CN110923214A

CN110923214A - 抗病转TaM2K基因小麦的培育方法及其相关生物材料

Info

Publication number: CN110923214A
Application number: CN201911355826.9A
Authority: CN
Inventors: 张增艳; 王开
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110923214B

Abstract

本发明公开了抗病转TaM2K基因小麦的培育方法及其相关生物材料。本发明首先保护一种来源于小麦的抗纹枯病的重要激酶，命名为TaM2K蛋白，为由序列表中序列1或序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。编码TaM2K蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将TaM2K基因导入目的植物中，得到抗病性高于目的植物的转基因植物。本发明的培育抗病性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

Description

抗病转TaM2K基因小麦的培育方法及其相关生物材料

技术领域

本发明涉及抗病转TaM2K基因小麦的培育方法及其相关生物材料。

背景技术

全球40％以上人口以小麦作为主粮作物，因此小麦对于保障粮食安全起着举足轻重的作用。随着种植密度增加、肥水条件和耕作制度的改变，小麦纹枯病已发展为我国小麦生产的第一大土传病害，成为我国小麦高产稳产的重要限制因素。

小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)。我国小麦纹枯病主要由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的。纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产50％以上。据全国农技推广站报道，2005-2019年我国小麦纹枯病每年发生面积约1.0-1.3亿亩，经济损失达数十亿元以上。因此，选育和推广抗纹枯病小麦新品种，是防治该病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保障我国小麦安全生产和我国粮食安全非常重要。然而，由于缺乏易于利用的抗纹枯病的小麦种质资源，常规育种方法进行抗纹枯病的小麦育种的进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展，特别是抗病重要基因的分离克隆及功能研究的进步，为抗纹枯病小麦的遗传改良提供了一条新途径。植物抗性蛋白基因的分离克隆与功能分析，对高效地进行分子育种研究十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供抗病转TaM2K基因小麦的培育方法及其相关生物材料。

本发明首先保护一种来源于小麦的抗纹枯病的重要激酶，获自小麦CI12633，命名为TaM2K蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a4)将序列表的序列1或序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物纹枯病抗病性相关的蛋白质。

所述标签见表1。

表1标签的序列

TaM2K蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码TaM2K蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

编码TaM2K蛋白的基因命名为TaM2K基因。

TaM2K基因具体为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)的DNA分子：

(b1)编码区如序列表的序列2中第39-1145位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表的序列4中第106-1260位核苷酸所示的DNA分子；

(b4)序列表的序列4所示的DNA分子；

(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA分子杂交且编码所述TaM2K蛋白的DNA分子；

(b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述TaM2K蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明提供的TaM2K基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的TaM2K基因具有90％或者更高同一性的核酸，只要编码TaM2K蛋白且具有TaM2K蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

含有所述TaM2K基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组微生物均属于本发明的保护范围。

所述表达盒自上游至下游依次包括启动子、TaM2K基因和终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)，来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)，西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)，热休克启动子(美国专利5，187，267)，四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)，种子特异性启动子[如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))]。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。可用于本发明的终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子),花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子,tml终止子,豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

在本发明的实施例中，所述TaM2K基因表达盒中启动所述TaM2K基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子，终止所述TaM2K基因转录的终止子为胭脂碱合成酶基因终止子PloyA。

可用现有的植物表达载体构建含有TaM2K基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pWMB123、pAHC25、pAHC20、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在单子叶植物表达载体pWMB123的多克隆位点(例如BamHⅠ和SacⅠ酶切位点之间)插入TaM2K基因得到的重组质粒。

所述重组微生物的出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。

所述转基因植物组织或所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还保护TaM2K蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：

(c1)调控植物的抗病性；

(c2)调控小麦的抗病性；

(c3)提高植物的抗病性；

(c4)提高小麦的抗病性。

本发明还保护一种植物抗病剂，其活性成分为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)TaM2K蛋白；

(d2)TaM2K基因；

(d3)所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组微生物。

所述植物抗病剂可为植物抗纹枯病制剂。所述纹枯病可由禾谷丝核菌引起。所述禾谷丝核菌具体可为禾谷丝核菌WK207。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将TaM2K基因导入目的植物中，得到抗病性高于目的植物的转基因植物。

