CN114457093A

CN114457093A - 一种岷江百合LrWRKY-R1基因及其应用

Info

Publication number: CN114457093A
Application number: CN202210168880.8A
Authority: CN
Inventors: 符勇耀; 赵洁淼; 吴娇; 雷美艳; 姜思佳; 焦丽; 徐文姬
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114457093B

Abstract

本发明公开了一种岷江百合LrWRKY‑R1基因及其应用，所述LrWRKY‑R1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过生化实验揭示，LrWRKY‑R1定位于细胞核，且具有转录激活活性。将该基因在拟南芥和百合中过表达后，研究其生物学功能，发现LrWRKY‑R1基因不仅提高植物对百合灰霉菌的抗性，而且具有调节木质素合成的双重功能，在植物的育种工作中发挥着重大作用，有助于提高植物的产量和品质。本发明为百合基因工程改良提供了一个优良的抗病基因，为培育广谱持久抗病的百合新品种或其它植物新材料提供了有力支撑，具有重要的理论和实际应用价值。

Description

一种岷江百合LrWRKY-R1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及一种岷江百合LrWRKY-R1基因及其应用。

背景技术

百合是国内外著名的花卉之一，也是重要的蔬菜，在国内外市场上均占有重要的份额。灰霉病害是十大植物真菌病害中位居第二的非常严重的病害，灰霉病菌危害了估计超200种以上的植物，受到研究者广泛的关注和重视。百合灰霉病是危害百合生产和采用各环节过程中的最为常见的病害之一。研究表明，百合灰霉病主要由两种病原真菌，即灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和椭圆葡萄孢(B.elliptica)(杜艳丽,曹兴,王桂清,等(2019)百合灰霉病病原菌鉴定及其部分生物学特性测定.南方农业学报,50:307-314)。百合植株在被灰霉菌感染后，通常表现为叶部枯死，花器褐腐，进而引起茎秆发黑，地下鳞茎减产，品质变劣(Cao X,Shi S,Zhang Z.(2018)First report of Botrytis leaf blight on lily(Lilium longiflorum)caused by Botrytis cinereain Beijing,China.Plant Dis,102:1033)。灰霉病最容易在湿热天气发生，一旦爆发，通常传播速度较快，根治困难。一般灰霉病发生时会造成20–40％的产量损失，在受感染严重区域引起完全失收。在农业生产上，主要通过种前消毒、喷施农药来减少百合灰霉病发生，但农药残留和环境问题等日益凸显。多年的实践表明，培育和应用百合抗病新品种是解决百合灰霉病害最有效、最经济和环保的措施。因此，关于百合抗灰霉菌关键基因的筛选、从基因水平上揭示百合抗灰霉病的分子机理，对于培育百合抗病品种具有着重要的理论和实践价值。

WRKY蛋白是植物最大的转录因子家族之一，在植物的生物逆境胁迫反应中扮演了重要的角色。研究发现，WRKY转录因子含有一段高度保守的七肽序列WRKYGQK而被定义，该序列由60多个氨基酸残基组成。WRKY转录因子的DNA结合域中一般还含有一个锌指结构。根据转录因子所含有WRKY结构域的个数和锌指结构特征，将WRKY转录因子分为3大类(EulgemT,Rushton PJ,Robatzek S,Somssich IE(2000)The WRKY superfamily of planttranscription factors.Trends Plant Sci 5:199–206)：第I类WRKY转录因子含2个WRKY结构域，且锌指结构的氨基酸组成为C2H2型，且DNA结合功能主要由C-末端的WRKY结构域介导。第II和III类WRKY因子通常含有一个WRKY结构域。第II类成员锌指结构也是C2H2型。第III类成员锌指结构与其他两组不同，结构模式为C2-HC型。第II组成员根据主要的氨基酸序列组成可分为IIa，IIb，IIc，IId和IIe(Zhang Y,and Wang L(2005)The WRKYtranscription factor superfamily:its origin in eukaryotes and expansion inplants.BMC Evol.Biol.5,1)。研究表明，WRKY因子主要通过调节SA、JA和乙烯(ET)等激素信号参与植物免疫反应，而有关WRKY因子调节对木质素合成的影响研究鲜有报道。

