CN116082478A - 小麦抗病蛋白TaLM3D及其相关生物材料与应用 - Google Patents

小麦抗病蛋白TaLM3D及其相关生物材料与应用 Download PDF

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Abstract

本发明本发明涉及生物技术领域，公开了小麦抗病蛋白TaLM3D及其相关生物材料与应用。本发明提供了TaLM3D蛋白或能够调控TaLM3D蛋白编码基因表达的物质或能够调控TaLM3D蛋白含量和/活性的物质在如下任一中的应用：调控植物抗病性；制备提高植物抗病性的产品；培育抗病植物；制备植物抗病产品；植物育种。TaLM3D基因沉默可以降低小麦CI12633对纹枯病菌和茎基腐病的防御能力，TaLM3D是小麦抗纹枯病和茎基腐病反应所必需的基因。本发明所提供的TaLM3D基因为植物抗病相关基因，本发明对于培育新的植物抗病品种具有重要意义。

Description

小麦抗病蛋白TaLM3D及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦抗病蛋白TaLM3D及其相关生物材料与应用。
背景技术
小麦是世界上最重要的粮食作物之一。随着气候变暖、施肥原因和耕作制度改变，小麦茎基腐病、纹枯病等土传真菌病害，发展为小麦生产的主要茎部病害，严重影响小麦产量和籽粒品质，已成为小麦生产中亟待解决的重要问题之一。小麦茎基腐病(wheatFusarium crown rot)，主要由假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)感染引起。可造成小麦严重减产，损失可高达35％～75％，而且病原菌产生DON等真菌毒素残留在小麦籽粒中，严重影响小麦的食用和饲用价值。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharpeyespot)。主要由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)感染引起。一般纹枯病发生可使小麦减产10％～30％，严重发生地块则使小麦减产50％以上。因此，选育和推广抗病小麦新品种，是防治上述土传真菌病害流行的最经济、生态安全和有效的途径，对于保障小麦稳产、高产非常重要。然而，由于缺乏易于利用的高抗上述土传真菌病的小麦种质资源，田间鉴定困难，使得常规育种方法培育小麦抗病品种的育种进展缓慢。分子生物学技术和基因工程的发展与应用，特别是抗病重要基因的分离克隆及功能研究的进步，为培育抗茎基腐病、纹枯病的小麦新品种提供了一条新途径。
发明内容
为了提高植物的抗病性(如植物对茎基腐病和纹枯病的抗性)，本发明提供了小麦抗病蛋白TaLM3D及其相关生物材料与应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
第一方面，本发明要求保护一种抗纹枯病菌和茎基腐病的蛋白质，所述蛋白质为如下任意一种：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且来源于小麦的与植物抗病性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质可人工合成；也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述标签(tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对氨基酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
第二方面，本发明要求保护与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为如下任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低权利要求1所述蛋白的编码基因表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的第1-1257位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
下文中，所述蛋白质编码基因也均可为此处b1)或b2)。
其中，SEQ ID No.1由1475个核苷酸组成，其ORF序列是SEQ ID No.1的第1-1257位，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。
上述生物材料中，B2)所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，以及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶启动子("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1启动子(PR1，由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5187267)；四环素诱导型启动子(美国专利5057422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B，中国专利200710099169.7)，种子贮存蛋白质特异的启动子，例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的植物表达载体构建含有所述表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