上述方法中，TaM2K基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

①修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

②与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

③与适合的转录终止子连接，也可以提高基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

④引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

TaM2K基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法,转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中TaM2K基因的表达，得到抗病性低于目的植物的转基因植物。

“抑制目的植物中TaM2K基因的表达”具体可通过导入干扰片段实现。所述干扰片段具体可如序列表的序列5所示。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中TaM2K蛋白的含量和/或活性，从而增加目的植物的抗病性。

本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaM2K基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦属植物。所述小麦属植物可为小麦，例如小麦扬麦16或小麦CI12633。

所述抗病性具体可为对纹枯病的抗病性。所述纹枯病可由禾谷丝核菌引起。所述禾谷丝核菌具体可为禾谷丝核菌WK207。

实验证明，使植物中的TaM2K蛋白水平增高(具体可为过表达TaM2K基因)可以显著增强植物的抗病性，降低植物中的TaM2K蛋白水平(具体可为抑制TaM2K基因表达)可以显著降低植物的抗病性。说明TaM2K基因是小麦抗纹枯病反应中抗病重要基因，正向参与小麦抗纹枯病反应。本发明的培育抗病性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

附图说明

图1为荧光定量PCR分析TaM2K基因受纹枯病菌诱导的表达情况。

图2为TaM2K基因在小麦不同器官受纹枯病菌诱导的情况。

图3为重组质粒pWMB123-TaM2KHIS的元件示意图。

图4为荧光定量分析TaM2K基因的转录水平。

图5为转TaM2K基因小麦的PCR检测。

图6为qRT-qPCR检测TaM2K基因的沉默情况。

图7为TaM2K基因沉默小麦及对照的纹枯病感染严重度(照片)。

图8为TaM2K基因沉默小麦及对照的纹枯病感染严重度(病级鉴定)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。小麦CI 12633为抗纹枯病材料。小麦温麦6号为感纹枯病材料。

单子叶植物表达载体pWMB123(简称载体pWMB123)：参考文献：Generation ofmarker-free transgenic hexaploid wheat viaan Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheat varieties,Ke

Huiyun

Lipu Du and Xingguo Ye*,Plant Biotechnology Journal(2016),pp.1–10doi:10.1111/pbi.12660。

实施例中的小麦纹枯病致病菌均采用禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207。

小麦纹枯病病情分级标准，按照李斯深等方法(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)，具体见表2。

表2小麦纹枯病病情分级标准

小麦纹枯病病级(IT)	小麦纹枯病病症
		0级	植株的叶鞘与茎部均无病斑
1级	植株的叶鞘有病斑但不侵茎
		2级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎大于0小于等于1/2
3级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎大于1/2小于等于3/4
		4级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎大于3/4小于等于1
5级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且植株出现枯孕穗或枯白穗

0级代表免疫，1级代表抗，2级代表中抗，3级-4级代表中感，5级代表高感。

菌麦粒的制备方法：将浸泡5-6小时麦粒煮20分钟，塞满三角瓶，灭菌后将小麦纹枯病致病菌的菌丝块接种到三角瓶中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

菌牙签的制备方法：将牙签段竖立塞满小烧杯，倒入液体MS培养基，灭菌后将小麦纹枯病致病菌的菌丝块接种到小烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。

实施例1、抗纹枯病的小麦激酶TaM2K及其编码基因的克隆

一、TaM2K基因的克隆

本发明的发明人从抗纹枯病小麦CI12633中分离克隆出一个小麦抗病相关的蛋白质，如序列表的序列1所示，将其命名为TaM2K蛋白，属于小麦激酶。将编码TaMK蛋白的基因命名为TaM2K基因，其cDNA如序列表的序列2所示。序列表的序列2中，第39-1145位核苷酸为开放阅读框。

