CN105753953A - 小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用。本发明公开的小麦抗病蛋白(TaZnF2)是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，TaZnF2基因过表达的转TaZnF2基因小麦对小麦纹枯病的抗性显著提高；而抗病小麦CI12633中TaZnF2基因表达被抑制,则使这些植株对纹枯病抗性降低，说明TaZnF2基因是小麦抗纹枯病反应所需的抗病基因。

Description

小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用。
背景技术
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，对于保障粮食安全起着举足轻重的作用。随着肥水条件的改良、种植密度增加和耕作制度的改变，小麦纹枯病已发展成我国小麦生产的主要病害，成为我国小麦高产稳产的重要限制因素。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheatsharpeyespot)，是由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)CAG-1和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)AG4、AG5融合群引起的一种世界性小麦土传真菌病害。我国小麦纹枯病主要病原菌为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)。纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产50％以上。据全国农技推广站报道，2005—2015年我国小麦纹枯病每年发生面积达1-1.4亿亩，经济损失数十亿元以上，已成为我国小麦主产区小麦的第一大土传病害。选育和推广抗纹枯病小麦新品种是防治该病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保证我国小麦的高产、稳产非常重要。然而，由于缺乏易于利用的小麦纹枯病抗性种质资源，常规育种方法在抗纹枯病小麦品种育种方面进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展为植物抗性育种开辟了一条新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为抗病蛋白(TaZnF2)的蛋白质，该蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，序列2由181个氨基酸残基组成。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
上述A2)中的TaZnF2蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A2)中的TaZnF2蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的TaZnF2蛋白质的编码基因可通过将序列1的第250-795位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与TaZnF2相关的生物材料，该生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码TaZnF2的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低TaZnF2表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
上述生物才料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b5)中任一种：
b1)其编码序列是序列表中序列1的第250-795位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1的第1-955位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b3)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子cDNA分子或DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TaZnF2的cDNA分子或基因组DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码TaZnF2的cDNA分子或基因组DNA分子；
B8)所述核酸分子为与序列表中序列1所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列1由1096个核苷酸组成，其中序列1的第250-795位核苷酸所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TaZnF2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TaZnF2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TaZnF2且具有TaZnF2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码TaZnF2的核酸分子的表达盒(TaZnF2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaZnF2的DNA，该DNA不但可包括启动TaZnF2基因转录的启动子，还可包括终止TaZnF2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述TaZnF2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pMD18-T或pAHC25，也可为将pAHC25改造后得到的载体。所述病毒载体具体可为BSMV病毒的载体，如γ载体。
B3)所述重组载体可含有序列1的第250-795位所示的用于编码TaZnF2的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pAHC25-cMYC-TaZnF2或pMD-18T-TaZnF2。所述pAHC25-cMYC-TaZnF2为将pAHC25-cMYC载体的SpeI和EcoICRI识别位点间的DNA序列替换为序列1的第250-795位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达序列2所示的TaZnF2的重组载体。所述pMD-18T-TaZnF2为将pMD18-T的SpeI和EcoICRI识别位点间的DNA序列替换为序列1的第250-795位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述细菌具体可为大肠杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述生物材料中，B8)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第756-955位核苷酸所示的DNA分子反向互补的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗病剂。所述植物抗病剂含有TaZnF2、或所述生物材料。