第三方面，本发明要求保护一种植物抗病剂，所述植物抗病剂含有前文所述的蛋白质或前文所述的相关生物材料，所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。
第四方面，本发明要求保护一种前文所述蛋白质或前文所述生物材料的应用，所述应用为如下任意一种：
P1、在调控植物抗病性中的应用；
P2、在制备提高植物抗病性产品中的应用；
P3、在培育抗病植物中的应用；
P4、在制备植物抗病产品中的应用；
P5、在植物育种中的应用；
在所述应用中，在所述植物中，前文所述蛋白(TaLM3D)的含量和/或活性降低，所述植物的抗病性降低。或前文所述蛋白质(TaLM3D)编码基因的表达量降低，所述植物的抗病性降低。
第五方面，本发明要求保护一种培育抗病植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中前文所述蛋白的含量和/或活性或其编码基因的表达量，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性。
上述方法中，提高所述目的植物中所述蛋白质(TaLM3D)的含量可通过提高所述目的植物中所述蛋白质(TaLM3D)编码基因的表达量来实现，进一步可通过将所述蛋白质(TaLM3D)编码基因导入所述目的植物实现。
上述方法中，其中所述蛋白质(TaLM3D)编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。
所述蛋白质(TaLM3D)编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition))。
上述方法中，所述抗病植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
第六方面，本发明要求保护一种培育抗病性降低的转基因植物的方法包括如下步骤：降低所述目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。
上述方法中，降低所述目的植物中前文所述蛋白质(TaLM3D)编码基因的表达量可通过将与SEQ ID No.1的第1091-1285位核苷酸所示的DNA片段(即SEQ ID No.3)反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上文中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。
进一步，所述单子叶植物具体可为小麦。
上文中，所述抗病可为抗小麦茎基腐病和/或抗小麦纹枯病。
进一步，所述所述小麦茎基腐病可由假禾谷镰孢菌(Fusariumpseudograminearum)引起。小麦纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
实验证明：采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaLM3D基因，结果显示TaLM3D基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌和茎基腐病的防御能力，上述结果说明TaLM3D是小麦抗纹枯病和茎基腐病反应所必需的基因，也从反向证明TaLM3D是小麦抗纹枯病和茎基腐病的重要基因。本发明所提供的TaLM3D基因为植物抗病相关基因，本发明对于培育新的植物抗病品种具有重要意义。
附图说明
图1为定量PCR分析在CI12633中TaLM3D基因应答禾谷丝核菌胁迫的转录表达。
图2为定量PCR分析在接种禾谷丝核菌4天的抗纹枯小麦品种与感纹枯小麦品种中TaLM3D基因应答转录表达。
图3为定量PCR分析TaLM3D基因在接种禾谷丝核菌4天的CI12633不同组织中的表达结果图。
图4为定量PCR检测BSMV:TaLM3D感染小麦中TaLM3D基因的沉默情况图。(纹枯)
图5为定量PCR检测BSMV:TaLM6D感染小麦中禾谷丝核菌的相对生物量。
图6为对照小麦与TaLM3D基因沉默小麦的纹枯病的病级鉴定结果。
图7为定量PCR分析在CI12633中TaLM3D基因应答茎基腐病菌胁迫的转录表达。
图8为定量PCR分析在接种茎基腐病菌4天的抗茎基腐小麦品种与感茎基腐小麦品种中TaLM3D基因应答转录表达。
图9为接种BSMV后小麦叶片症状及半定量检测BSMV转录水平的结果。
图10为定量PCR检测BSMV:TaLM3D感染小麦中TaLM3D基因的沉默情况。(茎基腐)
图11为对照小麦与TaLM3D基因沉默小麦的茎基腐病的病级鉴定结果。
