CN110627887A

CN110627887A - SlTLFP8蛋白及其相关生物材料在调控番茄抗旱性中的应用

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Publication number: CN110627887A
Application number: CN201910948682.1A
Authority: CN
Inventors: 张娜; 李双桃; 张姣姣; 吕红梅; 王志荣; 刘伦; 王小云; 张磊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110627887B

Abstract

本发明公开了一种SlTLFP8蛋白及其相关生物材料在调控番茄抗旱性中的应用。本发明首先公开了如下蛋白质在调控植物抗旱性和/或气孔密度中的应用：A1)由序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)在序列2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；A3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。本发明进一步公开了培育抗旱性强和/或气孔密度低的转基因植物的方法。本发明从番茄Micro Tom中得到SlTLFP8，使其在番茄中过量表达，获得抗旱性强的番茄，加快了育种进程，具有广泛的应用前景。

Description

SlTLFP8蛋白及其相关生物材料在调控番茄抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SlTLFP8蛋白及其相关生物材料在调控番茄抗旱性中的应用。

背景技术

现阶段，随着全球气候变暖，气温逐渐增高，水资源将进一步短缺。因此，研究植物的抗旱性，揭示其抗旱机理成为当前农业研究中的热点和方向。番茄作为一种重要的园艺作物其生长发育极易受到水分亏缺的影响，在水资源日益匮乏的今天，干旱胁迫已经成为影响番茄产量和品质的重要因素之一。

研究发现，在番茄中过表达WD40蛋白SlWD6能够显著提高番茄的耐旱能力，干旱胁迫下，SlWD6转基因植株T2代种子的根长和幼苗生长显著高于野生型植株(杨述章，高兰阳，孙晓春，李会容，邓恒，刘永胜.(2015).过量表达SlWD6基因增强番茄抗旱和耐盐功能.应用与环境生物学报.21(03)：413-420.)。ShWRKY6是从野生多毛番茄LA1777中克隆得到的一个第II类b型WRKY蛋白，将该基因转入普通番茄A57 中，显著提高了普通番茄的干旱胁迫耐受力。表现为干旱胁迫下，转基因株系气孔变小，脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质显著高于对照，复水后成活率变高(杨明泽(2015). 番茄ShWRKY6基因的抗逆功能研究，华中农业大学.硕士.)。将广谱胁迫蛋白编码基因SlUSP1转化普通番茄“中蔬6号”，对三叶一心时期的转基因幼苗进行干旱处理，存活率显著高于野生型植株(罗其德(2011).广谱胁迫蛋白编码基因(SlUSP1)介导番茄抗旱性的研究，华中农业大学.博士)。

干旱胁迫诱导植物体内合成ABA，受体感知ABA信号后，通过SnRK2s调节下游KAT1、SLAC1等保卫细胞离子通道蛋白控制气孔开度、减小水分蒸腾，从而帮助植物应对水分胁迫(Umezawa，T.，Nakashima，K.，Miyakawa，T.，Kuromori，T.，Tanokura， M.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2010).Molecular Basis of the CoreRegulatory Network in ABA Responses：Sensing，Signaling and Transport.PLANT ANDCELL PHYSIOLOGY 51，1821-1839.)。据报道，拟南芥GTL1(GT2-like 1)基因突变后，气孔密度降低了25％，该突变体在生物量没有减少的情况下，通过减少日间的蒸腾作用，提高了水分利用率，增强了抗旱性(Yoo CY，Pence HE，Jin JB，Miura K，Gosney MJ，HasegawaPM，Mickelbart MV.(2010).The Arabidopsis GTL1 transcriptionfactor regulateswater use efficiency and drought tolerance bymodulating stomatal density viatransrepression of SDD1.PLANT CELL.22(12)：4128～4141)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何简单、高效的调控番茄抗干旱能力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为蛋白质SlTLFP8，来源于番茄(Solanum lycopersicum)，是如下任一所示的蛋白质：

A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)在序列表中序列2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

A3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

其中，序列2由427个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。如为了使该蛋白质更容易纯化，本发明提供了在序列2所述的蛋白质的C端融合flag标签表达的如序列5所示的氨基酸序列。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost 和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

本发明还提供蛋白质SlTLFP8在调控植物抗旱性和/或气孔密度中的应用。

上述应用中，所述植物气孔密度具体为叶片的气孔密度。

蛋白质SlTLFP8相关生物材料也在本发明的保护范围之内。

蛋白质SlTLFP8相关生物材料也属于本发明的保护范围，本发明还提供了蛋白质SlTLFP8相关生物材料的新用途。

本发明蛋白质SlTLFP8相关生物材料在调控植物抗旱性和/或气孔密度中的应用。

上述应用中，所述植物气孔密度具体为叶片的气孔密度。

上述应用中，所述相关生物材料为如下任一所示：

C1)编码蛋白质SlTLFP8的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；

C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；

C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组载体的转基因植株；

C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；

C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述相关生物材料中，C1)所述核酸分子为如下任一所示：

D1)序列表中序列1所示的DNA分子；

D2)编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的DNA分子杂交，且编码蛋白质SlTLFP8 的DNA分子。

