CN112159465B - Drn蛋白质及相关生物材料与其在提高植物体细胞再生效率上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与植物体细胞再生效率相关的DRN蛋白质及其相关生物材料与应用。所述DRN蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有提高植物体细胞再生效率活性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。DRN蛋白质及其相关生物材料可用于提高植物体细胞再生效率。

Description

DRN蛋白质及相关生物材料与其在提高植物体细胞再生效率 上的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中DRN蛋白质及相关生物材料与其在提高植物体细胞再生效率上的应用。
背景技术
植物体细胞具有在适当条件下再生发育成为完整植物体的能力。这种再生能力不仅是植物修复损伤组织，产生新器官的基础，而且被广泛应用于组织培养等农业生产实践中。
已经证实，利用植物体细胞原生质体转化再生获得转基因植物，具有容易获得大量受体细胞，转化高效且稳定等优点，可以极大提升水稻、小麦、玉米等农作物的遗传转化效率。然而，由于转化过程和后续抗性筛选会对细胞发育造成胁迫，转化后的原生质体只有部分可以获得再生能力，所以提高植物体细胞再生效率对提升作物遗传转化效率尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物体细胞再生效率。
本发明提供了一种蛋白质，名称为DRN，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有提高植物体细胞再生效率活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
与DRN相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与蛋白质DRN相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码DRN的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
b1)编码链的编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子。
其中，序列表中的序列1的第1-987位由987个核苷酸组成，编码序列表中的序列2所示的蛋白质。
上述生物材料中，B2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(DRN基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达DRN的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动DRN基因转录的启动子，还可包括终止DRN转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的植物表达载体构建含有所述DRN基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pGREEN0229-35S::GR、pSoup、pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白质基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
上述的蛋白质、或上述生物材料在调控植物体细胞再生效率中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为提高植物体细胞再生效率。
本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。
上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物体细胞再生效率的提升效果确定。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种产生体细胞再生效率高的植物的方法。
本发明所提供的产生体细胞再生效率高的植物的方法，包括将编码所述蛋白质的基因导入目的植物中，得到体细胞再生效率高的植物；所述体细胞再生效率高的植物的体细胞再生效率高于所述目的植物的体细胞再生效率。
所述目的植物可为不含编码所述蛋白质的核酸分子的单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥。
上述方法中，其中所述的核酸分子可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述的核酸分子可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecularBiology(2nd Edition)。
上述方法中，所述体细胞再生效率高的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明的实验证明将DRN基因在拟南芥叶肉细胞原生质中过表达，可以使体细胞再生愈伤组织数量显著提升，因此，DRN基因对提升体细胞再生效率有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中载体pGREEN0229-35S::DRN-GR的结构示意图。
图2为实施例1中DRN过表达的转基因株系和Col-0野生型再生细胞团统计图。其中，数据表示为平均值±标准差，重复数为3，采用Graphpad Prism 8进行显著性分析，*表示显著性分析结果为P＜0.05，**表示显著性分析结果为P＜0.01，***表示显著性分析结果为P＜0.001。
图3为实施例1中DRN过表达的转基因株系和Col-0野生型再生愈伤组织数量统计图。其中，图3的A图为直径大于500μm的愈伤组织数量统计柱状图，图3的B图为再生愈伤组织照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
1载体
下述实施例中载体pGREEN0229-35S::GR记载于非专利文献“Yu H,Ito T,WellmerF,et al.Repression of AGAMOUS-LIKE 24is a crucial step in promoting flowerdevelopment[J].Nature genetics,2004,36(2):157-161”。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中pSoup质粒记载于非专利文献“Hellens R P,Edwards E A,LeylandN R,et al.pGreen:a versatile and flexible binary Ti vector forAgrobacterium-mediatedplant transformation[J].Plant molecularbiology,2000,42(6):819-832.”。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
