CN114807161B

CN114807161B - 水稻多元醇转运基因OsPLT5及其多元醇转运体、应用和扩增引物

Info

Publication number: CN114807161B
Application number: CN202210237986.9A
Authority: CN
Inventors: 张振华; 李明娟; 刘冬; 罗劲松
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114807161A

Abstract

本发明公开了水稻多元醇转运基因OsPLT5，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，该基因在水稻中过量表达可显著增加水稻分蘖数和穗粒数，敲除突变后可显著降低水稻的结实率和产量。该基因OsPLT5的多元醇转运体，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明还公开了该水稻多元醇转运基因OsPLT5和其多元醇转运体在培育高产量水稻中的应用和PCR扩增引物，能够快速、有效提高水稻的产量。

Description

水稻多元醇转运基因OsPLT5及其多元醇转运体、应用和扩增引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具有涉及水稻多元醇转运基因OsPLT5及其多元醇转运体、应用和扩增引物。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，我国约65％、全球约50％人口以稻米为主食。我国是水稻生产和消费大国，因此水稻生产对我国粮食安全及社会经济稳定具有重大影响。

高产稳产一直是作物育种工作的首要目标。上个世纪，矮杆基因和杂种优势的利用有效提高收获指数，使水稻产量大幅增加。随后，增加穗粒数即扩大库容成为突破产量上限的育种新策略，一系列株型高大、穗大、产量潜力大的品种相继被培育出。然而，这些品种在生产中往往由于灌浆不充分导致产量潜力无法充分发挥。

按照同化物的分配规律，植物器官可分为源和库。源是指产生或输出同化物的器官；库是指利用或贮藏同化物的器官。水稻抽穗前，叶是源，叶鞘和茎既是源也是库，光合作用同化的碳主要以非结构性碳水化合物的形式贮存在茎鞘中。抽穗后，叶、叶鞘和茎均为源，穗是主要的库。成熟功能叶产生的光合产物被直接运输至籽粒，而茎鞘中前期贮存的非结构性碳水化合物会重新形成蔗糖，进一步转运至籽粒。灌浆期上部功能叶的光合产物及茎鞘储存的非结构性碳水化合物向穗部的有效运输分配是决定水稻产量的关键。由此可知，目前“源”和“库”已不是水稻高产的主要限制因子，源到库的运输不畅才是水稻生产上籽粒灌浆不足以及空秕率高的主要原因。

碳水化合物的源库转运效率主要受源端非结构性碳水化合物再活化和韧皮部装载效率、库端活力和韧皮部卸载效率、还有维管束筛管结构等因素影响。挖掘出调控碳水化合物源库分配的因子将为未来通过品种改良、增强碳水化合物由源向库的高效运输分配提供基因资源和理论基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种水稻多元醇转运基因OsPLT5及其多元醇转运体、应用和扩增引物。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种水稻多元醇转运基因OsPLT5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的水稻多元醇转运基因OsPLT5编码得到的多元醇转运体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的水稻多元醇转运基因OsPLT5或所述的多元醇转运体在培育高产水稻中的应用。

上述的应用，优选的，其应用的方法包括如下步骤：通过PCR法扩增所述水稻多元醇转运基因OsPLT5的CDS序列，然后通过同源重组的方法克隆至表达载体中，得到含有基因OsPLT5的目标载体，再将所述目标载体通过热击转化法转入农杆菌中，最终通过遗传转化克隆至水稻中进行表达，得到含有所述水稻多元醇转运基因OsPLT5的过表达株系，即为高产量水稻；也可以得到用于组织定位的GUS材料，过表达株系还可以用于进一步探究基因功能。

优选的，所述表达载体为PCAMBIA1300；所述PCR法扩增采用的扩增引物为OE::OsPLT5，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供以下水稻多元醇转运基因OsPLT5的扩增引物：

第一对扩增引物为OE::OsPLT5，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。该扩增引物OE::OsPLT5用于扩增水稻多元醇转运基因OsPLT5的CDS序列，适合用于转化过表达材料OE::OsPLT5的应用。

第二对扩增引物为G::OsPLT5，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。该扩增引物G::OsPLT5用于扩增水稻多元醇转运基因OsPLT5的CDS序列，适合用于建立基因表达模式的应用。

第三对扩增引物为OE::OsPLT5-GFP，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示。该扩增引物OE::OsPLT5-GFP用于扩增水稻多元醇转运基因OsPLT5的CDS序列，适合用于多元醇转运体OsPLT5的亚细胞定位实验。

第四对扩增引物为GUS::OsPLT5，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10所示。该扩增引物GUS::OsPLT5用于扩增水稻多元醇转运基因OsPLT5的启动子序列，适合用于转化组织表达材料GUS::OsPLT5的应用。

