CN112409466B

CN112409466B - 蛋白质hda703在调控水稻产量中的应用

Info

Publication number: CN112409466B
Application number: CN201910773155.1A
Authority: CN
Inventors: 颜永胜; 方荣祥; 陈晓英; 王华彩
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2039-08-21
Also published as: CN112409466A

Abstract

本发明公开了蛋白质HDA703在调控水稻产量中的应用。向日本晴中导入提高蛋白质HDA703的表达量和/或活性的物质，得到T₀代转HDA703基因水稻；将该水稻连续自交三代，得到T₃代转基因水稻。向日本晴中导入抑制蛋白质HDA703的表达量和/或活性的物质，得到T₀代RNAi转基因水稻；将该水稻连续自交三代，得到T₃代RNAi转基因水稻。与日本晴相比，T₃代转基因水稻的抽穗期提前、株高显著降低、叶夹角和百粒重显著增加，T₃代RNAi转基因水稻的株高显著降低、叶夹角有一定程度的减小和百粒重显著增加。由此可见，蛋白质HDA703可以调控水稻产量、抽穗期、株高和叶夹角。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质HDA703在调控水稻产量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质HDA703在调控水稻产量中的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球有120多个国家种植水稻，栽培面积常年保持在1.5亿公顷以上，并有占世界50％比例的人口以稻米为主食。在人口持续增加和可种植耕地面积逐年减少的今天，提高水稻单产是保障世界粮食安全的有力措施之一。回顾半个多世纪以来的水稻育种史，我国水稻单产经历了两次飞跃，第一次是以矮化育种为标志的绿色革命，第二次是水稻杂种优势的利用。但近20年来，水稻单产一直停滞不前。

水稻农艺性状包括株高、分蘖、籽粒大小、抽穗时期等。一般来讲，水稻株高变矮，其收获指数(即种子与稻杆的比例)和产量均会提高；叶夹角变大有利于水稻的光合作用效率的提高，而叶夹角变小则可以提高植物的种植密度从而增加叶面积指数，因此叶夹角的变化均能够促进水稻产量的增加；分蘖数的多少直接影响水稻穗数的多少从而直接影响水稻的产量；籽粒大小作为决定种子重量的主要因素之一也是决定水稻产量的重要农艺性状；抽穗时期同样决定水稻是否能够达到产量最大化。另外，抽穗时间提前也有利于避免某些条件下植物疾病的传播，避免产量的损失。因此，改良水稻的农艺性状对于提高水稻的品质和产量具有重要的应用潜力。

与水稻农艺性状相关的基因已经有较多报道，且这些基因在改良水稻品质方面具有重要作用。直接改变与水稻农艺性状相关的基因的表达水平可能会造成过高或过低的结果，从而对农艺性状的改良造成不利影响。

发明内容

本发明的目的为提高水稻产量。

本发明首先保护蛋白质HDA703的应用，可为如下a1)-a4)中的至少一种：a1)调控植物产量；a2)调控植物抽穗期；a3)调控植物株高；a4)调控植物叶夹角。

上述应用中，所述蛋白质HDA703可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物产量和/或抽穗期和/或株高和/或叶夹角相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由510个氨基酸残基组成。

为了使b1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述b3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述蛋白质HDA703的核酸分子的应用，可为如下a1)-a4)中的至少一种：a1)调控植物产量；a2)调控植物抽穗期；a3)调控植物株高；a4)调控植物叶夹角。

上述应用中，编码所述蛋白质HDA703的核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的DNA分子：

c1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质HDA703的DNA分子；

c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质HDA703的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1533个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质HDA703的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质HDA703的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质HDA703，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质HDA703的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一所述的应用中，所述产量可为百粒重。

上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种日本晴。

本发明还保护一种培育转基因植物甲的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述蛋白质HDA703的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物相比，转基因植物甲的产量增加和/或株高降低和/或叶夹角增加和/或抽穗期提前。

上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中所述蛋白质HDA703的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入重组载体甲实现；所述重组载体甲可为向表达载体插入编码蛋白质HDA703的核酸分子，得到的重组质粒。

所述表达载体可为pCAMBIA1300载体。

所述重组载体甲具体可为重组质粒pCAMBIA1300-HDA703。所述重组质粒pCAMBIA1300-HDA703具体可为将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶XbaI和限制性内切酶SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

