CN111875684B

CN111875684B - 抗病耐热相关蛋白TaRHP1及其相关生物材料与培育抗病耐热植物的方法

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Publication number: CN111875684B
Application number: CN201910299035.2A
Authority: CN
Inventors: 张增艳; 王开
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN111875684A

Abstract

本发明公开了抗病耐热相关蛋白TaRHP1及其相关生物材料与培育抗病耐热植物的方法。TaRHP1是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物耐热性和抗病性相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。TaRHP1及其编码基因可用于提高植物对纹枯病和灰霉病的抗性，并可用于提高植物的耐热性。

Description

抗病耐热相关蛋白TaRHP1及其相关生物材料与培育抗病耐热植物的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中抗病耐热相关蛋白TaRHP1及其相关生物材料与培育抗病耐热植物的方法。

背景技术

随着全球气候变暖，高温等自然灾害日益加重，严重地影响重要作物的产量和籽粒品质(Trnka M,

RP,Ruiz-Ramos M,Kersebaum KC,Olesen JE,

Z,SemenovMA.Adverse weather conditions for European wheat production will become morefrequent with climate change.Nature Climate Change,2014,4:637–643)。世界上约50％人口以小麦面粉及其产品作为主粮，因此小麦高产稳产对于保障全球粮食安全起着举足轻重的作用。英国科学家预测，气温高于最适生长温度2度以上，即可引起小麦减产12～50％(Semenov&Shewry.2011,Modelling predicts that heat stress,not drought,willincrease vulnerability of wheat in Europe.Scientific Reports,1:66)。

小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)。我国小麦纹枯病主要由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1引起的。纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产50％以上。因此，选育和推广抗纹枯病小麦新品种是防治该病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保障我国小麦稳产、高产非常重要。然而，由于缺乏易于利用的抗纹枯病的小麦种质资源，常规育种方法在抗纹枯病的小麦品种育种方面进展缓慢。发掘、克隆重要抗病基因，通过基因工程或基因编辑创制抗病小麦新品系(种)，为抗纹枯病育种开辟了重要的新途径。

另外，灰霉菌(Botrytis cinerea)，又称灰葡萄孢菌，是一种广寄主性的真菌，其在空气中广泛分布，不仅能够侵染田间作物，也会给植物的采后阶段、储藏水果造成巨大损失。灰霉菌侵染后，能够引起多种植物幼苗、果实及储藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窖，这种病统称为灰霉病。截止2013年，世界上尚未发现有任何一种植物对灰霉菌产生抗性。灰霉病最初只是流行于欧洲和美洲，自20世纪80年代才开始在中国发生蔓延。由于温室和大棚种植技术的推广普及，作物灰霉病害严重，已成为蔬菜、花卉和林业苗培育基地生产的主要限制因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗病性(如植物对纹枯病和/或灰霉病的抗性)和/或耐热性。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种来源于小麦的抗病耐热蛋白，名称为TaRHP1，来源于抗纹枯病的小麦品系CI12633，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物耐热性和抗病性相关的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质中，序列表中的序列2由385个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，所述TaRHP1可来源于小麦。

与TaRHP1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与TaRHP1相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码TaRHP1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；

B6)降低TaRHP1表达的核酸分子；

B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下1)或2)所示的基因：

1)编码序列(ORF)是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子。

上述生物材料中，B6)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第1-1219位核苷酸所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子，如与序列表中序列1的第474-746位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子。

其中，序列表中的序列1由1219个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列1，编码序列表中的序列2所示的蛋白质。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码TaRHP1的核酸分子的表达盒(TaRHP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaRHP1的DNA，该DNA不但可包括启动TaRHP1基因转录的启动子，还可包括终止TaRHP1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述TaRHP1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗病剂和/或植物耐热剂。

本发明所提供的植物抗病剂和/或植物耐热剂含有所述蛋白质或/和所述蛋白质相关的生物材料。

上述植物抗病剂和/或植物耐热剂的活性成分可为所述蛋白质或所述蛋白质相关的生物材料，上述植物抗病剂和/或植物耐热剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的抗病和/或耐热效果确定。

