CN112552383B

CN112552383B - 转录因子hinge1在调控植物氮-磷稳态中的应用

Info

Publication number: CN112552383B
Application number: CN202011429001.XA
Authority: CN
Inventors: 储成才; 张志华; 胡斌; 李钊; 王威; 蒋志敏
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN112552383A

Abstract

本发明公开了一种转录因子HINGE1。外界硝酸盐诱导HINGE1表达，大量表达的HINGE1可激活下游磷饥饿诱导基因，增加磷吸收，从而维持水稻氮‑磷稳态。表达HINGE1基因的转基因水稻与受体水稻相比，对磷的吸收能力显著增强，说明HINGE1基因是与调控植物氮‑磷稳态相关的基因，HINGE1基因可用于协调植物的氮‑磷吸收。

Description

转录因子HINGE1在调控植物氮-磷稳态中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种转录因子HINGE1在调控植物氮-磷稳态中的应用。

背景技术

氮和磷是两种最重要的植物矿质营养元素，以氮肥和磷肥为代表的化肥投入，是促成现代农业“绿色革命”的重要因素之一。然而大量化肥投入也带来水体富营养化等诸多环境问题，此外，磷矿石属于不可再生资源，其储量也是有限的。随着全球人口的持续增加，如何在保证粮食产量增加的同时降低化肥投入，是一个亟待解决的问题。水稻(Oryzasativa L.) 作为重要粮食作物，其生产所面临的“减肥增效”问题尤为严峻。

包括氮磷在内的许多矿质元素在土壤中的分布存在非常大的异质性。因此整合不同营养元素信号通路、实现不同营养间的平衡，对于植物的生长发育至关重要。硝酸盐是植物吸收利用的一种重要氮源，同时也是一种调控植物生长发育的重要信号分子。已有研究发现，氮的增加可以促进磷的吸收，但对这一信号通路的认识还不全面。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何协调植物氮-磷的吸收利用。

本发明提供了一种蛋白质，名称为HINGE1，其为一种转录因子，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与 A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1 中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用 BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或 100％的同一性。

与HINGE1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与蛋白质HINGE1相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码HINGE1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B2)所述表达盒中启动子可为序列表中序列4所示的DNA分子。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)-b5)中任一所示的基因：

b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b3)编码链的核苷酸是序列表中序列1的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

其中，序列表中的序列2由1275个核苷酸组成，编码序列表中的序列3所示的蛋白质。

上述生物材料中，B2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(HINGE1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达HINGE1的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动HINGE1基因转录的启动子，还可包括终止HINGE1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J. 4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990) Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述HINGE1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等等。如pAHC25、pWMB123、 pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

本发明还提供一种DNA分子，其序列为如下c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列4所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

上述的蛋白质、或上述生物材料、或上述DNA分子在调控植物氮-磷稳态中的应用也属于本发明的保护范围。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为协调植物氮-磷吸收。

本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。

上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的协调植物氮-磷吸收效果确定。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育氮-磷稳态植物的方法。

本发明所提供的培育氮-磷稳态植物的方法，包括将编码所述蛋白质的核酸分子导入目的植物中，得到氮-磷稳态植物；所述氮-磷稳态植物相比所述目的植物对磷的吸收能力显著增强。

本发明所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为谷子、水稻。

本发明方法中，其中所述的核酸分子可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV 的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

所述的核酸分子可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

本发明所述培育氮-磷稳态植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

本发明所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明的实施例表明外界硝酸盐诱导HINGE1表达，大量表达的HINGE1可激活下游磷饥饿诱导基因，增加磷吸收，从而维持水稻氮-磷稳态。表达HINGE1基因的转基因水稻与受体水稻相比，对磷的吸收能力显著增强，说明HINGE1基因是与调控植物氮-磷稳态相关的基因，HINGE1基因可用于协调植物的氮-磷吸收。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同氮处理水稻RNA-seq分析结果图。其中图1的A为短期硝酸盐诱导处理(标为KNO₃)水稻及其对照(标为KCl)的RNA-seq分析结果图；图1的B 为供应不同氮源水稻RNA-seq分析结果图(纯铵处理标为NH₄Cl、纯硝处理标为KNO₃、铵硝1:1(以氮计，质量比)混合处理标为NH₄NO₃)；图1的C为供应不同氮源水稻qRT-PCR 分析结果图(纯铵处理标为NH₄Cl、纯硝处理标为KNO₃、铵硝1:1(以氮计，质量比)混合处理标为NH₄NO₃)；图1的D为短期硝酸盐诱导处理(标为KNO₃)水稻及其对照(标为 KCl)的qRT-PCR分析结果图。

图2为本发明实施例1中HINGE1不同转录本qRT-PCR分析结果图，其中第1转录本标为V1，和第2转录本标为V2。

图3为本发明实施例2中水稻不同组织中HINGE1的表达情况分析结果图。

图4为本发明实施例2中HINGE1自身启动子驱动GUS报告基因的转基因株系幼苗不同发育时期根GUS染色结果图。

图5为本发明实施例3中HINGE1转录因子特性分析结果图。其中图5的A为35S启动子驱动的HINGE1蛋白C端融合eGFP(HINGE1-eGFP(C))在水稻叶肉细胞原生质体中的定位结果图；图5的B为萤火虫萤光素酶(LUC)报告基因的表达相关载体示意图；图5的C 为萤火虫萤光素酶(LUC)报告基因的相对萤光强度结果图。

图6为本发明实施例4中HINGE1过表达株系的磷吸收结果图。其中图6的A为HINGE1过表达株系的植株照片；图6的B为HINGE1过表达株系的叶片照片；图6的C为HINGE1 过表达株系的无机磷含量；图6的D为HINGE1过表达株系的HINGE1的表达量；图6的E 为不同磷处理下HINGE1过表达株系的无机磷含量。

图7为本发明实施例4中HINGE1过表达株系中磷酸盐转运蛋白基因的表达量。

图8为本发明实施例4中HINGE1过表达株系中磷饥饿诱导基因的表达量。

图9为本发明实施例4中利用双萤光素酶报告系统分析HINGE1对磷酸盐转运蛋白基因启动子的转录激活的结果图，其中图9的A为相关载体示意图，图9的B为双萤光素酶报告系统分析结果。

图10为发明实施例4中hinge1突变体中硝酸盐诱导的磷响应分析结果图。其中图10的 A为磷饥饿诱导基因OsIPS1在不同氮处理下的表达量，图10的B为磷饥饿诱导基因OsPT6 在不同氮处理下的表达量。