各图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中小麦CI12633、Nivat14为来自江苏省农业种质资源保护与利用平台(江苏农业科学院种质资源库)的种质，小麦CI12633、Nivat14表现为抗茎基腐病、抗纹枯病。小麦品种中国春、山红麦、温麦6号为来自中国农业科学院种质资源库的种质，中国春和山红麦表现为中抗茎基腐病、纹枯病，温麦6号表现为高感纹枯病(参考文献：XiuliangZhu,Chungui Lu,Lipu Du,Xingguo Ye,，Xin Liu,Anne Coules,Zengyan Zhang,2017，Thewheat NB-LRR gene TaRCR1 is required for host defence response to thenecrotrophic fungal pathogen Rhizoctonia cerealis，Plant BiotechnologyJournal，15,674-687)。扬麦9号、扬麦158来源于江苏里下河地区农业科学研究所，表现为感纹枯病、茎基腐病(参考文献：Xujiang Wu,Kai Cheng,Renhui Zhao,Shujiang Zang,Tongde Bie,Zhengning Jiang,Ronglin Wu,Derong Gao,Boqiao Zhang.2017,Quantitative trait loci responsible for sharp eyespot resistance in commonwheat CI12633，Scientific Reports,7:11799)。
下述实施例中的小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207(Ji L,Liu C,Zhang L,Liu A,Yu J.Variation of rDNA internal transcribed spacersequences in Rhizoctonia cerealis.Current Microbiology.2017,74,877–884)，引自山东农业大学植物保护学院于金凤教授。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)WHF220由山东农业大学植物保护学院于金凤教授和张莉博士分离、赠送。
下述实施例中BSMV病毒载体的3个组分BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ质粒(刘晓东,张增艳,姚乌兰,辛志勇.Implement of barley stripe mosaic virus-based induced genesilencing in wheat.Acta Agron Sin(作物学报),2005,31(11):1518–1520；赵丹,赵继荣,黄茜,李宁,刘艳,黄占景,张增艳.利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能.作物学报,2011,37(11):2106-2110)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中BSMV-γ：GFP质粒，从美国引入，参考文献：Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing inamonocot plant.The Plant Journal 30,315-327。本实验室保存。
小麦纹枯病病级标准(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)，具体见表1。
表1小麦纹枯病病级标准
其中，0级代表免疫、1级代表抗、2级代表中抗、3级-4级代表中感、5级代表高感。
病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。
小麦茎基腐病分级标准，按照周淼平等方法(周淼平，姚金保，张鹏，余桂红，马鸿翔.小麦抗茎腐病种质筛选及鉴定新方法的建立.植物遗传资源学报2016，17(2):377-382)，略有修改，具体见2。
表2小麦茎基腐病分级标准
实施例1小麦抗病蛋白TaLM3D及其编码基因的克隆
1、TaLM3D基因的克隆
本发明的发明人从抗茎基腐病、纹枯病小麦种质CI12633中分离克隆出一个广谱抗病的小麦蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将其命名为TaLM3D蛋白。将编码TaLM3D蛋白的基因命名为TaLM3D基因，如SEQ ID No.1所示，具体克隆方法如下：
提取接种茎基腐病菌的小麦CI12633茎部总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以TaLM3D-OF1：5'-ATGGCGCCGCCCCCGACCAC-3'和TaLM3D-OR1：5'-TCACAGCGAGGATCGCAGGC-3'为引物，进行PCR扩增，扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后98℃10秒，58℃30秒，68℃2.5分钟，共35个循环；68℃延伸5分钟；经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.1的第1-1257位所示(即为整个ORF序列)，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质TaLM3D。
实施例2、TaLM3D基因表达量与小麦对纹枯病抗性紧密相关
1、TaLM3D基因受纹枯病菌诱导的表达分析
在抗病小麦CI12633分蘖期的基部叶鞘与茎间，接种小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌WK207的菌丝牙签，在接种前(未接菌,None)以及接纹枯病菌WK207菌丝1d、2d、4d、7d、10d、14d，取抗纹枯病小麦品种CI12633的接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述小麦材料的RNA，纯化。
