CN116064572A - 一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用。本发明通过将所述MdWOX11基因在植物中过表达，可以促进植物不定根的发育，尤其可以促进不定根的伸长、增加不定根的数目、表面积和体积。说明MdWOX11基因可以促进植物不定根的发育，可用于培育不定根发育能力强的植物品种，降低植物育苗成本，提高植物育种效率，缩短生产年限。

Description

一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用。
背景技术
苹果(Malus domestica)是我国落叶果树的第一大水果，并且我国果树的面积和产量居世界首位，但是我国在果树生产质量和栽培技术方面还需要完善。矮化自根砧是目前世界苹果生产的发展趋势，其具有方法简单、苗貌整齐、早果丰产等优点。在我国，矮化砧木苹果园面积仅占苹果总面积的15％左右，造成这种情况的主要原因之一是优良矮化砧木的高效育种技术尚未有效建立。扦插繁殖作为苹果矮化砧木快速繁殖的有效途径，具有方法简便、成苗快、繁殖系数高、生产成本低等优点，但因其技术难度较大，尚未得到广泛应用。其中不定根的诱导是扦插繁殖的关键所在，它能够促进优良果树品种的营养繁殖。
植物所特有的WOX类转录因子在顶端发育中起着非常重要的作用。WOX11调控根系发育(Ge et al.2019)，在水稻中，WOX11是一个IAA和CK应答因子，在根细胞分裂旺盛的分生组织中特异表达，它通过参与IAA和CK的信号转导来促进水稻根分生组织细胞的分裂，激活水稻冠根的生长发育(Jiang et al.2017；Zhao et al.2015；Zhao et al.2009)。在拟南芥中，WOX11参与了不定根的从头合成(Liu et al.2014)。模式植物中对WOX11的研究，为本研究中在苹果中分析WOX11在不定根发生过程中的功能提供了研究思路，但是草本植物和木本植物不定根发生的调控过程有所差别，苹果作为常见的木本植物，探讨苹果中不定根的发生就显得非常重要。所以研究WOX11在苹果不定根发生过程中的功能至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用，本发明所述MdWOX11基因可以促进植物不定根的发育，尤其可以促进不定根的伸长、增加不定根的数目、表面积和体积。
本发明提供了一种促进不定根发育的MdWOX11基因，所述MdWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的MdWOX11基因编码的MdWOX11蛋白，所述MdWOX11蛋白的氨基酸序列为：
SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明还提供了一种含有上述技术方案所述MdWOX11基因的重组表达载体。
优选的，用于制备所述重组表达载体的初始载体包括质粒载体。
本发明还提供了一种工程菌，包括上述技术方案所述的MdWOX11基因或重组表达载体。
本发明还提供了一种由上述技术方案所述表达载体转化的宿主细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述的MdWOX11基因、重组表达载体、工程菌或宿主细胞在下述Ⅰ～Ⅵ中任一项或多项中的应用：
Ⅰ：促进植物不定根的发生；
Ⅱ：促进植物不定根的伸长；
Ⅲ：增加植物不定根的数目；
Ⅳ：增加植物不定根的表面积和/或体积；
Ⅴ：调控不定根的发育；
Ⅵ：植物无性繁殖；
Ⅶ：辅助植物分子育种。
优选的，所述植物包括园艺作物。
本发明还提供了一种培育不定根发育能力强的植物的方法，增加目的植物中MdWOX11基因的表达或提高目的植物中MdWOX11蛋白的含量，得到所述不定根发育能力强的植物。
优选的，所述增加目的植物中MdWOX11基因的表达或提高目的植物中MdWOX11蛋白的含量为通过向所述目的植物中导入所述MdWOX11基因实现的。
有益效果：
本发明提供了一种促进不定根发育的MdWOX11基因，所述MdWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将所述MdWOX11基因在植物中过表达，可以促进植物不定根的发育，尤其可以促进不定根的伸长、增加不定根的数目、表面积和体积。说明MdWOX11基因可以促进植物不定根的发育，可用于培育不定根发育能力强的植物品种，降低植物育苗成本，提高植物育种效率，缩短生产年限。