上述方法中，当出发植物为日本晴时，转基因植物甲的抽穗期提前具体可为抽穗期提前约25天。

本发明还保护一种培育转基因植物乙的方法，可包括如下步骤：降低出发植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物相比，转基因植物乙的产量增加和/或株高降低和/或叶夹角减小。

上述方法中，所述“降低出发植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低出发植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述“降低出发植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入抑制蛋白质HDA703表达的物质实现。

所述“抑制蛋白质HDA703表达的物质”具体可为重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703。所述重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703为将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶XbaI和限制性内切酶SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子，得到的重组质粒。

本发明还保护植物育种方法。

本发明所保护的植物育种方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质HDA703的表达量和/或活性，从而产量增加和/或株高降低和/或叶夹角增加和/或抽穗期提前。

上述方法一中，所述“增加植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性的效果。

本发明所保护的植物育种方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：降低植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性，从而产量增加和/或株高降低和/或叶夹角减小。

上述方法二中，所述“降低植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低植物中蛋白质HDA703的表达量和/或活性的目的。

上述任一所述的方法中，所述产量可为百粒重。

上述任一所述的方法中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种日本晴。

上述任一所述叶夹角具体可为稻穗和旗叶之间的夹角。

向水稻品种日本晴中导入实施例提及的重组质粒pCAMBIA1300-HDA703，得到T₀代转HDA703基因水稻；将T₀代转HDA703基因水稻连续自交三代，得到T₃代纯合转HDA703基因水稻。向水稻品种日本晴中导入实施例提及的重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703，得到T₀代RNAi转基因水稻；将T₀代RNAi转基因水稻连续自交三代，得到T₃代RNAi转基因水稻。与水稻品种日本晴相比，T₃代纯合转HDA703基因水稻的抽穗期提前、株高显著降低、叶夹角和百粒重显著增加，T₃代RNAi转基因水稻的株高显著降低、叶夹角有一定程度的减小和百粒重显著增加。由此可见，蛋白质HDA703在调控水稻产量、抽穗期、株高和叶夹角中具有重要的作用。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实时荧光定量检测T₂OE-4和T₂OE-5中HDA703基因的相对表达量。

图2为部分水稻植株的抽穗期表型和不同萌发时间下抽穗数的统计结果。

图3为部分水稻植株抽穗期的株高和叶夹角的统计结果。

图4为部分水稻植株的百粒重统计结果。

图5为RT-PCR检测T₂Ami-HDA703中HDA703基因的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验结果显示为平均值±标准差，student t检验，*P<0.05。

光暗交替培养即光培养和暗培养交替，条件为：14h光照培养/10h黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m²/s。

叶夹角具体是指稻穗和旗叶之间的夹角。

百粒重是指将随机选择的100粒种子42℃烘干至恒重的质量。

下述实施例中涉及的培养基如下：

YEB液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgSO₄·7H₂O 0.04g溶于1L去离子水，用10M NaOH水溶液调节pH至7.2，高温高压灭菌20min。

NMBi培养基：将10mL N6大量、1mL B5微量、1mL B5有机、5mLMSFe、2mg 2，4-D、500mg CH、2g肌醇和30g蔗糖溶于蒸馏水，然后加入l2.6g植物凝胶，用水定容至1L，调节pH值为5.5；121℃灭菌15min。

NMBs培养基：将10mL N6大量、1mL B5微量、1mL B5有机、5mL MSFe、2mg 2，4-D、0.5mg 6-BA、2mg KT、500mg脯氨酸、500mg谷氨酸、300mg CH、300mg cef、50mg hygB和30g蔗糖溶于蒸馏水，然后加入l2.6g植物凝胶，用水定容至1L，调节pH值为5.5；121℃灭菌15min。

NMBr培养基：将10mL N6大量、1mL B5微量、1mL B5有机、5mL MSFe、0.5mg 6-BA、0.5mg NAA、4mg KT、500mg脯氨酸、500mg谷氨酸、300mg CH、300mg cef、50mg hyg和30g蔗糖溶于蒸馏水，然后加入l2.6g植物凝胶，用水定容至1L，调节pH值为5.5；121℃灭菌15min。