上述植物抗病剂中，所述植物抗病剂可以以所述TaZnF2作为活性成分，还可以将TaZnF2和其它抗病性物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
上述植物抗病剂中，所述植物可为单子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633、温麦6或扬麦16。
上述植物抗病剂中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301或禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)北方毒力菌株WK207。
为解决上述技术问题，本发明还提供了TaZnF2、或所述生物材料在下述1)-3)中任一种中的应用：
1)调控植物抗病性；
2)制备提高植物抗病性产品；
3)培育抗病性植物。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633、温麦6或扬麦16。
上述应用中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301或禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)北方毒力菌株WK207。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病性转基因植物的方法，该方法包括向受体植物中导入TaZnF2的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物。
在本发明的实施例中，所述TaZnF2的编码基因(即序列1的第250-795位核苷酸所示的DNA分子)通过含有TaZnF2基因表达盒的TaZnF2基因重组表达载体导入目的植物中。所述TaZnF2基因表达盒中，启动TaZnF2基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，其中所述TaZnF2基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaZnF2基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述TaZnF2基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述方法还包括从导入序列2所示的TaZnF2的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因小麦。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述受体植物可为单子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633、温麦6或扬麦16。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301或禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)北方毒力菌株WK207。
上述培育抗病性转基因植物的方法中，所述TaZnF2的编码基因的编码序列可为序列表中序列1的第250-795位的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培育抗病性降低的转基因植物的方法，该方法包括降低目的植物中TaZnF2的编码基因的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。
上述培育抗病性降低的转基因植物的方法中，所述目的植物可为单子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。所述小麦可为小麦种质资源CI12633、温麦6或扬麦16。
上述培育抗病性降低的转基因植物的方法中，所述抗病性可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。所述禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)可为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301或禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)北方毒力菌株WK207。
上述培育抗病性降低的转基因植物的方法中，降低目的植物中TaZnF2的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第756-955位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。
在本发明的一个实施例中，与序列表中序列1的第756-955位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子通过BSMV病毒的γ载体导入所述目的植物中。
本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaZnF2基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
实验证明，将TaZnF2基因导入小麦的转基因的分子检测与抗病性实验结果证明，TaZnF2基因可以提高植物的抗病性：T1代转基因植株的平均病级为1.59；病情指数为31.76，野生型植株的平均病级为3.12，病情指数为62.37，T1代转基因植株的平均病级和病情指数分别显著低于野生型植株的病级与病情指数；T2代转基因植株的平均病级为1.23；病情指数为24.58；而野生型植株的平均病级为2.76，病情指数为55.17，T2代转基因植株的平均病级和病情指数分别显著低于野生型植株的病级与病情指数。TaZnF2基因过表达的转TaZnF2基因小麦对小麦纹枯病的抗性显著提高；而抗病小麦CI12633中所述TaZnF2基因表达被抑制,则使这些植株对纹枯病抗性降低，说明TaZnF2基因是小麦抗纹枯病反应所需的抗病基因，正向参与小麦抗纹枯病反应。TaZnF2基因是一种与纹枯病抗性密切相关的小麦抗病蛋白基因，对植物育种具有重大价值。
附图说明
图1为TaZnF2在禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301接种前后在CI12633和温麦6号中的相对表达量。其中，温6表示温麦6号；4DPI表示接种4天，21DPI表示接种21天。
