因组靶序列，例如根据SEQ ID NO：53的序列，其中相应的引导分子与同源核酸引导的位点定向核酸酶或其变体兼容，其中所包含或编码的引导分子可以容易地被靶向不同的感兴趣的基因组靶位点的另一引导分子替换；编码至少一个感兴趣的修复模板序列的载体；和/或包含或编码至少一个可表达标记基因的载体或表达构建体，优选标记基因，其可以在宏观或微观上容易地检测到，像如由例如SEQID NO：55所编码的荧光标记基因一样。适用于整个光谱，即适用于所有感兴趣的荧光通道，适用于可视化不同区室中的代谢物的植物生物技术的用途的多种合适的荧光标记蛋白和荧光团对熟练技术人员而言是可用的，这可以根据本发明来使用。实例是来自多管水母属(Aequoria Victoria)的GFP、来自日本鳗鲡(Anguilla japonica)的荧光蛋白或其突变体或衍生物)、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、黄绿色荧光蛋白(例如，衍生自来自头索动物文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum)的四聚物荧光蛋白的mNeonGreen)、橙色荧光蛋白、红色或远红色荧光蛋白(例如，tdTomato(tdT)或DsRed)，并且可以使用多种荧光和有色蛋白中的任何一种，这取决于在期望的波长处要被激发和/或可视化的靶标组织或细胞或其区室。

表达载体组装件的所有元件都可以单独组合。进一步地，元件可以以稳定或瞬时的方式表达，其中瞬时引入可以是优选的。在某些实施方式中，单个元件可能不作为尚未表达(转录和/或翻译)的表达载体的一部分来提供，但它们可以同时或随后在活化状态下直接转染，并且可以在一个和相同的要被修饰的感兴趣的细胞内形成表达载体组装件。例如，首先转化编码位点定向的核酸酶的表达载体组装件的一部分可能是合理的，这需要一些时间才能表达构建体，其中然后将同源引导分子在其活化RNA阶段中进行转染和/或在单独和随后的引入步骤中将至少一个修复模板在其活化DNA阶段中进行转染以快速可用。也可以将至少一个再生加强剂序列和/或至少一种基因组修饰或编辑系统和/或至少一个标记同时或随后转化为一个载体的一部分，转化为不同载体的一部分。应避免使用过多的单独引入步骤，并且可以将若干组件组合进表达载体组装件的一个载体中，以减少转化/转染期间的细胞压力。在某些实施方式中，在依赖于所有元件的复杂修饰的情况下，可以优选的是，在若干载体上和在若干引入步骤中单独提供至少一个再生加强剂序列和/或至少一种基因组修饰或编辑系统和/或至少一个标记和/或至少一种引导分子和/或至少一种修复模板的元件，以便所有元件在功能上表达和/或存在于要被以协同方式活化的细胞中。

在一个方面，本发明还涉及一种包含如上文所描述的至少一种再生加强剂或如上文所描述的表达构建体组装件的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

在另一方面，本发明涉及一种用于选择经修饰的植物细胞、植物组织、器官、植物或种子的方法，其中所述方法包括如用于根据上文描述的任何实施方式的基因组修饰的方法中所定义的步骤(a)至(c)，并且进一步包含以下步骤：

(d1)筛选携带靶向修饰的至少一个植物细胞，或

(d2)在携带期望靶向修饰的T0或T1代中筛选从至少一个经修饰的植物细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

用于选择经修饰的植物细胞、植物组织、器官、植物或种子的方法可以没有常规选择步骤。常规选择步骤是指通过使用整合的选择标记，例如抗生素(例如卡那霉素、潮霉素)或除草剂(例如草丁膦、草甘膦)抗性基因，从野生型细胞中选择并纯化转化细胞的任何过程。在没有常规选择的情况下，此种植物或种子可能不具有整合的任何基因组修饰组件，并且因此导致无转基因的经遗传修饰的植物。

再生加强剂对植物细胞分裂和干细胞相同性的积极影响使转化细胞在再生开始阶段选择性地再生，而加强剂对干细胞相同性的加强效应对细胞分化产生负面影响，允许在随后的再生中对具有加强剂的持续活性的细胞(即稳定转化的细胞)进行负选择。

本文描述的再生加强剂和加强剂组合显著地提高了来自单细胞来源的植物的再生能力。具体地，被认为对再生顽拗的植物/植物基因型可以有效地再生。

在进一步的方面，本发明还涉及一种用于从至少一个植物细胞或单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法，其中所述方法包括：

(i)将至少一种再生加强剂或编码其的序列引入到所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞中，其中所述至少一种再生加强剂在所述植物细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达，优选其中所述至少一种再生加强剂如上文描述的任何实施方式中所定义，以及

(ii)从至少一个植物细胞或所述单个植物细胞再生植物组织、器官或植物。

在用于从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法的一个实施方式中，所述至少一种再生加强剂包含至少一种RBP，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQ IDNO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

人工再生加强剂RBP1至RBP8可以以彼此的任意组合的方式或和/或与其他加强剂组合使用，如上文在用于植物基因组修饰的方法的背景下所公开的。优选，RBP1至RBP8或其任意组合与PLT或RKD加强剂中的一种组合。

在根据上文描述的任何实施方式的用于从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法的一个优选实施方式中，所述至少一种再生加强剂进一步包含至少一种PLT或RKD4，其中所述至少一种PLT或RKD4包含选自SEQ ID NO：28、29、30和31的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种PLT或RKD4由以下编码：选自SEQ IDNO：16、17、18和19的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

人工再生加强剂RBP1至RBP8或其组合也可以与选自BBM、WUS、WOX、GRF或LEC中的一种或多种加强剂组合使用。

在根据上文描述的任何实施方式的用于从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法的一个实施方式中，引入进一步的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂或编码其的序列选自BBM、WUS、WOX、GRF、LEC或其变体，或所述进一步的再生加强剂是选自RBP1至RBP8的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂不同于第一再生加强剂。

在根据上文描述的任何实施方式的用于从单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法的一个实施方式中，所述至少一种再生加强剂包含至少一种RBP，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列，并且所述至少一种再生加强剂包含PLT5，其中所述PLT5包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述PLT5由以下编码：SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

如上文已提及的，单倍体的生成对于植物育种家来说是非常期望的，因为在第一代中就可以获得纯合子。然而，通常很难从单倍体细胞，特别是从小孢子再生植物。本文公开的加强剂和加强剂组合显著地提高了单倍体植物的再生能力。

在上文描述的用于再生植物组织、器官或植物的方法的一个实施方式中，所述至少一个植物细胞是未成熟胚细胞或分生组织细胞，特别是合子或体细胞胚或分生组织的细胞，或所述单个植物细胞是二倍体细胞或单倍体细胞，特别是单倍体小孢子。

