CN111909941A

CN111909941A - 一种百合转录因子基因LrWRKY-L1及应用

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Publication number: CN111909941A
Application number: CN202010923728.7A
Authority: CN
Inventors: 符勇耀; 杨利平; 贺影; 梁渝华; 刘春渝; 徐文姬
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN111909941B

Abstract

本发明公开了一种百合转录因子基因LrWRKY‑L1及应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过生化染色分析发现该基因促进过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂ ^‑）的积累，从而影响ROS信号途径，进而调控叶片衰老进程。将该基因过表达后，过表达株系材料表现出了典型的提前衰老及其对灰葡萄孢菌更加敏感的表型。本发明提供了一个可以同时调控叶片衰老和灰霉病菌抗性的百合LrWRKY基因，通过对该基因及其同源基因的定向敲除或抑制表达技术不仅可以有效减缓百合或其它植物叶片的衰老，而且增强它们对灰霉病的抗性。因此，为植物新品种的遗传改良提供了更优的选择，具有重要的应用价值。

Description

一种百合转录因子基因LrWRKY-L1及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及一种百合转录因子基因LrWRKY- L1及应用。

背景技术

衰老是普遍存在于生物界的生理现象，是生物的某些器官或整个个体生理功能渐渐衰退直至最终死亡的过程。叶片是高等植物进行光合作用的器官，也是作物产量潜力的重要来源。一旦叶片开始衰老，叶片对整个植物体的贡献就开始下降。叶片衰老可能因某些内部因素或不均匀的环境变化而过早发生。百合是全世界知名的球根花卉，在国内外花卉市场上均占有非常重要的地位。同时百合也是重要的蔬菜，具有着重要的经济价值。在百合中，过早衰老导致百合产量降低和观赏性差，因此对百合的产量和质量有重要影响。

植物真菌病害一直以来也是在农业生产中是一个非常棘手的问题，尤其是灰霉病，灰霉病是由半知菌亚门葡萄孢属灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的死体营养型真菌病害，可为害番茄、黄瓜、葡萄、草莓等果蔬以及一些花卉作物，由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)病原真菌在百合中引起的百合叶枯病，危害很大，且传播速度快，产量损失高达20％～50％，严重影响作物的产量和经济效益。目前对灰霉病的防治主要是化学防治和农业防治，但灰葡萄孢菌具有繁殖生长迅速和遗传变异量巨大的特点，容易受环境和寄主的影响而产生新的变异，导致其对许多大量施用的化学药剂产生非常严重的多重耐药性。这不但使防治效果均不理想，而且造成一定程度的环境污染和药物残留。

转录因子在高等植物生长发育和应对外界环境条件变化中发挥着重要作用，并且它们通常以转录因子超家族的形式存在于高等植物中。WRKY家族是最大的转录因子家族之一。WRKY转录因子因含有一段高度保守的七肽序列WRKYGQK而被定义，该序列由60多个氨基酸残基组成，后来简称为WRKY转录因子家族。研究发现，WRKY 是一类广泛参与植物次生代谢调控、胁迫应答反应以及植物生长发育的一类转录因子超家族，在生物及非生物防御反应中具有重要的调控作用。

岷江百合(Lilium regale Wilson)是百合科百合属中重要的野生种质资源，广泛分布于我国四川岷江流域(杨利平和符勇耀著，中国百合资源利用研究[M]，哈尔滨：东北林业大学出版社,2018.11)。相对于模式植物，岷江百合的生长发育调控机制具有复杂性和特殊性。前人研究表明，岷江百合对百合真菌病和病毒病具有较强的抗性，并且证明多个WRKY转录因子与逆境胁迫相关。如发明专利CN110818783A公开了一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY2及应用，超表达LrWRKY2的转基因烟草对稻黑孢霉、茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、人参链格孢的侵染具有高水平的抗性。岷江百合 LrWRKY4和LrWRKY12 基因在拟南芥中过表达具有抵抗灰霉菌入侵的生物学功能（Qi Cui et al., Analysis of WRKYtranscription factors and characterization of two Botrytis cinerea-responsiveLrWRKY genes from Lilium regale, Plant Physiology and Biochemistry, 2018,127:525-536）。发明专利CN111235165A公开了岷江百合LrWRKY-S1基因在拟南芥中过表达导致植物对灰霉菌等真菌更加的敏感。鉴于此家族基因的重要作用，对于不同WRKY转录因子在植物生长过程中的具体作用显然需要进一步研究和探讨。