岷江百合(Lilium regale Wilson)是百合科百合属一种天然野生种质，广泛分布于我国四川岷江流域。研究表明，岷江百合对真菌和病毒具有高抗性，它被用于百合抗病分子机制研究(Gao X,Cui Q,Cao QZ,et al.(2017)Transcriptome-wide analysisofBotrytis elliptica responsive microRNAs and their targets in Lilium RegaleWilson by high-throughput sequencing and degradome analysis.Front Plant Sci,2017,8:753.)。目前已经从岷江百合中分离多个生物胁迫相关WRKY转录因子基因，包括LrWRKY1(申请号201610001896.4)、LrWRKY2(201911106106.9)、LrWRKY4(201911105589.0)和LrWRKY11(201911105582.9)等。然而，WRKY家族具有很多成员，目前这些基因还远远不够，特别是它们相关的抗病机制仍不清楚。从岷江百合中克隆抗病相关的WRKY转录因子基因，阐明其功能，并解析抗病相关的作用机制，为植物特别是百合抗病基因工程提供新靶标。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种岷江百合基因LrWRKY-R1及其应用，为培育百合乃至植物广谱持久的抗病新品种提供了一个新靶点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种岷江百合LrWRKY-R1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

本发明还提供了上述岷江百合LrWRKY-R1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

本发明还提供了含有上述LrWRKY-R1基因的生物材料，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒中的一种或多种。

本发明还提供了上述LrWRKY-R1基因或其编码蛋白或上述生物材料在提高植物对灰霉病抗性中的应用。

本发明还提供了上述LrWRKY-R1基因或其编码蛋白或上述生物材料在植物遗传育种或转基因植物制备中的应用。

本发明还提供了上述LrWRKY-R1基因或其编码蛋白或上述生物材料在调控植物木质素合成中的应用。

本发明还提供了一种提高植物抗病性的方法，所述方法包括向植物细胞中导入上述生物材料，提高植物中基因LrWRKY-R1的表达量。

进一步，所述植物对灰葡萄孢或椭圆葡萄孢产生抗性。

进一步，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。作为优选的，所述单子叶植物为百合属植物，所述双子叶植物为拟南芥或矮牵牛。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次克隆了岷江百合LrWRKY-R1基因全长序列，获得其编码的蛋白序列。生化实验表明，LrWRKY-R1定位于细胞核，且具有转录激活活性。将该蛋白在拟南芥和百合中过表达后，通过抑菌实验，研究该蛋白的生物学功能，发现该蛋白使得植物对2种百合灰霉菌，即灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和椭圆葡萄孢(B.elliptica)，具有显著高抗性。该研究不仅丰富了植物抗病基因库，为百合的遗传改良提供了一个关键的抗病基因，也为培育一种优质抗病新品种提供了新的选择。

2、本发明通过分子遗传学、生物化学和形态解剖学等方法表明，LrWRKY-R1基因不仅影响对百合灰霉菌的抗性，而且具有调节木质素合成的双重功能。细胞壁木质化是植物天然的基础防御机制，LrWRKY-R1过表达增加木质素合成将从基础水平增加植物细胞的抗性，为培育广谱持久的百合抗病品种提供了更优的选择。同时为解析百合抗灰霉病的分子机制奠定了重要基础。

附图说明

图1为岷江百合LrWRKY-R1转录因子的亚细胞定位分析；上组图从左到右依次分别为对照组在白光下明场图、激发光下暗场图和组合图；下组图从左到右依次分别为实验组在白光下明场图、激发光下暗场图和组合图。

图2为LrWRKY-R1因子的转录激活活性分析。

图3为转基因拟南芥基因组DNA的PCR扩增Npt II基因的电泳图；M为DNA Marker2000，N为空白对照，WT为野生型，L1～L4为拟南芥转基因株系。

图4为转基因植株中目的基因LrWRKY-R1的半定量PCR分析。

图5为过表达LrWRKY-R1转基因植株对灰葡萄孢抗性分析；A植株叶片接种灰葡萄孢处理3d后表型，标尺代表8mm；B植株叶片中灰葡萄孢腐蚀叶片面积，误差线代表3次重复实验±SE值,不同字母代表显著性差异,Duncan检验:p值<0.05。

图6为过表达LrWRKY-R1转基因植株对木质素合成的影响；A植株茎横切面Wiesner染色分析，标尺代表20μm；B拟南芥茎中木质素含量分析，误差线代表3次重复实验±SD值,不同字母代表显著性差异,Duncan检验:p值<0.05。

图7为在百合叶片中瞬时转化的GUS染色鉴定；WT为空白对照，pLGNe为注射含pLGNe质粒的农杆菌4d后百合叶片染色，LrWRKY-R1-OX为注射含pLGNe-35S::LrWRKY-R1载体的农杆菌4d后百合叶片染色，标尺代表1cm。

图8在百合叶片中瞬时过表达LrWRKY-R1对灰霉菌抗性的影响；A接种灰葡萄孢(B.cinerea)；B接种椭圆葡萄孢(B.elliptica)。

图9在矮牵牛叶片中瞬时过表达LrWRKY-R1对灰霉菌抗性的影响；A接种灰葡萄孢(B.cinerea)3d后的表型，标尺代表1.4cm；B灰葡萄孢腐蚀矮牵牛叶面积分析，误差线代表3次重复实验±SE值,星号代表Student’s T检验：**P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