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例

转化和转基因表达可以通过使用报告基因来监测，如构建体pGEP837中的绿色荧光基因(GEP)(图1)，其编码一种明亮的单体绿色荧光蛋白，所述蛋白的最大激发波长为506nm，并且最大发射波长为517nm。用于本发明的另一报告基因是构建体pGEP359中的红色荧光报告基因tdTomato(图13)，其编码一种异常明亮的红色荧光蛋白，所述蛋白的最大激发波长为554nm，并且最大发射波长为581nm。可以例如通过标记毛细管电泳分析、qPCR或数字PCR等方法来分析基因组编辑效率。通过下一代测序(NGS)、Sanger测序或Sanger测序跟踪分解分析来进一步确认位点特异性修饰。

除非在实施例中另有说明，否则所有重组DNA技术均根据如以下文献中所描述的标准协议进行：Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY，以及Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA的第1卷和第2卷。植物分子工作的标准材料和方法描述在以下文献中：Plant Molecular BiologyLabfax(1993)，R.D.D.Cray著,由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BBlackwellScientific Publications,UK联合出版。标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ThirdEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Brown(1998)Molecular BiologyLabFax,Second Edition,Academic Press(UK)的第I卷和第II卷。聚合酶链式反应的标准材料和方法见于Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，并且见于McPherson atal.(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,First Edition,Springer Verlag,Germany。

实施例1：一系列不同的再生加强剂刺激细胞增殖和再生(图1至11)

基因克隆和构建体生成

使用从玉米A188未成熟胚中分离出的总RNA，通过RT-PCR克隆玉米ZmPLT5基因。KWS_RBP基因(KWS_RBP2-8)根据其蛋白质序列进行玉米密码子优化，并且由IntegratedDNA Technologies(IDT，San Diego，CA，USA)合成。将加强基因片段克隆到BamHI和HindIII克隆位点处的表达载体pABM-BdEF1中，并且在BdEF1启动子(BdFE1)和nos终止子(nos-T)的控制下表达。BdFE1启动子是一种来自短柄草属的强大组成型启动子。测序确认的构建体图示出在图3至图10中。

制备用于轰击的玉米未成熟胚

授粉后9-12天，收获未成熟胚尺寸为0.5至2.5mm，优选0.8-1.5mm的玉米穗。用70％乙醇对穗进行灭菌10-15分钟。在层流罩中短暂风干后，用鲨鱼手术刀去除穗的果仁的约1/3顶部，然后用抹刀小心地将未成熟胚从果仁中取出。将新鲜的分离胚以盾片面朝上的方式放置到渗透培养基平板(N6OSM培养基)中的轰击靶区上。用石蜡膜包裹平板，并且在轰击之前将其在黑暗中在25℃下孵育4-20小时(优选4小时)。

粒子轰击

构建体pGEP837(SEQ ID NO：52)含有CRISPR核酸酶MAD7和绿色荧光报告基因GEP的表达盒(图1)，而pGEP842(SEQ ID NO：53)含有CRISPR crRNA m7GEP1的表达盒，其靶向玉米内源性HMG13基因(图2)。每次轰击，使用亚精胺钙(calcium-spermidine)方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与100ng不同的加强构建体共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。对于10次射击，用移液管将总体积为100微升(μl)的含1mg金粒子的50％(v/v)丙三醇(每次射击100μg金粒子)吸移到透明的低保留微量离心管中。超声15秒以使金粒子悬浮。在以低速涡旋时，按顺序向每100μl金粒子中添加以下物质：

- 至多10μl DNA(预先混合的总DNA为1.0-10.0μg，每次射击100-1000ng)

- 100μl的2.5M CaCl₂(冰上预冷)

- 40μl的0.1M冷亚精胺

关闭盖子，并且在0-10℃下将管涡旋2-30分钟，然后旋转减慢DNA涂覆的金粒子。在500μl的100％乙醇中洗涤两次之后，将颗粒重悬浮在120μl的100％乙醇中。在以低速涡旋时，用具有20μl宽开口尖端的移液管将10μl的共同涂覆的金粒子均匀地从管中吸移到宏载体的中心上，由于粒子此时倾向于形成团块，因此尽可能快地将金粒子移动到宏载体上。风干。使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪进行轰击。轰击条件为：28-30mm/Hg真空、450或650psi破裂片、6mm间隙距离，试样平台位于距离腔室底部60mm处的第二位置，每试样板三次射击(用于玉米未成熟胚)。尽可能将涂覆的金粒子保持在低温(例如0-10℃)下。在制备后3小时内，应将所制备的带有涂覆的金粒子的宏载体轰击到植物细胞中。

胚性愈伤组织诱导

轰击后，继续将胚保持在渗透培养基(N6OSM)上16-20小时。使用荧光显微镜检查瞬时转化，以确定最大激发波长506nm和最大发射波长517nm处的荧光报告基因表达。将胚以盾片面朝上的方式从渗透培养基转移到皮氏培养皿平板(100x25mm)中的胚性愈伤组织诱导培养基(例如N6_5Ag)上，密度为每板12-15个胚。将胚在黑暗中在27℃下孵育以进行胚性愈伤组织诱导，持续7-14天。

胚性愈伤组织诱导后四天，在Zeiss立体显微镜下检查未成熟胚盾片表面的细胞增殖和胚发生。代表性结果示出在图11中。在没有再生加强剂的情况下，来自顽拗型玉米优良品种的未成熟胚不会产生任何再生结构(图11A和I)。与没有加强剂的对照相比，从用不同的再生加强剂共同轰击的胚中诱导出多个胚发生细胞结构(比较图11A至B-H和I至J-L)。加强剂显著地促进玉米优良品种的细胞增殖和胚性愈伤组织诱导(图11)。再生加强剂在细胞增殖和再生方面为转化细胞提供了正选择。

培养基：

N6OSM：

N6盐、N6维生素、1.0mg/L的2,4-D、100mg/L的酪蛋白、0.7g/L的L-脯氨酸、0.2M甘露醇(36.4g/L)、0.2M山梨醇(36.4g/L)、20g/L蔗糖、15g/L的细菌培养用琼脂，pH 5.8。

N6_5Ag：

N6盐、N6维生素、1.0mg/L的2,4-D、100mg/L的酪蛋白、2.9g/L的L-脯氨酸、20g/L蔗糖、5g/L葡萄糖、5mg/L的AgNO3、8g/L的细菌培养用琼脂，pH 5.8。

实施例2：一系列不同的加强剂促进植物细胞的快速遗传转化(图12)