同时，本发明还提供了一种培育不定根发育能力强的植物的方法，通过增加目的植物中MdWOX11基因的表达量或提高目的植物中MdWOX11蛋白的含量，得到所述不定根发育能力强的植物，所述方法具有操作简单、繁殖系数高、生产成本低的优点，可广泛应用于作物无性繁育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中从13份苹果属组培材料中克隆得到的序列比对结果；
图2为实施例2为MdWOX11基因的亚细胞定位结果，其中35S：GFP作为阳性对照，GFP是绿色荧光，mCherry是细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚，BF是明场，Merge是GFP、DAPI和BF三个视野的组合；
图3为实施例3过表达和干扰MdWOX11转基因苹果株系DNA和RNA的检测结果，A为MdWOX11过表达转基因株系DNA检测结果，WT是野生型GL3，H2O为无菌水代替cDNA的阴性对照，MdWOX11过表达转基因株系15#，16#和20#检测到MdWOX11的条带。B为GL3、过表达和干扰MdWOX11转基因苹果株系RNA检测结果；
图4为实施例3提供的过表达和干扰MdWOX11转基因苹果株系及野生型GL3形态表型观察及统计结果，A为MdWOX11转基因株系及野生型GL3表型观察，B为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根数目统计，C为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根发生率统计，D为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根长度统计，E为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根表面积统计，F为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根体积统计。
具体实施方式
本发明提供了一种促进不定根发育的MdWOX11基因，所述MdWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具体为5’-ATGGAAGATCATCATCAAGGCCAAGACCCTAACGATAGCAGTCCAAGCAACGGCTCGACCAAGAGAAGCCCTGAGCCGGTGAGGTCAAGATGGATACCGAAGCCACAGCAAATCCTAATTCTGGAGTCAATTTTCAACAGTGGAATGGTGAATCCTCCCAAAGAAGAAACTGTGAGAATAAGGAAACTGCTTGAGAAGTTTGGCTCCGTTGGGGATGCCAACGTTTTCTACTGGTTCCAAAACCGACGGTCGCGATCTCGCCGCCGACAACGGCAGTTGCAGGCCAGCCTTGAACAAAGAACCAATTATAATATAAACAATAATCAAATGGCTTCTCTTTCTCAACACCAAGTGGGTGGTGCAATTCAATATGGAGTAAGCTGCTGTGTTCCTACTGCTGCTCCTCCTTTGGCTTTCGGAGCTTCTCCTAATAATTTTCTTGTGGGCTCTTCATCTTCGTCTTGTGGTCAACATCTGATAGCAGATCATGATGTTCATCATAGTATTGATTGCGTTGGTGATCAGTTCTTTTCTGTTTCTGATCAAATGGGGTTTCCGGAAATCGAGCAGAGCTCCGGGGTAACGTCTGTGTTAGGAGGAGGCCCTTCTGATACCTCAAATTTGCACTTCCAATCTGGTCTCATCACAGTGTTTATTAATGGGATTCCAACAGAAGTTCCCAACGGGCCACTTGACATGAAAGCCGTGTTTGGACAAGATGTGCTATTGGTTCATTCCTCTGGACTCCCACTTCCAATCAATGAATTTGGTTTTTTGGCACACAGCTTGGAGTCTGGTGAAAGCTATTTCCTGGTTTCAAGACCAACTTAA-3’。本发明所述MdWOX11基因从圆叶海棠中分离得到，具有调控植物不定根发育的作用。实验表明，在苹果中过表达所述MdWOX11基因可以促进苹果不定根的发育，抑制表达所述MdWOX11基因可以抑制苹果不定根的发育。