具体克隆步骤：提取接种小麦纹枯病致病菌的小麦CI12633的茎部的总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将RNA反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以TaM2K-OF：5'-GGAGCCAGCCTCGCGTTTC-3'和TaM2K-OR：5'-TTGTGGTGGTGGCTTCAGTT-3'为引物，进行扩增。反应体系：2×KOD-Fx buffer 25μl、2.5mMdNTPs 10μl、10μM F/R primer 1.5μl、KOD-Fx 1μl、ddH₂O 10μl，模板1μl。扩增程序：先94℃预变性5分钟；然后98℃变性10秒，60.8℃复性30秒，68℃延伸1.5分钟，共35个循环；68℃延伸10分钟。PCR反应结束后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。将回收的PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。

二、TaM2K基因受纹枯病菌诱导的表达分析

供试小麦为：抗纹枯病小麦CI12633和感纹枯病小麦温麦6号(用Wen6表示)。

将小麦纹枯病致病菌接种于供试小麦分蘖期幼苗的基部茎与叶鞘间(将菌牙签嵌入到植株基部第1-2叶鞘之间，同时将菌麦粒置于植株的茎基部)；分别于接种前(mock)以及接种2、4、7、10天，取植株的茎部组织，液氮速冻后储存于-80℃备用。

将小麦纹枯病致病菌接种于供试小麦分蘖期幼苗的基部茎与叶鞘间(将菌牙签嵌入到植株基部第1-2叶鞘之间，同时将菌麦粒置于植株的茎基部)；分别于接种前(Mock)以及接种4天，取植株的茎、叶和穗，液氮速冻后储存于-80℃备用。

提取冻存组织/冻存器官的总RNA(每个样品约5μg)，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录得到cDNA。利用组成性表达的TaActin基因作为内参基因，将cDNA浓度均一化。然后采用TaM2K基因的特异引物对进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)分析TaM2K基因的表达情况。每种样品重复检测3次。

用于检测TaM2K基因的特异引物对：

TaM2K-Q-F：5’-CTGCTGCCTCCAGAAGAACCC-3’；

TaM2K-Q-R：5’-CGTCCATGATCCCTCCGAATT-3’。

用于检测内参基因(TaActin基因)的引物对：

TaActin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

TaActin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

接种不同时间后茎部组织的TaM2K基因的相对表达水平见图1。TaM2K基因受小麦纹枯病致病菌诱导表达，接种小麦纹枯病致病菌4d后TaM2K基因表达量达到高峰。

接种前和接种4天后，不同器官的TaM2K基因的相对表达水平见图2。茎部受麦纹枯病致病菌诱导表达程度最大。

以上结果显示，TaM2K基因参与了小麦对小麦纹枯病致病菌的防御反应。

实施例2、抗纹枯病的转TaM2K基因小麦的获得和抗病性鉴定

一、重组表达载体的构建

1、提取小麦CI 12633的茎部的总RNA并反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用TaM2K-O-F1和TaM2K-O-R1组成的引物对，在高保真扩增酶PrimeSTAR的作用下进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

TaM2K-O-F1：5’-cGGGATCCATGCGTCCGGGCGGGCCG-3’；

TaM2K-O-R1：5’-cGAGCTCgtggtggtggtggtggtgGCACGGCGGGGCGGCGAGGG-3’。

PCR反应程序：94℃预变性5min；98℃10s、60.8℃30s、68℃1.5min，35个循环；68℃10min。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切，回收酶切产物。

4、取载体pWMB123，用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切，回收载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pWMB123-TaM2KHIS。

根据测序结果，对重组质粒pWMB123-TaM2KHIS进行结构描述如下：在载体pWMB123的BamHⅠ和SacⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列4中第106-1227位核苷酸所示的DNA分子。重组质粒pWMB123-TaM2KHIS中的部分序列如序列表的序列4所示。重组质粒pWMB123-TaM2KHIS中具有融合基因，如序列表的序列4中第106-1260位核苷酸所示。该融合基因编码序列表的序列3所示的融合蛋白，该融合蛋白中第1-368位氨基酸残基组成TaM2K蛋白，第369-374位氨基酸残基组成6×HIS标签。重组质粒pWMB123-TaM2KHIS中，TaM2K基因受Ubiquitin启动子控制。重组质粒pWMB123-TaM2KHIS中还具有1个受35S启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。重组质粒pWMB123-TaM2KHIS的元件示意图见图3。