图2为过表达的转基因载体的构建过程。
图3为T1代单株分子鉴定的部分结果。其中，M为DNA分子量标准，P为载体pAHC25-cMYC-TaZnF2，WT为扬麦16，L6,L11,L66，L119，L141，L145分别为T2代的部分单株。
图4为T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株TaZnF2基因的转录水平检测结果。其中，Y16为扬麦16；空载··为转空载体植株；L6,L11,L66，L119，L141，L145为部分T2代单株。
图5为分别接种禾谷丝核菌R0301的T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2转基因植株、转空载体植株和野生型植株扬麦16。其中，过表达株系表示T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2转基因植株，空载体对照表示转空载体植株，Y16表示野生型植株扬麦16。
图6为TaZnF2基因被沉默的转基因小麦中TaZnF2基因的表达分析。BSMV:GFP-1、BSMV:GFP-2、BSMV:GFP-3:接种BSMV-γ-GFP的植株；BSMV:TaZnF2-1、BSMV:TaZnF2-2和BSMV:TaZnF2-3均为接种BSMV-γ：antiTaZnF2的植株。
图7为接种禾谷丝核菌北方毒力菌株WK207的TaZnF2基因被沉默的转基因小麦植株及接种BSMV-γ-GFP的植株的表型图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
植物表达载体pAHC25-cMYC(XiuliangZhu,KunYang,XueningWei,QiaofengZhang2,WeiRong,LipuDu,XingguoYe,LinQi,ZengyanZhang(通讯作者),2015,ThewheatAGCkinaseTaAGC1isapositivecontributortohostresistancetothenecrotrophicpathogenRhizoctoniacerealis,JournalofExperimentalBotany,66(21):8591-6603)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。pAHC25-cMYC由pAHC25(ChristensenandQuail,1996；Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch，5,213–218)改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、6个重复的c-MYC标签、GUS基因、Nos终止子，GUS两端具有SpeI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子。
小麦种质资源CI12633抗纹枯病，小麦品种温麦6高感纹枯病。温麦6号来自中国农业科学院种质资源库，小麦CI12633来自江苏农业科学院种质资源库。小麦品种扬麦16来自江苏里下河地区农业科学研究所，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
BSMV-γ(BSMV病毒的γ载体),BSMV-α和BSMV-β及BSMV-γ-GFP(HolzbergS,BrosioP,GrossC,PogueGP.2002.Barleystripemosaicvirus-inducedgenesilencinginamonocotplant.ThePlantJournal30,315-327)。其中，BSMV-γ-GFP是将GFP(绿色荧光蛋白)编码区全长DNA插入BSMV-γ载体的多克隆酶切位点中得到可表达GFP的重组载体。BSMV-γ(BSMV病毒的γ载体),BSMV-α和BSMV-β及BSMV-γ-GFP公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301(江苏省农业科学院)(冷苏凤，张爱香，李伟，陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报，2010，26(6)：1176-1180；ChenLiang,ZhangZengyan(通讯作者),LiangHongxia,LiuHongxia,DuLipu,XuHuijun,XinZhiyong.2008.OverexpressionofTiERF1enhancesresistancetosharpeyespotintransgenicwheat.JournalofExperimentalBotany.59:4195-4204)公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)北方毒力菌株WK207(申芳嫡，洪彦涛，杜丽璞，徐惠君，马翎健，张增艳(通讯作者)，转细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35增强小麦对纹枯病抗性的研究，作物学报，2015,41(10)：1490-1499)，由山东农业大学植保学院于金凤教授分离、提供,经于金凤教授同意公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
下述实施例中的pMD18-T为宝生物工程(大连)有限公司产品。
实施例1、小麦抗病蛋白TaZnF2及其编码基因的克隆
本申请的发明人，从抗纹枯病小麦CI12633中分离克隆出一个小麦抗病蛋白，将其命名为TaZnF2。TaZnF2基因的具体克隆方法如下：
提取小麦CI12633叶鞘的总RNA，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以TaZnF2-3R1:5′-ATTCGGACGAGGAACCCC-3′，3RACE-OuterPrimer：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′(Takara),进行第一轮PCR扩增。扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后94℃45秒，52℃45秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟。得到第一轮PCR扩增产物。以稀释50倍的第一轮PCR扩增产物作为模板，以TaZnF2-3R2:5′-ATCCGTGCTCCGCATACAAG-3′，3RACE-InnerPrimer：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′(Takara)进行第二轮PCR扩增，扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后94℃45秒，58℃45秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟；第二轮PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该第二轮PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列1的第230-1096位所示，其编码序列是序列表中序列1的第250-795位核苷酸；编码序列2所示的抗病蛋白TaZnF2。