用质粒pGEP842(SEQ ID NO：53)和编码如所指示的特异性加强剂的表达盒的不同构建体来共同轰击构建体pGEP837(SEQ ID NO：52)中绿色荧光报告基因GEP的表达盒。对于未成熟胚分离、轰击和胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

在轰击并在胚性愈伤组织诱导中培养4天之后，使用立体荧光显微镜在最大激发波长506nm和最大发射波长517nm处检查受轰击未成熟胚的盾片表面细胞中的绿色荧光报告基因表达。代表性结果呈现在图12中。

在没有加强剂的情况下，来自玉米顽拗型优良品种WA4-29814和4V-40214的未成熟胚不会产生绿色荧光细胞团(图12A和D)。与没有加强剂的对照相比，在轰击并培养4天之后，从用不同的再生加强剂共同轰击的胚中出现了多个具有强烈且均匀的绿色荧光信号的胚发生结构(图12。B至C和E至G)。绿色荧光报告基因在再生组织(例如胚性愈伤组织)中的强烈且均匀的表达指示了外源基因的整合和稳定转化。

在正常的植物转化系统中，需要经过几轮选择才能鉴定和纯化具有稳定DNA整合的细胞以重新获得同质转基因植物。选择过程通常需要几周时间，例如玉米需要6-8周，这取决于细胞增殖的速度。通常需要多于3个月的时间才能在玉米中获得稳定的转化事件。此处呈现的结果揭示，加强剂显著地促进玉米优良品种的快速稳定转化。

实施例3.加强剂的持续表达对玉米顽拗型优良品种4V-40171的细胞分化和植物再生产生负面影响(图13至14)

对于未成熟胚分离、渗透处理、轰击和胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。具体而言，用再生加强剂ZmPLT5和KWS_RBP4共同轰击含有红色荧光报告基因tDTomato的表达盒的构建体pGEP359(SEQ ID NO：54)(图13)。对于每次轰击，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP359与两种加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。在N6_5Ag培养基中进行胚性愈伤组织诱导12天后，将胚性愈伤组织转移到胚成熟培养基MRM1上(请参见下文)。

通过代表组织的红色上的灰色阴影，可以看到强烈的tDTomato表达(图14)，这允许将tDTomat阳性组织与阴性组织区分开。tDTomate阳性愈伤组织还指示报告基因在再生细胞中的稳定转化。由于共同轰击的性质，加强基因很可能与tDTomato共同存在，并且因此tDTomat的表达可以用作存在受共同轰击的加强剂的报告。

在胚成熟培养基(例如MRM1)上培养10天后，tDTomato阴性胚性愈伤组织发育成成熟胚(图14A)，而tDTomat阳性愈伤组织(红色)通常保持为胚性愈伤组织，但未发育成成熟胚(图14B和C)。这些结果揭示，如果加强剂稳定表达并且具有活性，则加强剂对随后再生过程中转化细胞的进一步发育产生负面影响。

再生加强剂刺激细胞增殖，并且为转化细胞的初始再生提供正选择。然而，加强剂的持续表达会对植物细胞分化和随后的再生产生负面影响，并且因此在植物再生期间为稳定转化的细胞提供负选择。

综合而言，结果表明，再生加强剂为转化细胞提供了“双重选择”，即在再生期间正选择瞬时表达递送，并且负选择稳定的转基因细胞。

培养基

MRM1：

MS盐、MS维生素、100mg/L的肌醇、6％蔗糖、9g/L的细菌培养用琼脂，pH 5.8。

实施例4.再生加强剂增强玉米A188未成熟胚的基因组编辑(表1，图15-17、32和33)

细胞环境(如处于不同周期阶段的细胞)以及细胞基因组的表观遗传状态和染色质结构影响遗传修饰。普遍认为，高度分裂的细胞是遗传修饰(例如稳定转化)的最佳受体。再生加强剂促进细胞分裂和快速稳定转化，如上文所表明的。然而，进一步评估了加强剂是否也增强基因组编辑。

对于未成熟胚分离、轰击和轰击后的胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

具体而言，通过粒子轰击将100ng加强剂KWS_RBP2构建体(图4)与100ng质粒pGEP1054[含有CRISPR核酸酶MAD7和报告基因tDTomato的表达盒(SEQ ID NO：55，图15)]和300ng质粒pGEP842[含有靶向玉米HMG13基因的CRISPR引导RNAm7GEP1表达盒(SEQ ID NO：53，图2)]共同递送到玉米A188未成熟胚中。在轰击16小时后，使用立体荧光显微镜在激发波长554nm和发射波长581nm处检查受轰击胚中的tDTomato表达，并且结果示出在图16中。在如所指示的时间点对受轰击胚进行取样(参见例如图17)。通过Taqman ddPCR分析所取样的胚的SDN-1效率。

SDN-1效率呈现在表1和图17中。考虑到受轰击构建体的基因表达所需的时间，轰击后16小时胚的SDN-1效率很可能表明转化细胞的原始编辑活性而不受细胞增殖的影响。结果表明，加强剂KWS_RBP2本身增强了基因组编辑，而不仅仅是由于促进对细胞分裂的影响。

进一步进行了一项单独的实验，重点关注轰击后48小时加强剂对两个CRISPR靶标处的基因组编辑SDN-1效率的影响。通过粒子轰击将200ng加强剂ZmPLT5(图3)或100ng加强剂KWS_RBP2、或200ng ZmPLT5和100ng KWS_RBP2的组合与100ng质粒pGEP1054和150ng质粒pGEP842、或与100ng pGEP1054和150ng质粒pGEP1067[含有靶向玉米HMG13基因的CRISPR引导RNA m7GEP22表达盒(SEQ ID：56，图33)]共同递送到玉米A188未成熟胚中。轰击后48小时对受轰击胚进行取样。

所取样的胚的基因组编辑SDN-1效率通过Taqman ddPCR来分析，并且示出在图33中。与没有加强剂(无加强剂)的对照相比，观察到两个CRISPR靶位点处的SDN-1效率在230％至680％的范围内增加。当将CRISPR编辑构建体与两种加强剂ZmPLT5和KWS_RBP2的组合共同引入时，注意到最佳的加强效果(图33，PLT5/RBP2)。这些结果进一步支持了加强剂在分子和细胞水平上促进基因组编辑SDN-1的观点。

表1：在如所指示的时间处取样的受轰击玉米A188未成熟胚的SDN-1效率

实施例5.一系列不同的加强剂增强玉米A188的T₀植物的基因组编辑(表2，图18)

对于未成熟胚分离、轰击和轰击后的胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

具体而言，通过粒子轰击将构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和crRNA构建体pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到玉米A188未成熟中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837与150ng质粒pGEP842和两种加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。