二、转基因植物的获得

1、将重组质粒pWMB123-TaM2KHIS导入农杆菌C58C1的感受态细胞，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌转化小麦扬麦16的幼胚愈伤组织，然后在渗透压培养基上后处理16h。

3、完成步骤2后，将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、完成步骤3后，将愈伤组织转移到分化筛选培养基(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)中，24-26℃光照培养14d。

5、完成步骤4后，将愈伤组织分化的小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养。

获得了164株再生植株。

6、将步骤5得到的再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上培养，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆。

移栽3周以后，有116株植株(T₀代)成活。

7、PCR鉴定

步骤6得到的各个成活植株，分别于4叶期取一个叶片，提取基因组DNA。将基因组DNA作为模板，采用Ubi-F和PolyA-R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到扩增产物(约1277bp)，该植株为转基因植株。将重组质粒pWMB123-TaM2KHIS作为阳性对照。将扬麦16的基因组DNA作为阴性对照。

Ubi-F:5’-TTTAGCCCTGCCTTCATACGCT-3’；

PolyA-R:5'-CCTTATCTGGGAACTACTCACA-3'。

PCR反应程序：95℃5min；98℃10s、60.8℃30s、68℃90s，35个循环；68℃10min；16℃保存。

PCR鉴定结果表明，116株T₀代成活植株中，65株为转基因植株。

8、取转基因植株的总RNA，反转录得到cDNA，检测TaM2K基因的相对表达量。采用小麦内源TaActin基因作为内参基因。将小麦扬麦16作为转基因植株的对照植株。

用于检测TaM2K基因的特异引物对：

TaM2K-QF:5’-GGCAACTACAACGGCTACG-3'；

TaM2K-QR:5’-CTGCTTCCCCAGGTTCTCC-3’。

用于检测内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

TaActin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

部分转基因植株的TaM2K基因的相对表达量见图4。图4中，Y16代表扬麦16，OMK1、OMK2、OMK3、OMK4和OMK5分别代表5个转基因植株。转基因植株中TaM2K基因的相对表达量明显高于受体扬麦16。

从65株转基因植株中筛选得到12株TaM2K基因的相对表达量明显增高的过表达植株。

9、取12株过表达植株，分别自交并收获种子，得到T₁代种子。将T₁代种子播种并培养，得到T₁代植株。将T₁代植株进行PCR鉴定，方法同步骤7。

在得到的116株T₁代植株中，81株为转基因植株，分属5个转基因株系，阳性率69.83％。

部分T₁代植株的PCR扩增产物的2.0％琼脂糖凝胶电泳图见图5。图5中，P代表阳性对照，WT代表阴性对照，OMK1、OMK2、OMK3、OMK4和OMK5分别代表5个转基因株系。

三、转空载体植物的获得

用载体pWMB123代替重组质粒pWMB123-TaM2KHIS，其它同步骤二，得到转空载体植株。

四、T₁代转基因植物的纹枯病抗性鉴定

供试植株：OMK1株系的T₁代植株、OMK2株系的T₁代植株、OMK3株系的T₁代植株、OMK4株系的T₁代植株、OMK5株系的T₁代植株、转空载体株系的T₁代植株、扬麦16植株。

供试植株进行平行试验。

正常培养供试植株。在拔节期，将3-8粒菌麦粒埋到小麦茎基部周围，接种后喷水保湿5-7天。持续观察发病情况。收获时调查病情指数。

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。

接种小麦纹枯病致病菌约45天，扬麦16植株出现典型的纹枯病病症，而转基因植株病症不明显。

病情指数结果见表3(20-30株植株的平均值)。扬麦16的病情指数为54。5个转TaM2K基因株系的病情指数分别为36.9、45.5、43.8、32.3、37.6。