课题组前期通过比较转录组测序分析，获得了多个灰霉菌诱导的WRKY基因，且其中一个关键基因被抗病相关激素茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)信号诱导高水平表达，命名为LrWRKY-R1。

实施例1岷江百合LrWRKY-R1基因克隆与序列分析

以岷江百合叶片为材料，采用TRIzol^TMPlus RNA Purification Kit(12183555，Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取总RNA，利用DNase I(18047019，Invitrogen^TM)去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg岷江百合叶片总RNA，按照PrimeScript II first-strand cDNAsynthesis kit(6210A,Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。

PCR扩增体系：高保真扩增酶Prime STAR HS(R010A,TaKaRa)0.25μL，5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，正向引物(LrWRKY-R1-F,10μM)0.5μL，反向引物(LrWRKY-R1-R,10μM)0.5μL，模板(DNA)1μL，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

正向引物和反向引物为：

LrWRKY-R1-F：5’-CCATGACTTCATCCTCAGGAAGC-3’

LrWRKY-R1-R：5’-TCAGCAAGGCAAGGAGTCGAG-3’

PCR反应程序：预变性95℃，5min；95℃，30s；60℃，40s；72℃，2min，38个循环；72℃，10min。

获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外光照射下，在1.7kb左右可以观察到一条特异性的扩增条带。按照胶回收试剂盒(9672，Takara)纯化后备用。

利用平末端加A试剂将纯化的DNA片段加A，通过TA克隆将其与pMD20-Tvector(6019，Takara)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有氨苄霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取2个阳性克隆测序进行测序分析，结果表明，岷江百合LrWRKY-R1基因全长序列如SEQID NO.1所示，包括1650bp的开放阅读框(含终止密码)。

根据SEQ ID NO.1，通过DNAman软件翻译，获得岷江百合LrWRKY-R1的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示，含有549个氨基酸(*表示终止信号)。将LrWRKY-R1全长序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与经过转录组测序分析获得的序列岷江百合LrWRKY25(KX842523.1)和麝香百合LlWRKY33(MK452772.1)相似，核苷酸序列相似度为76.30％(1259/1650)和53.30％(879/1650)，氨基酸序列相似度为77.23％(424/549)和53.01％(291/549)，从比对结果来看LrWRKY-R1基因为新基因。LrWRKY-R1蛋白含有2个典型的WRKY结构域(WRKYGQK)和Cys2His2(C2H2)锌指结构，属于WRKY家族I簇成员。

实施例2GFP融合表达载体构建及亚细胞定位分析

根据pTF101-GFP载体序列和LrWRKY-R1基因全长序列(SEQ ID NO.1)，设计正向引物(LrWRKY-R1-gfp-F)和反向引物(LrWRKY-R1-gfp-R)，引物中引入无缝克隆(In-fusion)载体接头序列和酶切位点序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，进行LrWRKY-R1基因片段的PCR扩增。

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.5μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板(50倍稀释的质粒)1μL，dNTP(2.5mM)4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

正向引物和反向引物序列如下：

LrWRKY-R1-gfp-F：5’-TTCCCCGGGCTCGAGAAGCTTATGACTTCATCCTCAGGAAGCATG-3’；

LrWRKY-R1-gfp-R：5’-TTATCTAGATCCGGTGGATCCGCAAGGCAAGGAGTCGAG-3’；

其中，LrWRKY-R1-gfp-F的加粗序列为Hind III酶切位点，LrWRKY-R1-gfp-R的加粗序列为Bam HI酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；60℃，40s；72℃，2min，38个循环；72℃,7min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)的说明书步骤回收纯化，即获得目的基因片段。

用HindIII和BamHI双酶切处理pTF101-GFP表达载体。酶切体系为：pTF101-GFPvector5μL；Hind III 0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 10XK 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pTF101-GFP载体片段。

利用无缝克隆技术(In-fusion HD Cloning Kit，Takara)构建35S::GFP-LrWRKY-R1重组表达载体。

重组反应体系为：

Purifed PCR fragment(回收的LrWRKY-R1目的片段)50ng；Linearized vector(pTF101-GFP载体)100ng；5X In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有壮观霉素(Spec，100mg/L)的筛选培养板上，通过阳性克隆测序，获得正确的含LrWRKY-R1基因片段的重组表达载体35S::GFP-LrWRKY-R1。重组表达载体中报告基因GFP与目的基因LrWRKY-R1的5’端融合后，位于组成型启动子35S下游，形成融合表达。报告基因GFP经过蓝光激发，无需辅助因子和底物就能发出绿色荧光，作为报告基因可以检测目的基因表达情况。