图中，*表示显著性分析结果为0.01<P<0.05；**表示显著性分析结果为0.001<P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、植物材料

下述实施例中的水稻品种中花11(ZH11)，记载于非专利文献“Lu,Y.,Ye,X.,Guo,R., Huang,J.,Wang,W.,Tang,J.,Tan,L.,Zhu,J.-k.,Chu,C.,and Qian,Y.(2017).Genome-wide targeted mutagenesis in rice using the CRISPR/Cas9system.Mol.Plant 10:1242-1245.”，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的水稻品种Hwayoung(HY)，记载于非专利文献“Jakyung Yi,Gynheung An.Utilization ofT-DNA Tagging Lines in Rice.J.Plant Biol.(2013)56:85-90”，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的水稻hinge1突变体为水稻品种Hwayoung缺失HINGE1基因的突变体，来自韩国水稻突变体库(Crop Biotech Institute,Kyung Hee University,RepublicofKorea, http://www.postech.ac.kr/life/pfg/risd)，订购网址为http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE5，该水稻hinge1突变体的对应编号为PFG_2B-60306.R。具体构建方法记载于“Jakyung Yi, Gynheung An.Utilization ofT-DNATagging Lines in Rice.J.Plant Biol.(2013)56:85-90”一文。公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

2、载体

下述实施例中的载体pCAMBIA2391Z：记载于“Hu,B.,Wang,W.,Ou,S.,Tang,J.,Li,H., Che,R.,Zhang,Z.,Chai,X.,Wang,H.,Wang,Y.,et al.(2015).Variation in NRT1.1Bcontributes to nitrate-use divergence between rice subspecies.Nat.Genet.47:834-838.”一文公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

下述实施例中的载体pCAMBIA2300-35S-eGFP(C)：记载于“Hu,B.,Wang,W.,Ou,S.,Tang,J.,Li,H.,Che,R.,Zhang,Z.,Chai,X.,Wang,H.,Wang,Y.,et al.(2015).Variationin NRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between ricesubspecies.Nat.Genet.47:834-838.” 一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

下述实施例中的载体35S-GAL4DB：记载于“Guo,X.,Hou,X.,Fang,J.,Wei,P.,Xu,B., Chen,M.,Feng,Y.,and Chu,C.(2013).The rice GERMINATION DEFECTIVE 1,encoding a B3 domain transcriptional repressor,regulates seed germination andseedling development by integrating GA and carbohydrate metabolism.PlantJ.75:403-416.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

下述实施例中的载体35S-GAL4DB-VP16：记载于“Guo,X.,Hou,X.,Fang,J.,Wei,P.,Xu, B.,Chen,M.,Feng,Y.,and Chu,C.(2013).The rice GERMINATION DEFECTIVE 1,encoding a B3 domain transcriptional repressor,regulates seed germination andseedling developmentby integrating GA and carbohydrate metabolism.Plant J.75:403-416.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

下述实施例中的载体pCAMBIA2301-Actin1：记载于“Wang,W.,Hu,B.,Yuan,D.,Liu,Y., Che,R.,Hu,Y.,Ou,S.,Zhang,Z.,Wang,H.,Li,H.,et al.(2018).Expressionofthe nitrate transporter gene OsNRT1.1A/OsNPF6.3 confers high yield andearly maturation in rice.Plant Cell 30:638-651.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

下述实施例中的载体pCAMBIA2300-35S-OCS记载于“Hu,B.,Wang,W.,Ou,S.,Tang,J., Li,H.,Che,R.,Zhang,Z.,Chai,X.,Wang,H.,Wang,Y.,et al.(2015).VariationinNRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between ricesubspecies.Nat.Genet.47:834-838.”一文公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

下述实施例中的载体pGreenII 0800-LUC：记载于“Gao,S.,Fang,J.,Xu,F.,Wang,W.,and Chu,C.(2016).Rice HOX12 Regulates Panicle Exsertion by DirectlyModulating the Expression ofELONGATED UPPERMOST INTERNODE1.Plant Cell 28:680-695.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

实施例1 HINGE1基因的分析和克隆

1、HINGE1基因的分析

发明人首先对供应不同氮源的水稻品种ZH11的幼苗进行了转录组分析(RNA-seq)，结果见图1的B(纯铵处理标为NH₄Cl、纯硝处理标为KNO₃、铵硝1:1(以氮计，质量比)混合处理标为NH₄NO₃)；发明人对在短期硝酸盐诱导的水稻幼苗进行了转录组分析(RNA-seq)，结果见图1的A(短期硝酸盐诱导处理标为KNO₃，KCl为对照)。

根据上述结果，通过筛选受硝酸盐诱导转录因子，发明人得到一个在根中受硝酸盐诱导最强的基因(LOC_Os04g56990)，该基因编码GARP类MYB家族转录因子，将其命名为HINGE1(Highly Induced by Nitrate Gene 1)。

根据水稻基因组注释MSU7.0，LOC_Os04g56990有3个转录本，结合RNA-seq分析结果，以第1个转录本(V1)表达量最高。发明人进一步利用qRT-PCR对第1转录本(V1) 和第2转录本(V2)的表达情况进行了分析。

第1转录本(V1)特异的qRT-PCR引物如下：

qHINGE1-1F：5’-GCCGGGTTCCAGTCCAAAAT-3’；

qHINGE1-1R：5’-ACTTTCGCCAACTACACGGG-3’。

第2转录本(V2)特异的qRT-PCR引物序列为：

qHINGE1-2F：5’-TAGCGAAGTACATGCCAGCG-3’；

qHINGE1-2R：5’-TGGGATTTGGGACTGGTTCG-3’。

分析结果见图2，证明第1转录本(V1)表达量确实显著高于第2转录本(V2)。

因此，本发明针对第1转录本(V1)进行功能研究。通过HINGE1基因编码区全长引物进行PCR扩增，HINGE1基因编码区全长引物如下：

FL-HINGE1-F：5’-ATGTTGCAAGATATCATGAA-3’；

FL-HINGE1-R：5’-CTAGCTTATTTTGGACTGGA-3’。

测序鉴定结果与网站预测一致，HINGE1基因组序列见序列表的序列1，共有3634个核苷酸，包含6个内含子，HINGE1编码区序列见序列表的序列2，含有1275个碱基，编码424个氨基酸(序列见序列表的序列3)。