第五对扩增引物为Y::OsPLT5，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。该扩增引物Y::OsPLT5用于扩增水稻多元醇转运基因OsPLT5的CDS序列，适合用于多元醇转运体OsPLT5的酵母吸收实验。

本发明通过CRISPR-Cas9技术，植物分子遗传和生理生化方法，发现了一种水稻多元醇转运基因OsPLT5，其编码得到的单糖转运体，预测为多元醇转运体，多元醇转运体主要在水稻茎鞘实现功能，不同于以往的研究，可用于提高水稻的产量，通过植物分子遗传和生理生化等方法将该水稻多元醇转运基因OsPLT5敲除，使其失去功能，导致结实率和单株产量分别下降34.49％、19.15％。将这种水稻多元醇转运基因OsPLT5过量表达，导致分蘖数、穗粒数增加，为通过生物技术的手段进一步提高水稻的单产提供了优异的基因资源。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的水稻多元醇转运基因OsPLT5，在水稻中过量表达可显著增加水稻分蘖数和穗粒数，敲除突变后可显著降低水稻的结实率和产量；通过影响光合产物的运输与分配，进而对水稻的产量造成影响，对育性没有产生影响；为通过品种遗传改良增强光合产物运输与分配能力，持续提高水稻单产提供现实依据。

2、本发明还提供了该水稻多元醇转运基因OsPLT5和其多元醇转运体在培育高产量水稻中的应用，能够快速、有效提高水稻的产量。

3、本发明还提供了几种水稻多元醇转运基因OsPLT5的PCR扩增引物，可以有效、快捷地把基因OsPLT5从水稻的cDNA中扩增出来。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中得到的OsPLT5的时空表达模式结果(其中，LS：叶鞘，LB：叶片，S：茎，n：节，FS：剑叶叶鞘，P：穗，PL：穗分枝)；

图2是实施例1中得到的OsPLT5的组织定位结果(a：叶片，b-c：叶鞘，d-e：节，f-g：节间，h-i：根)；

图3是实施例1中得到的OsPLT5的亚细胞定位结果；

图4是实施例1中得到的OsPLT5的酵母吸收实验结果；

图5是实施例2中得到的OsPLT5突变体灌浆期表型；

图6是实施例2中得到的两个OsPLT5突变体的突变类型(其中，A：DNA序列，B：蛋白序列)；

图7是实施例2中得到的OsPLT5突变体成熟期农艺性状分析的结果；

图8是实施例2中得到的OsPLT5过表达株系灌浆期表型；

图9是实施例2中得到的OsPLT5过表达株系成熟期性农艺状分析的结果；

图10是实施例2中得到的野生型TB309和OsPLT5突变体成熟期茎鞘淀粉累积对比结果；

图11是实施例2中得到的野生型TB309和OsPLT5突变体成熟期茎鞘细胞壁主成分比较。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种水稻多元醇转运基因OsPLT5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码得到的多元醇转运体(以下称为“多元醇转运体OsPLT5”)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该多元醇转运基因OsPLT5及其多元醇转运体OsPLT5是通过CRISPR-Cas9技术，以及植物分子遗传和生理生化方法，在水稻中发现的。经过研究，我们还发现其过量表达能显著增加水稻的单产，而其基因OsPLT5的突变显著降低了水稻的结实率和单产，这为通过品种遗传改良增强光合产物运输与分配能力，持续提高水稻单产提供了现实依据。

1、本发明的多元醇转运基因OsPLT5的时空表达模式

为了获得多元醇转运基因OsPLT5的表达模式，在水稻的不同生育期对各个部位取样进行RNA提取，其中每个样本设置三次重复。使用TRIzol提取总RNA，利用Hiscript II QR T SuperMix试剂盒(Vazyme)合成第一链cDNA。采用qPCR预混液ChamQ Universal SYB RqPCR Master Mix(Vazyme)在StepOnePlus仪器上进行实时荧光定量PCR分析。PCR扩增引物为G::OsPLT5，其正向引物和反向引物分别为5'-GCCATTCGGATTGTAGTCGG-3'(如SEQ ID NO：5所示)和5'-AGGAGGATGGAGGTCATGGA-3'(如SEQ ID NO：6所示)。Action用作内部标准，带有引物5'-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3'(如SEQ ID NO：13所示)和5'-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3'(如SEQ ID NO：14所示)。