五、T₂代转基因植物的纹枯病抗性鉴定

供试植株：OMK1株系的T₂代植株、OMK2株系的T₂代植株、OMK3株系的T₂代植株、OMK4株系的T₂代植株、OMK5株系的T₂代植株、转空载体株系的T₂代植株、扬麦16植株。

方法同步骤四。

病情指数结果见表3(20-30株植株的平均值)。扬麦16的病情指数为40.4。5个转TaM2K基因株系的病情指数分别为27.4、26.5、20.1、28.9、18.9。

表3转基因小麦与对照的纹枯病病情的调查结果

注：*表示在P<0.05水平上各转基因株系与扬麦16有显著差异；**表示在P<0.01水平上各转基因株系与扬麦16有显著差异。

结果表明，TaM2K基因过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗病性。

实施例3、培育纹枯病抗性降低的小麦进行TaM2K反向功能分析

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaM2K基因

1、将序列表中序列5所示的双链DNA分子插入BSMV-γ质粒的NheI酶切位点，得到重组质粒BSMV-γ：antiTaM2K。序列表的序列5与序列表的序列2第954-1191位反向互补。

2、制备转录反应液

(1)取BSMV-α质粒，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-α。取BSMV-γ质粒，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-γ。取BSMV-β质粒，用限制性内切酶SpeI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-β。取重组质粒BSMV-γ：antiTaM2K，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-γ：antiTaM2K。

(2)取线性化质粒，采用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit(Promega)，进行体外转录反应，得到转录反应液。

线性化质粒为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-α。线性化质粒为线性化的BSMV-γ时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ。线性化质粒为线性化的BSMV-γ：antiTaM2K时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：antiTaM2K。线性化质粒为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-β。

3、BSMV接种小麦植株

取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ：antiTaM2K，混匀，然后加入60μl RNase-free ddH₂O，再加入90μl GKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K₂HPO₄、1％Bentonite和1％Celite，pH9.2)，混合，得到BSMV:antiTaM2K病毒混合液。待小麦CI 12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取BSMV:antiTaM2K病毒混合液摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后每隔6h在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液。

取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ，混匀，然后加入60μl RNase-free ddH₂O，再加入90μl GKP溶液，混合，得到BSMV病毒混合液。待小麦CI 12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取BSMV病毒混合液摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后每隔6h在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液。

4、步骤3中接种病毒混合液后第12天取第四片叶片，提取RNA，反转录得到cDNA，采用qRT-qPCR检测TaM2K基因沉默情况。采用小麦内源TaActin基因作为内参基因。

用于检测TaM2K基因的特异引物对：

TaM2K-QF：5’-CTGCTGCCTCCAGAAGAACCC-3’；

TaM2K-QR：5’-CGTCCATGATCCCTCCGAATT-3’。

用于检测内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

TaActin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

TaM2K基因的相对表达量见图6。接种BSMV:antiTaM2K病毒混合液的植株中TaM2K基因被沉默。将接种BSMV:antiTaM2K病毒混合液得到的TaM2K基因沉默的植株命名为BSMV:TaM2K-CI12633植株。将接种BSMV病毒混合液的植株命名为BMSV：CI12633植株。与小麦CI12633相比，BMSV：CI12633植株中TaM2K基因的表达量没有显著变化。

二、被沉默植株的抗病性鉴定

步骤一的3中接种病毒混合液后第20天，采用牙签接种法向植株接种小麦纹枯病致病菌(具体方法：将菌牙签嵌入到植株基部第1-2叶鞘之间，同时将菌麦粒置于植株的茎基部，用湿润的脱脂棉将其轻轻包围，保湿7天，以后每天喷施2次DEPC水)。接种45天后，观察纹枯病感染情况，拍照并进行纹枯病病级鉴定。

照片见图7。

病级鉴定结果见图8(两个批次试验的结果，每个批次试验取多株植株的平均值)。

TaM2K基因沉默的BSMV：TaM2K-CI12633植株茎部位的纹枯病病斑(平均病级4.13)明显大于作为对照的BMSV:CI12633植株的病斑(平均病级1.83)，表明TaM2K基因沉默显著降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力。