上述植物抗病剂和/或植物耐热剂中，所述植物抗病剂可为抗植物纹枯病和/或抗植物灰霉病的药剂。

上述蛋白质、或上述生物材料的下述P1-P9中的任一种应用也属于本发明的保护范围：

P1、所述蛋白质或所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、所述蛋白质或所述生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

P3、所述蛋白质或所述生物材料在培育抗病植物中的应用；

P4、所述蛋白质或所述生物材料在制备植物抗病产品中的应用；

P5、所述蛋白质或所述生物材料在调控植物耐热性中的应用；

P6、所述蛋白质或所述生物材料在制备提高植物耐热性的产品中的应用；

P7、所述蛋白质或所述生物材料在培育耐热植物中的应用；

P8、所述蛋白质或所述生物材料在制备植物耐热产品中的应用；

P9、所述蛋白质或所述生物材料在植物育种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐热和/或抗病植物的方法。

本发明所提供的培育耐热和/或抗病植物的方法，包括提高目的植物中所述蛋白质或其编码基因的表达量，得到耐热和/或抗病植物；所述耐热和/或抗病植物的耐热性和/或抗病性高于所述目的种子植物的耐热性和/或抗病性。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质或其编码基因的表达量可通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。

上述方法中，其中所述蛋白质的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述蛋白质的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述耐热和/或抗病植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病性降低的转基因植物的方法

本发明所提供的培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达可通过将与序列表中序列1的第474-746位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上文中，所述植物和所述目的植物均为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，双子叶植物具体为十字花科植物，如拟南芥。

上文中，所述抗病性可为抗纹枯病和/或抗灰霉病。

上文中，所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。所述灰霉病可由灰霉菌(Botrytis cinerea)引起。

将TaRHP1基因导入拟南芥的转基因实验证明，表达TaRHP1基因的转基因拟南芥与受体拟南芥相比，耐热性和对灰霉病的抗性显著提高；将TaRHP1基因导入小麦的转基因实验证明，表达TaRHP1基因的转基因小麦与受体小麦相比，对纹枯病的抗性显著提高，说明TaRHP1基因是与植物抗纹枯病、抗灰霉病和耐热性相关的基因，TaRHP1及其编码基因可用于提高植物对纹枯病和灰霉病的抗性，并可用于提高植物的耐热性。

附图说明

图1为小麦接种禾谷丝核菌后TaRHP1基因表达量分析。

图2为小麦热处理后TaRHP1基因表达量分析。

图3为T₃代转TaRHP1基因拟南芥阳性株系中TaRHP1的转录相对水平的分析。

图4为TaRHP1表达的转基因拟南芥和野生型拟南芥对高温胁迫的表型。

图5为TaRHP1表达的转基因拟南芥对灰霉病的抗性提高。

图6为转TaRHP1基因小麦的PCR检测。

图7为RT-qPCR检测TaRHP1基因在小麦中沉默情况。

图8为TaRHP1基因沉默极显著地降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦CI12633为来自江苏省农业种质资源保护与利用平台(江苏农业科学院种质资源库)的种质，小麦CI12633表现为抗纹枯病。扬麦16为中感纹枯病小麦品种，来自于江苏里下河地区农业科学研究所；温麦6为来自国家植物种质资源共享平台(中国农业科学院种质资源库)的种质，温麦6高感纹枯病。

下述实施例中的野生型拟南芥为Col-0生态型拟南芥(Arabidopsis thalianaecotype Columbia-0(Col-0))(Zhao Xiang,Wang Jin,Yuan Jing,Wang Xi-li,ZhaoQing-ping,Kong Pei-tao,Zhang Xiao*.NITRIC OXIDE-ASSOCIATED PROTEIN1(AtNOA1)isessential for salicylic acid-induced root waving in Arabidopsis thaliana.NewPhytologist.2015,207:211-224)，由中国农科院作物科学研究所李文学研究员惠赠。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。Col-0生态型拟南芥对灰霉菌和高温敏感。