通过常规冻融法将重组表达载体35S::GFP-LrWRKY-R1转入农杆菌菌株EHA105中，通过PCR筛选阳性克隆。以含有pTF101-GFP质粒的农杆菌菌株为阳性对照，按照霍琳等(农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化,分子植物育种,2016,14(1):80-85)方法制备农杆菌注射缓冲液。选择光照培养箱中正常生长具有8-10片叶子完全展开的烟草进行注射，用去除针头的注射器将注射缓冲液缓慢推入叶片背面。然后，把转化后的植株重新放回培养箱中，培养36h-48h后进行观察。

用剪刀小心剪下重组表达载体35S::GFP-LrWRKY-R1成功转化后的烟草叶片放在载玻片上，加1滴蒸馏水，制成装片作为实验组；同时取空载体pTF101-GFP转化成功后的烟草叶片放在载玻片上，加1滴蒸馏水，制成装片作为对照组；然后将对照组和实验组分别放在荧光显微镜上，在激发光波长488-507nm的蓝光下，进行荧光观察，结果如图1所示。

从图中可以看出，对照组(上)中烟草表皮细胞的细胞核和细胞膜上均有荧光表达，而实验组(下)中只在烟草表皮细胞的细胞核上特异性表达。以上结果表明，岷江百合LrWRKY-R1是1个核定位转录因子蛋白，与大部分的WRKY转录因子表达定位情况相符。

实施例3BD载体构建和转录自激活活性分析

根据pGBKT7载体序列和LrWRKY-R1基因序列(SEQ ID NO.1)，设计引物LrWRKY-R1-BD-F(正向引物)和LrWRKY-R1-BD-R(反向引物)，引物中引入无缝克隆(In-fusion)载体接头序列和酶切位点序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，进行LrWRKY-R1基因片段的特异性扩增。

所述引物序列如下：

LrWRKY-R1-BD-F：

5’-ATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGATGACTTCATCCTCAGGAAGC-3’

LrWRKY-R1-BD-R：

5’-CCGCTGCAGGTCGACGGATCCTCAGCAAGGCAAGGAGTCGAG-3’

其中，LrWRKY-R1-BD-F的加粗序列为Nde I酶切位点，LrWRKY-R1-BD-R的加粗序列为Bam HI酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

用Nde I和BamH I双酶切处理pGBKT7载体。酶切体系为：pGBKT7vector5μL；NdeI0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 10XK 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pGBKT7载体片段。

利用无缝克隆技术(In-fusion HD Cloning Kit，Takara)构建LrWRKY-R1-BD表达载体。

重组反应体系为：

Purifed PCR fragment(回收的LrWRKY-R1目的片段)300ng；Linearized vector(Pgbkt7载体)500ng；5X In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有卡纳霉素(Kan，100mg/L)的筛选培养板上，通过阳性克隆测序，获得LrWRKY-R1-BD重组表达载体。将LrWRKY-R1-BD载体转化到酵母感受态细胞AH109，均匀涂布在缺陷培养基上作为实验组；同时将pGBKT7载体转化到酵母感受态细胞AH109均匀涂布在缺陷培养基上作为对照组；然后将实验组和对照组分别置于37℃培养，开展酵母转录激活实验，结果如图2所示。

从图中可以看出，实验组中酵母菌能够在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/-Ade上正常生长，且在SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal缺陷型平板上显示蓝色；而对照组中酵母菌仅能在缺陷培养基SD/-Trp上生长，而不能在缺陷培养基SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal平板上正常生长。以上结果表明：LrWRKY-R1蛋白具有转录激活活性。

实施例4过表达LrWRKY-R1基因载体构建及拟南芥的遗传转化

(1)构建pBI121-35S::LrWRKY-R1过表达载体

根据pBI121载体序列和LrWRKY-R1基因序列(SEQ ID NO.1)，设计引物LrWRKY-R1-inf-F1(正向引物)和LrWRKY-R1-inf-R1(反向引物)，引物中引入无缝克隆(In-fusion)载体接头序列和酶切位点序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，进行LrWRKY-R1基因片段的特异性扩增。

所述引物序列如下：

LrWRKY-R1-inf-F1:5’-GGACTCTAGAGGATCCATGACTTCATCCTCAGGAAGCATG-3’

LrWRKY-R1-inf-R1:5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCGCAAGGCAAGGAGTCGAG-3’