将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLM3D基因序列设计特异定量引物TaLM3D-QF/TaLM3D-QR，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method.Methods.25:402-408)分析未接菌(None)以及接纹枯病菌WK207菌丝1d、2d、4d、7d、10d、14d，抗病小麦CI12633中TaLM3D的表达情况，每组样品重复3次。
结果如图1所示。对TaLM3D基因表达量分析结果表明，接种禾谷丝核菌(纹枯病菌)前后的CI12633中的TaLM3D基因表达量受禾谷丝核菌诱导表达，在接种禾谷丝核菌4天时，TaLM3D基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量最高。
内参基因TaActin的引物对：
TaActin-F：5’-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3’；
TaActin-R：5’-GACCCAGACAACTCGCAAC-3’。
TaLM3D基因的特异引物对：
TaLM3D-QF：5’-CAATGCCCCCAAATACGCTG-3’；
TaLM3D-QR：5’-ACAGCCCATCCTTGAGCATC-3’。
2、TaLM3D基因表达量与小麦对纹枯病抗性程度紧密相关
接种小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌WK207后4天，采取抗纹枯病小麦品种/系(CI12633、山红麦)、及感病小麦品种(温麦6号以及扬麦9号)接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述6个小麦材料的RNA，纯化。将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLM3D基因序列设计特异定量引物TaLM3D-QF/TaLM3D-QR(引物见上文)，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2-△△CT method.Methods.25:402-408)，计算TaLM3D基因在不同抗纹枯病小麦与感病小麦材料中TaLM3D的相对表达量。结果如图2所示，抗病小麦材料CI12633以及山红麦中TaLM3D的表达量显著高于感病小麦温麦6号以及扬麦9号，说明TaLM3D基因表达量与抗性正相关，TaLM3D基因应该是抗纹枯病的重要基因。
3、TaLM3D基因在抗病小麦CI12633不同组织中表达特性的分析
接种小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌WK207后4天提取抗病小麦CI12633根部、叶片、叶鞘与茎部组织的RNA，纯化。将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLM3D基因序列设计特异定量引物TaLM3D-QF/TaLM3D-QR(引物见上文)，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod.Methods.25:402-408)，分析TaLM3D基因在抗病材料CI12633不同组织中的表达情况。结果如图3所显示的，接种禾谷丝核菌WK207 4天后，TaLM3D基因在小麦茎和鞘中受诱导上调，而小麦茎和鞘正是纹枯病发病部位，再次表明TaLM3D基因表达量与小麦抗性相关。其中茎中TaLM3D对小麦纹枯病致病菌胁迫响应进行表达上调的程度最高，小麦茎部对纹枯病反应的差异到茎部病斑的大小，也与小麦对纹枯病抗性程度成正比。
上述(图1-3)结果也表明，TaLM3D基因表达量在抗纹枯病小麦品种中表达量显著高于在感病小麦中，而且在纹枯病菌胁迫情况下，小麦茎部(纹枯病发生组织)中TaLM3D基因表达量最多。因此，TaLM3D可用于制备植物抗病剂，或构建TaLM3D基因过表达载体用于培育转基因抗病植物，也可以发展为分子标记进行分子标记辅助培育抗病小麦新品种。
实施例3、培育纹枯病抗性降低的小麦进行TaLM3D基因功能反向验证
一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaLM3D基因
1、将SEQ ID No.1的第1091-1285位核苷酸(SEQ ID No.3)所示的DNA片段的两末端分别带有NheI识别序列。NheI酶切后，将SEQ ID No.1的第1091-1285位核苷酸(SEQ IDNo.3)所示的DNA片段(194bp)以反向插入法插入到NheI酶线性化后的BSMV-γ(BMSV病毒的γ载体)上，得到重组载体BSMV-γ：antiTaLM3D，使与SEQ ID No.1的第1091-1285核苷酸(SEQ ID No.3)所示的DNA片段反向互补的DNA分子(antiTaLM3D)被γ载体的T7启动子驱动。
2、制备转录反应液