下述实施例中的小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301(江苏省农业科学院)(冷苏凤,张爱香,李伟,陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报,2010，26(6)：1176-1180)；小麦纹枯病致病菌WK207(Ji L,Liu C,Zhang L,Liu A,Yu J.Variation of rDNA internal transcribed spacer sequences inRhizoctonia cerealis.Current Microbiology.2017,74,877–884)，引自山东农农业大学于金凤教授。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的灰霉菌为灰霉菌(Botrytis cinerea)(Abuqamar S,Chai MF,LuoH,Song F,Mengiste T.Tomato protein kinase 1b mediates signaling of plantresponses to necrotrophic fungi and insect herbivory.Plant Cell.2008 20:1964-1983),公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的单子叶植物表达载体pWMB123(参考文献，Wang Ke,Liu Huiyun,Du Lipu,Ye Xingguo*.Generation of marker-free transgenic hexaploid wheat viaan Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinesewheat varieties.Plant Biotechnology Journal.2017,15,614–623)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的双子叶植物表达载体pCAMBIA1300(Zhao Xiang,Wang Jin,YuanJing,Wang Xi-li,Zhao Qing-ping,Kong Pei-tao,Zhang Xiao*.NITRIC OXIDE-ASSOCIATED PROTEIN1(AtNOA1)is essential for salicylic acid-induced rootwaving in Arabidopsis thaliana.New Phytologist.2015,207:211-224)。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中BSMV病毒载体的3个组分BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ质粒(Lu X-D(刘晓东),Zhang Z-Y(张增艳),Yao W-L(姚乌兰),XinZ-Y(辛志勇).Implement of barleystripe mosaic virus-based induced gene silencing in wheat.Acta Agron Sin(作物学报),2005,31(11):1518–1520；赵丹，赵继荣，黄茜，李宁，刘艳，黄占景，张增艳.利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能.作物学报ACTA AGRONOMICASINICA 2011,37(11):2106-2110)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

小麦纹枯病病级标准(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)，具体见表1。

表1.小麦纹枯病病级标准

小麦纹枯病病级(IT)	小麦纹枯病病症
		0级	植株的叶鞘与茎部均无病斑
1级	植株的叶鞘有病斑但不侵茎
		2级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎大于0小于等于1/2
3级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎大于1/2小于等于3/4
		4级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎大于3/4小于等于1
5级	植株的叶鞘与茎部均有病斑，且植株出现枯孕穗或枯白穗

其中，0级代表免疫、1级代表抗、2级代表中抗、3级-4级代表中感、5级代表高感。

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。

长满禾谷丝核菌的菌麦粒的制备方法：将浸泡5-6小时麦粒煮熟20分钟，塞满250-500毫升三角瓶，配制MS液体培养基，灭菌后，将新培养的禾谷丝核菌R0301、WK207的菌丝块接种到三角瓶中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

实施例1、抗病耐热的小麦TaRHP1编码基因的克隆

1、TaRHP1基因的克隆

本发明的发明人从抗纹枯病小麦种质CI12633中分离克隆出一个小麦抗病、耐高温相关的小麦基因TaRHP1，如序列表的序列1所示，将其编码蛋白命名为TaRHP1蛋白，如序列表的序列2所示。具体克隆方法如下：

提取接种纹枯菌R0301的小麦CI12633茎部总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以TaRHP1-OF1：5'-CAGCAGCAGCCACCTCTCTCT-3'和TaRHP1-OR1：5'-TTAGAAATCGAGCTGCGAGC-3'为引物，进行PCR扩增，扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后98℃变性30秒，54℃复性30秒，68℃延伸90秒，共35个循环；68℃延伸10分钟；PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该PCR产物连接到pEASY-Blunt载体(全式金公司)上得到重组载体，并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列是序列表中序列1，其编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸，编码序列2所示的蛋白质TaRHP1(序列表中序列2的第1-385位氨基酸残基)；将序列表中序列1所示的DNA命名为TaRHP1基因。将含有TaRHP1基因的重组载体命名为pEASY-TaRHP1。

