CN105713079A

CN105713079A - 蛋白质及其相关生物材料在提高植物产量中的应用

Info

Publication number: CN105713079A
Application number: CN201610282304.0A
Authority: CN
Inventors: 景蕊莲; 徐伟娜; 张斌; 刘霞; 毛新国
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2036-04-29
Also published as: CN105713079B

Abstract

本发明公开了蛋白质及其相关生物材料在提高植物产量中的应用。本发明公开的应用中，蛋白质是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物产量相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；提高植物产量包括改良植物产量相关性状，植物产量相关性状包括穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和二次枝梗数中的至少一种。实验证明，可通过利用本发明的蛋白质及其编码基因提高植物的穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和二次枝梗数来提高植物产量。

Description

蛋白质及其相关生物材料在提高植物产量中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中蛋白质及其相关生物材料在提高植物产量中的应用。

背景技术

粮食的生产产量不仅关系着人们的日常生活，在一定程度上也制约着国家的经济状况。我国作为世界上人口最多的国家，提高粮食的产量显得尤为重要。在过去几十年，粮食产量大幅度提高，除了耕作栽培管理条件的改善之外，作物品种的遗传改良对于粮食增产发挥了重要作用。然而，近些年粮食产量的提高到达了瓶颈期。目前，可耕地面积逐渐减少，而且当前育成品种增产潜力有限，世界正面临着新一轮粮食安全的挑战，因此需要发展具有更大增产潜力的新品种。

因此，利用现代分子生物技术，发掘产量相关的关键基因，通过基因工程提高粮食产量，对于保障国家粮食生产安全具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何通过提高穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和/或二次枝梗数来提高植物产量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质在下述1)-3)中任一种中的应用：

1)改良植物产量相关性状；

2)制备改良植物产量相关性状产品；

3)培育植物产量相关性状改良植物；

所述植物产量相关性状包括穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和二次枝梗数中的至少一种；

所述蛋白质的名称为TaSPL20-7D，是如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物产量相关的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，如所述植物有一次枝梗和二次枝梗(如水稻)，所述植物产量相关性状为穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和二次枝梗数中的至少一种；如所述植物无一次枝梗和二次枝梗(如小麦)，所述植物产量相关性状为穗长、穗粒数、千粒重、粒长和粒宽中的至少一种。

其中，序列2由388个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的TaSPL20-7D蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A2)中的TaSPL20-7D蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的TaSPL20-7D蛋白质的编码基因可通过将序列1的第213-1379位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与TaSPL20-7D相关的生物材料在所述1)-3)中任一种中的应用，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码TaSPL20-7D的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b4)中任一种：

b1)其编码序列是序列表中序列1的第213-1379位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子cDNA分子或DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TaSPL20-7D的cDNA分子或基因组DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码TaSPL20-7D的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由1445个核苷酸组成，其中序列1的第213-1379位核苷酸所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TaSPL20-7D的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TaSPL20-7D的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TaSPL20-7D且具有TaSPL20-7D功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码TaSPL20-7D的核酸分子的表达盒(TaSPL20-7D基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaSPL20-7D的DNA，该DNA不但可包括启动TaSPL20-7D基因转录的启动子，还可包括终止TaSPL20-7D基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述TaSPL20-7D基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pMD18-T或pAHC25。

B3)所述重组载体可含有序列1的第213-1379位所示的用于编码TaSPL20-7D的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pCUbi1390-TaSPL20-7D。所述pCUbi1390-TaSPL20-7D为将pCUbi1390的KpnI和SpeI识别位点间的DNA序列替换为序列1的第213-1379位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达TaSPL20-7D的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了提高植物产量产品；所述产品含有TaSPL20-7D、或所述生物材料。

上述产品中，所述提高植物产量产品可以以TaSPL20-7D作为活性成分，还可以将TaSPL20-7D和其它提高植物产量物质进行组合得到的组合物作为活性成分。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种改良植物产量相关性状的方法，所述方法包括向受体植物中导入TaSPL20-7D的编码基因得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和/或二次枝梗数增加。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育产量提高植物的方法，所述方法包括向受体植物中导入TaSPL20-7D的编码基因得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的产量增加。

上述改良植物产量相关性状的方法和培育产量提高植物的方法中，所述TaSPL20-7D的编码基因的编码序列均可为序列表中序列1的第213-1379位的DNA分子。

上述改良植物产量相关性状的方法和培育产量提高植物的方法中，所述受体植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为禾本科植物，如水稻或小麦。

在本发明的实施例中，所述TaSPL20-7D的编码基因(即序列1的第213-1379位核苷酸所示的DNA分子)通过含有TaSPL20-7D基因表达盒的TaSPL20-7D基因重组表达载体导入目的植物中。