2菌株
下述实施例中的农杆菌GV3130菌株记载于非专利文献“Clough S J,Bent AF.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana[J].The plantjournal,1998,16(6):735-743”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
3植物品系
下述实施例中的拟南芥Col-0(哥伦比亚0生态型)记载于非专利文献“Rédei GP.Supervital mutants ofArabidopsis[J].Genetics,1962,47(4):443.”。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
4试剂
小量RNA提取试剂盒(RNA Miniprep Kit)为Axygen公司的产品。
TransGene一步法反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix Kit)为TransGen的产品。
KOD-plus-DNA聚合酶(产品目录号KOD-201)和10×PCRbuffer for KOD-plus均为TOYOBO公司的产品。
W5溶液的配制方法如下：向去离子水中加入MES、NaCl、CaCl2和KCl，并调pH为5.6得到的溶液；W5溶液中MES、NaCl、CaCl2、KCl的浓度分别为MES 2mM、NaCl 154mM、CaCl2125mM、KCl 5mM。
5培养基
下述实施例中，含有草甘膦(10μg/ml)的MS筛选培养基为向MS培养基中加入草甘膦得到的培养基，该培养基中草甘膦的浓度为10μg/ml。
下述实施例中，含有10μM的Dex(Dexamethasone)的MS培养基为向MS培养基中加入Dex得到的培养基，该培养基中Dex的浓度为10μM。
下述实施例中，含有1％蔗糖的1/2MS培养基为向1/2MS培养基中加入蔗糖得到的培养基，该培养基中蔗糖的质量百分比为1％。
下述实施例中，MGG酶解溶液(Gly Glc medium)、PIM培养基(protoplastinduction medium)、CIM1培养基(callus induction medium 1)、CIM2培养基(callusinduction medium 2)、以及SIM培养基(shoot induction medium)的配方均参照非专利文献“Chupeau M C,Granier F,Pichon O,et al.Characterization ofthe early eventsleading to totipotency in an Arabidopsis protoplast liquid culture bytemporal transcriptprofiling[J].The Plant Cell,2013,25(7):2444-2463”。
下述实施例中，含有10μM的Dex的PIM培养基为在PIM培养基中加入Dex得到的培养基，该培养基中Dex的浓度为10μM。
下述实施例中，含有10μM的Dex的CIM1培养基为在CIM1培养基中加入Dex得到的培养基，该培养基中Dex的浓度为10μM。
下述实施例中，含有10μM的Dex的CIM2培养基为在CIM2培养基中加入Dex得到的培养基该培养基中Dex的浓度为10μM。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
实施例1
一、DRN基因的克隆
一种来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的体细胞再生基因，名称为
Figure BDA0002721375660000071
(DRN)，其cDNA序列如序列表中序列1第1-987位所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示，名称为DRN。
DRN基因的克隆过程如下：
1、拟南芥Col-0种子用体积百分比30％的84消毒液消毒15分钟后，平铺在1/2MS培养基上，4℃黑暗冷处理2天后转移至22℃全日照环境培养7天。取小苗利用小量RNA提取试剂盒(RNA Miniprep Kit)提取总RNA。通过TransGene一步法反转录试剂盒将2μg提取的RNA反转录形成cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，用DRN-F1和DRN-F2作为引物，利用KOD-plus-DNA聚合酶和10×PCRbuffer for KOD-plus进行PCR扩增：
DRN-F1:5’-GCTCTAGAATGGAAAAAGCCTTGAGAAACTTC-3’(下划线指示的序列为XbaI识别位点序列)
DRN-F2:5’-CGGGATCCTCCCCACGATCTTCGGCAA-3’(下划线指示的序列为BamHI识别位点序列)
PCR扩增产物约1043bp，经测序该PCR产物具有序列表中序列1中自5’末端起序列1第1-987位所示的核苷酸序列(即为DRN基因的cDNA)。
用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切上述PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与XbalI和BamHI双酶切pGREEN0229-35S::GR得到的植物表达载体pGREEN0229-35S::GR的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子质粒，测序后证实该质粒为将pGREEN0229-35S::GR的XbaI和BamHI识别位点之间的片段替换为序列表中序列1的第1-987位核苷酸，并保持pGREEN0229-35S::GR的其它核苷酸不变得到的载体，将该载体命名为pGREEN0229-35S::DRN-GR，其结构示意图如图1所示。
二、转基因拟南芥的获得
1、将重组载体pGREEN0229-35S::DRN-GR与pSoup质粒一起用电击转化法导入农杆菌GV3130菌株中，得到重组菌，提取重组菌质粒，测序。测序结果表明质粒为pGREEN0229-35S::DRN-GR。
2、挑取转化农杆菌的单菌落在3ml LB培养基中，于28℃培养8小时，再转接至300ml LB培养基中继续培养3小时。集菌后重悬于LB培养基中得到转化液。将全日照生长30天抽薹开花的拟南芥Col-0的花浸泡于转化液中10分钟。转化完成后遮光培养48小时，48小时后转入全日照培养，直至收种，获得T0代转化种子。
3、将T0代转化种子播于含有草甘膦(10μg/ml)的MS筛选培养基上进行筛选，筛选得到的T1代植物，待长至6片真叶时转移至蛭石中培养。T1代植株收种后，继续用含有草甘膦(10μg/ml)的MS筛选培养基筛选以观察T2代分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因纯合株系，简称为纯合阳性植物。