2、HINGE1基因的克隆

2.1水稻总RNA提取

(1)取适量新鲜水稻材料(液氮或-80℃冰箱保存)，置于液氮预冷的研钵中，用液氮迅速研磨成粉末，快速转移至液氮预冷过的2mL离心管中；

(2)加入1mL TRIzol(Invitrogen)，涡旋振荡器上混匀，于冰上放置10min；

(3)加入500μL氯仿，涡旋振荡器上剧烈振荡15s，室温放置10min；

(4)4℃，12,000rpm离心10min，吸取500μL上清至1.5mL离心管中；

(5)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上放置30min后，4℃，12,000rpm离心10min；

(6)弃上清，用1mL DEPC-H₂O配制的70％乙醇清洗沉淀，然后4℃，12,000rpm离心1min；

(7)吸尽上清，室温下晾干，然后加入50μL DEPC-H₂O溶解，紫外分光光度计Nano-drop 测定RNA的浓度和质量，于-80℃长期保存。

注意：该实验过程中的离心管和枪头均为Axygen公司的RNase-free产品。

2.2 mRNA反转录

反转录采用试剂盒ReverTraAce qPCRRT Master Mix with gDNA Remover(Toyobo)。具体步骤如下：

(1)根据1.2.1测定的RNA浓度计算2μg总RNA所需体积，加入到Nuclease-free PCR管中，并用Nuclease-free H₂O补至总体积12μL，PCR仪上65℃温育5min后迅速放在冰上冷却2min；

(2)加入4μL 4×DN MasterMix(预先加入gDNA Remover)，混匀后置于37℃温育5min，随后迅速在冰上冷却2min；

(3)加入4μL 5×RT MasterMix II至终体系为20μL，混匀后与PCR仪上按照如下程序进行反应。37℃，30min；50℃，5min；98℃，5min；16℃，5min。

(4)反应结束后的cDNA置于-20℃条件下保存备用。

实施例2、HINGE1基因的表达分析

1、供应不同氮源的水稻HINGE1表达分析

发明人利用qRT-PCR(引物为qHINGE1-1F和qHINGE1-1R)对供应不同氮源的水稻ZH11 幼苗的HINGE1表达情况进行了分析，结果见图1的C，同时对短期(0.5，1，2，4，8，16，24小时)不同浓度(0mM、0.2mM、5mM)硝酸盐诱导的水稻幼苗的HINGE1表达情况进行了分析，结果见图1的D。上述结果均证明HINGE1受硝酸盐诱导表达。

2、水稻不同组织HINGE1表达分析

2.1qRT-PCR分析

进一步利用qRT-PCR对水稻不同组织中HINGE1的表达情况进行分析，所用引物为qHINGE1-1F和qHINGE1-1R，结果发现HINGE1在根中表达量最高(见图3)。

2.2转基因水稻表达分析

发明人还通过构建HINGE1自身启动子驱动GUS报告基因的转基因株系，对幼苗不同发育时期的根进行了GUS染色观察，具体过程如下：

2.2.1构建HINGE1_Pro-GUS载体

针对载体pCAMBIA2391Z设计包含In-Fusion接头的引物，引物序列如下：

HINGE1-GUS-F:5’

(下划线指示的序列为HindⅢ酶识别位点序列，加粗字体指示的序列为In-Fusion接头序列)；

HINGE1-GUS-R:5’

(双下划线指示的序列为EcoRI酶识别位点序列，加粗字体指示的序列为In-Fusion接头序列)。

以水稻ZH11基因组DNA为模板扩增HINGE1启动子(2kb)，所用引物对由 HINGE1-GUS-F和HINGE1-GUS-R组成，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒将其连入HindⅢ和EcoRI酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA2391Z，得到以HINGE1启动子(其序列为序列表序列4)替换pCAMBIA2391Z载体的限制性核酸内切酶HindⅢ和EcoRI 识别位点间的片段，保持pCAMBIA2391Z载体的其它序列不变的重组表达载体，即 HINGE1_Pro-GUS载体，命名为pCAMBIA2391Z-HINGE1_Pro-GUS。

2.2.2获得HINGE1自身启动子驱动GUS报告基因的转基因株系

水稻遗传转化采用的是农杆菌介导转化水稻愈伤组织的方法。具体方法如下：挑取含有 pCAMBIA2391Z-HINGE1_Pro-GUS的阳性农杆菌单菌落，接种于10mL的YEP液体培养基中 (含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)，28℃，200rpm摇床培养2-3天。取4mL菌液， 4,000rpm离心3min，倒去上清液，加入少量AAM液体培养基重悬细菌，然后加入20mL AAM 培养基(含0.1mM乙酰丁香酮As)，28℃，150rpm摇床避光培养1-2h，培养至OD₆₀₀＝0.4 左右。挑选生长状态良好、颗粒状水稻ZH11愈伤组织浸入农杆菌培养液中，28℃，150-200 rpm，20min。浸润后，将愈伤倒出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到NB共培养基上，黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至含30mg/L潮霉素或150mg/L G418，以及400mg/L头孢霉素的NB培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含50mg/L潮霉素或200mg/L G418，以及200mg/L头孢霉素的NB培养基)上筛选3周。将抗性愈伤转入分化培养基上(30mg/L潮霉素或200mg/L G418)进行分化，再生植株在含30mg/L潮霉素或200mg/L G418的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中，得到HINGE1自身启动子驱动GUS报告基因的转基因株系。

2.2.3 HINGE1自身启动子驱动GUS报告基因的转基因株系中HINGE1的表达分析

对T2代的HINGE1自身启动子驱动GUS报告基因的转基因株系幼苗不同发育时期的根进行了GUS染色观察，观察结果结果见图4，发现在萌发3天后的幼苗的根中，HINGE1在靠近根尖区主要在中柱细胞中表达(见图4的A，图4的B)，而在成熟区的中柱细胞和表皮细胞中都有表达(见图4的A，图4的C)。而继续水培10天之后的根中，HINGE1在根的不同部位中表达存在明显差异：在靠近根尖的成熟区，HINGE1在根毛、皮层和中柱中均有表达(见图4的D，图4的G)；在靠近基部的成熟区，侧根发育完成之后，HINGE1在主根中不表达，而在侧根的中柱细胞表达(见图4的D，图4的E)；在成熟区中分化出侧根的过渡区，随着侧根原基的发育，HINGE1逐渐由在主根的中柱区表达，过渡为在侧根中表达(见图4的D，图4的F)。因此，HINGE1在根中的表达模式与根的发育状态密切相关，暗示其在根中可能具有重要作用。