其中，序列表中的序列1由1284个核苷酸组成，编码序列2所示的蛋白质。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述相关生物材料中，C2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质SlTLFP8的DNA，该DNA不但可包括启动SlTLFP8基因转录的启动子，还可包括终止SlTLFP8转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：SlTLFP8基因自身的启动子，组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自番茄的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(″LAP″，Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关 1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；番茄蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子 (美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：SlTLFP8基因自身的终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子 (NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313：810； Rosenberg等人(1987)Gene，56：125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet，262：141； Proudfoot(1991)Cell，64：671；Sanfacon等人Genes Dev.，5：141；Mogen等人(1990) Plant Cell，2：1261；Munroe等人(1990)Gene，91：151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891；Joshi等人(1987)NucleicAcid Res.，15：9627)。

上述相关生物材料中，C3)所述重组载体可含有序列表中序列1所示的用于编码蛋白质SlTLFP8的DNA分子。

可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白质SlTLFP8编码基因或所述蛋白质SlTLFP8编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、 pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCambia1305、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、 pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用SlTLFP8构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS 基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述相关生物材料中，C4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌GV3101菌株。

上述相关生物材料中，C7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上述相关生物材料中，C9)所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述蛋白质SlTLFP8或其相关生物材料在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内；

E1)在培育抗旱性增强和/或气孔密度降低的转基因植物中的应用；

E2)在培育抗旱性减弱和/或气孔密度升高的转基因植物中的应用；

E3)在植物育种中的应用。

上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有所述蛋白质SlTLFP8或所述相关生物材料(如蛋白质SlTLFP8编码基因SlTLFP8)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

本发明还提供了一种改变植物抗旱性和/或气孔密度的方法。

本发明改变植物抗旱性和/或气孔密度的方法，包括改变目的植物中蛋白质SlTLFP8的表达量和/或活性，使目的植物的抗旱性和/或气孔密度改变。

本发明进一步还提供了一种培育抗旱性强和/或气孔密度低的转基因植物的方法。

本发明培育抗旱性强和/或气孔密度低的转基因植物的方法，包括提高目的植物中蛋白质SlTLFP8的表达量和/或活性，得到转基因植物；与所述目的植物相比，所述转基因植物的抗旱性增强和/或气孔密度降低。

上述方法中，所述提高目的植物中蛋白质SlTLFP8的表达量和/或活性为在目的植物中过表达蛋白质SlTLFP8。

上述方法中，所述过表达的方法为将蛋白质SlTLFP8的编码基因导入目的植物；具体的，所述蛋白质SlTLFP8的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA 分子。

上述将蛋白质SlTLFP8的编码基因导入目的植物可通过携带有本发明基因SlTLFP8的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明基因SlTLFP8的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

携带有本发明基因SlTLFP8的植物表达载体可为OE-SlTLFP8。具体的载体构建方法为利用同源重组方法将序列1所示的DNA分子插入至pCambia1305载体中得到 SlTLFP8基因表达载体OE-SlTLFP8。

本发明进一步还提供了培育抗旱性弱和/或气孔密度高的转基因植物的方法，包括抑制目的植物中蛋白质SlTLFP8的表达量和/或活性，得到转基因植物；与所述目的植物相比，所述转基因植物的抗旱性减弱和/或气孔密度升高。

上述方法中，所述抑制目的植物中蛋白质SlTLFP8的表达量和/或活性为在目的植导入抑制目的植物中SlTLFP8的编码基因表达的干扰载体。

所述抑制目的植物中SlTLFP8的编码基因表达的干扰载体可为RNAi-SlTLFP8。具体的构建方法为利用同源重组方法先将序列3所示正义片段插入pFGC1008载体得中间载体，再利用相同方法将序列4所示反义片段插入中间载体得到RNAi-SlTLFP8。

本发明中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为番茄属植物，具体的所述番茄属植物为番茄。

本发明从番茄Micro Tom中克隆得到基因SlTLFP8，通过利用转基因的方法将蛋白质SlTLFP8的编码基因导入到目的植物中，获得了抗旱性增强和/或气孔密度降低的番茄。与传统育种相比，本发明的方法操作简单，成本低，大大加快了育种进程，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为基因SlTLFP8的凝胶电泳图；图中，M为DL2000 DNA Marker；1和2均为基因SlTLFP8。

图2为基因SlTLFP8的RNAi片段的凝胶电泳图；图中，M为DL2000 DNA Marker； 1和2分别为RNAi载体的正义片段和反义片段。

图3为SlTLFP8过表达转基因株系的验证凝胶电泳图；图中，M为DL2000 DNAMarker；CK为阳性对照重组质粒OE-SlTLFP8；WT为番茄Micro Tom野生型植株； OE9-OE47为不同的过表达转基因株系。

图4为SlTLFP8过表达转基因株系的RT-PCR验证表达量；图中，OE12-OE47为不同的过表达转基因株系。

图5为SlTLFP8RNAi沉默转基因株系的验证凝胶电泳图；图中M为DL2000 DNAMarker；CK为阳性对照重组质粒RNAi-SlTLFP8；WT为番茄Micro Tom野生型植株； R3-R41为不同的RNAi转基因株系。