具体步骤如下：

总RNA提取：1.组织取样后液氮速冻并研磨成粉，取0.1g样品加入预冷的1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol，迅速混匀，室温下静置5分钟；2.向离心管中加入200μL三氯甲烷，剧烈振荡30秒，室温(25℃)静置10分钟；3.于4℃ 12000rpm离心10分钟，样品分相为三层；4.小心吸取上清液600μL转移至新离心管中，重复步骤2和步骤3以得到更纯的RNA；5.加入与上清液等体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温(25℃)静置10分钟；4℃ 12000rpm离心10分钟，弃上清液；6.加入1mL 75％乙醇，温和振荡使沉淀悬浮；7. 4℃ 8000rpm离心5分钟，弃上清液；8.重复步骤6和步骤7以得到更纯的RNA；9.短暂离心后用20μL移液器小心吸弃残余的乙醇；10.于超净台中将RNA沉淀吹至半透明胶状，根据沉淀多少加30-40μL灭菌DEPC溶解RNA；11.55～60℃孵育10分钟；12.小心混匀样品，并短暂离心；13.保存于-80℃冰箱备用。

RNA质量检测和浓度测定：1.电泳检测RNA完整性：1％琼脂糖凝胶快速电泳，检测RNA分子完整性，观察18S、28S条带，28S条带亮度为18S条带亮度的2倍左右说明RNA完整性较好；2.核酸分析仪检测RNA的纯度及浓度：用溶解RNA的溶剂读取BLANK，NanoDrop测定RNA浓度。核酸的吸收峰在260nm处，蛋白质在280nm处有最大吸收峰，OD260/280在1.8-2.0之间的RNA样品纯度达标，可以用于后续的荧光定量实验。

合成cDNA第一链：总RNA利用反转录试剂盒Hiscript II Q RT SuperMix合成cDNA第一链，每个样品一次反转cDNA终浓度都为1μg。cDNA存放-20℃保存备用。反转体系如下：Total RNA(1μg)，4×gDNA wiper Mix 4μL，II qRT SuperMix II 4μL，RNA-free water添至20μL。反应条件：42℃孵育15min，85℃，5s灭活。反应完成后加入等体积RNA-free water稀释一倍，混匀后-20℃冰箱保存备用。

实时荧光定量PCR引物设计及特异性分析：根据基因cDNA全长通过软件primer5进行qPCR引物的设计，选择特异性好、碱基之间无互补的引物送擎科生物科技有限公司合成，得到扩增引物G::OsPLT5。以水稻各时期的cDNA为模板，通过琼脂糖凝胶电泳检测引物特异性，反应体系如下：cDNA 1μL，G::OsPLT5正向引物(10μM)0.5μL，G::OsPLT5反向引物(10μM)0.5μL，1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物)18μL。反应条件：95℃，3分钟；95℃，10秒；55℃，10秒；72℃，10秒；共36个循环，72℃，5分钟。

荧光定量PCR引物检测正确后，以反转录合成的cDNA第一链为模板，在罗氏Light96实时荧光定量PCR仪上运用两步法进行定量，每个基因每个样品设置3个技术重复，反应体系如下：cDNA 1μL，G::OsPLT5正向引物(10μM)0.5μL，G::OsPLT5反向引物(10μM)0.5μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，ddH₂O 8μL。反应条件：(1)预变性阶段：95℃，10分钟；(2)扩增阶段：95℃，20秒，60℃，30秒，共40个循环；(3)溶解曲线阶段：60℃ 60s，97℃ 1s。

结果如图1所示，OsPLT5在各时期各组织都有表达，其中分蘖期的叶片、叶鞘，灌浆期的叶鞘和穗分枝中表达相对较高。

2、本发明的多元醇转运基因OsPLT5的定位

为了研究多元醇转运基因OsPLT5表达的组织特异性，我们构建了携带ProOsPLT5的转化载体。通过PCR扩增得到OsPLT5的启动子(2.0kb)，扩增引物GUS::OsPLT5的正向引物和反向引物分别为(如SEQ ID NO：9所示,其中HindIII识别位点斜体显示)和/> (如SEQ ID NO：10所示，其中BamHI识别位点斜体显示)。使用HindIII和BamHI内切酶进行片段切割，扩增的片段被克隆到pCAMBIA1300载体中，产生ProOsPLT5载体。ProOsPLT5载体被转化进入根癌农杆菌EHA105菌株，然后利用根癌农杆菌介导转化野生水稻类型(cv.TB309)。