实施例3、HINGE1转录因子特性分析

1、亚细胞定位分析

转录因子一般情况下在细胞核内行使其转录激活或抑制功能，发明人对HINGE1进行了亚细胞定位分析。因此发明人构建了35S启动子驱动的HINGE1蛋白C端融合eGFP(enchanced GFP)的质粒，并转化水稻原生质体，具体步骤如下：

1.1构建HINGE1-eGFP载体

针对pCAMBIA2300-35S-eGFP(C)载体设计包含In-Fusion接头的引物，引物序列如下：

HINGE1-GFP-F:5’

(下划线指示的序列为 KpnI酶识别位点序列，加粗字体指示的序列为In-Fusion接头序列)；

HINGE1-GFP-R:5’

(双下划线指示的序列为BamHI酶识别位点序列，加粗字体指示的序列为In-Fusion接头序列)。

以实施例1获得的水稻ZH11 cDNA为模板扩增HINGE1全长CDS(不包含终止密码子)，所用引物对由HINGE1-GFP-F和HINGE1-GFP-R组成，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒将其连入KpnI和BamHI酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA2300-35S-eGFP(C)，得到以HINGE1全长CDS(不包含终止密码子，其序列为序列2的第1-1272位)替换pCAMBIA2300-35S-eGFP(C)载体的限制性核酸内切酶KpnI和BamHI识别位点间的片段，保持pCAMBIA2300-35S-eGFP(C)载体的其它序列不变的重组表达载体，命名为 pCAMBIA2300-35S-HINGE1-eGFP(C)。

1.2利用水稻原生质体观察HINGE1蛋白C端融合eGFP的蛋白的亚细胞定位

将pCAMBIA2300-35S-HINGE1-eGFP(C)转化水稻ZH11叶肉细胞原生质体，

通过激光共聚焦显微镜观察观察发现，HINGE1-eGFP(C)定位在细胞核中，与细胞核特异染料DAPI的信号重叠(见图5的A)。

2、转录激活或抑制活性分析

2.1构建GAL4DB-HINGE1嵌合载体

利用基于GAL4的嵌合转录因子技术，发明人在水稻原生质体系统中对HINGE1是否具有转录激活或抑制活性进行了分析。GAL4DB可以结合报告载体中的5×GAL4结合元件，因此融合GAL4DB后的转录因子如果具有转录激活活性，就可以激活萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase,LUC)报告基因的表达(载体示意图见图5的B)。

2.1.1针对载体35S-GAL4DB设计包含In-Fusion接头的引物，引物序列如下：

GAL4-HINGE1-F：5’

(下划线指示的序列为XbaI酶识别位点序列，加粗字体指示的序列为In-Fusion接头序列)；

GAL4-HINGE1-R：5’

(下划线指示的序列为XbaI酶识别位点序列，加粗字体指示的序列为In-Fusion接头序列)。

以实施例1获得的水稻ZH11 cDNA为模板扩增HINGE1全长CDS(不包含终止密码子，其序列为序列2的第1-1272位)，所用引物对由GAL4-HINGE1-F和GAL4-HINGE1-R组成， PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒将其连入用XbaI酶切线性化后的35S-GAL4DB，得到利用XbaI酶将HINGE1全长CDS(不包含终止密码子，其序列为序列2的第1-1272 位)插入至35S-GAL4DB载体中，保持35S-GAL4DB载体的其它序列不变的重组表达载体，命名为GAL4DB-HINGE1。GAL4DB-HINGE1载体示意图见图5的B，标为GAL4DB-HINGE1， 35S-GAL4DB载体标为GAL4DB。

2.1.2针对载体35S-GAL4DB-VP16载体设计包含In-Fusion接头的引物，引物序列如下：

VP16-HINGE1-F：5’

VP16-HINGE1-R:5’

以实施例1获得的水稻ZH11 cDNA为模板扩增HINGE1全长CDS(不包含终止密码子，其序列为序列2的第1-1272位)，所用引物对由VP16-HINGE1-F和VP16-HINGE1-R组成， PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒将其连入用XbaI酶切线性化后的 35S-GAL4DB-VP16载体，得到利用XbaI酶将HINGE1全长CDS(不包含终止密码子，其序列为序列2的第1-1272位)插入至35S-GAL4DB-VP16载体中，保持35S-GAL4DB-VP16载体的其它序列不变的重组表达载体，命名为HINGE1-VP16。HINGE1-VP16载体示意图见图 5的B，标为HINGE1-VP16，35S-GAL4DB-VP16载体标为VP16。

2.2水稻原生质体中验证转录激活或抑制活性

利用所获得的GAL4DB-HINGE1、GAL4DB、HINGE1-VP16、VP16载体转化水稻叶肉细胞原生质体，采用双萤光素酶报告系统检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter AssaySystem, Promega)和GLOMAX 20/20单管型化学发光检测仪(Promega)检测萤火虫萤光素酶(LUC)相对萤光强度，结果见图5的C，表明：GAL4DB-HINGE1的转录激活活性显著高于GAL4DB 空载体，说明HINGE1具有转录激活活性。强转录激活子VP16与HINGE1融合后(HINGE1-VP16)，融合蛋白的转录激活活性显著低于VP16，暗示HINGE1蛋白可能还具有转录抑制活性。

实施例4、HINGE1调控水稻磷吸收

1、HINGE1对水稻磷吸收的影响

为了进一步研究HINGE1的功能，发明人构建了HINGE1过量表达的转基因水稻株系。具体如下：

1.1构建HINGE1过表达载体

针对pCAMBIA2301-Actin1载体设计包含In-Fusion接头的引物，引物序列如下：

HINGE1-OE-F：5’

(下划线指示的序列为XmaI酶识别位点序列，加粗字体指示的序列为In-Fusion接头序列)；

HINGE1-OE-R:5’

以实施例1获得的水稻ZH11 cDNA为模板，以HINGE1-OE-F和HINGE1-OE-R组成的引物对扩增HINGE1全长CDS(包含终止密码子)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒将其连入XmaI和XbaI酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA2301-Actin1，得到以HINGE1全长CDS(包含终止密码子，其序列为序列2)替换pCAMBIA2301-Actin1载体的限制性核酸内切酶XmaI和XbaI识别位点间的片段，保持pCAMBIA2301-Actin1载体的其它序列不变的重组表达载体，即HINGE1过表达载体，命名为 pCAMBIA2301-Actin1-HINGE1。