图6为SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系的RT-PCR验证表达量；图中，R3-R41为不同的RNAi转基因株系。

图7为SlTLFP8过表达转基因株系、SlTLFP8RNAi沉默转基因株系及番茄Micro Tom野生型植株的气孔密度；图中，OE13和OE31为SlTLFP8过表达转基因株系； R24和R26为SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系。

图8为SlTLFP8过表达转基因株系、SlTLFP8RNAi沉默转基因株系及番茄Micro Tom野生型植株叶片失水率；图中，OE13和OE31为SlTLFP8过表达转基因株系； R24和R26为SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系。

图9为SlTLFP8过表达转基因株系及番茄Micro Tom野生型植株的抗旱表型；图中，OE13和OE31为SlTLFP8过表达转基因株系；R24和R26为SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系。

图10为SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系及番茄Micro Tom野生型植株的抗旱表型；图中，OE13和OE31为SlTLFP8过表达转基因株系；R24和R26为SlTLFP8 RNAi 沉默转基因株系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明发明人在番茄Micro Tom(野生型植株，WT)(购自PanAmerican Seed，货号3558)发现了与叶片气孔密度和抗旱相关的基因，该基因命名为SlTLFP8，其核苷酸序列如序列1所示，由1284个核苷酸组成；编码序列2所示的蛋白，由427个氨基酸残基组成，将所述蛋白命名为SlTLFP8。

实施例1、SlTLFP8基因的克隆

一、实验材料的获得

将番茄Micro Tom种植于中国农业大学园艺学院光照培养箱，光照培养箱培养条件为光照密度为10000LUX；光照12h，温度为26℃；黑暗12h、温度为16℃。番茄幼苗生长到第4片叶展开，取成熟叶片，迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。

二、RNA的提取

采用RNA提取试剂盒(购自华越洋生物科技有限公司)提取番茄叶片总RNA。

三、cDNA的获得

以步骤二提取得到的总RNA为模板，利用反转录试剂盒(购自Takara公司)进行反转录反应获得cDNA，进一步将cDNA溶液稀释到100ng/ul作为下述反应模板。

其中，

反应体系和反应程序如下所示：

在冰上加入上述物质，70℃反应10分钟，迅速置于冰上2分钟，然后依次加入如下物质

42℃1h进行反转录，70℃反应15分钟使酶灭活，最终获得cDNA。

四、目的基因SlTLFP8、RNAi载体的正义片段和反义片段的扩增

以步骤三获得的cDNA为模板，采用引物SlTLFP8S和SlTLFP8A进行PCR扩增，得到如序列1所示的PCR产物，反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，预期获得目的条带大小为1200bp左右，而克隆获得的条带位于2000bp与1000bpDNA Marker之间，结果与预期相符，即得到如序列1所示的目的基因SlTLFP8的开放阅读框全长序列(CDS)。

同样以步骤三获得的cDNA为模板，分别采用引物SlTLFP8正向S和SlTLFP8 正向A、引物SlTLFP8反向S和SlTLFP8反向A进行PCR扩增，分别得到PCR产物，反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2所示，预期获得目的条带大小为280bp左右，而克隆获得的条带位于500bp与250bp的DNA Marker之间，结果与预期相符，即得到如序列3所示的SlTLFP8的RNAi载体的正义片段和序列4所示的SlTLFP8的RNAi载体的反义片段。

其中，引物序列如下：

PCR反应体系如表1和表2所示：

表1、目的基因SlTLFP8开放阅读框全长序列PCR反应体系

表2、SlTLFP8的RNAi载体正义片段和反义片段PCR反应体系

PCR反应程序如表3所示：

表3、PCR反应程序

实施例2 SlTLFP8在番茄气孔密度调节和抗旱调节上的应用

一、SlTLFP8过表达载体及RNAi载体的构建

一)、使用ClonExpress II重组克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)进行连接，获得连接产物；其中，重组反应步骤如下：

1)插入片段扩增：通过在引物5′端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5′和3′最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列。

根据上述原则和基因SlTLFP8，设计分别带有酶切位点BamHI、SwaI和SpeI及 5′端引入线性化克隆载体末端同源序列的扩增引物，引物序列如下：

分别以实施例1得到的cDNA为模板，利用上述引物SlTLFP8S′和SlTLFP8A′、引物SlTLFP8正向S′和SlTLFP8正向A′、引物SlTLFP8反向S′和SlTLFP8反向A′进行PCR扩增，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，然后进行切胶回收，得到分别得到包含目的基因SlTLFP8、SlTLFP8的RNAi载体的正义片段和反义片段的插入片段；

其中，所述PCR产物切胶回收利用胶回收试剂盒(购自北京蓝伯斯特生物技术有限公司)进行，具体包括如下步骤：

A将插入片段切出，放入1.5ml离心管中，加入600微升溶胶液，65℃加热10 分钟使胶块完全溶解，得溶液。

B将所得液体降至室温后加入吸附柱中，室温静置2分钟，室温12000g离心1 分钟，弃穿透液。

C向吸附柱中加入600微升洗涤液，室温12000g离心1分钟，弃穿透液，重复此步骤。

D室温12000g离心5分钟，将吸附柱转移至1.5ml离心管中。

E加入40微升在65℃预热的TE Buffer，静置5分钟，室温12000g离心2分钟，收集到的液体即得包含目的基因SlTLFP8、SlTLFP8的RNAi载体的正义片段和反义片段的插入片段。