轰击后，继续将胚保持在渗透培养基(N6OSM)上16-20小时。将胚以盾片面朝上的方式从渗透培养基转移到皮氏培养皿平板(100x25mm)中的胚性愈伤组织诱导培养基(例如N6_5Ag)上，密度为每板12-15个胚。将胚在黑暗中在27℃下孵育以进行胚性愈伤组织诱导。在N6_5Ag培养基中进行胚性愈伤组织诱导10-14天之后，将诱导的愈伤组织转移到皮氏培养皿(100x25mm)中的胚成熟培养基MRM1上，并且在黑暗中在在27℃下培养10天，然后在25℃弱光照(20-50μmol m^-2s^-1)下培养2-4天。然后将成熟的体细胞胚转移到用于植物外生长的植物托盘(phytotray)中的MSO培养基(参见下文)上，并且进一步发育5-7天。从T₀植物的每片叶子上采集5-10mm的叶端以用于DNA提取。通过TaqMan实时PCR(qPCR)对再生T₀植物的靶向基因组编辑SDN-1进行筛选，并且通过Sanger测序跟踪分解分析来进一步确认。SDN-1结果示出在表2和图18中。

表2：不同的加强剂增强了玉米A188的基因组编辑。

玉米A188是一种高度再生性基因型，并且已被广泛用作植物研究的模型。使用此处呈现的快速再生系统，本发明人能够从玉米A188中以可行的效率(例如，每T0植物0.6％的SDN-1或每最初使用的未成熟胚1.5％的SDN-1)重新获得经基因组编辑的T₀植物，而无需常规的选择和加强剂。然而，当加强剂被共同递送时，SDN-1效率明显地增加(例如，与未使用加强剂的情况相比，平均增加超过15倍)。达到了每再生T0植物平均10％的SDN-1或每未成熟胚平均24％(表2；图18)。这些结果指示，加强剂促进基因组编辑并且为转化细胞的植物再生提供正选择。开发了用于玉米A188的高效基因组编辑的一系列不同加强剂。

培养基：

MS0：MS盐、MS维生素、2g/L的肌醇、2％蔗糖、8g/L的细菌培养用琼脂，pH 5.8

实施例6：使用再生加强剂作为“双重选择”，以用于直接在玉米顽拗型优良品种中进行快速再生和基因组编辑(图19)

对于未成熟胚分离、轰击和轰击后的胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

用于玉米的快速基因组编辑的工作流程

玉米的快速再生和基因组编辑包含以下步骤：

a)制备作为优选未成熟胚(IE)(合子胚或体细胞胚)的一部分的植物细胞。

b)通过粒子轰击将基因组修饰/编辑组件递送到来自a)的作为优选未成熟胚(IE)的一部分的植物细胞中，

c)在允许基因组修饰发生的条件下培养来自b)的植物细胞，以及

d)从步骤C)的经修饰的植物细胞再生植物，所述步骤包含：

i)植物细胞增殖和胚性愈伤组织诱导，其中来自未成熟胚盾片表面的细胞呈倍数增加并且组织成再生愈伤组织。具体而言，粒子轰击后16-48小时，将受轰击未成熟胚转移到皮氏培养皿平板(例如25 100mm)中含有相对高浓度生长素(例如2,4-D)的胚发生愈伤组织诱导培养基(例如N6_5Ag，也请参见实施例1-6)上，并且在黑暗中在15-30℃下培养1-4周，优选1-3周，最优选7-14天(注意：在所述步骤期间，加强剂为瞬时转化的细胞提供正选择)。

ii)来自i)中的细胞的植物器官/胚发育：将来自i)中的正在发育的胚性愈伤组织分离成直径为1-10mm、优选2-7mm的小片，并且根据不同的基因型将愈伤组织转移到皮氏培养皿(例如25x100mm)中的植物器官/胚发育培养基上。胚发育培养基含有不含植物激素的高浓度蔗糖(例如6％的蔗糖)(例如MRM1培养基)，而植物器官发育培养基则含有较高比例的细胞分裂素(例如6-苄基氨基嘌呤、玉米素)和植物生长素(例如NAA或IAA)，例如生芽培养基(参见下文)。用石蜡膜/医用胶带密封平板，并且在15-30℃、光照(50-200μmol m^-2s^-1)下培养1-4周，优选1-3周，最优选10-18天[注意：在所述步骤期间，加强剂为稳定转化的细胞提供负选择；仅在再生步骤(a)中具有加强剂活性的细胞的“双重选择”在步骤(b)中减少]。还请参见实施例6。

iii)从ii)中再生的器官和胚的植物发育：将来自ii)中的正在发育的小植株转移到植物托盘中的植物发育培养基(例如MSO或生根培养基，参见下文)上，并且在15-30℃、光照(50-200μmol m^-2s^-1)下培养1-4周，优选5-20天。现在，再生的T0植物已准备好进行叶片取样以用于分子分析，或转移到土壤中以进行T₁种子生产。

e)筛选再生T₀植物的遗传修饰事件

从T₀植物的每片叶子上采集5-20mm的叶端以用于DNA提取。通过TaqMan实时PCR(qPCR)、标记毛细管电泳分析和TaqMan Digital Droplet PCR来筛选再生T₀植物的基因组修饰，例如基因组编辑。通过下一代测序(NGS)、Sanger测序或Sanger测序跟踪分解分析来进一步确认位点特异性修饰。

f)生长经修饰的T₀植物以进行T₁种子生产。

在分子筛选和确认之后，将经修饰的T₀植物转移到土壤中，并且在合适的生长条件下在生长室或温室中生长。对T₀植物进行表型分析，并且使其生长以通过自交或回交至玉米WT来进行T₁种子生产。

g)对T1后代中的遗传修饰进行分子分析

受轰击未成熟胚细胞的基因组中的基因组修饰(例如靶标基因组编辑)很可能是可遗传的。通过对T₁后代中的修饰进行分离分析来确定基因组编辑事件的可遗传性。授粉后10-20天，通过直接将胚从生长穗的果仁中整体取出(从穗尖开始)来从T₀植物的生长穗中分离出未成熟T₁胚(注意：此时不要收获穗，并且将具有剩余果仁的穗留在T₀植物中以进行T₁种子生产)。单独分离每个T₁未成熟胚的DNA，并且通过TaqMan qPCR、标记毛细管电泳分析和TaqMan Digital Droplet PCR来分析T₁后代中的修饰。通过Sanger测序进一步确认位点特异性修饰。也可以使用成熟的T1胚或T1幼苗的叶组织来对T₁后代中的修饰进行分离分析。

工作流程也展示在图19中。使用再生加强剂作为“双重选择”，建立快速植物再生和基因组编辑系统。对于玉米，从未成熟胚到T0植物大约需要4-6周，或从未成熟胚到T1种子需要4-5个月。