具体步骤如下：以测序完成的水稻数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.htmL)中得到OsPLT5的起始密码子ATG之前的2.0kb的序列为依据，设计OsPLT5启动子的特异引物，以营养液培养的苗期水稻幼嫩叶片基因组DNA为模板，使用Max高保真聚合酶(Vazyme)进行PCR扩增，反应体系如下：模板DNA 1μL，/>Max MasterMix 15μL，GUS::OsPLT5的正向引物1.5μL，GUS::OsPLT5的反向引物1.5μL，ddH₂O 11μL，依次加入以上成分，轻弹混匀，瞬时离心。PCR反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，40个循环；72℃延伸10分钟。获得OsPLT5启动子序列的PCR扩增产物经电泳检测后使用凝胶回收试剂盒回收。使用HindⅢ和BamHI双酶切表达载体pCAMBIA1300质粒，然后进行凝胶电泳检测并回收大片段。使用/>II重组克隆试剂盒(Vazyme)将回收的pCAMBIA1300双酶切大片段和OsPLT5启动子序列小片段重组。反应体系如下：pCAMBIA1300质粒大片段200ng，proPLT5 PCR扩增产物回收的片段80ng，5×CEII Buffer 4μL，Exnase II 4μL，ddH₂O添至20μL。依次加入以上成分，使用移液器轻轻吸打混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。37℃反应30分钟，反应完成后立即置于冰上冷却。将重组质粒转入DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞内，筛选平板使用的抗生素为卡那霉素，挑取阳性克隆进行菌液PCR检测后送测序，经测序鉴定无误后扩培菌液并抽取质粒，质粒命名为ProOsPLT5，并将质粒转化入农杆菌EHA105，抗生素为卡那霉素和利福平，菌液阳性鉴定无误后，加入甘油保存菌液于-80℃备用。将遗传转化得到的株系进行全生育期培养，取阳性植株加入已配置好的GUS染液中，保证样品各组织部位都完全浸到GUS染液，放入37℃恒温箱中用锡箔纸进行避光染色10h左右，待样品出现明显蓝色时，倒掉并回收染液。依次使用30％、50％、70％酒精对材料进行脱色处理，待叶绿素完全脱去，将材料放在显微镜下进行观察、拍照。OsPLT5启动子驱动的GUS蛋白表达部位结果如图2所示。

由图2可知，分蘖期PLT5启动子驱动的GUS蛋白在叶片的叶肉细胞、叶鞘维管束鞘周围的薄壁细胞、幼嫩的叶片、根皮层细胞中高表达。

为了研究OsPLT5表达的细胞特异性，我们又构建了携带OsPLT5-GFP的转化载体。通过PCR扩增得到OsPLT5的CDS序列，扩增引物OE::OsPLT5-GFP的正向引物和反向引物分别为(如SEQ ID NO：7所示，其中HindIII识别位点斜体显示)和/> (如SEQ ID NO：8所示，其中SalI识别位点斜体显示)。使用HindIII和SalI内切酶进行片段切割，扩增的片段被克隆到pCAMBIA1300-GFP载体中，产生OsPLT5-GFP载体。产生的载体通过PEG介导的方法转化水稻原生质体。

具体步骤如下：将OsPLT5-GFP菌液大摇，利用索莱宝质粒大提试剂盒提取OsPLT5-GFP质粒并浓缩。浓缩步骤如下：(1)将所有同名称基因的质粒混到一管，保证质粒浓缩后浓度≥1μg；(3)将盛有质粒的离心管放进-80℃冻存降温；(2)用封口膜将离心管封口，在管盖上用针头戳2个孔；(4)使用冷冻干燥机对质粒进行冷冻干燥；(5)加ddH₂O调浓度≥1μg，-20℃保存备用。

水稻原生质体的制备：(1)选取15株水稻白化苗，用一次刀片切成细条，越细越好；(2)放入装有10mL酶解液的培养皿中，抽真空5min，放入恒温摇床，28℃，45rpm，避光酶解4-5h；(3)取出培养皿加10mL W5，轻柔晃动使原生质体充分释放；(4)使用150目筛将原生质体过滤到圆底离心管中，分成2管，放入冰上；(5)200×g，1min，4℃，弃上清液，沿壁轻轻加4mLW5，轻轻重悬原生质体；(6)冰上静置孵育40min；(7)去上清液，加4mL W5轻轻混匀，取200μL加入等体积的0.01％二乙酸荧光素FDA染色剂；(8)吸取12μL混匀样轻轻打入血球计数板并放置显微计数；(9)剩余原生质体200×g，1min，4℃，弃上清液。

PEG介导的原生质体转化：根据原生质体的浓度估算出原生质体个数，加入MMG使原生质体终浓度大约为2×105个/mL；在1.5mL圆底离心管配置如下反应液：20μL待转化的质粒(1.0μg/μL)，200μL原生质体和220μL 40％的PEG转化液，轻缓地上下颠倒几次，促使PEG、质粒及原生质体融合，室温静置20min，加入1mL的W5，终止反应；200g离心5min，去掉上清液，用2mL的W5使原生质体重悬浮，28℃黑暗条件下培养过夜；利用激光共聚焦显微镜观察原生质体的GFP信号。结果如图3所示，水稻多元醇转运蛋白OsPLT5定位在水稻原生质体的细胞膜上。