2)进行重组反应：

选择内切酶BamHI对载体pCambia1305(购自淼灵质粒平台，货号P1117)进行酶切，得到线性化的载体pCambia1305；将包含目的基因SlTLFP8的插入片段与线性化的载体pCambia1305进行同源重组得到连接产物pCambia1305-SlTLFP8；

选择SwaI对载体pFGC1008(购自Arabidopsis Biological Resource Center，货号 CD3-446)进行酶切，得到线性化的载体pFGC1008；将包含SlTLFP8的RNAi载体的正义片段的插入片段与线性化的载体pFGC1008进行同源重组得到中间载体；选择 SpeI对中间载体进行酶切，得到线性化的中间载体；将包含SlTLFP8的RNAi载体的反义片段的插入片段与线性化的中间载体进行同源重组得到连接产物 pFGC1008-RNAi-SlTLFP8；

其中，酶切体系如下：

同源重组的反应体系和程序如下：

在冰水浴中配制上述体系后再37℃反应30分钟，然后冰浴3分钟，得到连接产物。

二)、连接产物转化到大肠杆菌感受态

1)取出-80℃冰箱保存的大肠杆菌感受态DH5α，在冰上融化。

2)在超净工作台中，吸取50μL的感受态细胞，分别加入10μL的连接产物pCambia1305-SlTLFP8和连接产物pFGC1008-RNAi-SlTLFP8，吹打混匀，在冰上放置 30min。

3)冰浴结束后，放入42℃金属浴热击80s，迅速冰浴5min。

4)在超净工作台中，加入500μL的LB液体培养基，吹打混匀，至于37℃，180rpm 摇床培养1h。

5)吸取100μL的菌液，利用涂布器，均匀涂布在LB选择固体培养基上。待菌液完全吹干后，将封好的平板倒置放于37℃培养箱内，过夜培养。

6)长出菌斑后，挑取单克隆于700μLLB液体选择培养基，37℃，180rpm摇床培养3h左右，待菌液混浊后，PCR验证，方法同实施例1，利用引物SlTLFP8S和SlTLFP8A 进行PCR扩增(PCR反应体系和程序如表1和表3所示)，选取包含目的片段SlTLFP8 的菌液；分别利用引物SlTLFP8正向S和SlTLFP8正向A、引物SlTLFP8反向S和 SlTLFP8反向A进行PCR扩增(PCR反应体系和程序如表2和表3所示)，选择包含 SlTLFP8的RNAi载体的正义片段和SlTLFP8的RNAi载体的反义片段的菌液。

三)、质粒提取

选取经菌液PCR验证的含目的片段的菌液，提取质粒进行测序，与已知核苷酸序列进行比对，经验证后得到SlTLFP8的过表达载体即重组质粒OE-SlTLFP8、RNAi载体即重组质粒RNAi-SlTLFP8。

其中，质粒提取采用质粒中量小提试剂盒(购白天根生化科技(北京)有限公司)进行，具体步骤如下：

1)取10ml步骤二)中过夜培养的菌液，12000g离心1分钟，弃上清液。

2)加入500μL溶液P1，振荡器振荡至细菌细胞完全悬浮。

3)加入500μL溶液P2，温和上下地翻转6-8次。

4)加入700μL溶液P3，温和上下地翻转6-8次，12000g离心10分钟。

5)将上清液加入到吸附柱中，12000g离心1分钟，弃穿透液。

6)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000g离心1分钟，弃穿透液，重复一次。

7)将吸附柱置于收集管中，12000g离心5分钟.

8)将吸附柱置于干净离心管中，向吸附柱中加入200μLEB Buffer，室温放置5分钟，12000g离心2分钟，将质粒收集到离心管中。

四)、重组质粒转化农杆菌GV3101

1)将10μL重组质粒OE-SlTLFP8和重组质粒RNAi-SlTLFP8分别加入30μl农杆菌GV3101中，混匀，冰浴5分钟。

2)液氮速冻5分钟，37℃5分钟，再次冰浴3分钟。

3)加入500μL不含抗生素的YEP液体培养基，28℃，200rpm/min培养4小时。

4)将100μL菌液均匀涂布于含利福平的YEP固体培养基，倒置培养2天。

5)挑取单克隆，菌液PCR验证后，选择分别转化重组质粒OE-SlTLFP8和重组质粒RNAi-SlTLFP8成功的农杆菌侵染液保存备用，将转化重组质粒OE-SlTLFP8成功的农杆菌命名为OE-SlTLFP8-GV3101，将转化重组质粒RNAi-SlTLFP8成功的农杆菌命名为RNAi-SlTLFP8-GV3101。