培养基

生芽培养基：

1x MS盐、1x LS维生素，1x FeEDTA、2.5mg/L CuSO4.5H2O、100mg/L肌醇六磷酸、5mg/L玉米素、0.5g/L MES、20g/L蔗糖、3g/L Gelzan，pH：5.8

生根培养基：

1x MS盐、LS维生素、1x FeEDTA、0.5mg/L MES、0.5mg/L IBA、1.25mg/L CuSO4、20g/L蔗糖、3g/L Gelzan

实施例7：一系列不同的加强剂促进顽拗型优良品种4V-40171的胚性愈伤组织诱导和再生(5F1690，图20和21)

对于未成熟胚分离、渗透处理、轰击和胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到玉米优良品种4V-40171的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

轰击后4天和7天，在Zeiss立体显微镜下观察到胚性愈伤组织诱导。代表性结果示出在图20中。

玉米优良品种4V-40171是一种顽拗型基因型。在没有再生加强剂的情况下，当在轰击后4天和7天进行检查时，来自所述优良品种的未成熟胚都没有产生任何再生结构(图20A和H)。与没有加强剂的对照相比，在轰击后4天和7天，从用不同的再生加强剂共同轰击的胚中都诱导出多个胚发生细胞结构(比较图20A至B-G和图20H至K中的结果)。

轰击后12天，记录愈伤组织诱导率，其被定义为100个最初使用的胚中具有至少一个胚性愈伤组织的胚的数量。愈伤组织诱导率呈现在图21A中，并且植物再生率(100个最初使用的胚中再生T0事件的数量)呈现在图21B中。在没有加强剂的情况下，这种优良品种通常是一种顽拗型基因型，当将加强剂应用(图21B)在本发明人的再生系统中时，这种优良品种具有再生性。这些结果表明，加强剂显著地促进玉米优良品种的细胞增殖和植物再生。

实施例8：一系列不同的加强剂促进玉米顽拗型优良品种4V-40171的快速转化(图22)

对于未成熟胚分离、渗透处理、轰击和胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP359(SEQ ID NO：54，图13)和pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到玉米优良品种4V-40171的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP359和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

在轰击并在胚性愈伤组织诱导中培养8天之后，使用立体荧光显微镜在激发波长554nm和发射波长581nm处检查受轰击未成熟胚的盾片表面细胞中的tDTomato基因表达。代表性结果呈现在图22中。

在没有加强剂的情况下，来自玉米顽拗型优良品种4V-40171的未成熟胚不会产生红色荧光细胞团(图22A)。与没有加强剂的对照相比，在轰击并培养8天之后，从用不同的再生加强剂共同轰击的胚中出现了多个具有强烈且均匀的荧光信号的胚发生结构(图22B至G)。tDTomato在再生组织(例如胚性愈伤组织)中的强烈且均匀的表达指示了这种外源基因的整合和稳定转化。轰击后8天，记录tDTomato报告基因在受共同轰击的未成熟胚中的稳定转化频率(被定义为100个最初使用的胚中具有至少一个tDTomata阳性结构的胚的数量)，并且示出在图22H中。作为一种顽拗型基因型，来自玉米优良品种4V-40171的未成熟胚通常对转化不响应，但当加强剂被应用时，所述未成熟胚会迅速响应并且是高度可转化的。结果表明，加强剂显著地促进玉米优良品种的快速稳定转化，并且在细胞增殖和再生方面为转化细胞提供正选择。

实施例9：一系列不同的加强剂促进玉米顽拗型优良品种4V-40171的T₀植物的基因组编辑(表3；图23)。

工作流程描述在实施例6中。对于未成熟胚分离、轰击和轰击后的胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到玉米优良品种4V-40171的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

对于胚性愈伤组织诱导和植物再生以及基因组编辑SDN-1筛选和确认，请参见实施例5。

来自玉米顽拗型优良品种4V-40171的未成熟胚通常对再生不响应，但当加强剂被共同递送时，所述未成熟胚变得具有再生性。达到了每再生T0植物平均约20％的SDN-1或每未成熟胚平均10％(表3；图23)。结果表明，加强剂显著地促进玉米优良品种的细胞再生和基因组编辑，并且为转化细胞的再生提供正选择。

表3：不同的加强剂促进顽拗型玉米优良品种4V-40171的高效基因组编辑

实施例10：一系列不同的加强剂促进顽拗型优良品种2V-20195的胚性愈伤组织诱导和再生(图24和25)

对于未成熟胚分离、渗透处理、轰击和胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1和实施例7中的描述。

具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到玉米优良品种2V-20195的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

轰击后8天，在Zeiss立体显微镜下观察到胚性愈伤组织诱导。代表性结果示出在图24中。在没有再生加强剂的情况下，在轰击后8天，来自玉米顽拗型优良品种2V-20195的大多数未成熟胚不会产生再生结构(图24A)。与没有加强剂的对照相比，在轰击后8天，从用不同的再生加强剂共同轰击的胚中诱导出多个胚发生细胞结构(比较图24A至B-F中的结果)。

轰击后14天，记录愈伤组织诱导率，其被定义为100个最初使用的胚中具有至少一个胚性愈伤组织的胚的数量。愈伤组织诱导率呈现在图25A中，并且植物再生率(被定义为100个最初使用的胚中再生T0事件的数量)呈现在图25B中。在没有加强剂的情况下，这种优良品种在愈伤组织诱导和植物再生二者中的再生率都较低，并且当加强剂在本发明人的再生系统中被共同递送时，这两种再生率都显著地增加(图25)。这些结果表明，加强剂显著地促进玉米优良品种的细胞增殖和植物再生。

实施例11：一系列不同的加强剂促进玉米顽拗型优良品种2V-20195的快速且高效的遗传转化(图26)

对于未成熟胚分离、渗透处理、轰击和胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1、实施例7和实施例10中的描述。

具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到玉米优良品种2V-20195的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

在轰击并在胚性愈伤组织诱导中培养4天之后，使用立体荧光显微镜在最大激发波长506nm和最大发射波长517nm处检查受轰击未成熟胚的盾片表面细胞中的绿色荧光报告基因表达。代表性结果呈现在图26中。

在没有加强剂的情况下，来自玉米顽拗型优良品种2V-20195的未成熟胚不会产生绿色荧光细胞团(图26A)。与没有加强剂的对照相比，在轰击并培养8天之后，从用不同的再生加强剂共同轰击的胚中出现了多个具有强烈且均匀的绿色荧光信号的胚发生结构(图26B至F)。绿色荧光报告基因在再生组织(例如胚性愈伤组织)中的强烈且均匀的表达指示了这种外源基因的整合和稳定转化。轰击后14天，记录绿色荧光报告基因在受共同轰击的未成熟胚中的稳定转化频率(被定义为100个最初使用的胚中具有至少一个绿色荧光报告基因阳性结构的胚的数量)，并且示出在图26G中。来自玉米优良品种2V-20195的未成熟胚通常对转化不响应，但当加强剂被应用时，所述未成熟胚会迅速响应并且是高度可转化的。结果表明，加强剂显著地促进玉米优良品种的快速稳定转化，并且在细胞增殖和再生方面为转化细胞提供正选择。