3、本发明的OsPLT5在酵母吸收实验中的功能分析

为了研究OsPLT5特异性研究底物，采用PCR扩增的方法利用引物Y::OsPLT5，正向引物序列为(如SEQ IDNO：11所示，其中EcoRI识别位点斜体显示)，反向引物序列为/> (如SEQ ID NO：12所示，其中XhoI识别位点斜体显示)，把基因OsPLT5从水稻的cDNA中扩增出来，然后通过同源重组的方法克隆至酵母(Yeast)表达载体PDR196中，得到含有基因OsPLT5的目标载体，同时设置一个空载体对照组PDR196(不含OsPLT5)。我们利用PEG/醋酸锂的方法把空载体和含有基因OsPLT5的目标载体转化至酵母突变菌株EBY.VW4000中进行异源过表达，具体如下：1)将待转化的酵母菌种在完全营养型培养基(YPD培养基：20g/L胰化蛋白胨，10g/L酵母抽提物，20g/L D-葡萄糖，固体培养基添加20g/L琼脂，高压灭菌待用)平板上划线活化；2)挑取单克隆接种于5mL完全营养型培养基中，28℃-30℃培养至OD600＝1.0；3)取0.5mL菌液，12000g，离心30秒，倒去上清液(底部还剩约100μL培养基)；4)加入1μL鲑鱼精DNA，混匀；加入1μg目的质粒DNA，混匀；再加入500μL酵母转化缓冲液，混匀，室温静置8-10小时；5)取管底20-50μL菌体悬液，涂布于选择平板SD(-Ura)+2％麦芽糖，28-30℃，静置培养，即得到含有本发明的多元醇转运体OsPLT5的酵母。然后用酵母打点实验在不同糖为底物的SD(-Ura)平板上鉴定表型。

酵母转化缓冲液：将90mL45％的PEG4000、10mL 1M的醋酸锂、1mL 1M的Tris-Hcl(pH7.5)、0.2mL 0.5M的EDTA混合所得。参考文献为Elble R.(1992)A simple andefficient procedure for transformation of yeasts.Biotechniques.13,18-20。

结果如图4所示，在对照培养基上，转入空载体和目标基因载体的菌株都可以正常生长，但在以核糖、木糖、木糖醇、赤藓糖醇、山梨醇、甘露糖、半乳糖为唯一碳源的培养基上，转入空载体的菌株完全不能生长，转入目标载体的菌株具有一定的生长活性，说明对核糖、木糖、木糖醇、赤藓糖醇、山梨醇、甘露糖、半乳糖有较微弱的转运活性。

实施例2：

本发明的水稻多元醇转运基因OsPLT5或其多元醇转运体(多元醇转运体OsPLT5)在培育高产量水稻(提高水稻结实率和单株产量)中的应用，具体包括OsPLT5过表达和突变体植物的构建、成熟期表型和产量因子分析。

为了验证本发明的多元醇转运体OsPLT5在水稻中的作用，我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对OsPLT5进行编辑，分别获得了两个不同突变类型的敲除株系plt5-1、plt5-2(如图5)，如图6所示，plt5-1中OsPLT5基因缺失52bp，导致编码20个氨基酸，提前终止；plt5-2中OsPLT5基因C→T且缺失40bp，导致编码24个氨基酸，提前终止。

为了进一步验证多元醇转运体OsPLT5在植物中的功能，我们利用OE::OsPLT5引物，正向和反向引物序列分别为 (如SEQ ID NO：3所示，其中BamHI识别位点斜体显示)和/> (如SEQ ID NO：4所示，其中SpeI识别位点斜体显示)，利用PCR的方法把基因OsPLT5从水稻的cDNA中扩增出来，然后通过同源重组的方法克隆至植物表达载体PCAMBIA1300中，得到含有基因OsPLT5的目标载体OE::OsPLT5；再将所述目标载体通过热击转化法转入农杆菌中，将纯化的质粒将纯化的质粒克隆至水稻中进行表达，具体步骤如下：