2、小麦TaRHP1基因受纹枯病菌诱导表达的分析

为了研究TaRHP1基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用RT-qPCR分析在禾谷丝核菌接种不同天数的抗纹枯病和感纹枯病小麦中TaRHP1基因的表达情况。

用小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301菌丝牙签、麦粒接种于抗病小麦CI12633及感纹枯病小麦温麦6号(图1中简称wen 6)分蘖期幼苗的叶鞘与茎间；于接种前(mock)和接种2,4,7,10,14天，分别取各个小麦材料接种茎部组织，液氮速冻后储存于－80℃超低温冰箱备用。

分别提取各小麦材料茎的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaRHP1基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)分析TaRHP1基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。

内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

TaActin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

TaRHP1基因的特异引物对：TaRHP1-QF：5’-AAAAGCAATCCCAGATGAGGAC-3’和TaRHP1-QR，5’-TTGGTCTGTGCCACCTTATGAA-3’

结果如图1所示。对TaRHP1基因表达量分析结果表明，TaRHP1基因受纹枯菌诱导表达，其表达量在接种纹枯菌后4d达到高峰(图1)，而且该基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量显著高于在高感纹枯病材料温麦6号中的表达量(图1)，暗示TaRHP1参与小麦对纹枯病的抗性反应。

3、小麦TaRHP1基因受高温诱导表达的分析

为了研究TaRHP1基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用RT-qPCR分析TaRHP1基因在高温处理小麦幼苗中的表达情况。

小麦CI12633苗期(3叶1心)植株，在培养箱中在40℃进行高温处理0,0.5,1,2,3,6,9,12,24小时，分别取小麦叶组织，液氮速冻后，提取总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaRHP1基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)分析TaRHP1基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。

内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

TaActin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

结果如图2所示。对TaRHP1基因表达量分析结果表明，TaRHP1基因受高温诱导表达，其表达量在高温处理2小时达到第一高峰(2.91倍)，在高温处理12小时达到第二高峰(3.73倍)，暗示TaRHP1参与小麦对高温的耐受反应。

实施例2、抗病耐热的转TaRHP1基因拟南芥的获得与鉴定

一、重组表达载体的构建

1、将TaRHP1基因完整的ORF序列构建到双子叶植物表达载体pCAMBIA1300上，具体操作如下：以实施例1中的pEASY-TaRHP1为模板，采用A1300-TaRHP1-inF：GCTGTACAAGGTCG ACATGGCCGCCGCCGCCG(带下划线的序列为载体上的接头序列)和A1300-TaRHP1-inR：TACCG GATCCACTAGTGAAATCGAGCTGCGAG组成的引物对(带下划线的序列为载体上的接头序列)，在高保真扩增酶KOD-FX(TOYOBO公司)的作用下进行PCR扩增序列表中序列1的第62-1216位核苷酸，得到PCR扩增产物并回收。

PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃10s、58℃30s、68℃2min，35个循环；68℃10min。

2、回收并纯化步骤1得到的PCR扩增产物。

3、SalI线性化pCAMBIA1300载体，回收载体骨架。

4、将步骤1回收的PCR扩增产物用In-Fusion酶(In-Fusion HD Cloning Kit，Clontech)和步骤3回收的载体骨架进行连接，得到重组表达载体pCAMBIA1300-TaRHP1。