上述改良植物产量相关性状的方法和培育产量提高植物的方法中，其中所述TaSPL20-7D基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaSPL20-7D基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述TaSPL20-7D基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述方法还包括从导入序列2所示的TaSPL20-7D的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因小麦。

本发明中，所述产量可为籽粒的产量。

本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaSPL20-7D基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为禾本科植物，如水稻或小麦。

实验证明，本发明的TaSPL20-7D及其编码基因可提高植物的穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和二次枝梗数：三个转TaSPL20-7D水稻株系的穗长均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出8.0％、15.2％和9.6％；三个转TaSPL20-7D水稻株系的穗粒数均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出33.9％、53.9％和31.5％；三个转TaSPL20-7D水稻株系的一次枝梗数均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出45.2％、35.5％和27.4％；三个转TaSPL20-7D水稻株系的二次枝梗数均显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出23.6％、48.6％和31.9％；三个转TaSPL20-7D水稻株系的千粒重均显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出9.4％、5.3％和1.9％；三个转TaSPL20-7D水稻株系的粒长均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出6.0％、5.5％和2.8％；三个转TaSPL20-7D水稻株系的粒宽均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出2.6％、1.7％和2.0％。表明，在实际生产中，可通过利用TaSPL20-7D及其编码基因提高植物的穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和二次枝梗数来提高植物产量。

附图说明

图1为过表达TaSPL20-7D转基因水稻三个株系的相对表达量。其中，L1-L3分表表示TaSPL20-7D-A、TaSPL20-7D-B和TaSPL20-7D-C，WT表示水稻KitaaKe，Vector表示pCUbi1390。

图2为TaSPL20-7D在小麦不同发育时期不同组织中的相对表达量；A和B分别为半定量PCR和实时定量PCR分析TaSPL20-7D在不同时期不同组织中的相对表达情况。

图3为不同发育时期TaSPL20-7D在小麦穗部各器官中的相对表达量；A和B分别为穗发育前期和穗发育后期TaSPL20-7D在小麦穗部各器官中的相对表达量

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的小麦(TriticumaestivumL.)品种偃展4110：弱春性，早熟，成熟期与对照豫麦18号相同。幼苗直立，分蘖力强，叶色浓绿，叶片宽短。株高75cm，株型较紧凑，旗叶上冲，抗倒性较好。小麦(TriticumaestivumL.)品种偃展4110(赵天祥等，EMS诱变六倍体小麦偃展4110的形态突变体鉴定与分析.中国农业科学,2009,42(3):755-764)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。来源于实验室保存材料，公众可从申请人处获得，仅限于用于重复本发明。

下述实施例中的载体pCUBi1390(水稻基因OsASIE1抗逆功能分析.作物学报，2011年37(10)1771-1778.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105(AgrobacteriumtumefaciensStrainEHA105)：BiovectorScienceLab,Inc产品。

下述实施例中的水稻KitaaKe(水稻高光效育种研究进展，生物技术进展，2014年4(3)153-157.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、TaSPL20-7D基因的功能验证

用TRIZOL提取小麦(TriticumaestivumL.)品种偃展4110幼苗总RNA，以M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(Invitrogen)，以此cDNA为模板，引物F1和R1进行PCR扩增，得到1445bp的PCR扩增产物。

F1：5'-AAGAGTTATTGCCAACGGAC-3'(序列1的第1-20位)；

R1：5'-CTAATGTGGTGTTCTAACTGTGG-3'(序列1的第1423-1445位的反向互补序列)。

经过测序，该PCR产物的序列如序列表中序列1所示，序列1的第213-1379位核苷酸为编码区，将序列1的第213-1379位核苷酸所示的基因命名为TaSPL20-7D基因，将该基因编码的蛋白质命名为TaSPL20-7D，其氨基酸序列为序列表中序列2。

一、转基因水稻的获得

1、重组载体的获得

将载体pCUbi1390的KpnI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列1的第213-1379位核苷酸所示的基因(TaSPL20-7D基因)，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pCUbi1390-TaSPL20-7D。pCUbi1390-TaSPL20-7D中TaSPL20-7D基因的表达由玉米泛素启动子启动。

将pCUbi1390-TaSPL20-7D导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌，将该重组菌命名为E-pCUbi1390-TaSPL20-7D；将载体pCUbi1390导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌，将该重组菌命名为E-pCUbi1390。

2、转基因水稻的获得

以水稻KitaaKe为受体，通过农杆菌介导转化方法利用E-pCUbi1390-TaSPL20-7D转化水稻KitaaKe的成熟胚愈伤组织，经过抗性愈伤组织的筛选及分化，生根、壮苗过程，最终获得32个T₀代转TaSPL20-7D基因水稻株系。