其中，LrWRKY-R1-inf-F1引物的加粗序列为BamHI酶切位点，LrWRKY R1-inf-R1引物的加粗序列为Sac I酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR反应体系为：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.5μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板(50倍稀释的质粒)1μL，dNTP(2.5mM)4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；60℃，40s；72℃，2min，38个循环；72℃,10min。

用Bam HI和Sac I双酶切处理pBI121植物双元表达载体。酶切体系为：pBI121vector5μL；BamHI 0.5μL；Sac I0.5μL；Buffer 10XK 1μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pBI121载体大片段。

利用无缝克隆技术(In-fusion HD Cloning Kit，Takara)构建35S::LrWRKY-R1重组表达载体。

重组反应体系为：

Purifed PCR fragment(回收LrWRKY-R1目的片段)50ng；Linearized vector(pBI121)100ng；5X In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有卡纳霉素(100mg/L)的筛选培养板上，通过阳性克隆筛选和测序，获得正确的含LrWRKY-R1基因片段的重组表达载体pBI121-35S::LrWRKY-R1。重组表达载体中目的基因LrWRKY-R1的5’端位于组成型启动子35S下游，它能使LrWRKY-R1基因过量表达；LrWRKY-R1 3’端组装有NOS终止子，可以有效终止融合基因的转录。在重组表达载体上组装有NPTII基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因NPTII整合至植物受体染色体上。

(2)农杆菌介导的拟南芥遗传转化

拟南芥的遗传转化采用浸花法(Zhang X.,et al.,Nat Protoc.2006,1:641-646)。将携带pBI121-35S::LrWRKY-R1载体的农杆菌导入哥伦比亚Col型拟南芥。用卡那霉素(100mg/L)筛选具抗性的拟南芥再生幼苗，获得转基因植株。采用CTAB法提取基因组DNA，用PCR扩增抗性标记基因检测转基因阳性植株。

正向引物和反向引物序列如下：

Npt II-F:5'-TTGGGTGGAGAGGCTATTCGG-3'

Npt II-R:5'-GCCACAGTCGATGAATCCAG-3'

PCR反应试剂选用大连宝生物(TaKaRa)产品(RR001A)，具体包括：DNA 1μL，10×Buffer(含20mM Mg²⁺)2μL，2.5mM/L dNTP 2μL，10uM/L正反向引物各0.5μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，13.8μLddH2O；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；12℃保存。

PCR检测结果如图3所示，在野生型植株(WT)中检测不到Npt II标记基因的存在，只有在L1、L2、L3和L4的4个转基因株系中扩增Npt II标记基因，表明重组表达框已经导入拟南芥转基因株系的基因组中。

进一步，通过半定量RT-PCR检测目的基因的表达情况。采用Trizol试剂(Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取拟南芥叶片总RNA，利用DNase I(Invitrogen^TM)去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂(Takara)并按照说明书步骤合成第一链cDNA。以拟南芥AtActin基因为内参。

AtActin基因引物为：

AtActin-F:5'-CACTTGCACCAAGCAGCATGAAGA-3'

AtActin-R:5'-AATGGAACCACCGATCCAGACACT-3'

目的基因引物为：

LrWRKY-R1-F：5'-CCATGACTTCATCCTCAGGAAGC-3'

LrWRKY-R1-R：5'-TCAGCAAGGCAAGGAGTCGAG-3'

结果如图4所示，在3个代表转基因株系(OX-L1、OX-L2和OX-L3)中目的基因LrWRKY-R1均为异源上调表达，而在野生型植株(WT)中检测不到LrWRKY-R1的表达，表明LrWRKY-R1已导入拟南芥基因组并成功转录表达。

实施例5转基因LrWRKY-R1株系的灰霉菌抗性

将病原真菌灰葡萄孢接种到PDA培养基(200g/L马铃薯，15g/L琼脂，20g/L葡萄糖)中，在28℃黑暗条件下培养1周。以温室中正常生长4周左右的野生型和转基因拟南芥为材料，利用打孔器将大小相等的新鲜真菌菌丝块分别接种到离体的莲座叶片上，在培养皿中保持湿度，放于光照培养箱正常培养，3d后观察病原真菌的侵染情况。结果如图5所示。

从图中可以看出，野生型(WT)拟南芥叶片在接种灰葡萄孢后受伤害的病斑面积较大；与野生型病斑面积相比，转LrWRKY-R1基因株系(OX-L1、OX-L2、OX-L3)的叶片受伤害的病斑面积从144mm²降低到约60mm²左右。表明过表达LrWRKY-R1基因会使转基因材料对灰葡萄孢抗性显著增加，表现出对灰霉菌的抗病特征。