(1)取BSMV-α质粒，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-α。取BSMV-β质粒，用限制性内切酶SpeI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-β。取重组质粒BSMV-γ：antiTaLM3D、BSMV-γ：GFP，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，分别命名为线性化的BSMV-γ：antiTaLM3D、线性化的BSMV-γ：GFP
(2)取线性化质粒，采用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit(Promega)，进行体外转录反应，得到转录反应液。
线性化的载体为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-α。线性化的载体为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-β。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：GFP时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：GFP。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：TaLM3D时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：TaLM3D。
3、BSMV接种小麦植株
取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ：TaLM3D或转录反应液BSMV-γ：GFP，混匀，然后加入60μl RNase-freeddH2O，再加入90μl GKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K2HPO4、1％ Bentonite和1％Celite，pH9.2)，混合，得到BSMV：TaLM3D病毒混合液或BSMV：GFP病毒混合液。待小麦CI12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取BSMV：TaLM3D病毒混合液或BSMV：GFP病毒混合液，摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％ DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后每隔6h在叶片表面喷施0.1％ DEPC水溶液。
4、接种第14天取第四片叶片，提取RNA，采用RT-qPCR检测TaLMD基因沉默情况，所用引物为TaLM3D-QF和TaLM3D-QR。
TaLM3D-QF：5’-CAATGCCCCCAAATACGCTG-3’；
TaLM3D-QR：5’-ACAGCCCATCCTTGAGCATC-3’。
结果如图4所示：导入BSMV-γ：TaLM3D的CI12633植株中TaLM3D基因表达量被显著降低，得到TaLM3D基因沉默的CI12633(命名为BSMV-γ：TaLM3D-CI12633)；而导入BSMV：GFP的CI12633(命名为BMSV：GFP-CI12633，作为对照)与野生型小麦CI12633中TaLM3D基因的表达量没有显著变化。
二、被沉默植株的抗病性鉴定
步骤一的小麦转染BSMV病毒21天后，采用牙签接种法，在这些小麦的基部叶鞘与茎间接种禾谷丝核菌WK207：将长满禾谷丝核菌WK207菌丝的牙签嵌入到基部第2叶鞘与茎之间，保湿7天，在禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207接种14天定量PCR分析禾谷丝核菌相对生物量(以RcActin表达量表示)，检测引物如下：
RcActin-F：5'-GCATCCACGAGACCACTTAC-3'；
RcActin-R：5’-GCGTCCCGCTGCTCAAGAT-3'。
结果如图5所示，TaLM3D基因表达沉默后的小麦叶鞘中禾谷丝核菌相对生物量显著高于对照(BMSV：GFP感染小麦CI12633植株作为对照)。
在禾谷丝核菌WK207接种35天后，对小麦接种茎部位进行纹枯病病级鉴定。2批次实验的病级鉴定结果如图6所示，TaLM3D基因表达沉默后的BSMV：TaLM3D植株茎部位的纹枯病病斑(平均病级为3.04和3.31)明显大于对照(BMSV:GFP)植株的病斑(平均病级为2.19和2.13)，表明TaLM3D基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaLM3D是CI12633抗纹枯病反应所需的基因。
实施例4、TaLM3D基因表达量与小麦对茎基腐病抗性紧密相关
本实施例将分析TaLM3D基因受茎基腐菌诱导的表达分析，具体如下：
在抗病小麦CI12633分蘖期的基部叶鞘与茎间，接种引发茎基腐病的假禾谷镰孢菌菌丝牙签，在接种前(未接菌，None)以及接种菌丝1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，取小麦品种CI12633的接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述小麦材料的RNA，纯化。
将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLM3D基因序列设计特异定量引物TaLM3D-QF/TaLM3D-QR，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method.Methods.25:402-408)分析未接菌以及接茎基腐菌丝1d、2d、3d、4d、7d抗病小麦CI12633中TaLM3D的表达情况，每组样品重复3次。