MMBg培养基：将10mL N6大量、1mL B5微量、1mL B5有机、5mL MSFe和30g蔗糖溶于蒸馏水，然后加入8g Agar，用水定容至1L，调节pH值为5.5；121℃灭菌15min。

N6大量：含2.83g/L KNO₃、0.463g/L(NH₄)₂SO₄、0.4g/L KH₂PO₄、0.185g/L MgSO₄·7H₂O和0.166g/L CaCl₂·2H₂O的水溶液。

B5微量：含10mg/L MnSO₄·4H₂O、2mg/L ZnSO₄·7H₂O、3mg/L H₃BO₃、0.75mg/L KI、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.25mg/L NaMoSO₄·2H₂O和0.025mg/L CoCl₂·6H₂O的水溶液。

B5有机：含10mg/L维生素B1、1mg/L维生素B6、2.0mg/L甘氨酸、0.5mg/L烟酸和100mg/L肌醇的水溶液。

MSFe：含0.0746g/L Na₂·EDTA·2H₂O和0.0556g/L FeSO₄·7H₂O的水溶液。

实施例1、T₃代纯合转HDA703基因水稻的获得和农艺性状鉴定

一、重组质粒pCAMBIA1300-HDA703的构建

1、以水稻品种日本晴(以下简称日本晴)的2周苗为实验材料，先用TRIZOL试剂提取总RNA，然后用反转录酶进行反转录，得到日本晴的cDNA。

2、以日本晴的cDNA为模板，采用HDA703-XbaI：5′-CTCTAGAATGGACTACAAAGACGACGATGACAAG-3′(下划线为限制性酶切酶XbaI的识别位点)和HDA703-SacI：5′-CGAGCTCGCTGCTGGTGGGTTCGGTCATT-3′(下划线为限制性酶切酶SacI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1500bp的DNA片段。

3、用限制性内切酶XbaI和SacI酶切步骤2得到的DNA片段，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶XbaI和SacI酶切pCAMBIA1300载体(记载于如下文献中：Qu etal.，2007)，回收约10kb的载体骨架。

5、将酶切产物与载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA1300-HDA703。

将重组质粒pCAMBIA1300-HDA703进行测序。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1300-HDA703进行结构描述如下：将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶XbaI和限制性内切酶SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子(序列表中序列1所示的DNA分子即HDA703基因)，得到的重组质粒。

重组质粒pCAMBIA1300-HDA703表达序列表中序列2所示的蛋白质HDA703。

二、重组农杆菌的获得

将重组质粒pCAMBIA1300-HDA703导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1300-HDA703。

将pCAMBIA1300载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1300。

三、T₂代纯合转HDA703基因水稻的获得

将EHA105/pCAMBIA1300-HDA703转化日本晴，获得T₀代转HDA703基因水稻。具体步骤如下：

1、将EHA105/pCAMBIA1300-HDA703单克隆接种于20mL含50μmol/L卡那霉素和利福平50mg/L的YEB液体培养基，28℃、220rpm震荡培养12～16h，得到农杆菌菌液。将农杆菌菌液按2％(v/v)的比例接种于20mL含100μM乙酰丁香酮的YEB液体培养基，28℃、220rpm振荡培养8-12h，然后加入YEB液体培养基稀释，得到OD_600nm值为0.1的农杆菌侵染液。

2、完成步骤1后，将日本晴授粉后14天的幼胚浸泡于农杆菌侵染液，先28℃、80rpm略微摇动，再静置侵染10min；然后置于铺有一层灭菌滤纸的含100μM乙酰丁香酮的NMBi培养基上，25℃暗培养3天，得到愈伤组织。

3、完成步骤2后，取所述愈伤组织，用含40mg/L潮霉素(HygB)和500mg/L头孢霉素(cef)的NMBs培养基进行筛选(25℃光照交替培养，每15天继代一次)，得到抗性愈伤组织。

4、完成步骤3后，将所述抗性愈伤组织置于含30mg/L HygB的NMBr培养基上，25℃光照交替培养，得到小芽长至2-3cm的抗性芽。

5、完成步骤4后，将所述抗性芽置于含20mg/L HygB的MMBg培养基上，25℃光照交替培养，得到T₀代转HDA703基因水稻。将T₀代转HDA703基因水稻从固体培养基转至营养液中开放式培养。待生成新根后,将苗转入温室。