上述结果说明，TaM2K基因是小麦CI12633抗纹枯病反应所需的基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 抗病转TaM2K基因小麦的培育方法及其相关生物材料

<130> GNCYX192887

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 368

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 1

Met Arg Pro Gly Gly Pro Pro Asn Ala Arg Pro Gly Leu Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Pro Gly Thr Pro Gly Arg Ala Arg Arg Arg Pro Asp Leu Thr Leu

20 25 30

Pro Leu Pro Gln Arg Asp Leu Thr Ser Leu Ala Val Pro Leu Pro Leu

35 40 45

Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ser Thr Ser Ser Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Ala Ser Ser Met Pro Met Pro Met Ser Met Thr Pro Pro Asn

65 70 75 80

Ser Ala Gly Ser Thr Pro Pro Ala Pro Pro Pro Leu Gly Glu Leu Glu

85 90 95

Arg Val Arg Arg Val Gly Ser Gly Ala Gly Gly Thr Val Trp Leu Val

100 105 110

Arg His Ala Pro Thr Gly Arg Ala Tyr Ala Leu Lys Val Leu Tyr Gly

115 120 125

His His Asp Glu Ala Val Arg Arg Gln Ile Thr Arg Glu Ile Ala Ile

130 135 140

Leu Arg Thr Ala Glu His Pro Ser Ile Val Arg Cys His Gly Met Tyr

145 150 155 160

Glu Gln Ala Gly Glu Leu Gln Ile Leu Leu Glu Tyr Met Asp Gly Gly

165 170 175

Ser Leu Asp Gly Arg Arg Ile Ala Ser Glu Ser Phe Leu Ala Asp Val

180 185 190

Ala Arg Gln Val Leu Ser Gly Ile Ala Tyr Leu His Arg Arg His Ile

195 200 205

Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asp Cys Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Val Gly Arg Ile Leu Asn Gln Thr