在过去的十几年中，通过在模式植物拟南芥和水稻中大量的遗传和基因组研究，人们已经在叶片衰老的分子机制上取得了重大进展，发现了WRKY转录因子调控衰老相关基因，但在百合中研究较少，并且，目前在百合中同时具有调控叶片衰老和真菌抗性的WRKY基因未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种百合转录因子基因LrWRKY-L1及应用，为百合属叶片衰老和灰霉病抗性的遗传改良提供更优越的选择。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种百合转录因子基因LrWRKY-L1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

本发明还提供了百合转录因子基因LrWRKY-L1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

本发明还提供了一种含有百合转录因子基因LrWRKY-L1的植物表达载体。

本发明还提供了一种含有百合转录因子基因LrWRKY-L1的宿主细胞。

本发明还提供了百合转录因子基因LrWRKY-L1的应用，为如下（1）、（2）、（3）、（4）或（5）；（1）提高植物抗灰葡萄孢菌的能力，（2）调控植物叶片发育，（3）延缓叶片衰老，（4）抑制叶片黄化，（5）抑制叶片过敏性坏死。具体包括以下步骤：通过在目的植物中沉默/抑制核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的LrWRKY-L1基因或其同源基因的表达。

作为优选的，所述植物为百合、烟草或拟南芥。

本发明还提供了一种防治植物灰霉病的方法，包括：通过敲除目的植物中如SEQIDNO.1所示的LrWRKY-L1基因或其同源基因来降低灰霉病菌的侵染能力。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明首次从岷江百合中克隆获得LrWRKY-L1基因的全长序列，并获得其编码的氨基酸序列。通过生化染色分析发现该基因促进过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂ ^-）的积累，从而影响ROS信号途径，进而调控叶片衰老进程。将该基因过表达后，过表达株系材料表现出了典型的提前衰老（叶片黄化及过敏性坏死）及其对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌更加敏感的表型。该研究首次揭示了一个同时调控叶片衰老和真菌抗性的百合LrWRKY基因，为通过分子手段如基因敲除或反向抑制等培育延迟叶片衰老且抗真菌病害的百合新品种奠定基础。本发明可以通过对一个WRKY基因的编辑可以实现植物育种的双重目标，为植物新品种的遗传改良提供了更优的选择，尤其对百合属植物叶片发育的遗传改良提供了理论和技术支持，因此具有重要的应用价值。

附图说明

图1 为PCR扩增岷江百合LrWRKY-L1基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DL 2000DNA Marker(大连宝生物)；泳道1为LrWRKY-L1基因。

图2 为岷江百合LrWRKY-L1蛋白与不同植物中13个保守WRKY蛋白的序列比对，其中1为保守的WRKYGQK序列，2为锌指结构基序（C-X₇-C-X₂₃-H-X₁-C），3为核定位信号序列RLTTKKRRTM。

图3 为岷江百合LrWRKY-L1蛋白与不同植物中13个保守WRKY蛋白的进化树分析图，分枝上的数字表示聚类支持率。

图4 为LrWRKY-L1基因在岷江百合组织的PCR表达分析；A为在不同组织中的定量PCR表达分析，B为在叶片发育不同时期的半定量PCR表达分析，不同字母代表显著性差异（采用Duncan检验：P<0.05）,下同。