随机选取2个T₀代转HDA703基因水稻，分别命名为T₀OE-4和T₀OE-5。然后T₀OE-4和T₀OE-5连续两代自交，获得T₂代纯合转HDA703基因水稻，分别命名为T₂OE-4和T₂OE-5。

按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA1300-HDA703替换为EHA105/pCAMBIA1300，其它步骤均相同，得到T₂代转空载体水稻的植株，以下简称转空载体水稻。

四、实时荧光定量检测T₂OE-4和T₂OE-5中HDA703基因的相对表达量

1、分别将T₂OE-4、T₂OE-5、转空载体水稻和日本晴生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

2、采用Trizo1法分别提取待测样本的总RNA，然后反转录得到第一链cDNA，将该cDNA用无菌水稀释50倍作为模板，实时定量PCR检测HDA703基因的相对表达量(Actin基因为内参基因)。检测HDA703基因的引物为5′-TGCACCTAGCGTCCAATTTCA-3′和5′-TCATTTGGGTGAGCTTCCCG-3′。检测Actin基因的引物为5′-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3′和5′-ATCCAACCGGAGGATAGCATG-3′。

部分检测结果见图1(WT为日本晴)。结果表明，日本晴和转空载体水稻中HDA703基因的相对表达量无显著差异；与日本晴相比，T₂OE-4和T₂OE-5中HDA703基因的相对表达量均有不同程度的增加。

分别取T₂OE-4和T₂OE-5，自交，获得T₃代纯合转HDA703基因水稻，分别命名为T₃OE-4和T₃OE-5。

五、T₃代纯合转HDA703基因水稻的农艺性状鉴定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、将20粒待测水稻种子(T₃OE-4的种子、T₃OE-5的种子、转空载体水稻种子或日本晴种子)播种于大田，常规田间管理，得到待测水稻植株。

2、统计不同萌发时间下的抽穗数。

3、待待测水稻植株处于抽穗期，统计株高和叶夹角。

部分待测水稻植株抽穗期的表型见图2中A左图(WT为日本晴)。

日本晴不同萌发时间下的抽穗数统计结果见图2中B(横坐标为萌发天数)。

T₃OE-4不同萌发时间下的抽穗数统计结果见图2中C(横坐标为萌发天数)。

T₃OE-5不同萌发时间下的抽穗数统计结果见图2中D(横坐标为萌发天数)。

部分待测水稻植株的株高统计结果见图3中A(WT为日本晴)。

部分待测水稻植株的叶夹角统计结果见图3中B(WT为日本晴)。

结果表明，与日本晴相比，T₃OE-4和T₃OE-5的抽穗期均提前约25天，T₃OE-4和T₃OE-5的株高均显著降低，T₃OE-4和T₃OE-5的叶夹角均显著增加。日本晴和转空载体水稻的株高、抽穗期和叶夹角均无显著差异。

4、待待测水稻植株成熟后，统计百粒重。

部分待测水稻植株的百粒重统计结果见图4。结果表明，与日本晴相比，T₃OE-4和T₃OE-5的百粒重均显著增加。日本晴和转空载体水稻的百粒重无显著差异。

实施例2、T₃代纯合RNAi转基因水稻的获得和农艺性状鉴定

一、重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703的构建

以水稻miRNA528(OsmiR528)的序列作为改造骨架(序列来源参考如下文献：LiuB，Li P，Li X，Liu C，Cao S，Chu C，Cao X.(2005).Loss of function of OsDCL1affectsmicroRNA accumulation and causes developmental defects in rice.PlantPhysiology，139:296-305.)，利用Artifitial microRNA的方法构建重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703。具体步骤如下：

1、采用CTAB法提取日本晴的基因组DNA并以其作为模板，采用528-XbalF和528-SacIR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。该PCR扩增产物即为天然miRNA528前体。

引物的核苷酸序列如下：

528-XbalF：5’-CTCTAGACAGCAGCAGCCACAGCAAA-3’(下划线为限制性内切酶Xbal的识别位点)；

528-SacIR：5’-CGAGCTCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3’(下划线为限制性内切酶SacI的识别位点)。