五)、转基因植株的获得

1、SlTLFP8过表达转基因植株的获得

1.1利用OE-SlTLFP8-GV3101侵染番茄，获得转基因T₀代植株：

1)播种

取番茄Micro Tom的种子，用75％的乙醇浸泡消毒5分钟，5分钟后倒掉乙醇溶液，再将种子用4％的次氯酸钠浸泡10分钟，消毒后用无菌水洗涤7-8次，每次需充分洗涤，彻底去除残留的消毒剂，种子洗涤干净后，将种子播在种子萌发培养基(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L)，以每瓶30-40粒种子为宜。

2)种子萌发T0

将剥好的种子，首先在暗室培养3-4天，待种子冒出小白芽后放置光下培养3-4天，一般种子萌发7-8天后便可用于组织培养。

3)预培养阶段T1

将生长7-8天的番茄小苗至于无菌水中，一般取小苗的子叶和茎部两个鲜嫩部位作为组织培养材料，用剪刀剪去子叶的叶尖，将剩余部分剪成5*5mm的方块，茎端除去根部和生长点区，将剩余部分剪成6-8mm长。将处理好的外植体置于预培养培养基 (MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+1mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA)上，培养基上提前铺好滤纸，子叶背面朝上放置，摆放间隔以5-10mm为宜，暗培养。

4)共培养阶段T1

将预培养两天后的外植体浸泡于OE-SlTLFP8-GV3101的侵染液中，浸泡期间需不断震荡，侵染5分钟后倒掉侵染液，滤纸吸干，置于预培养培养基上，暗室共培养2 天。

5)芽诱导期T21

将共培养2天后的外植体从暗室取出，全部置于芽诱导培养基T21(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+1mg/L ZT+0.1mg/L IAA+200mg/L Tim+抗生素)，在光下培养 7天后转入新的T21培养基中继续进行继代培养，第一次继代培养后，一般每隔2周进行下一次继代培养，直至外植体发芽完全。

6)芽伸长期T22

经过芽诱导后，待外植体发芽芽长约为2-3cm时转入芽伸长培养基T22(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+0.5mg/L ZT+1mg/L GA+200mg/L Tim+抗生素)中，培养3-4周。

7)生根期Tr

当芽伸长至4-5cm时，剪掉愈伤组织后将芽转移到生根培养基Tr(MS 4.43g/L+ 蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+2mg/L IBA++150mg/L Tim+1/2抗生素)，培养3-4周。

8)土培期

将生根旺盛，生长到一定高度的小苗及时转入土盆里，得到转基因T₀代植株。

1.2转基因T₀代植株的PCR鉴定

提取番茄Micro Tom(WT)和转基因T₀代植株的叶片的总DNA，以上述总DNA 和重组质粒OE-SlTLFP8(CK)为模板，利用引物(表4中过表达鉴定S和过表达鉴定A)进行PCR鉴定(PCR反应体系如实施例1中表1所示，PCR反应程序如实施例1中表3所示)，结果如图3所示，在WT、OE9、OEl2、OEl5、OE17、OE18、 OE22、OE35、OE36、OE42、OE45、OE46、OE47中无目的条带，而在CK及转基因株系OE13、OE19、OE31中有目的条带，结果说明转基因株系OE13、OE19、OE31 为阳性T₀代SlTLFP8基因过表达株。

1.3基因株系中SlTLFP8的相对表达量鉴定

取番茄Micro Tom(WT)及转基因株系(OE12、OE13、OE15、OE17、OE18、 OE19、OE31、OE42、OE47)叶片为材料提取RNA，反转录合成第一链cDNA，将反转录得到的cDNA稀释至50ng/μl，作为RT-PCR的模板。以番茄Efα为内参基因，利用引物(表4中qTLFP8S和qTLFP8A、EfαS和EFαA)以上述cDNA为模板进行 RT-PCR扩增，设置三次平行重复，使用仪器为ABIPRISM 7500，使用2^-ΔΔCT法分析SlTLFP8基因在不同株系中的表达情况，结果如图4所示，OE13、OE19、OE31中 TLFP8的基因表达量显著上升，分别为WT中SlTLFP8的基因表达量中的108、28 及81倍，进一步证实转基因株系OE13、OE19、OE31为阳性过表达株系，即为SlTLFP8基因过表达株系。

表4转基因鉴定引物列表

RT-PCR反应体系如下

反应程序如下：

2、SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系的获得

2.1转基因T₀代植株的获得

利用RNAi-SlTLFP8-GV3101侵染番茄Micro Tom，获得转基因T₀代植株，具体方法同步骤1。

2.2转基因T₀代植株的PCR鉴定

提取番茄Micro Tom(WT)和转基因T₀代植株的叶片的总DNA，以总DNA和重组质粒RNAi-SlTLFP8(CK)为模板，利用引物(干扰鉴定S和干扰鉴定A)进行 PCR鉴定，结果如图5所示，在WT及R3、R16、R19中无目的条带，而在CK及转基因株系R9、R24、R25、R26、R41中有目的条带。结果说明转基因株系R9、R24、 R25、R26、R41为转基因阳性T₀代SlTLFP8基因沉默株。