4、将纯合阳性植物单株收种，分别将各个单株种子和野生型拟南芥Col-0种子铺在含有10μg Dex的MS培养基中培养，观察小苗表型。参照Banno H,Ikeda Y,Niu Q W,etal.Overexpression ofArabidopsis ESR1 induces initiation ofshoot regeneration[J].The Plant Cell,2001,13(12):2609-2618文章中对于过表达DRN小苗表型描述，选取与对照(野生型拟南芥Col-0)相比，种子萌发后生长停止，植株变白表型最为显著的纯合株系作为后续实验使用材料，称为转基因株系p35S∷DRN-GR。
三、转基因株系p35S∷DRN-GR在体细胞再生过程中的表型分析
1、将获得的转基因株系p35S∷DRN-GR种子和Col-0野生型种子分别平铺于含有1％蔗糖的1/2MS培养基上，黑暗冷处理4℃2天后，22℃培养11天，每天光照/黑暗的时长为16h/8h。
2、取样时分别取转基因材料p35S∷DRN-GR小苗真叶和野生型Col-0小苗真叶各1g，分别放置于10ml MGG酶解溶液中。用剪刀快速剪碎叶片，黑暗24℃解离出原生质体。而后使用10ml W5溶液对原生质体进行洗涤，每次洗涤去除上清前100g离心5分钟。洗涤至少4次。最后一次洗涤前使用血球计数板对溶液中的原生质体数量进行统计，保证转基因材料得到的原生质体数量和野生型Col-0材料得到的原生质体数量一致，且原生质体浓度大于105个/ml。之后，对材料进行再生诱导培养具体处理如下：
处理组(转基因株系p35S∷DRN-GR)：将原生质体以含有10μM的Dex的PIM培养基重悬培养，黑暗22℃培养诱导体细胞再生，培养的第11天，用含有10μM的Dex的CIM1培养基将培养体系中的培养基稀释1倍；培养的第30天，用含有10μM的Dex的CIM2培养基将将培养体系中的培养基稀释4倍。
对照组(野生型Col-0)：将原生质体以含有10μM的Dex的PIM培养基重悬培养，黑暗22℃培养诱导体细胞再生，培养的第11天，用含有10μM的Dex的CIM1培养基将培养体系中的培养基稀释1倍；培养的第30天，用含有10μM的Dex的CIM2培养基将将培养体系中的培养基稀释4倍。
培养的第60天分别将处理组和对照组的再生细胞团转移至SIM培养基上，培养至85天，获得再生愈伤组织。
3、在培养的第4天、第8天、第11天分别对再生细胞团数量进行统计，设置三次重复实验，具体结果见图2。图2显示，在再生早期第4天，受Dex诱导处理的DRN过表达转基因材料其再生细胞团百分数约为野生型Col-0对照组的3倍，在培养的第11天，处理组再生细胞团百分数为66.4％，显著高于对照组40.9％。
4、在培养的第85天，对处理组和对照组再生出的直径大于500μm的愈伤组织数量进行统计，结果如图3的A图所示，处理组得到的直径大于500μm的再生愈伤组织数量为对照组的8.4倍，其中图3的B图为对照组和处理组分别得到的再生愈伤组织照片。
以上结果证明过表达DRN可以显著提升植物体细胞再生效率，可以为提升植物遗传转化效率提供新思路。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> DRN蛋白质及相关生物材料与其在提高植物体细胞再生效率上的应用
<130> GNCSY202384
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 987
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
atggaaaaag ccttgagaaa cttcaccgaa tctacccact caccagaccc taatcctctc 60
acaaaattct tcactgaacc tacagcctca cctgttagcc gcaaccgcaa actgtcttca 120
aaagatacca ctgtaaccat cgccggagct ggcagcagca cgacgaggta ccgcggcgta 180
cgccggaggc cgtggggacg atacgcggcg gagatacgtg acccaatgtc gaaggagaga 240
cgttggctcg gaacatttga cacggcggaa caagccgctt gtgcttacga ctctgcggct 300
cgtgcctttc gtggagcaaa ggctcgtact aattttactt atccgacagc tgtcattatg 360
cctgaaccaa ggttttcttt ttccaacaag aaatcttcgc cgtctgctcg ttgtcctctt 420
ccttctctac cgttagattc ctctacccaa aacttttacg gtgcaccggc agcgcagagg 480
atctataata cacagtctat cttcttacgc gacgcctcgt gttcctctcg taaaacgact 540
ccgtataata actctttcaa cggctcatca tcttcttact cagcatcgaa aacggcatgc 600
gtttcttatt ccgaaaacga aaacaacgag tcgtttttcc cggaagaatc ttctgatact 660
ggtctattac aagaggtcgt tcaagagttc ttgaagaaaa atcgcggcgt tcctccttct 720
ccaccaacac caccgccggt gactagccat catgacaact ctggttattt ctctaatctc 780
actatatact ctgaaaatat ggttcaagag actaaggaga ctttgtcgtc gaaactagat 840
cgctacggga attttcaagc taatgacgac ggcgtaagag ccgtcgcaga cggtggttta 900
tcgttgggat caaacgagtg ggggtatcaa gaaatgttga tgtacggaac tcagttaggc 960
tgtacttgcc gaagatcgtg gggatag 987
<210> 2
<211> 328
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 2
Met Glu Lys Ala Leu Arg Asn Phe Thr Glu Ser Thr His Ser Pro Asp
1 5 10 15
Pro Asn Pro Leu Thr Lys Phe Phe Thr Glu Pro Thr Ala Ser Pro Val
20 25 30
Ser Arg Asn Arg Lys Leu Ser Ser Lys Asp Thr Thr Val Thr Ile Ala
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Ser Thr Thr Arg Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro
50 55 60
Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Met Ser Lys Glu Arg
65 70 75 80