图5 为岷江百合LrWRKY-L1蛋白的亚细胞定位分析；上组图从左到右依次分别为实验组（35S::GFP-LrWRKY-L1）在白光下明场图、激发光下暗场图和组合图，下组图从左到右依次分别为对照组（35S::GFP）在白光下明场图、激发光下暗场图和组合图；“—”代表标尺 50μm。

图6 为转基因烟草瞬时转化4天后的表型图；A为对照组（转化35S::GFP），B和C为2组独立的实验组（转化35S:: GFP-LrWRKY-L1），箭头表示有斑点坏死，圆圈表示注射点。

图7 为转基因烟草叶片侵染4天后的叶绿素含量分析图。

图8 为转基因烟草叶片侵染4天后的DAB和NBT染色分析，A为DAB染色对照组（转化35S::GFP），B和C为DAB染色中2组独立的实验组（转化35S:: GFP-LrWRKY-L1），箭头表示注射点附近被染成棕红色；D为NBT染色对照组（转化35S::GFP），E和F为NBT染色中2组独立的实验组（转化35S:: GFP-LrWRKY-L1），箭头表示注射点附近被染成蓝色。

图9 为烟草叶片侵染4天后的灰葡萄孢菌抗性分析；A为对照组（转化35S::GFP），B和C为2组独立的实验组（转化35S:: GFP-LrWRKY-L1），圆圈内表示被灰葡萄孢菌腐蚀面积。

图10 为野生型和转基因拟南芥叶片的表型图，A为野生型拟南芥，B、C和D代表3个独立的转基因拟南芥株系，箭头表示黄化和衰老的叶片。

图11 为野生型和转基因拟南芥的分子水平检测；A为野生型和转基因拟南芥叶片的叶绿素含量分析图，B为LrWRKY-L1在转基因拟南芥中半定量PCR分析图；其中WT为野生型，OX-L1、OX-L2和OX-L3为3个代表的转基因拟南芥株系，下同。

图12 为转基因拟南芥离体叶片抑菌活性效果图；A为灰葡萄孢菌侵染拟南芥离体叶片2天后的表型图；B为灰葡萄孢菌对叶片的腐蚀面积比较分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1 岷江百合LrWRKY-L1基因克隆与序列分析

以岷江百合现蕾期叶片为材料，采用TRIzol™ Plus RNA Purification Kit(12183555，Invitrogen™)，按说明书步骤提取总RNA，利用DNase I (18047019，Invitrogen™) 去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0 μg岷江百合叶片总RNA，按照PrimeScript II first-strand cDNAsynthesis kit (6210A, Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。

PCR扩增体系：高保真扩增酶Prime STAR HS (R010A, TaKaRa) 0.2μL，5×PrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 5μL，正向引物(LrWRKY-L1-F, 10μM) 0.5μL，反向引物(LrWRKY-L1-R, 10μM) 0.5μL，模板(cDNA) 1μL，dNTP (2.5mM) 2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

正向引物和反向引物为：

LrWRKY-L1-F: 5’-CCTGACAGACATGGAGAACGAGG-3’

LrWRKY-L1-R: 5’-GCTCTGCAAACTCTTAGGAAAACTGG-3’

PCR反应程序为：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min，35个循环；72℃，10min。

获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，在1 kb左右可以观察到一条特异性的扩增条带（图1）。按照胶回收试剂盒（9672，Takara）纯化后备用。

利用平末端加A试剂将纯化的DNA片段加A，通过TA克隆将其与pMD20-T vector（6019，Takara）相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有氨苄霉素（100mg/L）的LB培养板上挑取2-3个阳性克隆测序进行测序分析，结果表明，岷江百合LrWRKY-L1基因全长序列如SEQ ID NO.1所示，包括924bp的开放阅读框（不含终止密码）和下划线部分的部分5’-UTR或3’-UTR序列，全长950bp。