结果显示，结果如图7所示，对TaLM3D基因表达量分析结果表明，接种假禾谷镰孢菌(茎基腐病菌)前后的CI12633中的TaLM3D基因表达量受茎基腐菌诱导表达，在接种茎基腐菌4天时，TaLM3D基因在抗茎基腐菌小麦CI12633中的表达量最高。
内参基因TaActin的引物对：
TaActin-F：5’-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3’；
TaActin-R：5’-GACCCAGACAACTCGCAAC-3’。
TaLM3D基因的特异引物对：
TaLM3D-QF：5’-CAATGCCCCCAAATACGCTG-3’
TaLM3D-QR：5’-ACAGCCCATCCTTGAGCATC-3’
2、TaLM3D基因在茎基腐菌接种的不同小麦品种中的表达分析
接种茎基腐菌4天，采取抗病小麦品种/系(Nivat14、中国春、CI12633)及感病小麦品种(扬麦9以及扬麦158)接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述5个小麦材料的RNA，纯化。将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLM3D基因序列设计特异定量引物TaLM3D-QF/TaLM3D-QR(引物见上文)，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod.Methods.25:402-408)，计算TaLM3D基因在不同抗茎基腐病小麦与感病小麦材料中TaLM3D的相对表达量。结果如图8所示，抗病小麦(Nivat14、中国春、CI12633)中TaLM3D的表达量显著高于感病小麦(扬麦9以及扬麦158)，说明TaLM3D基因表达量与抗性正相关，TaLM3D基因应该是抗茎基腐病的重要基因。
实施例5、培育茎基腐病抗性降低的小麦进行TaLM3D基因功能反向验证
一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaLM3D基因
1、将SEQ ID No.1的第1091-1285位核苷酸(SEQ ID No.3)所示的DNA片段的两末端分别带有NheI识别序列。NheI酶切后，将SEQ ID No.1的第1091-1285位核苷酸(SEQ IDNo.3)所示的DNA片段((194bp)以反向插入法插入到NheI酶线性化后的BSMV-γ(BSMV病毒的γ载体)上，得到重组载体BSMV-γ：antiTaLM3D，使与SEQ ID No.1的第1091-1285位核苷酸(SEQ ID No.3)所示的DNA片段反向互补的DNA分子(antiTaLM3D)被γ载体的T7启动子驱动。
2、制备转录反应液
(1)取BSMV-α质粒，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-α。取BSMV-β质粒，用限制性内切酶SpeI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-β。取重组质粒BSMV-γ：antiTaLM3D和BSMV-γ：GFP，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，分别命名为线性化的BSMV-γ：antiTaLM3D和线性化的BSMV-γ：GFP
(2)取线性化质粒，采用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit(Promega)，进行体外转录反应，得到转录反应液。
线性化的载体为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-α。线性化的载体为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-β。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：GFP时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：GFP。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：TaLM3D时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：TaLM3D。
3、BSMV接种小麦植株
取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ：TaLM3D或转录反应液BSMV-γ：GFP，混匀，然后加入60μl RNase-freeddH2O，再加入90μl GKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K2HPO4、1％ Bentonite和1％Celite，pH9.2)，混合，得到BSMV：TaLM3D病毒混合液或BSMV：GFP病毒混合液。待小麦CI12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取BSMV：TaLM3D病毒混合液或BSMV：GFP病毒混合液，摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％ DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后每隔6h在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液。