测序结果表明pCAMBIA1300-TaRHP1是含有序列表中序列1的第62-1216位核苷酸(编码序列表中序列2的蛋白质)的重组表达载体。

二、转TaRHP1基因植物的获得

1、将重组表达载体pCAMBIA1300-TaRHP1导入农杆菌GV3101的感受态细胞，得到重组农杆菌GV3101/pCAMBIA1300-TaRHP1。

2、将步骤1得到的重组农杆菌菌液转化Col-0生态型拟南芥花序：

挑取含pCAMBIA1300-TaRHP1的农杆菌阳性克隆(重组农杆菌GV3101/pCAMBIA1300-TaRHP1)，加入到1.5ml LB液体培养基(含卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml)中，28℃，200rpm孵育2天。将孵育好的100μl活化好的菌液加入到100ml液体LB培养基(含卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml)中，28℃200rpm过夜。4℃，5000rpm离心10min，弃上清。用配制好的转化液(100ml转化液:5g蔗糖；0.443g MS；0.02％Silwet L-77)把收集的菌液悬浮起来，OD₆₀₀＝1.8-2.0，倒入培养皿中，将Col-0生态型拟南芥花序完全浸入到液体中，静置大约1min，用保鲜膜将浸好的拟南芥花序包裹住，避光24h后取出正常培养，直至成熟，收获转TaRHP1基因植株的T₀代种子，将转TaRHP1基因植株的T₀代种子灭菌后点播在含有35ug/ml潮霉素的1/2MS培养基中，4℃春化3天，黑暗放置2天后正常培养5天，胚芽鞘伸长的阳性幼苗移栽到土中，在6-8叶期提取叶片DNA进行PCR鉴定，阳性单株单收种得到转TaRHP1基因植株的T₁代种子。T₁代种子消毒后点播在含有35μg/ml潮霉素的1/2MS培养基中，4℃春化3天，黑暗放置2天后正常培养5天，胚芽鞘伸长的阳性幼苗移栽到土中，阳性单株单收种子得到转TaRHP1基因植株的T₂代种子。依此类推获得转TaRHP1基因植株的T₃代种子。

3、PCR检测

在6-8叶期，每株成活的再生植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaRHP1基因特异的一段序列作为上游引物(TaRHP1-TG-F:5’-TGGACGAGCAAGTGATGAGG-3’)和TaRHP1基因特异的一段序列作为下游引物(TaRHP1-TG-R:5'-CTGCACTAAGATTTCCACCCTC-3')进行PCR扩增，以重组表达质粒pCAMBIA1300-TaRHP1为阳性对照,未转基因的野生型拟南芥的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为272bp。

PCR反应程序如下：先94℃5min；(94℃30s，58℃30s，72℃30s)，35个循环；再72℃5min；16℃保存。

PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。

PCR检测结果表明，在3株转TaRHP1基因植株的T₁代中，PCR阳性植株(即PCR产物有约272bp片段的转TaRHP1基因植株，以下简称T₁代转TaRHP1基因阳性植株)2株。

其中2株T₁代转TaRHP1基因阳性植收获到种子并被种植，得到T₁代单株。将T₁代单株进行潮霉素筛选，方法同以上步骤，单株收获T₂代种子并被种植，得到T₂代单株,依此类推获得T₃代种子，并种植单株，所有T₃代植株均为转TaRHP1基因阳性植株。

4、T₃代转TaRHP1基因阳性植株中TaRHP1的转录相对水平的分析

利用TaRHP1基因特异的定量引物(TaRHP1-QF:5’-AAAAGCAATCCCAGATGAGGAC-3',TaRHP1-QR:5’-TTGGTCTGTGCCACCTTATGAA-3’)和RT-qPCR技术分析2个T₃代转TaRHP1基因阳性株系中TaRHP1基因的相对表达量。利用拟南芥内源Actin基因(AtActin4-QF:5’-AGCACTTGCACCAAGCAGCATG-3’和AtActin4-QR：5’-ACGATTCCTGGACCTGCCTCATC-3’)作为内参。结果见图3。图3中，WT代表未转基因的Col-0生态型拟南芥，OE1和OE2分别代表2个T₃代转TaRHP1基因拟南芥阳性株系，M为DNA marker。结果表明2个T₃代转TaRHP1基因阳性株系中TaRHP1基因的相对表达量明显高于未转基因的拟南芥，未转基因的拟南芥中没有TaRHP1基因的表达。