2.3转基因株系中SlTLFP8的相对表达量鉴定

提取Micro Tom番茄(WT)及转基因株系(R3、R9、R16、R19、R24、R25、 R26、R41)叶片为材料提取RNA，反转录合成第一链cDNA，将反转录得到的cDNA 稀释至50ng/μl，作为RT-PCR的模板。以番茄EFα为内参基因，利用引物(表4中 qTLFP8S和qTLFP8A、EfαS和EFαA)以上述cDNA为模板进行RT-PCR扩增，设置三次平行重复，使用仪器为ABI PRISM 7500，使用2^-ΔΔCT法分析SlTLFP8基因在不同株系中的表达情况，结果如图6所示，R24、R26、R41中，SlTLFP8的基因表达量显著下降，分别为WT中SlTLFP8的基因表达量的0.27、0.24及0.63倍，进一步证实转基因株系R24、R26、R41为阳性基因沉默株系，即为SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系。

六)、表型检测

1、转基因株系中SlTLFP8气孔密度鉴定

将SlTLFP8基因过表达株系(OE13和OE31)、SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系(R24 和R26)和Micro Tom番茄(WT)置于人工气候室正常培养，生长10天后子叶完全展平，轻轻撕下子叶同一部位下表皮显微镜下观察，每个株系选取5棵苗子观察，选取不同的视野观察拍照并计数，结果如图7所示，SlTLFP8基因过表达株系(OE13 和OE31)叶片气孔密度低于WT且差异显著，为WT的0.8-0.9倍，而SlTLFP8 RNAi 沉默转基因株系(R24和R26)叶片气孔密度高于WT，为WT的1.2-1.5倍。

2、转基因株系的抗旱性鉴定。

取生长势一致，四周苗龄SlTLFP8基因过表达株系(OE13和OE31)、SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系(R24和R26)和Micro Tom番茄(WT)第3、4、5片叶进行叶片失水率测定，每个株系选取5棵苗子，结果如图8所示，经过5小时处理SlTLFP8 基因过表达株系(OE13和OE31)叶片失水率为43-47％，WT叶片失水率为60％，而SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系(R24和R26)叶片失水率为70-73％。

将SlTLFP8基因过表达株系(OE13和OE31)、SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系(R24 和R26)和Micro Tom番茄(WT)置于人工气候室正常培养，生长四周后，挑选生长一致的番茄幼苗进行断水处理，每个株系选取5棵苗子观察，断水处理两周后，观察番茄幼苗的生长情况，以正常浇水的番茄幼苗为对照，结果如图9和图10所示，在干旱14天后SlTLFP8 RNAi沉默转基因株系(R24和R26)中几乎全部成熟叶片枯死， WT中部分成熟叶片萎蔫枯死，而SlTLFP8基因过表达株系(OE13和OE31)中仅部分成熟叶片萎蔫发黄。

以上说明，本发明蛋白质SlTLFP8能调控番茄的气孔密度和抗旱性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> SlTLFP8蛋白及其相关生物材料在调控番茄抗旱性中的应用

<130> GNCFY192219

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 1

atgtcgttcc gcagtatagt tcgtgatgta agagatagta ttggtagctt atcaaggcga 60

agctttgatt taaggctgtc tggtcatcct agggacaaat cacatggttc attttatgac 120

ttaagtgacc agcctcccgt tatccaagat agttgttggg ccaatcttcc tccagagcta 180

ctttttgatg tagttagaag gttagaggag agtgagagca catggcccgg tcgtaagcat 240

gtcgtagcat gtgccgcagt ctgtaggtca tggaggagta tgtgcaaaga catcgttaga 300

aatccggaat tttgtggaaa gctaactttt cctgtttccc taaagcagcc tgggcctcgt 360

gatggaacta ttcagtgctt catcaagcgg gataaatcta atttgactta ccatcttttc 420

ttgtgtctta gtcctgcatt gttggttgag aatgggaagt tccttctctc tgcaaaaaga 480

acgagacgta ctacttgcac agagtatgtt atctcaatgg atgcagaaaa catctctaga 540

tcaagcaaca cctatattgg aaaattaaga tcaaattttc taggtacaaa attcattata 600

tatgacacac agcctcctca caccggtgca catgtacctc ccccggggcg aacaagccgt 660

agattcactt ccaagaaagt ctctcctaaa gtcccaactg gaagctatat catatcccag 720

atcacatacg agctgaatgt gcttggaaca cggggtccac ggagaatgca ctgcgtcatg 780

cactcaattc ctgactcagc ccttgaagcc ggtggctctg tacctggcca accagagctt 840

ctctcaaggc cccttgagga ttcgttccgc agcatctctt tctcaaagtc tcttgatcat 900

tccactgagt tcggtagtgc acgattttct gatattgctg gaggatcaac taatgaggag 960

gatgataaca aggggaaacc actggtccta aagaacaagg cgccacgatg gcatgaacaa 1020

ctgcagtgct ggtgtctgaa ttttcgagga cgagtgacag ttgcatctgt caagaacttc 1080

cagttgattg ctgccactca acaacctgcc gctgcaccaa caacatctca gccaacaagt 1140

caatcagatc atgacaaaat catcttgcaa tttgggaaag taggcaaaga tatgtttacc 1200

atggactacc gatatcccct atctgcattt caggcatttg ccatctgctt aagcagcttt 1260

gacacaaaat tggcttgtga atag 1284

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 2

Met Ser Phe Arg Ser Ile Val Arg Asp Val Arg Asp Ser Ile Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ser Arg Arg Ser Phe Asp Leu Arg Leu Ser Gly His Pro Arg Asp