实施例12：一系列不同的加强剂促进玉米顽拗型优良品种2V-20195的T₀植物的快速基因组编辑(表4；图27)

工作流程描述在实施例6中。对于未成熟胚分离、渗透处理和轰击，请参见实施例1中的描述。具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到玉米优良品种2V-20195的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

对于再生T0植物的植物再生以及基因组编辑SDN-1筛选和确认，请参见实施例5和实施例9。

在没有加强剂的对照实验中，优良品种2V-20195未成熟胚的植物再生率较低。从50个最初受轰击的未成熟胚中再生出仅七个T0植物。在从7个再生植物中鉴定出的靶位点处没有任何编辑(表4)。当加强剂被共同递送时，优良品种2V-20195未成熟胚变得更具再生性，并且对基因组编辑更具响应性。达到了每再生T0植物平均14.5％的SDN-1或每未成熟胚平均6％的SDN-1(表4；图27)。结果揭示，加强剂促进玉米优良品种的细胞再生和基因组编辑，并且为转化细胞的再生提供正选择。

表4：不同的加强剂促进玉米顽拗型优良品种2V-20195的T0植物的基因组编辑

实施例13：一系列不同的加强剂促进玉米顽拗型优良品种4V-40290的T₀植物的快速基因组编辑(表5；图28)

工作流程描述在实施例6中。对于未成熟胚分离、渗透处理和轰击，请参见实施例1中的描述。具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和pGEP842(SEQ ID NO：53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到优良品种4V-40290的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

对于再生T0植物的植物再生以及基因组编辑SDN-1筛选和确认，请参见实施例5和实施例9。

在没有加强剂的对照实验中，优良品种4V-402 90未成熟胚的植物再生率较低。从44个最初受轰击的未成熟胚中再生出仅五个T0植物。在从5个再生植物中鉴定出的靶位点处没有任何编辑(表5)。当加强剂被共同递送时，优良品种4V-40290未成熟胚变得更具再生性，并且对基因组编辑更具响应性。每再生T0植物和每未成熟胚的SDN-1都达到了平均14％(表5；图28)。结果揭示，加强剂促进玉米优良品种的细胞再生和基因组编辑，并且为转化细胞的再生提供正选择。

表5：不同的加强剂促进玉米顽拗型优良品种4V-40290的T₀植物的快速基因组编辑

实施例14：一系列不同的KWS RBP使得能够直接在玉米顽拗型优良品种中进行高效的基因组编辑(表6；图29)

为了检查使用再生加强剂作为玉米快速再生和基因组编辑的“双重选择”的稳健性和基因型非依赖性，对13种额外的玉米顽拗型优良品种进行测试。

工作流程描述在实施例6中。对于未成熟胚分离、渗透处理和轰击，请参见实施例1中的描述。具体而言，通过粒子轰击将基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52，图1)和pGEP842(SEQ ID NO_53，图2)与如所指示的不同加强剂共同轰击到优良品种4V-40290的未成熟胚中。对于每次轰击(射击)，使用亚精胺钙方法将100ng质粒pGEP837和150ng质粒pGEP842与不同加强构建体中的每一种(各100ng)共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上。每个样品板进行三次轰击(射击)。轰击后16-20小时，将受轰击胚转化到胚性愈伤组织诱导培养基上。

对于再生T0植物的植物再生以及基因组编辑SDN-1筛选和确认，请参见实施例5和实施例9。

具有用于13种玉米顽拗型优良品种的一系列不同加强剂的每再生植物的平均基因组编辑SDN-1效率列出在表6中，并且还展示在图29中。结果进一步显示，加强剂促进玉米优良品种的细胞再生和基因组编辑，并且为转化细胞的再生提供正选择。开发了用于玉米顽拗型优良品种的高效基因组编辑的一系列不同加强剂。

表6：不同的加强剂使得能够直接在玉米顽拗型优良品种中进行高效的基因组编辑。

实施例15：一系列不同的KWS RBP使得能够直接在玉米顽拗型优良品种中使用单细胞来源进行高效的基因组编辑(表7)。

在再生嵌合体期间，如果没有用于分离和纯化经遗传修饰的细胞的常规选择，则再生T0植物可能会出现问题。为了解决这一问题，通过基因组编辑的Sanger测序跟踪分解分析来对经编辑的T0事件进行分析。由基因组编辑构建体pGEP837(SEQ ID NO：52)和pGEP842(SEQ ID NO：53)与不同加强剂的共同轰击生成经编辑的T0事件。对于生成T0编辑植物的工作流程和方法，请参见上文实施例中的描述。结果揭示，大多数经编辑的T₀植物都含有一个或两个编辑，这表明T₀植物中存在单等位基因或双等位基因SDN-1事件，并且T₀植物很可能是从单个经编辑的细胞再生出来的(代表性结果示出在表7中)。

表7：玉米基因组编辑SDN-1T0事件的sanger测序跟踪分解分析的代表性结果

实施例16：经编辑的T₀植物正常，能育并且无转基因(图30)

将经编辑的T₀植物转移到土壤中并在温室中生长，以进行基因分型、表型分型和T1种子生产。通过qPCR和WGS来分析外源DNA整合。T₀植物一般正常并且能育(图30)。通过对总计642个再生T₀植物进行分析，仅六个T₀植物示出了外源DNA整合，而通过对衍生自35种独立编辑系的1471个T₁后代进行分析，未检测到外源DNA整合，并且多达99％的经编辑的T0植物不含转基因。

实施例17：编辑可从T0完全遗传给T1后代(图31；表8)

T1种子通过自交来产生，这需要来自T0植物的有活力的雄性和雌性配子。T1种子在温室内萌发和生长都正常(图31)。通过Taqman qPCR分析T1后代的编辑分离。观察到T1后代编辑事件的实际分离与单等位基因或双等位基因事件的预期孟德尔分离定律完全匹配(表8)。这些结果表明，编辑可从T0完全传递/遗传给T1后代，并且也进一步支持了T0植物衍生自单个经编辑的细胞的观点。