2、完成步骤1后，以天然miRNA528前体为模板，采用528-XbalF和miR-a1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲；以天然miRNA528前体为模板，采用miR-s1和miR*a1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙；以天然miRNA528前体为模板，采用miR*s1和528-SacIR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物丙。

各个引物的核苷酸序列如下：

miR-a1：5’-tgCCGGAGTTGATCTGTATACTActgctgctgctacagcc-3’；

miR-s1：5’-agTAGTATACAGATCAACTCCGGcaggagattcagtttga-3’；

miR*a1：5’-aaTAGTATACAGAACAAGTCCGGagagaggcaaaagtgaa-3’；

miR*s1：5’-ctCCGGACTTGTTCTGTATACTAttcctgctgctaggctg-3’。

3、完成步骤2后，将PCR扩增产物甲、PCR扩增产物乙和PCR扩增产物丙混合并作为模板，采用528-XbalF和528-SacIR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、完成步骤3后，取所述PCR扩增产物，用限制性内切酶Xbal和SacI酶切，回收约260bp的酶切产物。

5、用限制性内切酶XbaI和SacI酶切pCAMBIA1300载体，回收约10kb的载体骨架。

6、将酶切产物与载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703。

将重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703进行测序。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703进行结构描述如下：将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶XbaI和限制性内切酶SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子，得到的重组质粒。

二、重组农杆菌的获得

将重组质粒pCAMBIA1300-Ami-HDA703导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1300-Ami-HDA703。

三、T₂代RNAi转基因水稻的获得

按照实施例1中步骤三的方法，将EHA105/pCAMBIA1300-HDA703替换为EHA105/pCAMBIA1300-Ami-HDA703，其它步骤均不变，得到T₀代RNAi转基因水稻。

随机选取1个T₀代RNAi转基因水稻，命名为T₀Ami-HDA703。然后T₀Ami-HDA703连续两代自交，获得T₂代纯合RNAi转基因水稻，命名为T₂Ami-HDA703。

按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA1300-Ami-HDA703替换为EHA105/pCAMBIA1300，其它步骤均相同，得到T₂代转空载体水稻的植株，以下简称转空载体水稻。

四、RT-PCR检测T₂Ami-HDA703中HDA703基因的相对表达量

1、分别将T₂Ami-HDA703、转空载体水稻和日本晴生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

2、采用Trizo1法分别提取待测样本的总RNA，然后反转录得到第一链cDNA，将该cDNA用无菌水稀释50倍作为模板，RT-PCR检测HDA703基因的相对表达量(Actin基因为内参基因)。检测HDA703基因的引物为5′-TGCACCTAGCGTCCAATTTCA-3′和5′-TCATTTGGGTGAGCTTCCCG-3′。检测Actin基因的引物为5′-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3′和5′-ATCCAACCGGAGGATAGCATG-3′。

部分检测结果见图5(WT为日本晴)。结果表明，日本晴和转空载体水稻中HDA703基因的相对表达量无显著差异；与日本晴相比，T₂Ami-HDA703中HDA703基因的相对表达量显著下降。

取T₂Ami-HDA703，自交，获得T₃代纯合RNAi转基因水稻，命名为T₃Ami-HDA703。

五、T₃代纯合RNAi转基因水稻的农艺性状鉴定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、将20粒待测水稻种子(T₃Ami-HDA703的种子、转空载体水稻种子或日本晴种子)播种于大田，常规田间管理，得到待测水稻植株。

2、统计不同萌发时间下的抽穗数。

3、待待测水稻植株处于抽穗期，统计株高和叶夹角。

部分待测水稻植株抽穗期的表型见图2中A右图(WT为日本晴)。

T₃Ami-HDA703不同萌发时间下的抽穗数统计结果见图2中E(横坐标为萌发天数)。

部分待测水稻植株的株高统计结果见图3中A(WT为日本晴)。

部分待测水稻植株的叶夹角统计结果见图3中B(WT为日本晴)。

结果表明，与日本晴相比，T₃Ami-HDA703的株高显著降低，叶夹角有一定程度的减小，抽穗期无显著差异。日本晴和转空载体水稻的株高、抽穗期和叶夹角均无显著差异。