根据SEQ ID NO.1所示序列，将924bp的开放阅读框通过DNAman软件翻译，获得岷江百合LrWRKY-L1的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示，含有308个氨基酸（*表示终止信号）。将LrWRKY-L1全长氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，获得13个相似度较高的序列。通过序列比对分析发现，它们含有保守的WRKY结构域（WRKYGQK）和锌指结构基序（C-X₇-C-X₂₃-H-X₁-C），属于第III类WRKY转录因子（图2）。通过进化树比对分析表明，LrWRKY-L1与经过转录组测序分析获得的拼接序列麝香百合LlWRKY53（GenBank: QIL87967.1）和岷江百合LrWRKY55（GenBank: AYU71102.1）同源性较高（图3）。通过cNLS Mapper在线预测表明，在LrWRKY-L1蛋白的N端具有核定位信号序列（RLTTKKRRTM）。从以上结果来看，LrWRKY-L1基因为岷江百合LrWRKY家族的新成员。

实施例2 LrWRKY-L1基因的组织表达特异性分析

以现蕾期岷江百合为材料，取不同组织（根、茎、叶、花和鳞茎外层鳞片）分别用液氮磨样，采用Trizol试剂（Invitrogen™），按说明书步骤提取总RNA，利用PrimeScript^TM RTreagent Kit with gDNA Eraser (PR047A,TaKaRa) 反转录获得cDNA，以百合18S基因为内参，并用SYBR Premix Ex Taq^TM II(PR820A, TaKaRa)试剂进行定量RT-PCR检测，分析LrWRKY-L1基因在百合各组织中的表达水平。

检测18S基因引物为：

18S-F：5’- CGCAAGGCTGAAACTTAAAGG -3’

18S-R：5’- CAGACAAATCGCTCCACCAAC -3’

检测LrWRKY-L1基因的引物为：

LrWRKY-L1-QF: 5’- CCTCTCCATCCTTACTGTTTCC -3’

LrWRKY-L1-QR: 5’- GTTCTCCTCCCAGATGTTATCC -3’

以根中LrWRKY-L1基因表达水平为参照，相对表达水平采用2^−ΔΔCt方法（Livak KJ,Schmittgen TD, 2001. Analysis of relative gene expression data using realtimequantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 25, 402–408）分析计算。结果显示（图4A），LrWRKY-L1基因在叶片组织中最高水平的表达，表明该基因在岷江百合叶组织发育过程中可能具有重要调控作用。

以岷江百合幼苗期叶片、现蕾期成熟叶片和果实成熟期黄化叶片为材料，按上述方法提取总RNA，反转录cDNA，并对LrWRKY-L1基因进行半定量RT-PCR分析，结果显示（图4B），随着叶片组织的发育，LrWRKY-L1基因表达水平逐渐增加，特别在黄化的叶片中表达水平最高，表明该基因可能参与叶片衰老的调控。

实施例3 GFP融合表达载体构建及亚细胞定位分析

根据pTF101-GFP载体序列和LrWRKY-L1基因全长序列（SEQ ID NO .1），设计正向引物（LrWRKY-L1-GFP-F）和反向引物（LrWRKY-L1-GFP-R）。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，进行LrWRKY-L1基因片段的PCR扩增。

所述引物序列如下：

LrWRKY-L1-GFP-F:

5’-CCGGAAGCTTATGGAGAACGAGGAGAATCCACT-3’

LrWRKY-L1-GFP-R:

5’-GCGGGATCCTTAGGAAAACTGGAAACTGGGGT-3’

下划线处为引入的酶切位点。

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS (R010 A , TaKaRa) 0.5μL，5xPrimeSTAR Buffer (Mg²⁺Plus) 10μL，引物LrWRKY-L1-GFP-F (10μM) 1μL，引物LrWRKY- L1-GFP-R (10μM) 1μL，模板(50倍稀释的质粒) 1μL，dNTP (2.5mM) 4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min，36个循环；72℃, 7min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后用HindIII和BamHI双酶切处理，酶切体系为：PCR扩增产物10μL；HindIII 0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 10xK 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应12h。按照胶回收试剂盒（9672，Takara）步骤回收纯化，即获得LrWRKY-L1目的基因片段。