1.2获得HINGE1过表达株系

将pCAMBIA2301-Actin1-HINGE1转入水稻HY，具体转化方法参照实施例2中2.2.2的转化方法，获得HINGE1过表达株系8株，选其中3株分别命名为HINGE1-OE1、HINGE1-OE2和HINGE1-OE3。

1.3 HINGE1过表达株系对磷的吸收

材料为HINGE1过表达株系HINGE1-OE1(标为OE1)、HINGE1-OE2(标为OE2)和HINGE1-OE3(标为OE3)为，对照为野生型HY(标为WT)。

田间种植的HINGE1-OE1、HINGE1-OE2和HINGE1-OE3均表现出叶尖干枯坏死的表型(见图6的A，图6的B)，与之前报道的OsPHR2过表达和OsPHO2突变体ltn1造成的磷毒害表型类似。因此，发明人检测了HINGE1-OE1、HINGE1-OE2和HINGE1-OE3株系叶片中的无机磷含量，结果发现，HINGE1-OE1、HINGE1-OE2和HINGE1-OE3株系的无机磷含量显著高于野生型(见图6的C)，HINGE1-OE1、HINGE1-OE2和HINGE1-OE3叶尖干枯坏死是由无机磷过量积累造成的磷毒害而导致，而且与HINGE1的表达量存在正相关(见图6 的D)。此外，发明人还在水培条件下，分别为HINGE1-OE1、HINGE1-OE2和HINGE1-OE3 株系提供高磷(正常木村营养液，其中的磷浓度为0.18mM KH₂PO₄)和低磷(低磷木村营养液，磷浓度为正常木村营养液的1/10，0.018mM KH₂PO₄)营养液，并检测了地上部分的磷浓度，结果发现，不论是在高磷还是低磷条件下，HINGE1-OE1、HINGE1-OE2和HINGE1-OE3 株系都能够积累更多的无机磷(见图6的E)。

2、过表达株系中磷酸盐转运蛋白基因的表达水平

植物主要通过PHT1家族的磷酸盐转运蛋白来吸收磷酸盐，在水稻中PHT1家族共有13 个成员(OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT6、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT10、OsPT11、OsPT12、OsPT13)。由于HINGE1-OE1和HINGE1-OE2株系中无机磷过量积累，发明人首先对过表达株系HINGE1-OE1和HINGE1-OE2中磷酸盐转运蛋白基因的表达水平进行了检测，结果发现，与对照野生型HY(WT)相比许多磷酸盐转运蛋白基因的表达量在 HINGE1-OE1和HINGE1-OE2株系中都显著上调，例如OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、 OsPT6、OsPT8、OsPT9、OsPT10、OsPT11、OsPT13(见图7)。

此外，与对照野生型HY(WT)相比，HINGE1过量表达株系HINGE1-OE1和HINGE1-OE2中许多磷饥饿诱导基因(OsIPS1、OsIPS2、OsRB3、OsSQD2)的表达也受到上调(见图8)。

所用到的qRT-PCR引物见表1：

表1 qRT-PCR相关引物

3、HINGE1对磷酸盐转运蛋白基因的转录水平的调控

为了进一步确认HINGE1是否能够在转录水平上激活这些磷酸盐转运蛋白基因，发明人利用双萤光素酶报告系统在水稻原生质体瞬时转化体系中进行了验证，具体如下：

3.1构建双萤光素酶报告系统中相关载体

3.1.1构建转录因子表达质粒

以水稻ZH11 cDNA为模板，扩增HINGE1的全长CDS(其序列为序列2)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入XbaI酶切线性化后的pCAMBIA2300-35S-OCS，得到载体35S-HINGE1(载体示意图见图9的A，标为HINGE1)作为转录因子表达质粒。扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体35S-HINGE1对应的引物。

3.1.2构建报告基因质粒

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT1的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT1-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT1-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT2的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT2-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT2-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT3的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT3-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT3-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT4的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT4-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT4-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT5的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT5-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT5-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT6的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT6-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT6-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT7的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT7-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT7-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT8的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT8-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT8-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT9的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT9-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT9-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT10的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT10-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT10-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT11的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT11-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT11-LUC对应的引物。

以水稻ZH11基因组DNA为模板，扩增OsPT13的启动子(2kb)，PCR产物回收后，使用In-Fusion克隆试剂盒，将其连入SalI和NcoI酶切线性化后的pGreenII 0800-LUC载体，得到载体pPT13-LUC(载体示意图见图9的A)，扩增所用正向引物和反向引物见表2中载体pPT13-LUC对应的引物。

表2构建双萤光素酶报告系统中相关载体的引物序列

3.2水稻原生质体瞬时转化

以3.1.1中构建的35S-HINGE1(标为HINGE1)为转录因子表达质粒，设置阴性对照质粒为pCAMBIA2300-35S-OCS(标为Control)，分别以3.1.2中构建的载体pPT1-LUC、pPT2-LUC、pPT3-LUC、pPT4-LUC、pPT5-LUC、pPT6-LUC、pPT7-LUC、pPT8-LUC、pPT9-LUC、pPT10-LUC、pPT11-LUC、pPT13-LUC为报告基因质粒，共转化水稻ZH11的原生质体，结果见图9的B，发现在瞬时转化系统中，HINGE1可以激活OsPT3、OsPT5、OsPT6、OsPT7、 OsPT9、OsPT10、OsPT11和OsPT13的启动子。

4、HINGE1参与硝酸盐诱导的磷响应

发明人进一步对hinge1突变体(命名为hinge1-1)中硝酸盐诱导的磷响应(NIPR)进行了分析。hinge1-1突变体购自韩国水稻突变体库，并与野生型HY进行回交，对后代进行 PCR鉴定，获得纯合突变体株系进行后续实验(对纯合突变体DNA采用引物2B-60306F 和RB2进行PCR反应可以特异地扩增出融合T-DNA序列与基因组序列的融合条带，同时引物2B-60306F和2B-60306R无法扩增出条带)。鉴定引物序列为：