本发明还提供了上述技术方案所述的MdWOX11基因编码的MdWOX11蛋白，所述MdWOX11蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。本发明所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具体为：MEDHHQGQDPNDSSPSNGSTKRSPEPVRSRWIPKPQQILILESIFNSGMVNPPKEETVRIRKLLEKFGSVGDANVFYWFQNRRSRSRRRQRQLQASLEQRTNYNINNNQMASLSQHQVGGAIQYGVSCCVPTAAPPLAFGASPNNFLVGSSSSSCGQHLIADHDVHHSIDCVGDQFFSVSDQMGFPEIEQSSGVTSVLGGGPSDTSNLHFQSGLITVFINGIPTEVPNGPLDMKAVFGQDVLLVHSSGLPLPINEFGFLAHSLESGESYFLVSRPT*。
本发明还提供了一种含有上述技术方案所述MdWOX11基因的重组表达载体。
本发明用于制备所述重组表达载体的初始载体优选包括质粒载体，进一步优选包括pCAMBIA2300或pK7GWIWG2D(II)，更优选为35S：pCAMBIA2300-GFP或pK7GWIWG2D(II)。本发明所述pCAMBIA2300优选用于过表达，所述pK7GWIWG2D(II)优选用于干扰表达。本发明所述包括35s启动子的35S：pCAMBIA2300-GFP可以提高基因的表达水平。
本发明所述重组载体优选包括MdWOX11-GFP过表达载体或pK7GWIWG2D(II)-MdWOX11。本发明所述MdWOX11-GFP过表达载体优选为将SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列导入载体pCAMBIA2300得到的重组载体；所述MdWOX11-GFP可以表达SEQ ID NO.2所示的MdWOX11蛋白。本发明所述pK7GWIWG2D(II)-MdWOX11优选为将所述MdWOX11中的部分序列导入pB7GWIWG2(II)中得到的重组载体，所述pK7GWIWG2D(II)-MdWOX11可以干扰MdWOX11基因表达。本发明所述MdWOX11中的部分序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示，具体为5’-ATGGAAGATCATCATCAAGGCCAAGACCCTAACGATAGCAGTCCAAGCAACGGCTCGACCAAGAGAAGCCCTGAGCCGGTGAGGTCAAGATGGATACCGAAGCCACAGCAAATCCTAATTCTGGAGTCAATTTTCAACAGTGGAATGGTGAATCCTCCCAAAGAAGAAACTGTGAGAATAAGGAAACTGCTTGAGAAGTTTGGCTCCGTTGGGGATGCCAACGTTTTCTACTGGTTCCAAAACCGACGGTCGCGATCTCGCCGCCGACAACGGCAGTTGCAGGCCAGCCTTGAACAAAGAACCAATTATAATATAAACAATAATCAAATGGCTTCTCTTTCTCAACACCAAGTGGGTGGTGCAATTCAA-3’。本发明采用所述重组载体进行过表达后，可以促进植物不定根的发生，促进不定根的伸长、增加不定根的数目、表面积和体积，辅助植物的无性繁殖和培育不定根发育能力强的植物，优化植物组培苗不定根的发生体系，可以广泛应用于砧木和栽培品种的组培快繁生根。
本发明还提供了一种工程菌，包括上述技术方案所述的MdWOX11基因或重组表达载体。本发明用于制备所述工程菌中的原始菌株优选为农杆菌，进一步优选为根癌农杆菌，更优选为农杆菌EHA105。本发明所述工程菌优选通过将所述重组表达载体转入到原始菌株中获得。本发明对所述转入方式没有特殊限定，采用本领域中常规转入方式即可。