用HindIII和BamHI双酶切处理pTF101-GFP表达载体。酶切体系为：pTF101-GFPvector 5μL；HindIII 0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 10xK 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pTF101-GFP载体片段。

利用T4连接酶（M0202S，NEB）构建pTF101-P35S::GFP- LrWRKY-L1融合表达载体，反应体系为：回收的LrWRKY-L1目的片段 50ng；pTF101-GFP载体片段 25ng；10x T4 DNALigase buffer 2μL；T4 DNA Ligase 1μL；无菌ddH2O补足至20μL。室温22-25℃反应15min。65℃反应10min。按照分子克隆实验指南将上述连接反应产物转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有壮观霉素（Spec，100 mg/L）的筛选培养板上，通过阳性克隆测序，获得正确的含LrWRKY-L1基因片段的重组表达载体pTF101-P35S::GFP-LrWRKY-L1。重组表达载体中报告基因GFP与目的基因LrWRKY-L1的5’端融合后，位于组成型启动子P35S下游，形成融合表达；LrWRKY-L1的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止融合基因的转录。报告基因GFP经过蓝光激发，无需辅助因子和底物就能发出绿色荧光，作为报告基因可以检测目的基因表达情况。

通过常规冻融法将构建的重组表达载体pTF101-P35S::GFP-LrWRKY-L1转入农杆菌菌株EHA105中，通过PCR筛选阳性克隆。以含有pTF101-GFP质粒的农杆菌菌株为阳性对照，按照（孙蔓莉等，农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究，西北农业学报，2015，24（1）：161-165）方法制备农杆菌注射缓冲液。选择光照培养箱中正常生长具有8-10片叶子完全展开的烟草进行注射，用去除针头的注射器将注射缓冲液缓慢推入叶片背面。然后，把转化后的植株重新放回培养箱中，培养36h-48h后进行观察。

用剪刀小心剪下转化后的烟草叶片放在载玻片上，加1滴蒸馏水，制成装片；然后放在荧光显微镜上，在激发光波长488-507nm的蓝光下，进行荧光观察。结果显示（图5），对照组在烟草表皮细胞的细胞核和细胞膜上均有荧光表达，而实验组只在烟草表皮细胞的细胞核上特异性表达。以上结果表明，岷江百合LrWRKY-L1是1个核定位的蛋白，与其作为转录因子在细胞核中发挥转录激活或抑制功能相符。

实施例4 烟草瞬时转化的表型观察及灰葡萄孢菌抗性分析

将实施例3中转化后的烟草在光照培养箱中正常培养4天以后进行观察，结果显示（图6），转化pTF101-P35S::GFP-LrWRKY-L1的烟草叶片表现出黄化以及斑点状的坏死现象，而转化pTF101-P35S::GFP的烟草（对照组）为无异常。

采用常规生化方法，分别取转LrWRKY-L1基因烟草和对照烟草各0.1g基部对应叶片，加碳酸钙粉和石英砂少许，加入3-5mL 95%乙醇，研磨至组织变白；漏斗过滤，用少量乙醇冲洗研钵几次，一并加入漏斗过滤；滤液最终定容至10mL。以95%乙醇作为对照组，在波长OD₆₆₅nm和OD₆₄₉nm处分别测吸光值。然后根据叶绿素含量计算方法（胡秉芬, 黄华梨, 季元祖,赵晓芳, 戚建莉, 张露荷, 张广忠. 分光光度法测定叶绿素含量的提取液的适宜浓度. 草业科学, 2018, 35(8): 1965-1974.），检测烟草叶片中叶绿素含量，结果表明（图7），与对照烟草相比，转LrWRKY-L1基因烟草叶片中叶绿素含量显著降低。