2B-60306F：5’-GCAGGGTCACTTGATCAACTAC-3’；

2B-60306R：5’-TGTTGGCAAATGATGGAGCTAG-3’；

RB2：5’-TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC-3’。

按照硝酸盐诱导实验方法，对前期纯铵培养的野生型和hinge1-1幼苗进行2mMKNO₃诱导(分别标为WT-KNO₃和hinge1-1-KNO₃)，同时以2mM KCl作为对照(分别标为WT-KCl和hinge1-1-KCl)，分别对诱导起始0h及诱导后1h和2h的根进行取样，提取RNA后进行 qRT-PCR分析。由于OsIPS1和OsPT6是受硝酸盐诱导最为显著的两个磷饥饿诱导基因，因此，发明人对其表达量进行了分析。结果发现野生型和hinge1-1中OsIPS1(见图10的A) 和OsPT6(见图10的B)都受到硝酸盐的诱导，但hinge1-1中这两个基因在硝酸盐诱导之后的表达量明显低于野生型，说明hinge1突变体中NIPR受到抑制。

以上实施例中，发明人首先对供应不同氮源、以及在短期硝酸盐诱导的水稻幼苗进行了转录组分析(RNA-seq)，通过筛选受硝酸盐诱导转录因子，得到一个编码GARP类MYB家族转录因子的基因在根中受硝酸盐诱导最强，即HINGE1。组织细胞表达分析发现，HINGE1 在根和叶片中表达量较高，且主要在维管组织中表达。在水稻中过量表达HINGE1可显著提高叶片中无机磷含量。HINGE1编码一个细胞核定位转录因子，具有转录激活和抑制活性。进一步研究发现，HINGE1可以激活许多磷酸盐转运蛋白基因以及磷饥饿诱导基因的表达

hinge1突变体的硝酸盐诱导的磷响应(NIPR)也受到抑制，说明HINGE1参与了硝酸盐诱导的磷响应。

综上所述，外界硝酸盐诱导HINGE1表达，大量表达的HINGE1可激活下游磷饥饿诱导基因，增加磷吸收，从而维持水稻氮-磷稳态。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 转录因子HINGE1在调控植物氮-磷稳态中的应用