4、待待测水稻植株成熟后，统计百粒重。

部分待测水稻植株的百粒重统计结果见图4。结果表明，与日本晴相比，T₃Ami-HDA703的百粒重均显著增加。日本晴和转空载体水稻的百粒重无显著差异。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 蛋白质HDA703在调控水稻产量中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

atggacccct cgtcggcggg cgcgggcggc aactcgctgg cgtcggcgtc gtgcggcgac 60

gcgcagaagc ggcgggtgtg ctacttctac gacccggagg tgggcaacta ctactacggt 120

cagggccacc cgatgaagcc ccaccgggtg aggatgaccc acgcgctgct cgcccactac 180

ggcctcctcg ccccggccaa gatggaggtg ctccgcccgc tccccgcccg cggcatcgac 240

ctctgccgct tccactccga cgactacgtc gccttcctcc gcgccgtcac cccggagacc 300

cagctcggcc aggtccgcgc cctccgccgc ttcaacatcg gcccggactg ccccgtcttc 360

gacggcctct acgcctactg ccagacctac gcgggggcct ccgtcggcgc cgccgtcaag 420

ctcaaccacg gcacccacga catcgccatc aactggtccg gcgggttgca ccacgccaag 480

aagtccgagg cctccggctt ctgctacgtc aacgacatcg tcctcgccat cctcgagctc 540

ctcaagctcc atgagcgagt tctgtatatt gatattgata tccatcatgg agatggagtt 600

gaggaggcat tctacacaac aaacagggtt atgacagtct catttcacaa gtttggggat 660

tatttcccgg gaacagggga tatccgcgac attgggtatt cagaagggaa gtattactgc 720

ctgaatgtcc cgctggatga tggaattgat gatgacagct accagtccat cttcaagccg 780

atcatcagca aagtcatgga gatgtatcgt cctggtgcag tcgtgcttca gtgcggcgct 840

gattcgttgt ccggtgatag gttgggctgt ttcaatctct cagggaaagg tcatgctgaa 900

tgtgttaagt tcatgaggtc tttcaatgtt ccgttgcttc ttcttggtgg tggtggatat 960

accataagaa atgttgcacg ctgctggtgt tacgagacag gagttgcact tggtgaagag 1020

ctacaggaga agttgcctta caatgagtat tatgaatatt ttggtccaga atacagtctt 1080

tacgttgcag caagtaacat ggagaacaga aatacaaaca agcaactgga ggaaataaaa 1140

tgcaatattc tggacaatct ttcaaaactt caacatgcac ctagcgtcca atttcaagag 1200

cgaattcctg aaacaaagct acctgagcca gatgaagatc aagaggatcc agatgaaagg 1260

cacgaccctg actctgatat ggtgttggat gatcacaaac ctacgggaca ctcagcaaga 1320

agccttattc acaacatcgg agtaaagaga gaaattactg aaacagagac caaagatcag 1380

catggtaaga gattaacaac cgaacataaa ggaccagaac cgatggcaga ggatcttggt 1440

tcctccaagc aagctcctac tgcggatgca aatgcggtgg ccgtcaacgc gccaggcaac 1500

gccaggaatg aaccgggaag ctcacccaaa tga 1533

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

Met Asp Pro Ser Ser Ala Gly Ala Gly Gly Asn Ser Leu Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ser Cys Gly Asp Ala Gln Lys Arg Arg Val Cys Tyr Phe Tyr Asp Pro

20 25 30

Glu Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro His

35 40 45

Arg Val Arg Met Thr His Ala Leu Leu Ala His Tyr Gly Leu Leu Ala

50 55 60

Pro Ala Lys Met Glu Val Leu Arg Pro Leu Pro Ala Arg Gly Ile Asp

65 70 75 80

Leu Cys Arg Phe His Ser Asp Asp Tyr Val Ala Phe Leu Arg Ala Val

85 90 95

Thr Pro Glu Thr Gln Leu Gly Gln Val Arg Ala Leu Arg Arg Phe Asn

100 105 110

Ile Gly Pro Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Ala Tyr Cys Gln

115 120 125

Thr Tyr Ala Gly Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Lys Leu Asn His Gly

130 135 140

Thr His Asp Ile Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Leu His His Ala Lys