实施例6：转基因LrWRKY-R1株系的木质素含量分析

将病原真菌灰葡萄孢接种到PDA培养基(200g/L马铃薯，15g/L琼脂，20g/L葡萄糖)中，在28℃黑暗条件下培养1周。以温室中正常生长4周左右的野生型和转基因拟南芥为材料，利用打孔器将大小相等的新鲜真菌菌丝块分别接种到离体的莲座叶片上，在培养皿中保持湿度，放于光照培养箱正常培养，观察土壤中生长约35天左右的拟南芥植株表型，相对于野生型植株，过表达LrWRKY-R1转基因植株无显著表型差异。取拟南芥植株第一节茎段材料，徒手横切后，采用间苯三酚染色方法(Li C.,et al.Plant Cell Physiol.2015,56(12):2436-2446.)对其进行木质素染色分析，结果如图6A所示。从图中可以看出，转基因拟南芥株系(OX-L1和OX-L2)中木质素染色比野生型(WT)对照更深。

采用溴化乙酰AcBr方法(Fu Y.,et al.Plant Physiol Biochem,2020,157:379-389)定量分析拟南芥植株茎段木质素含量，结果如图6B所示，转基因拟南芥株系(OX-L1和OX-L2)的木质素含量明显高于野生型拟南芥的木质素含量，木质素的含量提高了约60％，与木质素染色实验结果一致。表明过表达LrWRKY-R1能够促进木质素的合成。而细胞壁木质化是植物天然的基础防御机制，LrWRKY-R1过表达增加木质素合成将从基础水平增加植物细胞的抗性。

实施例7：LrWRKY-R1基因在百合叶片中的瞬时过表达功能验证

将实施例4中的重组质粒pBI121-35S::LrWRKY-R1和pLGNe载体(Li et al.,Horticul Res,2020,7:42)为模板，利用限制性内切酶HindⅢ和EcoRI(TaKaRa)分别进行双酶切，酶切体系为：pBI121-35S::LrWRKY-R1或pLGNe5μL；Hind III 0.5μL；EcoR I0.5μL；Buffer 10X M 1μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收35S::LrWRKY-R1表达框和pLGNe载体骨架。利用T4连接酶(NEB，M0202S)连接35S::LrWRKY-R1表达框和pLGNe载体骨架，按照分子克隆实验指南将上述连接反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有卡纳霉素(100mg/L)的筛选培养板上，通过阳性克隆筛选和测序，获得正确的重组表达载体pLGNe-35S::LrWRKY-R1，将其转化农杆菌EHA105备用。

百合叶片的瞬时转化方法参考Fu等(Plant Physiol Bioch,2020,157:380-382)方法。将携带pLGNe-35S::LrWRKY-R1载体和对照pLGNe载体的农杆菌分别转化百合叶片，4天后进行灰霉菌(B.cinerea和B.elliptica)接种，百合灰霉菌接种方法参考Zhang等(MolPla nt Pathol,2019,20:309-322)报道，将一致大小约4mm菌斑接种到注射叶片背面处，保湿后在光照培养箱正常培养。

分别取转化pLGNe-35S::LrWRKY-R1载体和pLGNe载体后并培养4天的百合叶片为材料，进行GUS化学染色分析，结果如图7所示。从图中可以看出，转化叶片(pLGNe或LrWRKY-R1-OX)均能染成蓝色，而空白对照(WT)中检测不到蓝色，表明百合叶片瞬时转化成功表达。

将接种灰霉菌(B.cinerea和B.elliptica)的百合培养5天后，观察灰霉菌的侵染情况，图8A和图8B分别是利用农杆菌注射百合叶片培养4d后，接种灰葡萄孢(B.cinerea)和椭圆葡萄孢(B.elliptica)处理5d后的百合叶片发病情况。从图中可以看出，过表达LrWRKY-R1的百合叶片(LrWRKY-R1-OX)上的灰葡萄孢(B.cinerea)和椭圆葡萄孢(B.ellipti ca)侵染面积均显著小于注射含pLGNe质粒的农杆菌的对照组(pLGNe)的病菌侵染面积。以上结果表明，在百合叶片中过表达LrWRKY-R1提高了对灰霉菌(B.cinerea和B.elliptica)的抗性，为百合抗病育种提供了重要的理论和实际应用基础。

实施例8：LrWRKY-R1基因在矮牵牛叶片中瞬时过表达分析

根据实施例7中的描述方法，将含pBI121-35S::LrWRKY-R1质粒的农杆菌和pBI121对照质粒的农杆菌分别转化矮牵牛叶片，然后接种灰葡萄孢(B.cinerea)3d后，观察矮牵牛叶片发病情况。结果如图9A所示，转化LrWRKY-R1矮牵牛叶片(LrWRKY-R1-OX)上灰葡萄孢(B.cinerea)侵染面积显著小于对照组(Control)的病菌侵染面积。与对照组相比(图9B)，转LrWRKY-R1叶片受伤害的病斑面积从185mm²降低到97mm²左右。该结果表明，在双子叶植物矮牵牛中过表达LrWRKY-R1同样提高了对灰霉菌的抗性，为其他花卉植物的抗病育种提供了参考和借鉴。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 长江师范学院