<130> GNCSY203007

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3634

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

tacacatata tacatctctt tgcatattta tattcttgtc agttgtttgc tgaggccccc 60

actgtgagaa gttcatattc catttgggat tatcaggact ccttcagatt attccaatcc 120

ttccctgcat acagaaagtg atctagctga ggtgagatca gagagagaga gagattgagc 180

tggttttacc aggaagtttc cagtggtgtt tgctttgctg cacatgtgat gcccttcaag 240

ttgtaagttc atctcaacca tgtgtgtaat aatgcttact ttttgccatg cattgcattg 300

cgtcctctcc ttctccggcg gctgctgctg ctgcatggtg tgatggtggt ggtggtggtc 360

gtcgtcgtcg gctgttttgc gattctggag attggttttg tacttttgtg cgtatccggg 420

gacatgcacc gccgtcgaat tattctcgcc gttgttgcgt gccacgcctc ccctccttcc 480

ctccctgcga atataggccg gtgcggattc ccaattaatt cccattgatc tatcgtatgt 540

gccactagct tcccgttcgt tcgatcgaga gcctatttaa gcttcgccgc cgcgttaatc 600

cctctttcct cctccaaatt aatctcatcc taattctgtt ttaatttctg gtgggaattt 660

cgctgtttga tctggcctct tcacgtaacc gtaatgttct atgtgtaaat tgaattaatg 720

gagttggttg tgaaatcgtt gaattgatgg tgattcggtt gttgttagtt cagttaaatg 780

ttgcaagata tcatgaacac caagaagatt aagctgcacg actgccactt cggctcgccg 840

ctatgtgacc cttcgccggc gccgcacctg ctgagctccg ccgccgccgc cgggctgtcg 900

ttccacccgg ggctcgtgag ctcggcggcg cagcaccagc agcacggcgc gggcggctgg 960

ctgcacgagg agtactacgc gccgaggtcg tcgccgccgt cgtcgcttct cgcgcagacc 1020

tgcgtcggct ccaacgcgac cgcgttctac gccgccgaga acctgccgca gttcgacttc 1080

ccagctctcg gtacggcggc ggcggcggcg gccaaggcgc cgttccggtc gtcggagagc 1140

gagctgtacc ggccggtcga cccgctgctc ctccgtgcgg accactcggt gaggacgtac 1200

tacgtccggc cgcagaagcg ggattccggc gagaggacac cattgccgcc gccgtcgcag 1260

caacagcatc aggacagaat ccacgggctc ttcgccggcg ctcccaccac tcggcttctc 1320

agcggcgaac ccaaaatcca ctcgtttcca cctcaagtaa gcatggaaca atcatgaaca 1380

gaactctact aagaattcta ctgtttgtct ttaattcttt tctttgagat gcctgtgaat 1440

ttttttatcg taatctgaaa attaactccg atgaaggtgg cggcgaagcc gattctgccg 1500

gcgatggatg cgccgagcct gcagaaccag atggagaatc agctgacaag gaactgcatc 1560

ggcgcggcaa ctccggtgac ccccaccgga aacctcgccg gatcaggtgc gccgagcaag 1620

acgcggatca ggtggacgca ggacctgcac gagcggttcg tcgactgcgt caatcagctc 1680

ggcggcgcag acagtgagtg ttcttgatca gcaaaaaaca aaacaaaaaa aacagagaag 1740

cttttgtcat gcatgacgat ttctcatggc gcatagttct ttcttcttct tgcatgcaga 1800

ggcaactccg aaggggattc tgaagctgat gaattcggat ggcctgacga tctaccacat 1860

caagagccat ctccaggtaa ctgaaactct gaaactggaa agcagggtca cttgatcaac 1920

tacacacgaa cgattttaaa cagatgacat agatgtgtaa ccaaacagat atcgtattaa 1980

tgtcgatttg tagctaggga ttggttgatc tagttgaagt ttgtttaata aacgagctgt 2040

agttatctaa caattttctc tcatcttctt tctgtgcaga aatatcgcat agcgaagtac 2100

atgccagcgt catctgaagg taagccatca caacttcgtt actgtttttt ttttttttgg 2160

ttgggagggg gggggtctaa gctgaatcct gaaatagaga agttaatcct ccattagtag 2220

cagcatttgt aagagataag cataaattcc agatcccctg agttcaggag gatctggatt 2280

cgttcgttcg ttgtgttgct ttattctagg tcatttcaac gccgtgcttt tatcctacta 2340

ctgttgtttg gtatgcttcg ctatccattc atccactgac acatgtcctc attctgctgc 2400

tatactgtcg aattttttca gggaagcaac tggagaaaag agcaacagga aatgacatgc 2460

agaatctgga ccccaaaacg tatctctctt tctctctgtc tgctagtagt aatagctttg 2520

cgaaccagtc ccaaatccca atggagtgca agtgctgcta gctatctact gtcaaatcat 2580

gcgtgcatat attaacaaga atcgcctttt tgctgtagtg gaatgcaaat cacggaagca 2640

ctgcgtgttc agctcgacgt gcagaggcgc ctccatgaac agctagaggt gctagctcca 2700

tcatttgcca acactttgac actagatact ttacaatttt cagaaaagga acggcttaat 2760

tatatagcca tcattgataa tcatgtaact aacttcttta tgcctgaatt ttgtgtgcct 2820

cgctagattc agagaaatct gcagctgagg atagaggagc aggggaagag gctgcagaag 2880

atgttcgagg accagctgaa ggcgagcagg agcgtgatgg aaccgcagga gctggacgac 2940

gtcgtcgcct tcgccgccgg cgacggagac gacgacgcgt tcgatgacgt cgacgtgcag 3000

ctgctggccg tcgctggcag cggctatgac gacgccgggt tccagtccaa aataagctag 3060

gacagccttt tttgcgtttt gtgttttggc actttgattt gacaaatatt gttctggttc 3120

ttcgacgtat gatacgcaca atgctatttt ttgcccgtgt agttggcgaa agtttcaaaa 3180

agatatttta agaaagagag tgggatccac agattcgcgc ttaatttttt tttttgtagc 3240

tagtttgatc agagttgtaa aatttaggct ttttcaattg gcctgcactg catttcttaa 3300

tggttttagt taggtcttag caggcaaaaa acaggttaag ttcaagtggc aatatattgc 3360

tcatgtcaca ttcacatatg ggcttgggat gctctacgtg taccaccatg acaccatcct 3420

acgcagaaaa aggaaattac aaaatggata tcaaccacag aacgcaataa tgctgttgtg 3480

gattgtctac tagatacctt gaattaattt gtcaatagtt aagaaataag accttaatga 3540

tttgcactta actttcagca gcaacctgga ctgatgttca acagtagaag tatcatcaag 3600

aatatggaca tggtcctcac gcgcatcttc ataa 3634

<210> 2

<211> 1275

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgttgcaag atatcatgaa caccaagaag attaagctgc acgactgcca cttcggctcg 60

ccgctatgtg acccttcgcc ggcgccgcac ctgctgagct ccgccgccgc cgccgggctg 120

tcgttccacc cggggctcgt gagctcggcg gcgcagcacc agcagcacgg cgcgggcggc 180

tggctgcacg aggagtacta cgcgccgagg tcgtcgccgc cgtcgtcgct tctcgcgcag 240

acctgcgtcg gctccaacgc gaccgcgttc tacgccgccg agaacctgcc gcagttcgac 300

ttcccagctc tcggtacggc ggcggcggcg gcggccaagg cgccgttccg gtcgtcggag 360

agcgagctgt accggccggt cgacccgctg ctcctccgtg cggaccactc ggtgaggacg 420

tactacgtcc ggccgcagaa gcgggattcc ggcgagagga caccattgcc gccgccgtcg 480

cagcaacagc atcaggacag aatccacggg ctcttcgccg gcgctcccac cactcggctt 540

ctcagcggcg aacccaaaat ccactcgttt ccacctcaag tggcggcgaa gccgattctg 600

ccggcgatgg atgcgccgag cctgcagaac cagatggaga atcagctgac aaggaactgc 660

atcggcgcgg caactccggt gacccccacc ggaaacctcg ccggatcagg tgcgccgagc 720

aagacgcgga tcaggtggac gcaggacctg cacgagcggt tcgtcgactg cgtcaatcag 780

ctcggcggcg cagacaaggc aactccgaag gggattctga agctgatgaa ttcggatggc 840

ctgacgatct accacatcaa gagccatctc cagaaatatc gcatagcgaa gtacatgcca 900

gcgtcatctg aagggaagca actggagaaa agagcaacag gaaatgacat gcagaatctg 960

gaccccaaaa ctggaatgca aatcacggaa gcactgcgtg ttcagctcga cgtgcagagg 1020

cgcctccatg aacagctaga gattcagaga aatctgcagc tgaggataga ggagcagggg 1080

aagaggctgc agaagatgtt cgaggaccag ctgaaggcga gcaggagcgt gatggaaccg 1140

caggagctgg acgacgtcgt cgccttcgcc gccggcgacg gagacgacga cgcgttcgat 1200

gacgtcgacg tgcagctgct ggccgtcgct ggcagcggct atgacgacgc cgggttccag 1260

tccaaaataa gctag 1275

<210> 3

<211> 424

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Leu Gln Asp Ile Met Asn Thr Lys Lys Ile Lys Leu His Asp Cys

1 5 10 15

His Phe Gly Ser Pro Leu Cys Asp Pro Ser Pro Ala Pro His Leu Leu

20 25 30

Ser Ser Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ser Phe His Pro Gly Leu Val Ser

35 40 45

Ser Ala Ala Gln His Gln Gln His Gly Ala Gly Gly Trp Leu His Glu

50 55 60

Glu Tyr Tyr Ala Pro Arg Ser Ser Pro Pro Ser Ser Leu Leu Ala Gln

65 70 75 80

Thr Cys Val Gly Ser Asn Ala Thr Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asn Leu

85 90 95

Pro Gln Phe Asp Phe Pro Ala Leu Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala

100 105 110

Lys Ala Pro Phe Arg Ser Ser Glu Ser Glu Leu Tyr Arg Pro Val Asp

115 120 125

Pro Leu Leu Leu Arg Ala Asp His Ser Val Arg Thr Tyr Tyr Val Arg

130 135 140

Pro Gln Lys Arg Asp Ser Gly Glu Arg Thr Pro Leu Pro Pro Pro Ser

145 150 155 160

Gln Gln Gln His Gln Asp Arg Ile His Gly Leu Phe Ala Gly Ala Pro

165 170 175

Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly Glu Pro Lys Ile His Ser Phe Pro Pro