本发明还提供了一种由上述技术方案所述表达载体转化的宿主细胞。本发明所述宿主细胞优选为园艺作物的细胞，进一步优选为苹果、梨或葡萄的细胞，更优选为苹果的细胞。本发明对将所述表达载体转化宿主细胞的方法没有特殊限定，采用本领域中常规遗传转化方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的MdWOX11基因、重组表达载体、工程菌或宿主细胞在下述Ⅰ～Ⅵ中任一项或多项中的应用：Ⅰ：促进植物不定根的发生；Ⅱ：促进植物不定根的伸长；Ⅲ：增加植物不定根的数目；Ⅳ：增加植物不定根的表面积和/或体积；Ⅴ：调控不定根的发育；Ⅵ：植物无性繁殖；Ⅶ：辅助植物分子育种。本发明所述植物优选包括园艺作物，进一步优选包括苹果、梨或葡萄，更优选为苹果。
本发明还提供了一种培育不定根发育能力强的植物的方法，增加目的植物中MdWOX11基因的表达或提高目的植物中MdWOX11蛋白的含量，得到所述不定根发育能力强的植物。本发明所述增加目的植物中MdWOX11基因的表达或提高目的植物中MdWOX11蛋白的含量为通过向所述目的植物中导入所述MdWOX11基因实现的。本发明所述植物优选包括园艺作物，进一步优选包括苹果、梨或葡萄，更优选为苹果。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明的实施例中，如没有特殊说明，试验方法均采用的是本领域技术人员所熟知的方法和步骤；试剂均可通过常规市售渠道购买得到。
实施例1
MdWOX11的编码区(CDS)克隆
试验材料：13个苹果属样品，分别为圆叶海棠、M.9-T337、M.26、礼泉富士、长富2号、SH6、B9、富士、烟富10号、烟富8号、珠美海棠(实验室保存)、王林愈伤(山东农业大学郝玉金教授惠赠)、GL3(沈阳农业大学张志宏教授惠赠)。
此13个苹果属材料都是组培条件下保存，转移至生根培养基培养2天，培养基配方为每升2.215g MS粉、30g蔗糖、7.8g琼脂和1mg IBA。培养条件：为16h光照和8h黑暗，温度为21℃。
从上述13个材料从生根培养基中取出，取0.5厘米的茎基部分别进行液氮研磨成粉末。采用CTAB法分别提取13个样本的总RNA。在2％琼脂糖凝胶上验证RNA的完整性。微量紫外分光光度计NanoDrop 2000c(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA)检测其质量。采用Takara的反转录试剂盒(PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNAEraser)对提取得到的总RNA进行反转录，得到13个样本的cDNA。反转录过程具体如下：首先在冰上配置如下反应液试剂，2.0μL 5×gDNAEraserBuffer、1.0μLgDNAenzyme、1mg RNA、5.0μL RNasefree H2O，42℃反应2min；然后进行反转录反应，在上述反应管中加入以下试剂：4.0μL 5×PrimerscriptBuffer 2、1.0μL RTPrimerMix、1.0μLPrimerscript RT enzyme Mix I、4.0μLRNase free H2O。反应条件37℃15min，85℃反应5s，PCR反应结束后-20℃保存。
根据苹果参考基因组(GDDH13)中推测的MdWOX11编码序列(CDS)，利用NCBI引物设计网站设计克隆引物，其中：克隆引物的上游引物F：5’-ATGGAAGATCATCATCAAGGC-3’(SEQID NO.4)；下游引物R：5’-AGTTGGTCTTGAAACCAGGA-3’(SEQ ID NO.5)。将13种苹果属材料反转录的cDNA稀释5倍作为模板克隆MdWOX11全长编码序列。PCR克隆体系参考诺唯赞Phanta高保真酶的反应体系，反应体系为50μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s/1kp，35个循环；72℃彻底延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收符合预期大小的目的片段，具体回收流程参考通用型胶回收试剂盒(Genestar)说明书。
将回收的目的片段连接到pMD18-T克隆载体上，16℃反应30min。将连接产物转化到50μL的大肠杆菌DH5α感受态中。将菌液涂布到含有氨苄的LB固体培养基上，37℃培养16h。挑取单克隆用2×TaqPCRMasterMix进行菌液PCR，检测阳性克隆，并用含氨苄的LB液体培养基摇菌，提取质粒后进行测序，分析序列结果。质粒提取步骤参照质粒小提试剂盒(天根)的说明书。送公司测序，将从13个样本中扩增得到的序列进行序列比对，结果如图1所示。其中，从上到下依次为圆叶海棠、M.26、M.9-T337、礼泉富士、长富2号、SH6、烟富8号、B9、富士、烟富10号、珠美海棠、GL3、王林愈伤品种。