Arg Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gln Ala Ala Cys Ala Tyr
85 90 95
Asp Ser Ala Ala Arg Ala Phe Arg Gly Ala Lys Ala Arg Thr Asn Phe
100 105 110
Thr Tyr Pro Thr Ala Val Ile Met Pro Glu Pro Arg Phe Ser Phe Ser
115 120 125
Asn Lys Lys Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Pro Leu Pro Ser Leu Pro
130 135 140
Leu Asp Ser Ser Thr Gln Asn Phe Tyr Gly Ala Pro Ala Ala Gln Arg
145 150 155 160
Ile Tyr Asn Thr Gln Ser Ile Phe Leu Arg Asp Ala Ser Cys Ser Ser
165 170 175
Arg Lys Thr Thr Pro Tyr Asn Asn Ser Phe Asn Gly Ser Ser Ser Ser
180 185 190
Tyr Ser Ala Ser Lys Thr Ala Cys Val Ser Tyr Ser Glu Asn Glu Asn
195 200 205
Asn Glu Ser Phe Phe Pro Glu Glu Ser Ser Asp Thr Gly Leu Leu Gln
210 215 220
Glu Val Val Gln Glu Phe Leu Lys Lys Asn Arg Gly Val Pro Pro Ser
225 230 235 240
Pro Pro Thr Pro Pro Pro Val Thr Ser His His Asp Asn Ser Gly Tyr
245 250 255
Phe Ser Asn Leu Thr Ile Tyr Ser Glu Asn Met Val Gln Glu Thr Lys
260 265 270
Glu Thr Leu Ser Ser Lys Leu Asp Arg Tyr Gly Asn Phe Gln Ala Asn
275 280 285
Asp Asp Gly Val Arg Ala Val Ala Asp Gly Gly Leu Ser Leu Gly Ser
290 295 300
Asn Glu Trp Gly Tyr Gln Glu Met Leu Met Tyr Gly Thr Gln Leu Gly
305 310 315 320
Cys Thr Cys Arg Arg Ser Trp Gly
325

Claims (6)

1.蛋白质在提高拟南芥的叶的原生质体培养获得的再生细胞团比例中的应用，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.与权利要求1中所述的蛋白质相关的生物材料在提高拟南芥的叶的原生质体培养获得的再生细胞团比例中的应用，其特征在于，所述生物材料为下述B1）至B5）中的任一种：
B1）编码权利要求1中所述的蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，B1）所述核酸分子为序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子。
4.一种植物试剂在提高拟南芥的叶的原生质体培养获得的再生细胞团比例中的应用，其特征在于，所述植物试剂含有权利要求1中所述的蛋白质、或权利要求2中所述生物材料。
5.一种产生拟南芥的叶的原生质体培养获得再生细胞团比例增加的拟南芥的方法，其特征在于，包括将编码权利要求1中所述蛋白质的基因导入目的拟南芥中。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的拟南芥为不含编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子的拟南芥。
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EP1057891A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-06 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek Use of the BNM3 transcriptional activator to control plant embryogenesis and regeneration processes
US6407312B1 (en) * 2000-06-27 2002-06-18 The Rockefeller University Esr1-A plant gene that can promote plant regeneration and transformation
US6441276B1 (en) * 2001-09-28 2002-08-27 The Rockefeller University ESR2 - a plant gene that can promote shoot regeneration
US20090144849A1 (en) * 2002-02-11 2009-06-04 Lutfiyya Linda L Nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription in plants
WO2006081029A2 (en) * 2004-12-22 2006-08-03 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant size and biomass and other characteristics in plants
US8299318B2 (en) * 2007-07-05 2012-10-30 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
AU2009323081B8 (en) * 2008-12-01 2014-03-06 Insight Genomics Limited Methods and compositions for the improvement of plant tolerance to environmental stresses
JP5519192B2 (ja) * 2009-06-04 2014-06-11 トヨタ自動車株式会社 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法
DE112010003389T5 (de) * 2009-08-25 2012-06-14 Basf Plant Science Company Gmbh Nematodenresistente transgene Pflanzen

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