180 185 190

Gln Val Ala Ala Lys Pro Ile Leu Pro Ala Met Asp Ala Pro Ser Leu

195 200 205

Gln Asn Gln Met Glu Asn Gln Leu Thr Arg Asn Cys Ile Gly Ala Ala

210 215 220

Thr Pro Val Thr Pro Thr Gly Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ala Pro Ser

225 230 235 240

Lys Thr Arg Ile Arg Trp Thr Gln Asp Leu His Glu Arg Phe Val Asp

245 250 255

Cys Val Asn Gln Leu Gly Gly Ala Asp Lys Ala Thr Pro Lys Gly Ile

260 265 270

Leu Lys Leu Met Asn Ser Asp Gly Leu Thr Ile Tyr His Ile Lys Ser

275 280 285

His Leu Gln Lys Tyr Arg Ile Ala Lys Tyr Met Pro Ala Ser Ser Glu

290 295 300

Gly Lys Gln Leu Glu Lys Arg Ala Thr Gly Asn Asp Met Gln Asn Leu

305 310 315 320

Asp Pro Lys Thr Gly Met Gln Ile Thr Glu Ala Leu Arg Val Gln Leu

325 330 335

Asp Val Gln Arg Arg Leu His Glu Gln Leu Glu Ile Gln Arg Asn Leu

340 345 350

Gln Leu Arg Ile Glu Glu Gln Gly Lys Arg Leu Gln Lys Met Phe Glu

355 360 365

Asp Gln Leu Lys Ala Ser Arg Ser Val Met Glu Pro Gln Glu Leu Asp

370 375 380

Asp Val Val Ala Phe Ala Ala Gly Asp Gly Asp Asp Asp Ala Phe Asp

385 390 395 400

Asp Val Asp Val Gln Leu Leu Ala Val Ala Gly Ser Gly Tyr Asp Asp

405 410 415

Ala Gly Phe Gln Ser Lys Ile Ser

420

<210> 4

<211> 2000

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

gtcctatgaa gtgcaagctt ttcctttagt ttgcacttcg gtgacgatat tggatcaccg 60

atcaaatgtg ccgtcacggg atggatagtc actccatgtg ccctatgtgt gcacaggagc 120

agaaaacaac caatcatatc ctgttggagt gcgtctttac aaagtaagtt ttgcacaagt 180

tactggccaa ggtcggactg cccttatctt cgcccagtcg acagtccacc ccccaagtcc 240

ggtactctgg tgggagtgca ctcaccggta gctgcctgat caccttagga gaggattcga 300

ctccttcatc ctctttgtta cctagaatat catgttggaa aggaatgctc gtgtcttcga 360

tgggttcatc tcccaggtgg atagagtggt tgatcgcatc gtgcaagaat aaaggatctg 420

ggtggaagcg aagccgagtc ctcttggagt tcttcttgtc catagtcctt tttcctgcct 480

ttttgcttgt tcggggctgg ttttgcctag cttaactggt cattgatccc cttttctccc 540

cgtttaaact ccccatgacc gctacggtag gtcacggttg tacaaacttt ttccttgagg 600

aggtaccatg aggtactatt ttttctatta taaatttggt acctcttggt acctatgtac 660

tacgaggtat catgaggtac taaaattttg gtacctcgtg gtacctcctc aaggaccgta 720

gaattgctct ttctaatata ttagcgtaca aggctcttgt gcgttcacaa aaaaaaaaga 780

tcagtttatt ttgctgctga tgaagttact gctctatttt gactactttg tctacctcat 840

ggtgacacag agagttgttt acttgattat ctatggatct aaaatttacc cgcttcgttt 900

ggccaataaa catcacgtcc aagaagattc aaactagaaa cattgtatga ttcgtcaggt 960

tatctaccct tgttgggaca tcaaaagaca agcaacacac aaattatgga gcatagagat 1020

gtcccctctg atcctaactg taatatgttt gaagcttgca aattatgttc agctagagct 1080

ggagactaaa aagaaccaga taagcaaaga aaatgatagc gagggtgagg gcaccaaagt 1140

ggctatttgt caccttagcc ttgtccgaca tgcgagataa tttatgctct gctatatata 1200

tgtagcagtt ggatttatat acatacacat atatacatct ctttgcatat ttatattctt 1260

gtcagttgtt tgctgaggcc cccactgtga gaagttcata ttccatttgg gattatcagg 1320

actccttcag attattccaa tccttccctg catacagaaa gtgatctagc tgaggtgaga 1380

tcagagagag agagagattg agctggtttt accaggaagt ttccagtggt gtttgctttg 1440

ctgcacatgt gatgcccttc aagttgtaag ttcatctcaa ccatgtgtgt aataatgctt 1500

actttttgcc atgcattgca ttgcgtcctc tccttctccg gcggctgctg ctgctgcatg 1560

gtgtgatggt ggtggtggtg gtcgtcgtcg tcggctgttt tgcgattctg gagattggtt 1620

ttgtactttt gtgcgtatcc ggggacatgc accgccgtcg aattattctc gccgttgttg 1680

cgtgccacgc ctcccctcct tccctccctg cgaatatagg ccggtgcgga ttcccaatta 1740

attcccattg atctatcgta tgtgccacta gcttcccgtt cgttcgatcg agagcctatt 1800

taagcttcgc cgccgcgtta atccctcttt cctcctccaa attaatctca tcctaattct 1860

gttttaattt ctggtgggaa tttcgctgtt tgatctggcc tcttcacgta accgtaatgt 1920

tctatgtgta aattgaatta atggagttgg ttgtgaaatc gttgaattga tggtgattcg 1980

gttgttgtta gttcagttaa 2000

Claims

1.蛋白质在促进硝酸盐诱导的水稻磷吸收中的应用，其特征在于，所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质。

2.与权利要求1中所述的蛋白质相关的生物材料在促进硝酸盐诱导的水稻磷吸收中的应用，其特征在于，所述生物材料为下述B1）至B5）中的任一种：

B1）编码权利要求1中所述的蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，B1）所述核酸分子为如下b1）-b5）中任一所示的基因：

b1）编码链的编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2）编码链的核苷酸是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b3）编码链的核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

4.植物试剂在促进硝酸盐诱导的水稻磷吸收中的应用，其特征在于，所述植物试剂含有权利要求1中所述的蛋白质、或权利要求2中所述生物材料。

5.一种培育在硝酸盐诱导下对磷的吸收能力增强的水稻的方法，其特征在于，包括将编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子导入目的水稻。