如图1所示，MdWOX11编码区核酸序列总长为831bp，通过不同品种间MdWOX11的编码区核酸比对发现了几个碱基位点的差异，这些SNP的差异可能是导致不同品种间不定根发生能力差异的原因之一。同时，将从圆叶海棠中克隆得到序列命名为MdWOX11，序列如SEQID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
MdWOX11基因的亚细胞定位
将上述获得的圆叶海棠中SEQ ID NO.1所示的序列导入35S：pCAMBIA2300-GFP载体(由上海北诺生物科技有限公司购入)，形成MdWOX11-GFP过表达载体。将构建好的MdWOX11-GFP载体转入农杆菌中(菌株EHA105)。将活化好的农杆菌挑菌，并用液体LB于28℃培养16h，至OD值达到0.8。将农杆菌菌液5000转离心5min，倒掉上清加入重悬液并5000转离心5min，倒掉上清后加重悬液(取10mmol/L的0.097g MES，0.4064g MgCl2·6H2O，定容至200mL，并用NaOH调节pH＝5.6，加入200μL乙酰丁香酮(AS)(母液浓度为100μmol/L))调至OD值达到0.5，将带有菌液的重悬液，并室温静置2小时，用已消毒的1mL注射器，取下针头，在烟草植株叶片背面扎2～3个孔，用无针头的针管注射叶片，依靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间。注射完毕后，将烟草置于22℃人工培养室中培养2d。在488nm处激发共聚焦激光扫描显微镜检测GFP荧光(Zeiss LSM 510MetaJena，Germany)。
GFP荧光观测准备如下：
(1)配制DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)核染色剂(Solarbio)，配制浓度为0.5g/mL(水溶型)，避光-20℃保存。(2)剪取小块上述培养2～3d的烟草叶片(约5×5mm)，置于盛有1mL 0.5g/mLDAPI的2mL离心管中，浸泡约2～3min后用镊子夹放于滤纸上，用蒸馏水冲洗2～3次，表皮朝上制作临时玻片。(3)将玻片倒置于激光扫描共聚焦显微镜LSCM(IX-83-FV1200)上观测GFP荧光信号。同时需将35S：pCAMBIA2300-GFP空载体作为阳性对照进行GFP荧光观测。使用激光共聚焦显微镜观察MdWOX11亚细胞定位，结果显示如图2所示，其中GFP是绿色荧光，mCherry是细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚，BF是明场，Merge是GFP、DAPI和BF三个视野的组合。
由图2可以看出：MdWOX11-GFP的过表达载体只能在细胞核中能观察到绿色荧光，细胞的其他部位均无荧光信号，细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，细胞核呈现蓝色，将GFP和DAPI视野组合后发现，绿色荧光和蓝色荧光可以重合在一起，说明MdWOX11定位于细胞核，而阳性对照35S：GFP(pCAMBIA2300-35S-GFP)在细胞核、细胞膜与细胞质都可观察到绿色荧光，说明MdWOX11定位于细胞核内，进而充分证明MdWOX11蛋白可以在细胞核内发挥其转录因子的功能。
实施例3
MdWOX11转基因植株表型鉴定
将实施例1中获得的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，导入35S：pCAMBIA2300-GFP表达载体，酶切位点为SacⅠ和XbaⅠ。形成MdWOX11-GFP过表达载体。构建RNA干扰载体pK7GWIWG2D(II)(RNA干扰，RNAi)，将MdWOX11的一部分cDNA片段插入到pK7GWIWG2D(II)载体中，形成pK7GWIWG2D(II)-MdWOX11干扰表达载体，MdWOX11的干扰序列如SEQ ID NO.3所示。
将MdWOX11-GFP过表达载体及pK7GWIWG2D(II)-MdWOX11干扰表达载体用液氮速冻法转入农杆菌EHA105株系。具体转化步骤是：取5μL MdWOX11-GFP过表达载体及pK7GWIWG2D(II)-MdWOX11干扰表达载体质粒(约1-2μg)分别加入到100μL农杆菌感受态细胞中混匀。冰浴30min，液氮速冻5min，再37℃水浴5min，冰浴2min。分别加入800μL液体LB培养基，28℃摇床200rpm培养4-6h。吸取200μL培养好的菌液涂在含抗生素的固体LB培养皿上，28℃恒温培养箱培养48h。培养至有菌斑长出后，挑单克隆菌斑，阳性检测确认转化成功后扩繁菌液即可用于后续基因遗传转化。