4、接种第14天取第四片叶片，提取RNA，采用半定量PCR检测BSMV感染情况，采用RT-qPCR检测TaLM3D基因沉默情况。
用于检测BSMV感染情况的引物序列如下：
BSMV-CPF：5'-TGACTGCTAAGGGTGGAGGA-3'；
BSMV-CPR：5'-CGGTTGAACATCACGAAGAGT-3'。
用于检测TaLM3D基因沉默情况的引物序列如下：
TaLM3D-QF：5’-CAATGCCCCCAAATACGCTG-3’；
TaLM3D-QR：5’-ACAGCCCATCCTTGAGCATC-3’。
结果如图9所示：接种BSMV 21天时，小麦叶片出现了明显的白色条纹症状，使用BSMV外壳蛋白基因(CP gene)特异引物进行扩增，得到了清晰的单一条带，表明BSMV成功侵染了小麦叶片。
如图10所示，转染入BSMV：TaLM3D的CI12633植株中，TaLM3D基因表达量被显著降低，得到TaLM3D基因沉默的CI12633(命名为BSMV：TaLM3D-CI12633)；而导入BSMV：GFP的CI12633(命名为BSMV：GFP-CI12633，作为对照)与野生型小麦CI12633中TaLM3D基因的表达量没有显著变化。
二、被沉默植株的抗病性鉴定
步骤一的小麦转染BSMV病毒21天后，采用牙签接种法，在这些小麦的基部叶鞘与茎间接种假禾谷镰孢菌：将长满假禾谷镰孢菌菌丝的牙签嵌入到基部第2叶鞘与茎之间，保湿7天。在假禾谷镰孢菌接种21天后，对小麦接种的茎部位进行茎基腐病的病级鉴定。2批次实验的病级鉴定结果如图11所示，TaLM3D基因表达沉默后的BSMV：TaLM3D植株茎部位的茎基腐病病斑(平均病级为4.57和4.15)明显大于对照(BSMV：GFP)植株的病斑(平均病级为2.59和2.03)，表明TaLM3D基因沉默降低了小麦CI12633对茎基腐菌的防御能力，上述结果说明TaLM3D是CI12633抗小麦茎基腐病反应所需的重要基因。因此，TaLM3D可用于制备植物抗病剂，或构建TaLM3D基因过表达载体用于培育转基因抗病植物，也可以发展为分子标记进行分子标记辅助育种。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
SEQ ID No.1：
ATGGCGCCGCCCCCGACCACTAGCGCCCCCGACGGCGGCCTGGATCCCAGGGACGTGTGCGTCGTCGGCGTCGCCCGCACGCCCATCGGCGCCCTGCTCGGCTCCCTCTCCTCCCTCCCCGCCACCAGGCTCGGCTCCGTCGCCATCCAGGGCGCTCTCCGGCGAGCCAGCGTCGACCCGGCGCTGGTGCAGGAGGTGTTCATGGGCAACGTCCTCAGCGCCAACCTCGGCCAGGCCCCCGCCAGGCAGGCCGCCCTCGGCGCCGGCCTGCCCAACACCGTCCCCTGCACCACCGTCAACAAAGTCTGCTCCTCAGGGATGAAGGCTGTCATGCTTGCGGCACAGTCGATTCAGCTGGGGATCAACGACGTCGTGGTCGCCGGCGGCATGGAGAGCATGTCCAATGCCCCCAAATACGCTGCAACGGCAAGACGAGGATCGCGGTTTGGGCATGACGTCCTCATCGACGGGATGCTCAAGGATGGGCTGTGGGATGTGTATAATGATTTCCATATGGGGATGTGCGCTGAGCTCTGTGCAGATCAGCACTCGATTACAAGGGAGGAGCAGGATGCTTATGCTGTCCAGAGCAATGAGCACGGAATAGCAGCTCGAGACAGCGGCGCGTTTGATTGGGAAATTGTTCCGGTTGAAATTCCTTCTGGTAGAGGCAGACCGCCAGTTGTTGTTGACAAAGATGAGAGTCTTGCAAAGTACGATCCAGTGAAGCTGAAGAAACTTGGGCCGGCTTTTAAGAAGAATGGCTCTGTAACTGCCGGCAATTCTTCTAGTATAAGCGACGGTGCTGCTGCAATTGTGCTAGTCAGTGGGGAGAAAGCCAAGAACCTTGGCCTTCAAGTTCTTGCAAGGATCAGAGGGTACGCTGATGCTGCTCAGGCACCTGAGCTATTTACAACAACTCCAGCTCTTGCTATCCCAAAGGCTATATCAAACTCAGGTCTCCGAGATTCACAAATAGATTATTATGAGATAAATGAGGCTTTCTCGGTTGTTGCAGTGGCAAATCAGAGACTTCTTGGCATCTCTCCTGGAAAACTGAATATAAGTGGTGGCGCTGTTTCCCTGGGCCATCCTATCGGTTGCAGTGGTGCACGAATCATAGTCACCTTGCTCGGGATTCTTAGACAGAAACAGGGCAAGTTTGGGGTTGCCGGAGTATGCAACGGCGGGGGTGGTGCTTCAGCCATCGTCGTAGAGTCCATGCAAGCTTCGTCGCGCCTGCGATCCTCGCTGTGATGTGAAGTTTACCGTGAGCATGTTGGCAAGAAGAGCTGAGGTGTAAAGGTTGTTGTAAGTTGACTGTACCTTGTGTGAGGAGTGATCCATGGTGTATTAGGTCGGAACATGATGCATCGATCGATGAAAAGTGTGAAGATAATAAGGTGACCGTGTGCTGCTCGCGCATCCGCTCAGCGACTAGATGTAGTAAGATGACGTGCAGCAGAGGAGATGAA