145 150 155 160

Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala

165 170 175

Ile Leu Glu Leu Leu Lys Leu His Glu Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile

180 185 190

Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asn

195 200 205

Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Phe Gly Asp Tyr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Gly Asp Ile Arg Asp Ile Gly Tyr Ser Glu Gly Lys Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Leu Asn Val Pro Leu Asp Asp Gly Ile Asp Asp Asp Ser Tyr Gln Ser

245 250 255

Ile Phe Lys Pro Ile Ile Ser Lys Val Met Glu Met Tyr Arg Pro Gly

260 265 270

Ala Val Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu

275 280 285

Gly Cys Phe Asn Leu Ser Gly Lys Gly His Ala Glu Cys Val Lys Phe

290 295 300

Met Arg Ser Phe Asn Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr

305 310 315 320

Thr Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Cys Tyr Glu Thr Gly Val Ala

325 330 335

Leu Gly Glu Glu Leu Gln Glu Lys Leu Pro Tyr Asn Glu Tyr Tyr Glu

340 345 350

Tyr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Leu Tyr Val Ala Ala Ser Asn Met Glu

355 360 365

Asn Arg Asn Thr Asn Lys Gln Leu Glu Glu Ile Lys Cys Asn Ile Leu

370 375 380

Asp Asn Leu Ser Lys Leu Gln His Ala Pro Ser Val Gln Phe Gln Glu

385 390 395 400

Arg Ile Pro Glu Thr Lys Leu Pro Glu Pro Asp Glu Asp Gln Glu Asp

405 410 415

Pro Asp Glu Arg His Asp Pro Asp Ser Asp Met Val Leu Asp Asp His

420 425 430

Lys Pro Thr Gly His Ser Ala Arg Ser Leu Ile His Asn Ile Gly Val

435 440 445

Lys Arg Glu Ile Thr Glu Thr Glu Thr Lys Asp Gln His Gly Lys Arg

450 455 460

Leu Thr Thr Glu His Lys Gly Pro Glu Pro Met Ala Glu Asp Leu Gly

465 470 475 480

Ser Ser Lys Gln Ala Pro Thr Ala Asp Ala Asn Ala Val Ala Val Asn

485 490 495

Ala Pro Gly Asn Ala Arg Asn Glu Pro Gly Ser Ser Pro Lys

500 505 510

<210> 3

<211> 245

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

agcagcagcc acagcaaaat ttggtttggg ataggtaggt gttatgttag gtctggtttt 60

ttggctgtag cagcagcagt agtatacaga tcaactccgg caggagattc agtttgaagc 120

tggacttcac ttttgcctct ctctccggac ttgttctgta tactattcct gctgctaggc 180

tgttctgtgg aagtttgcag agtttatatt atgggtttaa tcgtccatgg catcagcatc 240

agcag 245

Claims

1.蛋白质HDA703的应用，为如下a1)或a2)：a1)使水稻抽穗期提前；a2)增加水稻叶夹角；

所述蛋白质HDA703为b1)或b2)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1中所述蛋白质HDA703的核酸分子的应用，为如下a1)或a2)：a1)使水稻抽穗期提前；a2)增加水稻叶夹角。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下c1)或c2)所示的DNA分子：

c1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

4.一种培育转基因水稻甲的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中权利要求1中所述蛋白质HDA703的表达量和/或活性，得到转基因水稻甲；与出发水稻相比，转基因水稻甲的百粒重增加和/或株高降低和/或叶夹角增加和/或抽穗期提前；

所述提高出发水稻中权利要求1中所述蛋白质HDA703的表达量和/或活性通过向出发水稻中导入重组载体甲实现；所述重组载体甲为向表达载体插入编码所述蛋白质HDA703的核酸分子，得到的重组质粒。

5.一种水稻育种方法，包括如下步骤：增加水稻中权利要求1中所述蛋白质HDA703的表达量和/或活性，从而百粒重增加和/或株高降低和/或叶夹角增加和/或抽穗期提前；所述增加水稻中权利要求1中所述蛋白质HDA703的表达量和/或活性通过向出发水稻中导入重组载体甲实现；所述重组载体甲为向表达载体插入编码所述蛋白质HDA703的核酸分子，得到的重组质粒。