225 230 235 240

Met Asp Pro Cys Asn Ser Ser Val Gly Thr Ile Ala Tyr Met Ser Pro

245 250 255

Glu Arg Ile Asn Thr Asp Leu Asn Asp Gly Asn Tyr Asn Gly Tyr Ala

260 265 270

Gly Asp Ile Trp Ser Phe Gly Leu Ser Ile Leu Glu Phe Tyr Leu Gly

275 280 285

Arg Phe Pro Leu Gly Glu Asn Leu Gly Lys Gln Gly Asp Trp Ala Ala

290 295 300

Arg Met Cys Ala Ile Cys Tyr Ser Glu Ser Pro Ala Ala Pro Pro Thr

305 310 315 320

Ala Ser Pro Glu Leu Arg Ser Phe Ile Asn Cys Cys Leu Gln Lys Asn

325 330 335

Pro Ala Lys Arg Pro Ser Ala Val Gln Leu Leu Gln His Arg Phe Ile

340 345 350

Ala Ser Pro Pro Gln Gln Gln Pro Gln Ala Leu Ala Ala Pro Pro Cys

355 360 365

<210> 2

<211> 1304

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 2

ggagccagcc tcgcgtttcg ggccggccag agcgcgcgat gcgtccgggc gggccgccga 60

acgcgcggcc ggggctgcag cagcagcagc cgggcacgcc gggccgcgcg cggcgccggc 120

cggatctcac gctcccgctc ccgcagcgcg acctgacgtc gctggccgtg ccgcttccgc 180

tgccaccgcc cccgtcctcg gctccgtcgt ccacgtcctc gtccgggtcg ggcggcgcgt 240

cgtccatgcc catgcccatg tccatgaccc cgcccaactc ggccggctcc acgccgcccg 300

cgcccccgcc gctcggcgag ctggagcgcg tgcggcgcgt cgggagcggc gccggcggga 360

cggtgtggct ggtgcggcac gcgcccacgg gccgcgccta cgcgctcaag gtgctctacg 420

ggcaccacga cgaggcggtc cggcggcaga tcacgcgcga gatcgccatc ctgcgcacgg 480

ccgagcaccc gtccatcgtg cgctgccacg gcatgtacga gcaggccggc gagctgcaga 540

tcctgctcga gtacatggac ggcgggtccc tggacggccg ccgcatcgcg tccgagtcgt 600

tcctcgccga cgtggcacgg caggtgctgt cggggatcgc ctacctccac cggcgccaca 660

tcgtgcaccg cgacatcaag ccgtccaacc tgctcatcga ctgcgcgcgg cgcgcgaaga 720

tcgccgactt cggggtgggg cgcatcctga accagaccat ggacccctgc aactcctccg 780

tgggcaccat cgcgtacatg agccccgagc gcatcaacac cgacctcaac gacggcaact 840

acaacggcta cgccggcgac atctggagct tcggcctcag catcctcgag ttctacctgg 900

gccgcttccc gctcggggag aacctgggga agcagggcga ctgggcggcg cgcatgtgcg 960

ccatctgcta ctccgagtcg ccggcggcgc cgcccaccgc gtccccggag ctgcggagct 1020

tcatcaactg ctgcctccag aagaacccgg cgaagcggcc gtcggcggtg cagctgctgc 1080

agcaccggtt catcgcctcg ccgccgcagc agcagccgca ggccctcgcc gccccgccgt 1140

gctgacggcc cgcccgccgt aaccaagtta aattcggacg gatcatggac ggacggacgg 1200

acggacggac ggacggtggc cggcggcgag acgcgggatc tagggggagg aggggcgatc 1260

tgtcttcttc ttagccattt tgggaactga agccaccacc acaa 1304

<210> 3

<211> 384

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Arg Pro Gly Gly Pro Pro Asn Ala Arg Pro Gly Leu Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Pro Gly Thr Pro Gly Arg Ala Arg Arg Arg Pro Asp Leu Thr Leu

20 25 30

Pro Leu Pro Gln Arg Asp Leu Thr Ser Leu Ala Val Pro Leu Pro Leu

35 40 45

Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ser Thr Ser Ser Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Ala Ser Ser Met Pro Met Pro Met Ser Met Thr Pro Pro Asn

65 70 75 80

Ser Ala Gly Ser Thr Pro Pro Ala Pro Pro Pro Leu Gly Glu Leu Glu

85 90 95

Arg Val Arg Arg Val Gly Ser Gly Ala Gly Gly Thr Val Trp Leu Val

100 105 110

Arg His Ala Pro Thr Gly Arg Ala Tyr Ala Leu Lys Val Leu Tyr Gly

115 120 125

His His Asp Glu Ala Val Arg Arg Gln Ile Thr Arg Glu Ile Ala Ile

130 135 140

Leu Arg Thr Ala Glu His Pro Ser Ile Val Arg Cys His Gly Met Tyr

145 150 155 160

Glu Gln Ala Gly Glu Leu Gln Ile Leu Leu Glu Tyr Met Asp Gly Gly

165 170 175

Ser Leu Asp Gly Arg Arg Ile Ala Ser Glu Ser Phe Leu Ala Asp Val

180 185 190

Ala Arg Gln Val Leu Ser Gly Ile Ala Tyr Leu His Arg Arg His Ile

195 200 205

Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asp Cys Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Val Gly Arg Ile Leu Asn Gln Thr

225 230 235 240

Met Asp Pro Cys Asn Ser Ser Val Gly Thr Ile Ala Tyr Met Ser Pro

245 250 255

Glu Arg Ile Asn Thr Asp Leu Asn Asp Gly Asn Tyr Asn Gly Tyr Ala

260 265 270

Gly Asp Ile Trp Ser Phe Gly Leu Ser Ile Leu Glu Phe Tyr Leu Gly

275 280 285

Arg Phe Pro Leu Gly Glu Asn Leu Gly Lys Gln Gly Asp Trp Ala Ala

290 295 300

Arg Met Cys Ala Ile Cys Tyr Ser Glu Ser Pro Ala Ala Pro Pro Thr

305 310 315 320

Ala Ser Pro Glu Leu Arg Ser Phe Ile Asn Cys Cys Leu Gln Lys Asn

325 330 335

Pro Ala Lys Arg Pro Ser Ala Val Gln Leu Leu Gln His Arg Phe Ile

340 345 350

Ala Ser Pro Pro Gln Gln Gln Pro Gln Ala Leu Ala Ala Pro Pro Cys

355 360 365

His His His His His His Glu Leu Leu Glu Phe Leu His Asn Asn Val

370 375 380

<210> 4

<211> 1277

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca 60

ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggtc gactctagag gatccatgcg tccgggcggg 120