SEQ ID No.2：
MAPPPTTSAPDGGLDPRDVCVVGVARTPIGALLGSLSSLPATRLGSVAIQGALRRASVDPALVQEVFMGNVLSANLGQAPARQAALGAGLPNTVPCTTVNKVCSSGMKAVMLAAQSIQLGINDVVVAGGMESMSNAPKYAATARRGSRFGHDVLIDGMLKDGLWDVYNDFHMGMCAELCADQHSITREEQDAYAVQSNEHGIAARDSGAFDWEIVPVEIPSGRGRPPVVVDKDESLAKYDPVKLKKLGPAFKKNGSVTAGNSSSISDGAAAIVLVSGEKAKNLGLQVLARIRGYADAAQAPELFTTTPALAIPKAISNSGLRDSQIDYYEINEAFSVVAVANQRLLGISPGKLNISGGAVSLGHPIGCSGARIIVTLLGILRQKQGKFGVAGVCNGGGGASAIVVESMQASSRLRSSL
SEQ ID No.3：
TCCTATCGGTTGCAGTGGTGCACGAATCATAGTCACCTTGCTCGGGATTCTTAGACAGAAACAGGGCAAGTTTGGGGTTGCCGGAGTATGCAACGGCGGGGGTGGTGCTTCAGCCATCGTCGTAGAGTCCATGCAAGCTTCGTCGCGCCTGCGATCCTCGCTGTGATGTGAAGTTTACCGTGAGCATGTTGGCA。

Claims (10)

1.一种抗纹枯病菌和茎基腐病的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下任意一种：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且来源于小麦的与植物抗病性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低权利要求1所述蛋白的编码基因表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下任意一种：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的第1-1257位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子。
4.一种植物抗病剂，其特征在于：所述植物抗病剂含有权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料，所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。
5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的应用，其特征在于：所述应用为如下任意一种：
P1、在调控植物抗病性中的应用；
P2、在制备提高植物抗病性产品中的应用；
P3、在培育抗病植物中的应用；
P4、在制备植物抗病产品中的应用；
P5、在植物育种中的应用；
P1-P5中的所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病；所述植物为小麦。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述纹枯病由禾谷丝核菌引起，所述茎基腐病由假禾谷镰孢菌引起。
7.一种培育抗病植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白的含量和/或活性或其编码基因的表达量，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性。
8.一种培育抗病性降低的转基因植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：降低所述目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，提高所述目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性或其编码基因的表达量是通过将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：降低所述目的植物中权利要求1所述蛋白的编码基因的表达量是通过将与SEQ ID No.1的第1091-1285核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。
CN202211545917.0A 2022-12-01 2022-12-01 小麦抗病蛋白TaLM3D及其相关生物材料与应用 Active CN116082478B (zh)

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