采用DAB（二氨基联苯胺）和NBT（氮蓝四唑）染色法（Deepak Kumar et al.,Histochemical Detection of Superoxide and H₂O₂ Accumulation in Brassica junceaSeedlings, Vol 4, Iss 8, April 20, 2014. http://www.bio-protocol.org/e1108），分别检测转化烟草叶片中的过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂ ^-）含量，结果如图8所示，转LrWRKY-L1基因的烟草叶片被分别染出棕红色（图8 B，图8C）和蓝色（图8E，图8F），而对照组中烟草叶片（图8A，图8D）无明显的颜色改变。以上结果表明，LrWRKY-L1在烟草中的表达促进了叶片的黄化和过敏性坏死，并且LrWRKY-L1可能是通过诱导ROS的合成，如H₂O₂和O₂ ^-的积累引起叶片的衰老。

进一步将病原真菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）接种到PDA培养基（200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖）中，在28℃黑暗条件下培养1-2周。按照（Hou Ping-Fu andChen Chao-Ying, Early Stages of Infection of Lily Leaves by Botrytis elliptica and B. cinerea, Plant Pathology Bulletin 12:103-108, 2003）方法制备灰葡萄孢菌的孢子悬液，通过显微镜观察计数，获得约5×10⁴左右的浓度。以瞬时转化烟草4天后的叶片组织为材料，利用孢子悬液（30 µL）分别侵染烟草叶片，24h后观察灰霉病菌侵染情况，结果显示（图9），转LrWRKY-L1基因烟草叶片被灰葡萄孢侵染后发生腐蚀，而对照烟草没有发生腐蚀现象。因此表明，LrWRKY-L1基因在烟草中的表达导致其对灰霉病菌更加敏感。

实施例5 LrWRKY-L1基因过表达载体构建及转化拟南芥分析

根据pBI121载体序列和LrWRKY-L1基因序列（SEQ ID NO.1），设计引物LrWRKY-L1-inf-F和LrWRKY-L1-inf-R，引物中引入无缝克隆（In-fusion）载体接头序列（含酶切位点序列）。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，进行LrWRKY-L1基因片段的特异性扩增。

所述引物序列如下：

LrWRKY-L1-inf-F:

5’- GGACTCTAGAGGATCCCCTGACAGACATGGAGAACGAGG -3’

LrWRKY-L1-inf-R:

5’- GATCGGGGAAATTCGAGCTCGCTCTGCAAACTCTTAGGAAAACTGG -3’

其中，下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR反应体系为：高保真扩增酶PrimeSTAR HS (R010A, TaKaRa) 0.5μL，5xPrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 10μL，正向引物(LrWRKY-L1-inf-F, 10μM) 1μL，反向引物(LrWRKY-L1-inf-R, 10μM) 1μL，模板(50倍稀释的质粒) 1μL，dNTP (2.5mM) 4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；58℃，40s；72℃，1min，35个循环；72℃, 10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）的说明书步骤回收纯化，即获得目的基因片段。

用Bam HI和Sac I双酶切处理pBI121植物双元表达载体。酶切体系为：pBI121vector 5μL；BamHI 0.5μL；Sac I 0.5μL；Buffer 10XK 1μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pBI121载体大片段。

利用无缝克隆技术（In-fusion HD Cloning Kit，Takara）构建pBI121-P35S::LrWRKY-L1重组表达载体。

重组反应体系为：Purifed PCR fragment (回收的LrWRKY-L1片段) 50ng；Linearized vector (pBI121载体大片段) 100ng；5x In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。50℃反应15min。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有卡纳霉素（100 mg/L）的筛选培养板上，通过阳性克隆筛选和测序，获得正确的含LrWRKY-L1基因片段的重组表达载体pBI121-P35S::LrWRKY-L1。重组表达载体中目的基因LrWRKY-L1的5’端位于组成型启动子P35S下游，它能使LrWRKY-L1基因过量表达；LrWRKY-L1的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止基因的转录。在重组表达载体上组装有NPTII基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因NPTII整合至植物受体染色体上。