ccgccgaacg cgcggccggg gctgcagcag cagcagccgg gcacgccggg ccgcgcgcgg 180

cgccggccgg atctcacgct cccgctcccg cagcgcgacc tgacgtcgct ggccgtgccg 240

cttccgctgc caccgccccc gtcctcggct ccgtcgtcca cgtcctcgtc cgggtcgggc 300

ggcgcgtcgt ccatgcccat gcccatgtcc atgaccccgc ccaactcggc cggctccacg 360

ccgcccgcgc ccccgccgct cggcgagctg gagcgcgtgc ggcgcgtcgg gagcggcgcc 420

ggcgggacgg tgtggctggt gcggcacgcg cccacgggcc gcgcctacgc gctcaaggtg 480

ctctacgggc accacgacga ggcggtccgg cggcagatca cgcgcgagat cgccatcctg 540

cgcacggccg agcacccgtc catcgtgcgc tgccacggca tgtacgagca ggccggcgag 600

ctgcagatcc tgctcgagta catggacggc gggtccctgg acggccgccg catcgcgtcc 660

gagtcgttcc tcgccgacgt ggcacggcag gtgctgtcgg ggatcgccta cctccaccgg 720

cgccacatcg tgcaccgcga catcaagccg tccaacctgc tcatcgactg cgcgcggcgc 780

gcgaagatcg ccgacttcgg ggtggggcgc atcctgaacc agaccatgga cccctgcaac 840

tcctccgtgg gcaccatcgc gtacatgagc cccgagcgca tcaacaccga cctcaacgac 900

ggcaactaca acggctacgc cggcgacatc tggagcttcg gcctcagcat cctcgagttc 960

tacctgggcc gcttcccgct cggggagaac ctggggaagc agggcgactg ggcggcgcgc 1020

atgtgcgcca tctgctactc cgagtcgccg gcggcgccgc ccaccgcgtc cccggagctg 1080

cggagcttca tcaactgctg cctccagaag aacccggcga agcggccgtc ggcggtgcag 1140

ctgctgcagc accggttcat cgcctcgccg ccgcagcagc agccgcaggc cctcgccgcc 1200

ccgccgtgcc accaccacca ccaccacgag ctcctcgagt ttctccataa taatgtgtga 1260

gtagttccca gataagg 1277

<210> 5

<211> 238

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cgtccatgat ccgtccgaat ttaacttggt tacggcgggc gggccgtcag cacggcgggg 60

cggcgagggc ctgcggctgc tgctgcggcg gcgaggcgat gaaccggtgc tgcagcagct 120

gcaccgccga cggccgcttc gccgggttct tctggaggca gcagttgatg aagctccgca 180

gctccgggga cgcggtgggc ggcgccgccg gcgactcgga gtagcagatg gcgcacat 238

Claims

1.一种蛋白质，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)由序列表的序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)的DNA分子：

(b2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(b4)序列表的序列4所示的DNA分子；

(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

(b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组微生物。

5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：

(c1)调控植物的抗病性；

(c2)调控小麦的抗病性；

(c3)提高植物的抗病性；

(c4)提高小麦的抗病性。

6.一种植物抗病剂，其活性成分为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)权利要求1所述蛋白质；

(d2)权利要求2或3所述核酸分子；

(d3)权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组微生物。

7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述核酸分子导入目的植物中，得到抗病性高于目的植物的转基因植物。

8.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求2或3所述核酸分子的表达，得到抗病性低于目的植物的转基因植物。

9.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性，从而增加目的植物的抗病性。

10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为小麦；所述抗病性为对纹枯病的抗病性。