(1)水稻成熟胚愈伤组织培养：挑选台北309健康籽粒，去壳，75％乙醇表面灭菌3min，用无菌水冲洗2次；次氯酸钠原液消毒20-30min，每隔几分钟轻摇使消毒充分，用无菌水冲洗6～8次；将种子移至无菌的滤纸上晾干，然后接种至NBM诱导培养基，每皿20～25粒；25～26℃，黑暗培养8～10天，诱导愈伤组织。挑取表面干爽，结构致密的淡黄色愈伤组织，除去谷粒和芽，转移至J3继代培养基，25～26℃，暗培养5-7天。

(2)农杆菌与愈伤组织共培养：挑取表面干爽，结构致密的淡黄色愈伤组织，放至无菌滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织移入调好OD值的菌液中，浸泡30min，每隔5min轻摇一次；倒去菌液，用无菌水清洗3～5次，再次将愈伤组织放至滤纸上晾干至表面发白；取出NBM(含As)固体培养基，在培养基表层铺一张无菌滤纸，将愈伤组织移入，然后放至25～26℃，暗培养2-3天。

(3)筛选培养：将共培养2～3天后的愈伤组织取出，无菌水冲洗6～8次，直至漂洗后的液体不浑浊；用50mL含有抗生素(500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素)的无菌水浸泡30min，每隔5min轻摇一次；将愈伤组织移至无菌滤纸上晾干至表面发白，然后转移到筛选培养基(J3+500mg/L头胞霉素+400mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素)中，25～26℃，黑暗培养。筛选培养12-17天后，挑取有活性的愈伤组织，移至新的筛选培养基，进行第二次筛选。

(4)预分化培养：将长出抗性愈伤的愈伤组织整体小心移至预分化培养基(Y+500mg/L头胞霉素+400mg/L羧苄青霉素)中，置于光照培养箱中，25～26℃，14h光照培养3～7天。

(5)分化培养：将预培养变绿的愈伤组织小心移至分化培养基(DL+500mg/L头胞霉素+400mg/L羧苄青霉素)中，25～26℃，14h光照培养，每15～20天更换一次培养基。

(6)生根培养：将分化出的绿苗(高约4～6cm)移至生根培养基(R)中，25～26℃，14h光照培养使其生根，每15～20天更换一次培养基。

(7)炼苗移栽：根长出10～20天后，打开培养瓶盖，加入无菌水至稍稍没过培养基，室温炼苗7～12天。用自来水将附着在幼苗根部的培养基冲洗干净，移栽至装有泥土的小盆子里，待幼苗成活后再移入试验田中培养。

(8)转基因植株鉴定：提取转基因植株DNA，根据载体上所带的筛选标记潮霉素基因的序列设计潮霉素鉴定特异性引物PCR鉴定，最终获得转基因阳性苗，即得到过表达株系OsPLT5^OE1、OsPLT5^OE2。

在成熟期，对野生型(WT)、突变体(plt5-1、plt5-2)和过表达株系(OsPLT5^OE1、OsPLT5^OE2)进行表型和产量相关性状进行分析。结果如图7所示，突变体(plt5-1、plt5-2)结实率和单株产量显著降低。如图8-图9所示过表达株系(OsPLT5^OE1、OsPLT5^OE2)分蘖数和穗粒数显著升高。数值为三次重复实验的平均值±标准差，P值为显著性差异统计检验Student’s t-test分析*P<0.05，**P<0.01。

为了验证多元醇转运体OsPLT5对碳水化合物源库分配的影响，我们利用I₂-KI对OsPLT5突变体及野生型的叶片、叶鞘、节、节间进行染色。如图10所示，OsPLT5突变后导致淀粉在叶鞘中大量积累。

为验证多元醇转运体OsPLT5对茎鞘结构性碳水化合物组分的影响，我们利用傅里叶红外光谱分析了OsPLT5突变体及野生型茎鞘细胞壁的主成分。如图11所示，plt5突变体中纤维素、半纤维素、木质素的含量高于野生型TB309。备注：850-1150，纤维素；1400-1500，木质素；1600-1750，半纤维素。

说明本实施例的多元醇转运体对碳水化合物的源库分配有重要的影响，对提高水稻产量有积极的作用，为通过遗传育种进一步提高水稻单产提供基因和种质资源。

综上所述，本发明的水稻多元醇转运基因能够合成水稻多元醇转运蛋白(即多元醇转运体)，该蛋白可介导木糖醇、半乳糖等的跨膜运输，可能参与细胞壁半纤维素的合成，敲除其表达造成纤维素、半纤维素含量升高。水稻多元醇转运基因OsPLT5应用到水稻中用于提高水稻生物能量等领域具有显著的效果。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 水稻多元醇转运基因OsPLT5及其多元醇转运体、应用和扩增引物