将保存的农杆菌在LB固体培养基(含利福平和载体相应抗生素)上划线，利福平抗生素浓度为50μg/mL，28℃培养。将活化好的农杆菌挑菌，并用液体LB于28℃培养16h，至OD值达到0.8。将农杆菌菌液5000转离心5min，倒掉上清加入重悬液并5000转离心5min，倒掉上清后加重悬液调至OD值达到0.8，将带有菌液的重悬液进行苹果转基因。
以嘎啦实生苗GL3(沈阳农业大学张志宏课题组惠赠)为转基因材料。利用农杆菌介导转化体系获得转基因苹果植株，叶盘法进行苹果转化。具体方法为：取刚展开的新叶(厚的叶片较好)，将取下的叶子放入菌液中，用手术刀片在菌液里横切叶片中脉4刀左右，用农杆菌浸染8～10min，将叶片放到滤纸上，然后用灭菌滤纸吸干多余菌液，将叶片接种到不含抗生素的共培养基上，共培养基配方为：4.43g/LMS+30g/L蔗糖+0.5mg/LNAA+2mg/LTDZ+7.5g/L琼脂,pH5.8。，使叶片与固体培养基贴合紧密，培养箱21℃黑暗条件下共培养3d。3d后洗菌，转移至加头孢霉素(250mg/L)和卡那(50μg/L)分化培养基上，分化培养基配方为：4.43g/L MS+30g/L蔗糖+0.5mg/LNAA+2mg/L TDZ+50mg/L卡那霉素+7.5g/L琼脂，pH5.8，21℃培养箱暗培养一个月，期间半个月更换一次培养基。然后转移至光下培养直至产生绿色的不定芽。取叶片上分化出的苹果不定芽，提取DNA及RNA，用MdWOX11的引物检测是否为转基因苗，RNA水平检测(定量检测)引物MdWOX11-1的上游引物为：5’-AATGGCTTCTCTTTCTCAACACC-3’(SEQ ID NO.6)，下游引物：5’-AGACGAAGATGAAGAGCCCA-3’(SEQ ID NO.7)。DNA水平检测(半定量)引物MdWOX11-2如下：上游引物为：5’-ATGGAAGATCATCATCAAGGC-3’(SEQ ID NO.8)，下游引物：5’-AGTTGGTCTTGAAACCAGGAA-3’(SEQ ID NO.9)。定量检测的PCR扩增程序为：95℃预变性30S；95℃5S，60℃30S，72℃30S，40个循环；半定量检测的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s/1kp，35个循环。PCR扩增的结果如图3所示，其中A为MdWOX11过表达转基因株系DNA检测结果，其中WT是野生型GL3，H2O为无菌水代替cDNA的阴性对照，15#、16#和20#代表MdWOX11过表达转基因株系WOX11-OE-15#、WOX11-OE-16#和WOX11-OE-20#。B为野生型GL3、MdWOX11过表达转基因株系和MdWOX11干扰转基因株系RNA检测结果，WOX11-OE-15#、WOX11-OE-16#和WOX11-OE-20#代表MdWOX11过表达转基因株系；WOX11-RNAi-1#、WOX11-RNAi-2#和WOX11-RNAi-5#代表MdWOX11干扰转基因株系。
由图3中A可以得出：野生型‘GL3’(WT)和阴性对照(H2O为无菌水)中检测不到MdWOX11的条带，而过表达株系MdWOX11-OE-15#、MdWOX11-OE-16#和MdWOX11-OE-20#株系检测到了清晰的条带。由B可以得出：过表达MdWOX11转基因株系MdWOX11的表达水平是野生型‘GL3’的3～4倍，而干扰MdWOX11转基因株系MdWOX11-RNAi-1#、MdWOX11-RNAi-2#和MdWOX11-RNAi-5#,MdWOX11的表达水平只占野生型‘GL3’的18％～27％。