三、TaRHP1表达的转基因拟南芥耐受高温胁迫

将22℃培养5天左右，2片子叶充分伸展的两个T₃代转TaRHP1基因阳性株系(OE1和OE2)植株和未转基因的Col-0生态型拟南芥(WT)植株(培养皿)，于38℃(水浴)处理3h，22℃恢复生长两天，在于45℃(水浴)热处理2h，恢复8天，统计幼苗存活率(图4)。实验设三次重复，每次重复设3个培养皿。结果表明，野生型拟南芥的存活率为5.6％(平均供试株数为72株，平均存活株数为4株),2个转基因拟南芥株系OE1和OE2的存活率分别为45.2％和34.4％(OE1平均供试株数为62株，平均存活株数为28株；OE2平均供试株数为61株，平均存活株数为21株)。该结果说明，TaRHP1表达显著增强了转基因拟南芥植株对高温的耐受能力，TaRHP1正向调控植物对高温的耐受反应。TaRHP1蛋白是耐热相关蛋白。

另外，测试了高温对转基因材料的种子发芽率和生长的影响：两个T₃代转TaRHP1基因拟南芥阳性株系(OE1和(OE2)和未转基因的拟南芥—野生型拟南芥(WT)种子消毒后50℃水浴1h，点播在1/2MS培养基上，4℃春化3天，22℃正常培养7天，拍照并统计。实验设三次重复，每次重复设3个培养皿。结果如表2所示，表明TaRHP1表达转基因拟南芥的种子发芽率和子叶展开率明显高于野生型，说明TaRHP1表达显著增强了转基因拟南芥对高温的耐受能力，TaRHP1正向调控植物对高温的耐受反应。

表2.高温(50℃)处理后转TaRHP1基因与野生型拟南芥种子的发芽率

发芽率(％)	WT	OE1	OE2
				胚根伸出为标准	53/70＝75.7	52/60＝86.7	62/72＝86.1
子叶展开为标准	43/70＝61.4	50/60＝83.3	58/72＝80.6

注：分子为发芽的株数，分母为供试株数。表中数据为三次重复实验的平均值。

五、TaRHP1表达的转基因植物对灰霉病抗性提高

将培养好的灰霉菌孢子液(5×10⁵个/mL)，接种到22℃培养三周左右的两个T₃代转TaRHP1基因阳性株系(OE1和OE2)和未转基因的野生型拟南芥(WT)植株第6-8片叶片上，继续培养7天，观察病斑并照相，然后提取叶片DNA，采用RT-QPCR测定灰霉菌Actin相对表达量。结果表明，与野生型拟南芥(WT)相比，TaRHP1表达的转基因拟南芥叶片上灰霉病菌斑显著小(图5)，其中灰霉菌生物量(用BcActin/AtActin表示，BcActin为灰霉菌Actin基因表达量，AtActin为拟南芥Actin基因表达量)极显著减少(图5)，证明TaRHP1表达显著增强了转基因拟南芥对灰霉病抗性。

实施例3、培育抗纹枯病的转基因小麦

一、重组表达载体的构建

将TaRHP1基因完整的ORF序列构建到单子叶转化载体pWMB132，具体操作如下：

以pCAMBIA1300-TaRHP1为模板用TaRHP1-O-F和TaRHP1-O-R组成的引物对，在高保真扩增酶PRIMERSTAR(TAKARA公司)的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并回收。

TaRHP1-O-F:5’-cgGGATCCATGGCCGCCGCCGCCG-3’(下划线指示的序列为BamH I酶切位点序列)；

(下划线指示的序列为Sac I酶切位点序列,方框指示的序列为6×HIS标签编码序列)。

PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃10s、56℃15s、72℃2min，35个循环；72℃10min。

2、回收并纯化步骤1得到的PCR扩增产物。

3、用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ酶切单子叶植物表达载体pWMB123，回收载体骨架。

4、将步骤1回收的PCR扩增产物用BamHⅠ和SacⅠ酶切后回收目的片段(TaRHP1)和步骤3回收的载体骨架进行连接，得到重组表达载体pWMB123-TaRHP1。