为了获得TaZnF2基因全长的cDNA序列，设计5’RACE引物TaZnF2-5R0:5′-GCCTTCTGGTCCCCTGCC-3′，TaZnF2-5R1:5′-GCGACTTTGGTCCGTTGG-3′，TaZnF2-5R2:5′-GACCTTGTCGGACTCCATCTC-3′，TAKARA公司5′RACE试剂盒中上游引物5′RACEOuterPrimer5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′，5′RACEInnerPrimer5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′。通过3轮PCR扩增，从小麦CI12633cDNA中扩增到5′序列,即序列1所示的自5′末端第1-282位核苷酸。
2、TaZnF2基因受纹枯病菌诱导的表达分析
为了研究TaZnF2基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用Q-RT-PCR分析TaZnF2基因在经禾谷丝核菌诱导前后的抗纹枯病和感纹枯病小麦中的表达情况。
用小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301的菌丝用牙签分别接种于小麦CI12633及感纹枯病小麦温麦6号分蘖期幼苗的叶鞘与茎间，分别于接种后4天和21天取小麦叶鞘与茎，液氮速冻后储存于－80℃超低温冰箱备用；分别以未接种的小麦叶鞘与茎部作为对照(Mock)。
分别提取各小麦茎的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaZnF2基因的特异引物进行实时定量RT-PCR分析，用2-△ΔCT法(LivakKJ,SchmittgenTD.2001.Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2-△ΔCTmethod.Methods.25:402-408)分析TaZnF2基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。
内参基因actin的引物对：
TaActin-F：5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′；TaActin-R：5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′。
TaZnF2基因的特异引物对：TaZnF2-Q-F:5′-GCGGCAGATGCGACGGAG-3′和TaZnF2-Q-R：5′-AGCAACGAAAGAACGGTAAGC-3′
对接种禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301前后的CI12633和温麦6号的TaZnF2基因表达量分析结果表明，TaZnF2基因在抗纹枯病小麦CI12633中受禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301诱导表达，在禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301诱导后的感纹枯病小麦温麦6号中受下调表达。在接种禾谷丝核菌21天时，TaZnF2基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量显著高于其在感纹枯病小麦温麦6号中的表达量(图1)。
实施例2、抗纹枯病转基因小麦的获得和抗病性鉴定
一、过表达的转基因载体的构建
将TaZnF2基因完整的ORF序列构建到单子叶植物表达载体pAHC25-cMYC上，构建过程如图2所示，具体步骤如下：
1、线性化质粒的制备：用SpeI和EcoICRI(与SacI为同裂酶,但EcoICRI酶切后产生平末端)酶切植物表达载体pAHC25-cMYC，1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收线性化pAHC25-cMYC载体骨架。
2、含酶切位点的目标基因TaZnF2的获得：根据TaZnF2基因的ORF序列设计一对引物TaZnF2-OT-F:5′-TAAACTAGTATGTCGCCGGCGGAGATGGA-3′(下划线序列为限制性内切酶SpeI位点)和TaZnF2-OT-R:5′-GGATTTAAATCAGGCGTATATTACGCCT-3′(下划线序列为限制性内切酶DraI位点(酶切后产生平末端,与EcoICRI酶切产生的平末端可以连接)，提取小麦CI12633叶鞘的总RNA，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，通过PrimeSTARHSDNAPolymerase高保真酶扩增基因的ORF片段，并在ORF的5′端和3′端分别添加SpeI和DraI限制性内切酶的酶切位点，扩增片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收纯化。回收的PCR产物与克隆载体pMD18-T载体连接、转化到Top10感受态细胞中并测序，选取测序正确的阳性单克隆并提取质粒，将序列正确的质粒命名为pMD-18T-TaZnF2。用限制性内切酶SpeI和DraI双酶切pMD-18T-TaZnF2，获得两侧带酶切位点的目标基因TaZnF2的DNA片段(将其命名为DNA片段1)。
3、目标基因TaZnF2与线性化载体连接：配制如下反应体系(10μl)：
连接反应于16℃恒温过夜得到连接产物。
4、将连接产物热激转化到大肠杆菌Top10菌株感受态细胞中，37℃培养8h后挑取单克隆，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并进一步测序验证。选取序列正确的单克隆，提取质粒，将序列正确的质粒命名为pAHC25-cMYC-TaZnF2。测序结果表明，pAHC25-cMYC-TaZnF2为用序列表中序列1的第250-795位所示的DNA分子替换pAHC25-cMYC的SpeI和EcoICRI酶切位点间的DNA片段，其他序列均不变,得到的重组表达载体。
pAHC25-cMYC-TaZnF2的结构：骨架载体为pAHC25-cMYC，在SpeI和EcoICRI酶切位点之间插入了序列表中序列1的第250位至第795核苷酸所示的TaZnF2基因；TaZnF2基因受玉米Ubiquitin启动子控制；质粒还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。
二、转基因植物的获得