20 25 30

Lys Ser His Gly Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Asp Gln Pro Pro Val Ile

35 40 45

Gln Asp Ser Cys Trp Ala Asn Leu Pro Pro Glu Leu Leu Phe Asp Val

50 55 60

Val Arg Arg Leu Glu Glu Ser Glu Ser Thr Trp Pro Gly Arg Lys His

65 70 75 80

Val Val Ala Cys Ala Ala Val Cys Arg Ser Trp Arg Ser Met Cys Lys

85 90 95

Asp Ile Val Arg Asn Pro Glu Phe Cys Gly Lys Leu Thr Phe Pro Val

100 105 110

Ser Leu Lys Gln Pro Gly Pro Arg Asp Gly Thr Ile Gln Cys Phe Ile

115 120 125

Lys Arg Asp Lys Ser Asn Leu Thr Tyr His Leu Phe Leu Cys Leu Ser

130 135 140

Pro Ala Leu Leu Val Glu Asn Gly Lys Phe Leu Leu Ser Ala Lys Arg

145 150 155 160

Thr Arg Arg Thr Thr Cys Thr Glu Tyr Val Ile Ser Met Asp Ala Glu

165 170 175

Asn Ile Ser Arg Ser Ser Asn Thr Tyr Ile Gly Lys Leu Arg Ser Asn

180 185 190

Phe Leu Gly Thr Lys Phe Ile Ile Tyr Asp Thr Gln Pro Pro His Thr

195 200 205

Gly Ala His Val Pro Pro Pro Gly Arg Thr Ser Arg Arg Phe Thr Ser

210 215 220

Lys Lys Val Ser Pro Lys Val Pro Thr Gly Ser Tyr Ile Ile Ser Gln

225 230 235 240

Ile Thr Tyr Glu Leu Asn Val Leu Gly Thr Arg Gly Pro Arg Arg Met

245 250 255

His Cys Val Met His Ser Ile Pro Asp Ser Ala Leu Glu Ala Gly Gly

260 265 270

Ser Val Pro Gly Gln Pro Glu Leu Leu Ser Arg Pro Leu Glu Asp Ser

275 280 285

Phe Arg Ser Ile Ser Phe Ser Lys Ser Leu Asp His Ser Thr Glu Phe

290 295 300

Gly Ser Ala Arg Phe Ser Asp Ile Ala Gly Gly Ser Thr Asn Glu Glu

305 310 315 320

Asp Asp Asn Lys Gly Lys Pro Leu Val Leu Lys Asn Lys Ala Pro Arg

325 330 335

Trp His Glu Gln Leu Gln Cys Trp Cys Leu Asn Phe Arg Gly Arg Val

340 345 350

Thr Val Ala Ser Val Lys Asn Phe Gln Leu Ile Ala Ala Thr Gln Gln

355 360 365

Pro Ala Ala Ala Pro Thr Thr Ser Gln Pro Thr Ser Gln Ser Asp His

370 375 380

Asp Lys Ile Ile Leu Gln Phe Gly Lys Val Gly Lys Asp Met Phe Thr

385 390 395 400

Met Asp Tyr Arg Tyr Pro Leu Ser Ala Phe Gln Ala Phe Ala Ile Cys

405 410 415

Leu Ser Ser Phe Asp Thr Lys Leu Ala Cys Glu

420 425

<210> 3

<211> 408

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 3

atatcatatc ccagatcaca tacgagctga atgtgcttgg aacacggggt ccacggagaa 60

tgcactgcgt catgcactca attcctgact cagcccttga agccggtggc tctgtacctg 120

gccaaccaga gcttctctca aggccccttg aggattcgtt ccgcagcatc tctttctcaa 180

agtctcttga tcattccact gagttcggta gtgcacgatt ttctgatatt gctggaggat 240

caactaatga ggaggatgat aacaagggga aaccactggt cctaaagaac aaggcgccac 300

gatggcatga acaactgcag tgctggtgtc tgaattttcg aggacgagtg acagttgcat 360

ctgtcaagaa cttccagttg attgctgcca ctcaacaacc tgccgctg 408

<210> 4

<211> 408

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 4

cagcggcagg ttgttgagtg gcagcaatca actggaagtt cttgacagat gcaactgtca 60

ctcgtcctcg aaaattcaga caccagcact gcagttgttc atgccatcgt ggcgccttgt 120

tctttaggac cagtggtttc cccttgttat catcctcctc attagttgat cctccagcaa 180

tatcagaaaa tcgtgcacta ccgaactcag tggaatgatc aagagacttt gagaaagaga 240

tgctgcggaa cgaatcctca aggggccttg agagaagctc tggttggcca ggtacagagc 300

caccggcttc aagggctgag tcaggaattg agtgcatgac gcagtgcatt ctccgtggac 360

cccgtgttcc aagcacattc agctcgtatg tgatctggga tatgatat 408

<210> 5

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ser Phe Arg Ser Ile Val Arg Asp Val Arg Asp Ser Ile Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ser Arg Arg Ser Phe Asp Leu Arg Leu Ser Gly His Pro Arg Asp