将获得的3个MdWOX11过表达株系和3个MdWOX11干扰株系以及野生型‘GL3’在扩繁培养基中培养6个月，将转基因株系扩繁到一定的数量，扩繁培养基配方为每升培养基加4.43g MS粉、30g蔗糖、7.8g琼脂、0.2mg 6-BA和0.2mg IBA。取生长至1.5cm高的MdWOX11转基因与野生型组培苗转移至生根培养基，生根培养基配方为每升培养基加2.215g MS粉、30g蔗糖、7.8g琼脂和0.2mg IBA。在生根培养基中培养30d后统计不定根生长表型。统计指标包括生根数与不定根发生率。不定根发生率计算公式为生成不定根的组培苗数目/组培苗总数×100％。将获得的不定根使用EPSONEXPRESSION 10,000xl型扫描仪(LA l600扫描仪，加拿大)扫描。并用仪器所带的软件分析不定根形态参数，包括根长、根表面积和根体积，获得的MdWOX11转基因株系以及野生型的不定根发生表型统计结果如图4所示，其中A为MdWOX11转基因株系及野生型GL3表型观察，B为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根数目统计，C为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根发生率统计，D为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根长度统计，E为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根表面积统计，F为MdWOX11转基因株系及野生型GL3不定根体积统计。
从图4可以看出，MdWOX11影响苹果不定根的形成，在‘GL3’中过表达MdWOX11(35S：MdWOX11-OE)促进苹果不定根形成。通过鉴定MdWOX11苹果转基因表型，发现转基因株系在生根培养基中培养30d时，过表达MdWOX11的转基因苹果株系WOX11-OE-15#、WOX11-OE-16#和WOX11-OE-20#不定根的数量远大于野生型‘GL3’(图4中A)，且WOX11-OE-15#的不定根数目高于WOX11-OE-16#和WOX11-OE-20#。而干扰MdWOX11会抑制不定根原基的产生，从而抑制不定根的发生，在生根培养基中培养30d后35S：MdWOX11-RNAi转基因植株中不定根数目明显低于野生型的‘GL3’(图4中B和C)。此外，不定根长度、不定根根表面积和不定根体积等指标统计与转基因植株表型观察相符，结果显示不定根长度、不定根生根率、不定根根表面积、不定根长度和根体积在过表达MdWOX11转基因株系中明显高于干扰MdWOX11转基因苹果株系(图4中D、E和F)。
由以上实施例结果可以得出，MdWOX11可以促进苹果不定根发生发育，尤其可以促进不定根的伸长、增加不定根的数目、表面积和体积。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种促进不定根发育的MdWOX11基因，其特征在于，所述MdWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的MdWOX11基因编码的MdWOX11蛋白，其特征在于，所述MdWOX11蛋白的氨基酸序列为：
SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述MdWOX11基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，用于制备所述重组表达载体的初始载体包括质粒载体。
5.一种工程菌，其特征在于，包括权利要求1所述的MdWOX11基因或权利要求3或4所述的重组表达载体。
6.由权利要求3或4所述表达载体转化的宿主细胞。
7.权利要求1所述的MdWOX11基因、权利要求3～5任一项所述的重组表达载体、权利要求5所述的工程菌或权利要求6所述的宿主细胞在下述Ⅰ～Ⅵ中任一项或多项中的应用：
Ⅰ：促进植物不定根的发生；
Ⅱ：促进植物不定根的伸长；
Ⅲ：增加植物不定根的数目；
Ⅳ：增加植物不定根的表面积和/或体积；
Ⅴ：调控不定根的发育；
Ⅵ：植物无性繁殖；
Ⅶ：辅助植物分子育种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物包括园艺作物。
9.一种培育不定根发育能力强的植物的方法，其特征在于，增加目的植物中MdWOX11基因的表达或提高目的植物中MdWOX11蛋白的含量，得到所述不定根发育能力强的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述增加目的植物中MdWOX11基因的表达或提高目的植物中MdWOX11蛋白的含量为通过向所述目的植物中导入所述MdWOX11基因实现的。
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