表8：玉米优良品种T1后代的基因组编辑SDN-1分离分析的代表性结果

实施例18：曲古抑菌素A(TSA)与基因组编辑构建体的共同递送

通过微粒轰击进行的共同递送增加了玉米A188未成熟胚的基因组编辑SDN-1效率(图34)。

程序：

对于未成熟胚分离、轰击和轰击后的胚性愈伤组织诱导，请参见实施例1中的描述。

用于与100μg金粒子(大约4.0-5.0x10⁷个尺寸为0.6微米的金粒子)进行轰击的TSA的量为15ng。具体而言，将质粒DNA和TSA共同涂覆到金粒子上以进行如下轰击。对于10次射击，用移液管将100微升(μl)含10mg/ml 0.6μm金粒子的50％(v/v)丙三醇粒子储备溶液(10次射击总计1.0mg金粒子，并且每次射击为100μg)吸移到透明的低保留微量离心管中。超声15秒以使金粒子悬浮。在以低速涡旋时，按顺序添加以下物质：

- 1.0μg的pGEP1054(图15)、1.5μg的pGEP842(图2)或pGEP1067(图32)

- 100μl的2.5M CaCl₂(冰上预冷)

- 40μl的0.1M冷亚精胺

关闭盖子，并且在室温下将管涡旋5分钟，并且旋转减慢DNA涂覆的金粒子。在1000μl的100％乙醇(在-20℃下预冷)中洗涤两次之后，将颗粒重悬浮在120μl的100％乙醇中。最后，小心地将150ng TSA添加到重悬浮的金粒子溶液中。在以低速涡旋时，用具有20μl宽开口尖端的移液管将10μl TSA共同涂覆的金粒子均匀地从管中吸移到宏载体的中心上。由于粒子此时倾向于形成团块，因此尽可能快地将金粒子移动到宏载体上。在透明层流罩中短暂风干。

使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪进行轰击。轰击条件为：28-30mm/Hg真空、450psi破裂片、6mm间隙距离，试样平台位于距离腔室底部60mm处的第二位置，并且每个试样板进行三次射击。轰击后，继续将胚保持在渗透板上16小时，然后取出并移动到胚性愈伤组织诱导培养基平板(N6_5Ag)上。轰击后48小时，对受轰击胚进行取样以通过TaqmanddPCR进行DNA提取和基因组编辑SDN-1分析。

通过微粒轰击将15ng TSA和基因组编辑组件共同递送到玉米未成熟胚中，显著地提高了6个重复序列的两个CRISPR靶位点处的基因组编辑SDN-1效率。与没有TSA(CK)的对照相比，在靶标m7GEP1和m7GEP22处分别检测到SDN-1效率增加61.5％(图34A)和354.5％(图34B)。这些结果清楚地表明，表观遗传调控化学物质，特别是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)曲古抑菌素A(TSA)增强了基因组编辑SDN-1的效率，这可能是通过其在放松染色质和增加靶标可接近性方面的作用而实现的。

Claims (26)

1.一种用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰，以获得至少一个经修饰的细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)提供至少一个植物细胞或单个植物细胞；

(b)将以下引入到所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞中：

(i)至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，其包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶、或编码其的序列，以及任选存在的至少一种引导分子或编码其的序列；

(ii)至少一种再生加强剂或编码其的序列和/或至少一种表观遗传调控化学物质，其中所述至少一种再生加强剂在所述植物细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达；

(iii)以及，任选存在的至少一种修复模板或编码其的序列；以及

(c)在允许表达和/或组装和/或激活所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及任选存在的所述至少一种再生加强剂，以及任选存在的所述至少一种引导分子和/或任选存在的所述至少一种修复模板的条件下，培养所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞；以及

(d)获得至少一个经修饰的植物细胞；和/或

(e)获得从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子；以及

(f)任选地：在携带期望的靶向修饰的T0和/或T1代中筛选从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

2.权利要求1的方法，其中步骤(i)和(ii)同时或接连发生，以促进植物细胞增殖和/或协助至少一个基因组靶序列的靶向修饰。

3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(ii)中引入至少一种再生加强剂并且

(a)所述再生加强剂促进植物细胞增殖和/或协助靶向修饰和/或为用于基因组修饰和/或用于再生成至少一种经修饰的植物的至少一个瞬时转化的细胞提供正选择，和/或

(b)如果细胞被稳定转化，则所述再生加强剂抑制植物细胞分化并为用于再生成一种转基因植物的至少一个稳定转化的细胞提供负选择，和/或

(c)所述再生加强剂为至少一个经转化的细胞提供根据(a)和(b)的双重选择。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述至少一个植物细胞是未成熟胚细胞或分生组织细胞，特别是合子或体细胞胚或分生组织的细胞，或其中所述单个植物细胞是二倍体细胞或单倍体细胞，优选单倍体小孢子。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述至少一种再生加强剂包含至少一种RBP，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

6.权利要求5的方法，其中所述至少一种再生加强剂进一步包含至少一种PLT或RKD4，其中所述至少一种PLT或RKD4包含选自SEQ ID NO：28、29、30和31的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种PLT或RKD4由以下编码：选自SEQ IDNO：16、17、18和19的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

7.权利要求5的方法，其中引入至少一种进一步的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂或编码其的序列选自BBM、WUS、WOX、GRF、LEC或其变体，或其中所述进一步的再生加强剂是如权利要求4中所定义的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂不同于第一再生加强剂。

8.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述至少一种再生加强剂包含至少一种RBP，其中所述至少一种RBP包含选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38和39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种RBP由以下编码：选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26和27的序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列，并且其中所述至少一种再生加强剂包含PLT5，其中所述PLT5包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述PLT5由以下编码：SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或同源密码子优化序列。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中在步骤ii)中引入至少一种表观遗传调控化学物质，并且其中所述至少一种表观遗传调控化学物质是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)，特别是曲古抑菌素A(TSA)或TSA样化学物质。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中通过由基因枪轰击介导的转化或转染、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、微粒或纳米颗粒递送，或通过化学转染，或它们的组合，将所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及所述至少一种再生加强剂或编码其的序列和/或所述至少一种表观遗传调控化学物质引入到细胞中，优选其中通过基因枪轰击引入所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及所述至少一种再生加强剂和/或所述至少一种表观遗传调控化学物质，优选其中所述基因枪轰击包含在轰击之前和/或之后的渗透处理步骤。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列被引入，并且选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样核酸酶系统、或大范围核酸酶系统，或其任何组合、变体或催化活性片段，所述CRISPR/Cas系统优选CRISPR/MAD7系统、CRISPR/Cfp1系统、CRISPR/MAD2系统、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cas13系统、或CRISPR/Csm系统。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中引入至少一种基因组编辑系统，其中所述至少一种基因组编辑系统进一步包含至少一种逆转录酶和/或至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶，优选其中所述至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶独立地选自载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶，优选大鼠来源的APOBEC、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、ACF1/ASE脱氨酶、ADAT家族脱氨酶、ADAR2脱氨酶、或PmCDA1脱氨酶、TadA来源的脱氨酶和/或转座子，或编码上述至少一种酶的序列，或其任何组合、变体、或催化活性片段。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中引入至少一种基因组编辑系统，其中所述至少一种基因组编辑系统包含至少一种修复模板，并且其中所述至少一种修复模板包含或编码双链和/或单链核酸序列。