<120> 一种岷江百合LrWRKY-R1基因及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)

<400> 1

atgacttcat cctcaggaag catggagacg tcggccaact ctcggccggc cgccttttcc 60

ttctccccat cctccttctc tgacctcctc ggaggaacca tcgatgacga caccgatcac 120

cgctcgatgg ccggagcaac ccgagaattc attgaccact atggagtccc taccagctcc 180

gaccaaccaa agttcaagtc aatcccacct ccttcgctac cactgtcacc tcctcccttc 240

tccccttctt ctttcttctc cataccggcc ggactcagcc ccgccgtact cttggattcc 300

cccgcgatgc tctcctcctt tcacggccaa cagtctcaaa ccatagggaa cttcccccca 360

caaaatttca actggagggg cactcctact acctatgagc agcccatcaa agaggaggat 420

aggggctttc ccgatttctc ctttgatgaa gctttccgag gtcaccaaca acaatggaat 480

ctccaagatc caagaaacat catgaacgtc accccactcc aaacaattac tactgaggcc 540

ccaaccatgc aagctagcac tcaagccaac aatggtggct accaacctaa tatccaccac 600

catcctatcc aagctaccca gacgctgcag aggaagtcgg acgacggcta caactggcgg 660

aagtacgggc agaaacaggt gaaggggagc gagaatccac ggagctacta taagtgtaca 720

taccctaatt gccccacaaa gaagaaggtg gagaggaaca tagatgggca ggttactgag 780

attgtgtaca agggctccca caaccacccg aaacctcagt ccataagaag gaacaattca 840

tcctcctccc aagcaatcca aacttctgcc catgccgaaa catctgagaa ttcttttggt 900

ggccggtcag gcaatcagtt cgattctgtc accacgccag agaactcttc agcgtctttt 960

ggcgatgatg ataccaatat tcaaagaaca agcggcgacg aaggcgaaca agaagctaaa 1020

cgatggaagg gagaatgcga gaatgaggtg gtttccgctg ccggcaatag aacggtgaga 1080

gaaccaagag tggtggttca gactacaagt gatatcgata tcctcgacga tggatatcgc 1140

tggagaaagt atggacagaa ggtggtgaag ggaaacccta atccaaggag ctactacaag 1200

tgcacaagtg tgggttgccc cgtgaggaag catgtcgaga gggcgtcgaa tgatctaagg 1260

gcagtgatca caacatatga gggcaagcac aaccatgatg ttccccctgc ccgtgggagc 1320

ggggggcaag cagccagcag gctggcgacc gagaacaata acttcccgat ggcgatcaga 1380

ccatcagcca tgtccaacaa tcaccattat atgagtgata actctatgtt tggtgtgagg 1440

cctgataccc aagctccctt cgcgcttgag atgatgcaag ctcagagaaa ctatggattg 1500

tctgggtacg agaattcaat gaatccctac atgaatcatc agcagcagtc acagcagcaa 1560

caacaacaaa ggcagatgga caacatgttc cagaaagcga aagaggaacc gagggaggat 1620

gaattgtttc tcgactcctt gccttgctga 1650

<210> 2

<211> 549

<212> PRT

<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)

<400> 2

Met Thr Ser Ser Ser Gly Ser Met Glu Thr Ser Ala Asn Ser Arg Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Ser Phe Ser Pro Ser Ser Phe Ser Asp Leu Leu Gly Gly

20 25 30

Thr Ile Asp Asp Asp Thr Asp His Arg Ser Met Ala Gly Ala Thr Arg

35 40 45

Glu Phe Ile Asp His Tyr Gly Val Pro Thr Ser Ser Asp Gln Pro Lys

50 55 60

Phe Lys Ser Ile Pro Pro Pro Ser Leu Pro Leu Ser Pro Pro Pro Phe

65 70 75 80

Ser Pro Ser Ser Phe Phe Ser Ile Pro Ala Gly Leu Ser Pro Ala Val

85 90 95

Leu Leu Asp Ser Pro Ala Met Leu Ser Ser Phe His Gly Gln Gln Ser

100 105 110

Gln Thr Ile Gly Asn Phe Pro Pro Gln Asn Phe Asn Trp Arg Gly Thr

115 120 125

Pro Thr Thr Tyr Glu Gln Pro Ile Lys Glu Glu Asp Arg Gly Phe Pro

130 135 140

Asp Phe Ser Phe Asp Glu Ala Phe Arg Gly His Gln Gln Gln Trp Asn

145 150 155 160

Leu Gln Asp Pro Arg Asn Ile Met Asn Val Thr Pro Leu Gln Thr Ile

165 170 175

Thr Thr Glu Ala Pro Thr Met Gln Ala Ser Thr Gln Ala Asn Asn Gly

180 185 190

Gly Tyr Gln Pro Asn Ile His His His Pro Ile Gln Ala Thr Gln Thr

195 200 205

Leu Gln Arg Lys Ser Asp Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln

210 215 220

Lys Gln Val Lys Gly Ser Glu Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr

225 230 235 240

Tyr Pro Asn Cys Pro Thr Lys Lys Lys Val Glu Arg Asn Ile Asp Gly

245 250 255

Gln Val Thr Glu Ile Val Tyr Lys Gly Ser His Asn His Pro Lys Pro

260 265 270

Gln Ser Ile Arg Arg Asn Asn Ser Ser Ser Ser Gln Ala Ile Gln Thr

275 280 285

Ser Ala His Ala Glu Thr Ser Glu Asn Ser Phe Gly Gly Arg Ser Gly

290 295 300

Asn Gln Phe Asp Ser Val Thr Thr Pro Glu Asn Ser Ser Ala Ser Phe

305 310 315 320

Gly Asp Asp Asp Thr Asn Ile Gln Arg Thr Ser Gly Asp Glu Gly Glu

325 330 335

Gln Glu Ala Lys Arg Trp Lys Gly Glu Cys Glu Asn Glu Val Val Ser

340 345 350

Ala Ala Gly Asn Arg Thr Val Arg Glu Pro Arg Val Val Val Gln Thr

355 360 365

Thr Ser Asp Ile Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr

370 375 380

Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys

385 390 395 400

Cys Thr Ser Val Gly Cys Pro Val Arg Lys His Val Glu Arg Ala Ser

405 410 415

Asn Asp Leu Arg Ala Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His

420 425 430

Asp Val Pro Pro Ala Arg Gly Ser Gly Gly Gln Ala Ala Ser Arg Leu

435 440 445

Ala Thr Glu Asn Asn Asn Phe Pro Met Ala Ile Arg Pro Ser Ala Met

450 455 460

Ser Asn Asn His His Tyr Met Ser Asp Asn Ser Met Phe Gly Val Arg

465 470 475 480

Pro Asp Thr Gln Ala Pro Phe Ala Leu Glu Met Met Gln Ala Gln Arg

485 490 495

Asn Tyr Gly Leu Ser Gly Tyr Glu Asn Ser Met Asn Pro Tyr Met Asn

500 505 510

His Gln Gln Gln Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg Gln Met Asp Asn

515 520 525

Met Phe Gln Lys Ala Lys Glu Glu Pro Arg Glu Asp Glu Leu Phe Leu

530 535 540

Asp Ser Leu Pro Cys

545

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatgacttc atcctcagga agc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagcaaggc aaggagtcga g 21

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttccccgggc tcgagaagct tatgacttca tcctcaggaa gcatg 45

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttatctagat ccggtggatc cgcaaggcaa ggagtcgag 39

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atctcagagg aggacctgca tatgatgact tcatcctcag gaagc 45

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctgcagg tcgacggatc ctcagcaagg caaggagtcg ag 42

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggactctaga ggatccatga cttcatcctc aggaagcatg 40

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatcggggaa attcgagctc gcaaggcaag gagtcgag 38

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgggtggag aggctattcg g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccacagtcg atgaatccag 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cacttgcacc aagcagcatg aaga 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aatggaacca ccgatccaga cact 24

Claims

1.一种岷江百合LrWRKY-R1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述岷江百合LrWRKY-R1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述LrWRKY-R1基因的生物材料，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒中的一种或多种。

4.权利要求1所述LrWRKY-R1基因或其编码蛋白或权利要求3所述生物材料在提高植物对灰霉病抗性中的应用。

5.权利要求1所述LrWRKY-R1基因或其编码蛋白或权利要求3所述生物材料在植物遗传育种或转基因植物制备中的应用。

6.权利要求1所述LrWRKY-R1基因或其编码蛋白或权利要求3所述生物材料在调控植物木质素合成中的应用。

7.一种提高植物抗病性的方法，其特征在于，所述方法包括向植物细胞中导入权利要求3所述生物材料，提高植物中基因LrWRKY-R1的表达量。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述植物对灰葡萄孢或椭圆葡萄孢产生抗性。

9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述单子叶植物为百合属植物；所述双子叶植物为拟南芥或矮牵牛。