具体转化方法按照文献(HieiY,OhtaS,KomariT,KumashiroT.Efficienttransformationofrice(OryzasalivaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofboundariesoftheT-DNA.PlantJ，1994，6(2):271-282.)中的农杆菌介导的粳稻成熟胚愈伤组织转化法进行。

按照上述农杆菌介导的粳稻成熟胚愈伤组织转化法，用E-pCUbi1390转化水稻KitaaKe，得到T₀代转空载体水稻。

3、转基因水稻的分子鉴定

提取T₀代转TaSPL20-7D水稻株系的基因组DNA，用AS2-F1(5’-GGCGAGCGACGACTTCC-3’)和AS2-R1(5’-TGTCGTTGTTCTGGTCGGAG-3’)进行PCR扩增，鉴定得到23个阳性T₀代转TaSPL20-7D水稻株系。

将阳性T₀代转TaSPL20-7D水稻株系进行自交，得到T₁代转TaSPL20-7D水稻种子；将T₁代转TaSPL20-7D水稻种子播种，并用1‰潮霉素水溶液进行抗性筛选，得到T₁代转TaSPL20-7D植株，在正常条件下进行培养得到T₂代转TaSPL20-7D水稻种子；将T₂代转TaSPL20-7D水稻种子播种，并用1‰潮霉素水溶液进行抗性筛选，得到T₃代转TaSPL20-7D植株，选取三个T₃代转TaSPL20-7D株系进行表型鉴定，命名为TaSPL20-7D-A、TaSPL20-7D-B和TaSPL20-7D-C。

利用半定量PCR分析各植株中目的基因在RNA水平上的表达情况，结果如图1所示。用组成型表达的水稻Ubiqutin基因作为内参，设计的引物序列如下：

检测基因TaSPL20-7D基因表达的引物序列如下：

TaSPL20-RT-F：5’-CGGAGAATGACGACCAC-3’；

TaSPL20-RT-R：5’-GTCGTTGTTCTGGTCGG-3’；

检测水稻Ubiqutin基因表达的引物序列如下：

OsUBQ5-F：5’-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3’；

OsUBQ5-R：5’-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3’。

结果显示，转基因植株中导入的目的基因均得到表达。

提取T₀代转空载体水稻的基因组DNA，用潮霉素抗性基因引物HYG-F(5’-CTTCTGCGGGCGATTTGT-3’)和HYG–R(5’-CAGCGTCTCCGACCTGAT-3’)进行PCR扩增，鉴定得到阳性T₀代转空载体水稻。

将阳性T₀代转空载体水稻进行自交，并用1‰潮霉素水溶液进行抗性筛选，直至得到T₃代纯合转空载体水稻。

4、转基因水稻表型鉴定

取水稻KitaaKe(野生型对照，WT)、T₃代纯合转空载体水稻(Vector)和T₃代转TaSPL20-7D水稻株系(TaSPL20-7D-A、TaSPL20-7D-B和TaSPL20-7D-C)的种子，育秧后，在大田内生长至成熟。每个株系至少30株，实验重复3次。

转基因水稻完全成熟后，对野生型、转空载体水稻和转TaSPL20-7D水稻株系进行表型鉴定，分别对各水稻的穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和二次枝梗数进行统计分析。统计结果如表2。

表2、转基因水稻成熟期表型统计结果

性状	WT	转空载体植株	TaSPL20-7D-A株系	TaSPL20-7D-B株系	TaSPL20-7D-C株系
						穗长	12.5±0.9B	12.5±1.1B	13.5±1.3A	14.4±1.4A	13.7±1.1A
穗粒数	53.3±8.3B	50.5±9.2B	67.6±10.8A	77.7±14.1A	66.4±8.0A
						一次枝梗数	6.6±0.7B	6.2±0.5B	9.0±1.3A	8.4±1.2A	7.9±0.7A
二次枝梗数	7.7±1.9b	7.2±1.9b	8.9±2.4a	10.7±2.9a	9.5±2.2a
						千粒重	26.7±0.5b	26.6±0.8b	29.1±0.9a	28.0±0.8a	27.1±0.6a
粒长	7.52±0.08B	7.46±0.08B	7.91±0.17A	7.87±0.17A	7.67±0.10A
						粒宽	3.52±0.06B	3.55±0.04B	3.61±0.04A	3.58±0.05A	3.59±0.04A

注释：同一行中，标大写字母A的植株与标B的植株的相应性状在0.01水平存在极显著差异，标小写字母a的植株与标b的植株的相应性状在0.05水平存在显著差异。

穗长：野生型水稻与转空载体水稻的穗长基本无差异，三个转TaSPL20-7D水稻株系的穗长均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出8.0％、15.2％和9.6％。