1、将4186块扬麦16的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将pAHC25-cMYC-TaZnF2轰击到愈伤组织。
2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。
3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。
4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养；获得了479株再生植株。
5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆,在移栽到温室3周以后，得到370株成活植株，以下将转pAHC25-cMYC-TaZnF2的植株称为扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2。
6、分子鉴定
在4叶期，每株扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaZnF2上跨内含子区域TaZnF2序列作为上下游引物TaZnF2-jian(nei)-12F：5′-GGAGATGGAGTCCGACAAGG-3′和TaZnF2-jian(nei)-308R：5′-TCCTCCTTGGTAGTAGAAGCCTGT-3′进行PCR扩增，以重组表达质粒pAHC25-cMYC-TaZnF2为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为297bp。
其中，PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
先94℃5min；(94℃40s，57℃40s，72℃50s)，35个循环；再72℃10min；16℃保存。
PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。
结果表明再生植株中，有PCR检测阳性的T0代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2植株59株(即PCR产物有目的片段的扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2)。
7、T1代单株及其分子鉴定
将步骤6的59株PCR阳性植株自交后得到573株T1代单株。将573株T1代单株进行分子鉴定，方法同步骤6，共检测出T1代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株134株，这134株PCR阳性转基因植株的PCR产物中均有目的片段，该134株中部分T1代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株的编号为L6,L11,L66，L119，L141，L145。以重组表达质粒pAHC25-cMYC-TaZnF2为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，目的片段为297bp。
8、T2代单株及其分子鉴定
将T1代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株进行自交，得到T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2，按照步骤6的方法进行分子鉴定，得到86株T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR转基因植株。
利用步骤7中的方法在DNA水平上对由L6,L11,L66，L119，L141，L145分别自交得到的后代的植株(即T2代)进行鉴定；部分单株PCR检测结果见图3，目的植株中均含有目的基因，将其命名为T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株。
利用引物TaZnF2-ox-Q-280-F:5’-GCAGCACAGGCTTCTACTACCA-3’；TaZnF2-ox-Q-471-R:5’-CTTCCTCCGTCGCATCTG-3’，荧光定量Q-RT-PCR分析T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株TaZnF2基因的转录水平。结果如图4所示，T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株TaZnF2基因的转录水平均显著高于未转基因小麦受体扬麦16。
三、转空载体植株的获得
按照步骤二中1-5的方法，将pAHC25-cMYC-TaZnF2替换为pAHC25-cMYC，其他步骤均不变，得到转pAHC25-cMYC的植株，将其称为扬麦16/pAHC25-cMYC。
四、转基因植物纹枯病抗性鉴定及TaZnF2基因的转录水平
1、小麦纹枯病菌丝培养
将牙签段竖立塞满小烧杯，配制MS液体培养基，倒入装牙签段的小烧杯中，灭菌后将保存的禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301菌丝块接种到烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。
制备麦粒蛭石培养基(熟麦粒：砂＝1：1，加适量水，混匀)，灭菌后，接种禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。
2、纹枯病抗性鉴定
选取步骤二中25株T2代扬麦16/pAHC25-6MYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株(TaZnF2基因的转录水平均显著高于未转基因小麦受体扬麦16)进行纹枯病抗性鉴定，用步骤三的转空载体植株扬麦16/pAHC25-6MYC和野生型植株扬麦16作为对照，具体步骤如下：
在小麦拔节期，将两根布满小麦禾谷丝核菌R0301的牙签嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态，接种后喷水保湿5-7天；于小麦蜡熟期、收获时调查纹枯病病情(图5)。
纹枯病病情分级(病级)标准，按照李斯深等方法进行(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)：
0级(IT0)：全株无病；
1级(IT1)：第1、2叶鞘发病，但茎秆无病；
2级(IT2)：第1、2叶鞘发病，但病斑绕茎秆小于1/3；
3级(IT3)：第3、4叶鞘发病，或病斑绕茎秆1/3-2/3；
4级(IT4)：第5、6叶鞘发病，或病斑绕茎秆2/3-1周；
5级(IT5)：出现枯、白穗或整株枯死。
T1代、T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株对纹枯病抗性显著提高，结果见表2。