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1734

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atgtcggcca ccacgtccaa ttcccggcgg ctatgcaacg gccggggaca ggtcatacct 60

gggcccacct taccagaggc tgtcaagatg ggcccacacg ccattcggat tgtagtcgga 120

gggctcggag aaggcgagct ctcgaccgcc actactgtac acggcccaga gcgagcctcc 180

tcctcctctg caccaccgga gatggcttcc gccgcgctgc cggaggccgt cgcgccgaag 240

aagaagggca acgtccggtt cgccttcgcc tgcgccatcc tcgcctccat gacctccatc 300

ctcctcggct acgatatcgg ggtgatgagc ggggcgtcgc tgtacatcaa gaaggacttc 360

aacatcagtg acgggaaggt ggaggttctc atgggcatac tgaacctcta ctcgctcatc 420

ggctccttcg cggcggggcg gacgtcggac tggatcggcc ggcggtacac catcgtgttc 480

gccgccgtca tattcttcgc gggggcgttc ctcatggggt tcgccgtcaa ctacgccatg 540

ctcatgttcg gccgcttcgt ggccggcatc ggcgtgggct acgcgctcat gatcgcgccg 600

gtgtacaccg ccgaggtgtc gccggcgtcg gcgcgtggct tcctgacgtc gttcccggag 660

gtgttcatca acttcggcat cctgctcggg tacgtctcga actatgcttt ctcccgcttg 720

ccgctgaacc tcgggtggcg catcatgctc ggcatcggcg cggcgccgtc cgtgctgctc 780

gcgctcatgg tgctcggcat gccggagtcg ccgcggtggc tggtcatgaa gggacgcctc 840

gcggacgcca aggtggtgct ggagaagacc tccgacacgg cggaggaggc cgcggagcgc 900

ctggccgaca tcaaggccgc cgccggcatc cccgaggagc tcgacggcga cgtggtgacc 960

gtccccaaga gagggagcgg aaacgagaag cgggtgtgga aggagctcat cctgtccccg 1020

accccggcca tgcggcgcat cctgctgtcg ggcatcggca tccacttctt ccagcaggcg 1080

tcgggcatcg actccgtcgt gctctacagc ccgcgcgtgt tcaagagcgc cggcatcacc 1140

gacgacaaac acctcctcgg caccacctgc gccgtcggtg tcaccaagac gctcttcatc 1200

ctcgtggcga ccttcttcct cgaccgcgtc gggcggcggc cgctgctgct gagcagcacg 1260

ggcgggatga tcctctccct catcggcctc ggcgccgggc tcaccgtcgt cggccagcac 1320

cccgacgcca agataccttg ggccatcggc ctaagcatcg cctccaccct cgcctacgtc 1380

gccttcttct ccatcggcct tggccccatc acgtgggtgt acagctcgga gatcttcccg 1440

ctccaggtgc gcgcgctggg ctgctcgctc ggcgtcgccg ccaaccgcgt caccagcggc 1500

gtcatctcca tgaccttcct gtcgctgtcc aaggccatca ccatcggcgg cagcttcttc 1560

ctctactccg gcatcgccgc gctcgcctgg gtgttcttct acacctacct cccggagacc 1620

cgcggccgga cgctggagga gatgagcaag ctgttcggcg acacggccgc cgcctcggaa 1680

tcagacgagc cagccaagga gaagaagaag gtggaaatgg ccgccactaa ctga 1734

<210> 2

<211> 577

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Ser Ala Thr Thr Ser Asn Ser Arg Arg Leu Cys Asn Gly Arg Gly

1 5 10 15

Gln Val Ile Pro Gly Pro Thr Leu Pro Glu Ala Val Lys Met Gly Pro

20 25 30

His Ala Ile Arg Ile Val Val Gly Gly Leu Gly Glu Gly Glu Leu Ser

35 40 45

Thr Ala Thr Thr Val His Gly Pro Glu Arg Ala Ser Ser Ser Ser Ala

50 55 60

Pro Pro Glu Met Ala Ser Ala Ala Leu Pro Glu Ala Val Ala Pro Lys

65 70 75 80

Lys Lys Gly Asn Val Arg Phe Ala Phe Ala Cys Ala Ile Leu Ala Ser

85 90 95

Met Thr Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp Ile Gly Val Met Ser Gly Ala

100 105 110

Ser Leu Tyr Ile Lys Lys Asp Phe Asn Ile Ser Asp Gly Lys Val Glu

115 120 125

Val Leu Met Gly Ile Leu Asn Leu Tyr Ser Leu Ile Gly Ser Phe Ala

130 135 140

Ala Gly Arg Thr Ser Asp Trp Ile Gly Arg Arg Tyr Thr Ile Val Phe

145 150 155 160

Ala Ala Val Ile Phe Phe Ala Gly Ala Phe Leu Met Gly Phe Ala Val

165 170 175

Asn Tyr Ala Met Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala Gly Ile Gly Val