穗粒数：野生型水稻与转空载体水稻的穗粒数基本无差异，三个转TaSPL20-7D水稻株系的穗粒数均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出33.9％、53.9％和31.5％。

一次枝梗数：野生型水稻与转空载体水稻的一次枝梗数基本无差异，三个转TaSPL20-7D水稻株系的一次枝梗数均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出45.2％、35.5％和27.4％。

二次枝梗数：野生型水稻与转空载体水稻的二次枝梗数基本无差异，三个转TaSPL20-7D水稻株系的二次枝梗数均显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出23.6％、48.6％和31.9％。

千粒重：野生型水稻与转空载体水稻的千粒重基本无差异，三个转TaSPL20-7D水稻株系的千粒重均显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出9.4％、5.3％和1.9％。

粒长：野生型水稻与转空载体水稻的粒长基本无差异，三个转TaSPL20-7D水稻株系的粒长均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出6.0％、5.5％和2.8％。

粒宽：野生型水稻与转空载体水稻的粒宽基本无差异，三个转TaSPL20-7D水稻株系的粒宽均极显著高于转空载体水稻，分别比转空载体水稻高出2.6％、1.7％和2.0％。

实验结果表明TaSPL20-7D能显著增加水稻穗长、穗分枝和穗粒数，同时增加粒长和粒宽以及千粒重。

实施例2、TaSPL20-7D基因在不同组织中的表达情况

一、TaSPL20-7D基因在不同组织中的表达情况

在小麦(TriticumaestivumL.)品种偃展4110生长不同时期取不同组织部位为样品，经液氮冷冻，-80℃保存备用。取得样品材料包括：苗期根(SR)，苗期顶端分生组织(SC)，4叶期顶端分生组织(4C)，6叶期顶端分生组织(6C)，返青期顶端分生组织(GC))，苗期叶(SL)，孕穗后的根(BR)、节(BN)、节间(BI)、叶鞘(BS)、叶(BL)、穗(BE)(0.5cm穗(0.5E)、2cm穗(2E)、3cm穗(3E)、6cm穗(6E)、8cm穗(8E)、10cm穗(10E))，孕穗后期的穗(BE)，开花期的穗(FE)，花后4天籽粒(4G)、花后7天籽粒(7G)、花后14天籽粒(14G)和花后21天籽粒(21G)。

用TRIZOL分别提取上述液氮保存样品的总RNA，采用实时定量和半定量方法检测TaSPL20-7D基因在不同时期不同组织中的表达差异。用组成型表达的Actin基因作为内参，设计的引物序列如下：

检测基因TaSPL20-7D基因表达的引物序列如下：

TaSPL20-RT-F：5’-CGGAGAATGACGACCAC-3’；

TaSPL20-RT-R：5’-GTCGTTGTTCTGGTCGG-3’；

检测基因Actin表达的引物序列如下：

Actin-F：5’-CTCCCTCACAACAACAACCGC-3’；

Actin-R：5’-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3’。

实时定量和半定量实验结果如图2所示，TaSPL20-7D基因在幼穗上的表达量明显高于其它组织。

二、TaSPL20-7D基因在穗部的时空表达情况

将小麦(TriticumaestivumL.)品种偃展4110穗部不同发育时期的各个器官取样，经液氮冷冻，-80оC保存备用。用TRIZOL分别提取上述液氮保存样品的总RNA，采用实时定量方法检测TaSPL20-7D从3cm的幼穗到开花时的穗在内稃、外稃、雌蕊、雄蕊和穗轴的表达情况。用组成型表达的Actin基因作为内参，检测TaSPL20-7D基因引物与检测基因Actin表达的引物同步骤一。

实时定量实验结果如图3所示，TaSPL20-7D基因在穗发育前期的内稃、外稃中大量表达。

Claims

1.蛋白质在下述1)-3)中任一种中的应用：

1)改良植物产量相关性状；

2)制备改良植物产量相关性状产品；

3)培育植物产量相关性状改良植物；

所述蛋白质是如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在权利要求1中所述1)-3)中任一种中的应用，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)-b4)中任一种：

b2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子cDNA分子或DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.提高植物产量产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1中所述蛋白质、或权利要求2或3中所述生物材料。

5.根据权利要求1-3中任一所述应用或权利要求4所述产品，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.根据权利要求5所述应用或所述产品，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

7.下述M1)或M2)的方法：

M1)一种改良植物产量相关性状的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的穗长、穗粒数、千粒重、粒长、粒宽、一次枝梗数和/或二次枝梗数增加；

M2)一种培育产量提高植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的产量增加。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因的编码序列是序列表中序列1的第213-1379位的DNA分子。

9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.根据权利要求7-9中任一所述方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。