T1代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株的纹枯病平均病级为1.59；病情指数为31.76，野生型扬麦16植株的纹枯病平均病级为3.12，病情指数为62.37，转空载体植株扬麦16/pAHC25-cMYC的纹枯病平均病级为2.72，病情指数为54.4；转空载体植株扬麦16/pAHC25-cMYC与野生型扬麦16植株的纹枯病病级与病情指数均无显著差异，T1代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株的纹枯病平均病级和病情指数分别显著低于野生型扬麦16植株的纹枯病病级与病情指数。
T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株的纹枯病平均病级为1.23；病情指数为24.58；而野生型扬麦16植株的纹枯病平均病级为2.76，病情指数为55.17，转空载体植株扬麦16/pAHC25-cMYC的纹枯病平均病级为3.06，病情指数为61.26，转空载体植株扬麦16/pAHC25-cMYC与野生型扬麦16植株的纹枯病病级与病情指数均无显著差异，T2代扬麦16/pAHC25-cMYC-TaZnF2PCR阳性转基因植株的纹枯病平均病级和病情指数分别显著低于野生型扬麦16植株的纹枯病病级与病情指数。
说明转TaZnF2基因显著增强植株对纹枯病抗性。表2中，株系编号L6、L11、L66、L141、L145和L119为在T1，T2代中pAHC25-cMYC-TaZnF2基因PCR检测为阳性且抗性显著提高的6个株系。
表2、转TaZnF2基因小麦T1代阳性植株的纹枯病病情调查结果
株系编号 T1代平均病级 T1代病情指数 T2代平均病级 T2代病情指数
L6 1.25 25 1 20
L11 1.54 30.71 1.37 27.5
L66 2 40 1.5 30
L141 2 40 1.5 30
L145 1.33 26.6 1 20
L119 1.41 28.23 1 20
平均值 1.59 31.76 1.23 24.58
实施例3、培育纹枯病性降低的基因沉默小麦
1、将序列表中序列1的第756-955位核苷酸所示的DNA片段的两末端分别带有限制性内切酶NheI识别序列。NheI酶切后，将序列表中序列1的第756-955位核苷酸所示的DNA片段(200bp)以反向插入法插入到NheI酶线性化后的BSMV-γ(BSMV病毒的γ载体)上，使与序列表中序列1的第756-955位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子(名称为antiTaZnF2)被γ载体的T7启动子驱动，得到重组载体BSMV-γ：antiTaZnF2。
2、于两叶一心期，用重组载体BSMV-γ：antiTaZnF2转染抗小麦纹枯病材料——小麦CI12633的第二片叶，具体步骤如下：
(1)采用摩擦法接种BSMV-γ：antiTaZnF2(或BSMV-γ:GFP)到第二片叶完全伸展的抗病材料CI12633的第二片叶上。接种时，用未接种手固定小麦幼苗的基部，接种手的拇指和食指压住叶片，沿着叶片伸展的方向，从叶底部连续摩擦到叶尖，一、二两片叶子同时接种。
(2)接种完成后，向小麦幼苗喷施DEPC水，保鲜膜覆盖保湿24h，之后移去保鲜膜，每隔1-2h喷施一次DEPC水。
(3)接种第14天取第四片叶片，提取RNA，采用Q-RT-PCR检测TaZnF2基因沉默情况(TaZnF2-Q-695F:5'-CGCCTGACCCATCCTTAGT-3'和TaZnF2-Q-917R:5'-CATACTTAGGACAAACACAAACAGG-3')。
结果如图6所示：导入BSMV-γ：antiTaZnF2的CI12633植株中TaZnF2基因表达水平极显著下降，得到TaZnF2基因沉默的CI12633(命名为BSMV-γ：antiTaZnF2)；而按照步骤(1)-(3)的方法导入BSMV-γ:GFP的CI12633(命名为BSMV-γ-GFP，作为对照)与野生型小麦CI12633中TaZnF2基因的表达量没有显著变化。
禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)北方毒力菌株WK207接种30天后，进行抗病性鉴定。结果如图7所示，TaZnF2基因表达沉默后的BSMV-γ：antiTaZnF2植株倒数第三叶茎部位纹枯病病斑明显大于对照(BSMV-γ-GFP)植株和野生型小麦CI12633植株的病斑，表明TaZnF2基因沉默降低了CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaZnF2是CI12633抗纹枯病反应所需的基因。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)-b5)中任一种：
b1)其编码序列是序列表中序列1的第250-795位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1的第1-955位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b3)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子cDNA分子或DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
B8)所述核酸分子为与序列表中序列1所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子。
4.植物抗病剂，其特征在于：所述植物抗病剂含有权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料。
5.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在下述1)-3)中任一种中的应用：
1)调控植物抗病性；
2)制备提高植物抗病性产品；
3)培育抗病性植物。
6.一种培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物。
7.培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。
8.根据权利要求4所述抗病剂，或权利要求5所述应用，或权利要求6或7所述的方法，其特征在于：权利要求4或5所述植物、权利要求6所述受体植物或权利要求7所述目的植物为单子叶植物，
和/或，
权利要求1所述蛋白质的编码基因的编码序列是序列表中序列1的第250-795位的DNA分子，
降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第756-955位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。
9.根据权利要求8所述抗病剂、所述应用或所述方法，其特征在于：所述单子叶植物为小麦。
10.根据权利要求8或9所述抗病剂、所述应用或所述方法，其特征在于：所述抗病性为抗纹枯病，和/或，
所述纹枯病由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。
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