180 185 190

Gly Tyr Ala Leu Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala Glu Val Ser Pro

195 200 205

Ala Ser Ala Arg Gly Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu Val Phe Ile Asn

210 215 220

Phe Gly Ile Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Tyr Ala Phe Ser Arg Leu

225 230 235 240

Pro Leu Asn Leu Gly Trp Arg Ile Met Leu Gly Ile Gly Ala Ala Pro

245 250 255

Ser Val Leu Leu Ala Leu Met Val Leu Gly Met Pro Glu Ser Pro Arg

260 265 270

Trp Leu Val Met Lys Gly Arg Leu Ala Asp Ala Lys Val Val Leu Glu

275 280 285

Lys Thr Ser Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Glu Arg Leu Ala Asp Ile

290 295 300

Lys Ala Ala Ala Gly Ile Pro Glu Glu Leu Asp Gly Asp Val Val Thr

305 310 315 320

Val Pro Lys Arg Gly Ser Gly Asn Glu Lys Arg Val Trp Lys Glu Leu

325 330 335

Ile Leu Ser Pro Thr Pro Ala Met Arg Arg Ile Leu Leu Ser Gly Ile

340 345 350

Gly Ile His Phe Phe Gln Gln Ala Ser Gly Ile Asp Ser Val Val Leu

355 360 365

Tyr Ser Pro Arg Val Phe Lys Ser Ala Gly Ile Thr Asp Asp Lys His

370 375 380

Leu Leu Gly Thr Thr Cys Ala Val Gly Val Thr Lys Thr Leu Phe Ile

385 390 395 400

Leu Val Ala Thr Phe Phe Leu Asp Arg Val Gly Arg Arg Pro Leu Leu

405 410 415

Leu Ser Ser Thr Gly Gly Met Ile Leu Ser Leu Ile Gly Leu Gly Ala

420 425 430

Gly Leu Thr Val Val Gly Gln His Pro Asp Ala Lys Ile Pro Trp Ala

435 440 445

Ile Gly Leu Ser Ile Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Val Ala Phe Phe Ser

450 455 460

Ile Gly Leu Gly Pro Ile Thr Trp Val Tyr Ser Ser Glu Ile Phe Pro

465 470 475 480

Leu Gln Val Arg Ala Leu Gly Cys Ser Leu Gly Val Ala Ala Asn Arg

485 490 495

Val Thr Ser Gly Val Ile Ser Met Thr Phe Leu Ser Leu Ser Lys Ala

500 505 510

Ile Thr Ile Gly Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Gly Ile Ala Ala Leu

515 520 525

Ala Trp Val Phe Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Glu Thr Arg Gly Arg Thr

530 535 540

Leu Glu Glu Met Ser Lys Leu Phe Gly Asp Thr Ala Ala Ala Ser Glu

545 550 555 560

Ser Asp Glu Pro Ala Lys Glu Lys Lys Lys Val Glu Met Ala Ala Thr

565 570 575

Asn

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggggactc tagaggatcc atgtcggcca ccacgtccaa 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcggaggagg ccatactagt tcagttagtg gcggccattt 40

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccattcgga ttgtagtcgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggaggatgg aggtcatgga 20

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagctcggta cccggggatc catgtcggcc accacgtcca a 41

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttctccttt gcccatgtcg acgttagtgg cggccattt 39

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgacggccag tgccaagctt attccacaac catcgcaatc 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gactgaccac ccggggatcc ctccggtggt gcagaggagg 40

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcccccgggc tgcaggaatt catgtcggcc accacgtcc 39

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtaccgggc cccccctcga gtcagttagt ggcggccatt 40

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgcacaatgg atgggtcaga 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggcatctct cagcacattc c 21

Claims

1. 一种水稻多元醇转运基因OsPLT5或其编码得到的多元醇转运体在培育高产水稻中的应用，其特征在于，所述水稻多元醇转运基因OsPLT5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述多元醇转运体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其应用的方法包括如下步骤：通过PCR法扩增所述水稻多元醇转运基因OsPLT5的CDS序列，然后通过同源重组的方法克隆至表达载体中，得到含有基因OsPLT5的目标载体，再将所述目标载体通过热击转化法转入农杆菌中，最终通过遗传转化克隆至水稻中进行表达，得到含有所述水稻多元醇转运基因OsPLT5的过表达株系，即为高产量水稻。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的表达载体为PCAMBIA1300。

4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述PCR法扩增采用的扩增引物为OE::OsPLT5，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。