20 25 30

Lys Ser His Gly Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Asp Gln Pro Pro Val Ile

35 40 45

Gln Asp Ser Cys Trp Ala Asn Leu Pro Pro Glu Leu Leu Phe Asp Val

50 55 60

Val Arg Arg Leu Glu Glu Ser Glu Ser Thr Trp Pro Gly Arg Lys His

65 70 75 80

Val Val Ala Cys Ala Ala Val Cys Arg Ser Trp Arg Ser Met Cys Lys

85 90 95

Asp Ile Val Arg Asn Pro Glu Phe Cys Gly Lys Leu Thr Phe Pro Val

100 105 110

Ser Leu Lys Gln Pro Gly Pro Arg Asp Gly Thr Ile Gln Cys Phe Ile

115 120 125

Lys Arg Asp Lys Ser Asn Leu Thr Tyr His Leu Phe Leu Cys Leu Ser

130 135 140

Pro Ala Leu Leu Val Glu Asn Gly Lys Phe Leu Leu Ser Ala Lys Arg

145 150 155 160

Thr Arg Arg Thr Thr Cys Thr Glu Tyr Val Ile Ser Met Asp Ala Glu

165 170 175

Asn Ile Ser Arg Ser Ser Asn Thr Tyr Ile Gly Lys Leu Arg Ser Asn

180 185 190

Phe Leu Gly Thr Lys Phe Ile Ile Tyr Asp Thr Gln Pro Pro His Thr

195 200 205

Gly Ala His Val Pro Pro Pro Gly Arg Thr Ser Arg Arg Phe Thr Ser

210 215 220

Lys Lys Val Ser Pro Lys Val Pro Thr Gly Ser Tyr Ile Ile Ser Gln

225 230 235 240

Ile Thr Tyr Glu Leu Asn Val Leu Gly Thr Arg Gly Pro Arg Arg Met

245 250 255

His Cys Val Met His Ser Ile Pro Asp Ser Ala Leu Glu Ala Gly Gly

260 265 270

Ser Val Pro Gly Gln Pro Glu Leu Leu Ser Arg Pro Leu Glu Asp Ser

275 280 285

Phe Arg Ser Ile Ser Phe Ser Lys Ser Leu Asp His Ser Thr Glu Phe

290 295 300

Gly Ser Ala Arg Phe Ser Asp Ile Ala Gly Gly Ser Thr Asn Glu Glu

305 310 315 320

Asp Asp Asn Lys Gly Lys Pro Leu Val Leu Lys Asn Lys Ala Pro Arg

325 330 335

Trp His Glu Gln Leu Gln Cys Trp Cys Leu Asn Phe Arg Gly Arg Val

340 345 350

Thr Val Ala Ser Val Lys Asn Phe Gln Leu Ile Ala Ala Thr Gln Gln

355 360 365

Pro Ala Ala Ala Pro Thr Thr Ser Gln Pro Thr Ser Gln Ser Asp His

370 375 380

Asp Lys Ile Ile Leu Gln Phe Gly Lys Val Gly Lys Asp Met Phe Thr

385 390 395 400

Met Asp Tyr Arg Tyr Pro Leu Ser Ala Phe Gln Ala Phe Ala Ile Cys

405 410 415

Leu Ser Ser Phe Asp Thr Lys Leu Ala Cys Glu Asp Tyr Lys Asp His

420 425 430

Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp

435 440 445

Lys

Claims

1.如下任一所示的蛋白质在调控植物抗旱性和/或气孔密度中的应用：

A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白质的相关生物材料在调控植物抗旱性和/或气孔密度中的应用，所述相关生物材料为如下任一所述的应用：

C1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；

C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：C1)所述核酸分子为如下任一所示：

D1)序列表中序列1所示的DNA分子；

D2)编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.权利要求1中所述蛋白质或权利要求2中所述相关生物材料在如下任一中的应用：

E3)在植物育种中的应用。

5.一种改变植物抗旱性和/或气孔密度的方法，其特征在于：所述方法包括改变目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，使目的植物的抗旱性和/或气孔密度改变。

6.一种培育抗旱性强和/或气孔密度低的转基因植物的方法，其特征在于：所述方法包括提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物；与所述目的植物相比，所述转基因植物的抗旱性增强和/或气孔密度降低。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性为在目的植物中过表达权利要求1所述蛋白质。

8.一种培育抗旱性弱和/或气孔密度高的转基因植物的方法，其特征在于：所述方法包括抑制目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物；与所述目的植物相比，所述转基因植物的抗旱性减弱和/或气孔密度升高。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性为在目的植导入抑制目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因表达的干扰载体。

10.根据权利要求1-4任一所述的应用，或，权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物。