采用常规冻融法将构建的重组表达载体pBI121-P35S::LrWRKY-L1转入农杆菌菌株EHA105中，通过PCR筛选获得阳性克隆。拟南芥的遗传转化采用浸花法（Zhang X., et al., Nat Protoc. 2006, 1:641-646）。将携带pBI121-P35S::LrWRKY-L1载体的农杆菌导入哥伦比亚Col-0型拟南芥。用卡那霉素（100mg/L）筛选具抗性的拟南芥再生幼苗，采用CTAB法提取基因组DNA，用PCR扩增nptII基因（前引物为NptII-F:5'-TTGGGTGGAGAGGCTATTCGG-3'，后引物为NptII-R:5'-GCCACAGTCGATGAATCCAG-3'）以筛选阳性株系。以验证的转基因T0代拟南芥中收取种子，继续播种，直到获得T3代稳定株系。

观察土壤中生长约20天左右的拟南芥植株表型，结果如图10所示，LrWRKY-T1转基因植株外周叶片有3-4片表现为黄化或坏死，而野生型植株表现为正常绿色，仅有1-2片边缘略带黄化。根据实施例4中叶绿素测定方法，检测转基因和野生型拟南芥叶片中的叶绿素含量，结果表明（图11A），转基因拟南芥叶片中的叶绿素含量相对于野生型显著降低，与其表型一致。

进一步通过半定量RT-PCR鉴定得到表现型良好的转基因株系，采用MiniBESTPlant RNA Extraction Kit (9769，TaKaRa) 从叶片组织提取总RNA，利用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser (PR047A,TaKaRa) 反转录获得cDNA，以拟南芥AtActin基因（AT3G53750）为内参，通过半定量RT-PCR方法分析转基因阳性株系与野生型中LrWRKY-L1基因的表达水平。

检测Actin基因引物为：

AtActin-F: 5'- GTCTGGATTGGAGGATCCAT -3'

AtActin-R:5'- CCGGTGAACAATCGACGGGC -3'

检测LrWRKY-L1基因引物同实施例1中的引物。检测结果如图11B，在3个代表的转基因拟南芥（OX-L1、OX-L2和OX-L3）中检测到LrWRKY-L1基因的表达，而在野生型（WT）中无表达。该结果说明，LrWRKY-L1基因已经导入到拟南芥基因组，并成功转录表达。结合表型分析可以看出，LrWRKY-L1的过表达促进了叶片的衰老，LrWRKY-L1是叶片衰老的正向调控因子。

实施例6 转LrWRKY-L1基因拟南芥对灰霉病菌的抗性分析

将灰葡萄孢菌接种到PDA培养基（200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖）中，在28℃黑暗条件下培养1-2周。以光照培养箱中正常生长约1个月左右的野生型和转基因拟南芥为材料，利用打孔器将大小相等的新鲜真菌菌丝块分别接种到离体的莲座叶片上，在培养皿中保持湿度，于25℃左右继续培养，2天后观察病原真菌的侵染情况。结果如图12所示，野生型拟南芥（WT）的叶片在接种灰葡萄孢菌后，受伤害的病斑面积较小；而3个转LrWRKY-L1基因株系（OX-L1、OX-L2和OX-L3）的叶片接种以后，受腐蚀的病斑面积明显增加（图12A）。进一步统计分析结果表明， 3个独立的转基因株系叶片受伤害面积显著高于野生型植株（图12B）。以上结果表明，过表达LrWRKY-L1基因会使转基因材料对灰葡萄孢菌抗性显著降低，表现出更加敏感的表型。该结果与实施例4中结果一致。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 一种百合转录因子基因LrWRKY-L1及应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 950