14.权利要求13的方法，其中所述至少一种修复模板包含对称或不对称同源臂和/或其中所述至少一种修复模板包含至少一种经化学修饰的碱基和/或骨架。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中引入至少一种基因组编辑系统，其中瞬时地或稳定地或以其组合的方式引入所述至少一种基因组编辑系统和任选存在的所述至少一种修复模板或编码其的相应序列。

16.再生加强剂或再生加强剂组合，优选如权利要求5至8中任一项所定义的再生加强剂或再生加强剂组合在靶向植物基因组修饰的方法中，优选在根据前述权利要求中任一项的方法中的用途，以

(a)促进植物细胞增殖和/或协助靶向修饰和/或为用于基因组修饰和/或用于再生成至少一种经修饰的植物的至少一个瞬时转化的细胞提供正选择，和/或

(b)如果植物细胞被稳定转化，则抑制植物细胞分化，并且为用于再生成一种转基因植物的至少一个稳定转化的细胞提供负选择，和/或

(c)为至少一个转化的细胞提供根据(a)和(b)的双重选择。

17.一种通过根据权利要求1至15中任一项的方法可获得或通过根据权利要求1至15中任一项的方法获得的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

18.根据权利要求17的植物细胞、组织、器官、植物或种子，其中所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于单子叶植物或双子叶植物。

19.根据权利要求18的植物细胞、组织、器官、植物或种子，其中所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的属：大麦属(Hordeum)、高粱属(Sorghum)、甘蔗属(Saccharum)、玉蜀黍属(Zea)、狗尾草属(Setaria)、稻属(Oryza)、小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)、黑小麦属(Triticale)、苹果属(Malus)、短柄草属(Brachypodium)、山羊草属(Aegilops)、胡萝卜属(Daucus)、甜菜属(Beta)、桉属(Eucalyptus)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、咖啡属(Coffea)、葡萄属(Vitis)、Erythrante、螺旋狸藻属(Genlisea)、黄瓜属(Cucumis)、Marus、拟南芥属(Arabidopsis)、须弥芥属(Crucihimalaya)、碎米荠属(Cardamine)、独行菜属(Lepidium)、荠属(Capsella)、Olmarabidopsis、南芥属(Arabis)、芸苔属(Brassica)、芝麻菜属(Eruca)、萝卜属(Raphanus)、柑橘属(Citrus)、麻疯树属(Jatropha)、杨属(Populus)、苜蓿属(Medicago)、鹰咀豆属(Cicer)、木豆属(Cajanus)、菜豆属(Phaseolus)、大豆属(Glycine)、棉花属(Gossypium)、紫云英属(Astragalus)、百脉根属(Lotus)、蝴蝶草属(Torenia)、葱属(Allium)、菠菜属(Spinacia)或向日葵属(Helianthus)，优选所述植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的物种：大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、高丹草(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉蜀黍属(Zea spp.)，包括玉米(Zea mays)、粟(Setariaitalica)、小粒野生稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryzaaustraliensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、小黑麦(Triticale)、苹果(Malusdomestica)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Beta spp.)，包括甜菜(Betavulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffeacanephora)、葡萄(Vitis vinifera)、虾衣花(Erythrante guttata)、Genlisea aurea、黄瓜(Cucumis sativus)、川桑(Marus notabilis)、Arabidopsis arenosa、深山南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、须弥芥(Crucihimalayahimalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、Cardamine nexuosa、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜花(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、Arabis hirsute、甘蓝型油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、印度芥菜(Brassica juncacea)、黑芥(Brassica nigra)、芝麻菜(Eruca vesicaria subsp.sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、桐油树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、Cicer yamashitae、野生鹰嘴豆(Cicer bijugum)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、Cicer reticulatum、Cicer judaicum、Cajanus cajanifolius、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉花属(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、大蒜(Alliumsativum)、韭菜(Allium tuberosum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthustuberosus)和/或菠菜(Spinacia oleracea)。

20.一种表达构建体集合，包含

(i)编码至少一种基因组修饰系统的至少一种载体，所述至少一种基因组修饰系统包含至少一种感兴趣的基因，优选感兴趣的外源基因，和/或所述至少一种基因组修饰系统优选是至少一种基因组编辑系统，所述至少一种基因组编辑系统包含基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选其中所述基因组编辑系统如权利要求11或12中所定义，以及

(ii)编码至少一种再生加强剂的至少一种载体，优选其中所述再生加强剂如权利要求5至8中任一项所定义，以及

(iii)当所述基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶是核酸引导的核酸酶时，任选存在的编码至少一种引导分子的至少一种载体，所述至少一种引导分子将所述至少一种核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶引导到至少一个感兴趣的基因组靶位点；以及

(iv)任选存在的编码至少一种修复模板的至少一种载体；

其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)在相同的或不同的载体上编码。

21.权利要求20的表达构建体集合，其中所述集合进一步包含编码至少一种标记的载体。

22.一种包含如权利要求5至8中任一项中所定义的至少一种再生加强剂或权利要求20或21的表达构建体集合的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

23.一种用于选择经修饰的植物细胞、植物组织、器官、植物或种子的方法，其中所述方法包括如权利要求1中所定义的步骤(a)至(c)，并且进一步包含以下步骤：

(d1)筛选携带靶向修饰的至少一个植物细胞，或

(d2)在携带期望的靶向修饰的T0或T1代中筛选从至少一个经修饰的植物细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

24.一种用于从至少一个植物细胞或单个植物细胞再生植物组织、器官或植物的方法，其中所述方法包括：

(i)将至少一种再生加强剂或编码其的序列引入到所述至少一个植物细胞或所述单个植物细胞中，其中所述至少一种再生加强剂在所述植物细胞中瞬时存在、瞬时活化或瞬时表达，优选其中所述至少一种再生加强剂如权利要求5至8中任一项中所定义，以及

(ii)从至少一个植物细胞或所述单个植物细胞再生植物组织、器官或植物。

25.权利要求24的方法，其中所述至少一个植物细胞是未成熟胚细胞或分生组织细胞，特别是合子或体细胞胚或分生组织的细胞，其中所述单个植物细胞是二倍体细胞或单倍体细胞。

26.权利要求25的方法，其中所述单个植物细胞是单倍体小孢子。

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