<212> DNA

<213> 岷江百合（Lilium regale Wilson）

<400> 1

cctgacagac atggagaacg aggagaatcc actggttctc gagctcagca gattccagga 60

gctgtttaag gcctatctcc gtcagccctc gtccagtgag tcgctgataa tggagatgca 120

atcatccctt gacaagtcta tgtcattggc gagaaccagc gtcccggccg cccagcaacc 180

cacctccccc tcggatgtcg gggcaaggtt gacaaccaag aagaggagga caatggccaa 240

aactattggg caaagagtaa tggtgcaggt ggccggcgtt ggggtcgatg gacaactcgg 300

cgatggccat aactggagga agtacggcca gaagaatatc caatatgcca aatatcccag 360

gtgctactac cgctgtagtt atagtgaaac ccgcaactgc ccagcgagga aacaagtaca 420

gcaatctgat gagaatctat ccgctttcga gatcacttat atccagactc acacatgcta 480

tcctagtgaa gcccataact gtcctgcgga gaaacaagtg cagcaatctg acgagaatct 540

atccactttt gaagacactt atattcagac tcatacatgc taccctcctc cccaacaaaa 600

aatccccaat atcaatactg aagtttcaag ctctgatttg gcctctccat ccttattgtt 660

tccgaccact ccagagatct ggttggattc ctcggcaatt gacaattgct tcatgggtaa 720

cttctcgccc tcacccatct ctgcagaaat gtcagcaccg aactacttct cggtgtctga 780

atgggacatg agagagggac caagcctcca ggccaaaggc tccaactcgg ataacatctg 840

ggaggagaac tcagcagcca tttctccttt ccttggcatg gacatggact caatgctaaa 900

tccgggggag ttggacccca gtttccagtt ttcctaagag tttgcagagc 950

<210> 2

<211> 308

<212> PRT

<213> 岷江百合（Lilium regale Wilson）

<400> 2

MENEENPLVL ELSRFQELFK AYLRQPSSSE SLIMEMQSSL DKSMSLARTS VPAAQQPTSP 60

SDVGARLTTK KRRTMAKTIG QRVMVQVAGV GVDGQLGDGH NWRKYGQKNI QYAKYPRCYY 120

RCSYSETRNC PARKQVQQSD ENLSAFEITY IQTHTCYPSE AHNCPAEKQV QQSDENLSTF 180

EDTYIQTHTC YPPPQQKIPN INTEVSSSDL ASPSLLFPTT PEIWLDSSAI DNCFMGNFSP 240

SPISAEMSAP NYFSVSEWDM REGPSLQAKG SNSDNIWEEN SAAISPFLGM DMDSMLNPGE 300

LDPSFQFS 308

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgacagac atggagaacg agg 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctgcaaa ctcttaggaa aactgg 26

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccggaagctt atggagaacg aggagaatcc act 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgggatcct taggaaaact ggaaactggg gt 32

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcaaggctg aaacttaaag g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagacaaatc gctccaccaa c 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctctccatc cttactgttt cc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttctcctcc cagatgttat cc 22

<210> 11

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggactctaga ggatcccctg acagacatgg agaacgagg 39

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatcggggaa attcgagctc gctctgcaaa ctcttaggaa aactgg 46

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgggtggag aggctattcg g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccacagtcg atgaatccag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtctggattg gaggatccat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccggtgaaca atcgacgggc 20

Claims

1. 一种百合转录因子基因LrWRKY-L1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述百合转录因子基因LrWRKY-L1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

3.一种含有如权利要求1所述百合转录因子基因LrWRKY-L1的植物表达载体。

4.一种含有权利要求1所述百合转录因子基因LrWRKY-L1的宿主细胞。

5.如权利要求1所述百合转录因子基因LrWRKY-L1的应用，为如下（1）、（2）、（3）、（4）或（5）；（1）提高植物抗灰葡萄孢菌的能力，（2）调控植物叶片发育，（3）延缓叶片衰老，（4）抑制叶片黄化，（5）抑制叶片过敏性坏死。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，包括以下步骤：通过在目的植物中沉默/抑制核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的LrWRKY-L1基因或其同源基因的表达。

7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述植物为百合、烟草或拟南芥。

8.一种防治植物灰霉病的方法，其特征在于，包括：通过敲除目的植物中如SEQ IDNO.1所示的LrWRKY-L1基因或其同源基因来降低灰霉菌的侵染能力。