测序结果表明pWMB123-TaRHP1是将pWMB123的BamHⅠ和SacⅠ识别位点间的片段替换为序列表中序列1的第62-1216位核苷酸(编码序列表中序列2的蛋白质)并保持pWMB123的其它序列不变得到的重组表达载体。

二、转TaRHP1基因小麦的获得

1、将重组表达载体pWMB123-TaRHP1导入农杆菌C58C1的感受态细胞，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌转化扬麦16的幼胚愈伤组织，然后在渗透压培养基上后处理16h。

3、完成步骤2后，将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、完成步骤3后，将愈伤组织转移到分化筛选培养基(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)中，24-26℃光照培养14d。

5、完成步骤4后，将愈伤组织分化的小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养。获得了48株再生小麦植株。

6、将步骤5得到的再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆。移栽3周以后，有36株小麦植株(T₀代)成活。

7、转基因小麦的分子鉴定

在4叶期，每株成活的再生小麦植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaRHP1基因特异的一段序列作为上游引物(TaRHP1-TG-F:5’-TGGACGAGCAAGTGATGAGG-3’)和TaRHP1基因特异的一段序列作为下游引物(TaRHP1-TG-R:5'-CTGCACTAAGATTTCCACCCTC-3')进行PCR扩增，以重组表达质粒pWMB123-TaRHP1为阳性对照，野生型扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段约为272p。

PCR反应程序如下：先94℃5min；(94℃30s，58℃30s，72℃30s)，35个循环；再72℃10min；16℃保存。

PCR检测结果表明，在36株转pWMB123-TaRHP1扬麦16植株(T₀代)中，PCR阳性植株(即PCR产物有约272bp片段的转TaRHP1基因植株)8株。其中5株PCR阳性植株小麦收获到种子并被种植，得到T₁代单株。将T₁代单株进行PCR鉴定，方法同以上步骤。

在90株T₁代单株中，PCR阳性植株(即PCR产物有约272bp片段的转TaRHP1基因植株)65株，分属5个株系(分别为ORH1、ORH2、ORH3、ORH4和ORH5这5个T₁代转TaRHP1基因阳性株系)，阳性率72.22％(图6)。

图6中，P代表pWMB123-TaRHP1重组表达载体质粒DNA，WT代表扬麦16，ORH1、ORH2、ORH3、ORH4和ORH5分别代表5个T₁代转TaRHP1基因阳性株系。

三、转空载体植物的获得

用载体pWMB123代替重组质粒pWMB123-TaRHP1，其它同步骤二，得到T₁代转空载体阳性小麦株系，作为转TaRHP1基因阳性植株的对照

四、转基因植物的纹枯病抗性鉴定

1、纹枯病抗性鉴定

用于鉴定的实验材料为步骤二的T₁代转TaRHP1基因阳性株系、步骤三的T₁代转空载体阳性小麦株系和野生型扬麦16。

在小麦拔节期，将3-8粒布满小麦禾谷丝核菌R0301的菌麦粒埋到小麦茎基部周围，接种后喷水保湿5-7天；于小麦收获时调查纹枯病病情。每个处理20株。

纹枯病病情分级标准，按照李斯深等方法(表2)进行(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)。

抗病效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100％。

结果表明，接种小麦纹枯菌50天，未转基因扬麦16茎干基部出现典型的纹枯病病症，纹枯病病情指数为55.60；而5个转TaRHP1基因小麦株系ORH1、ORH2、ORH3、ORH4和ORH5的纹枯病病情指数分别为23.99、23.98、22.60、26.20和30.20，均与未转基因受体扬麦16的纹枯病达到极显著差异(P<0.01)，病情减轻(表3)，5个转TaRHP1基因阳性株系与对照--野生型扬麦16相比，小麦纹枯病抗病效果提高了45.68％-59.35％之间，说明TaRHP1基因过表达极显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗性，TaRHP1也是小麦抗纹枯病的重要正向调控基因。

表3.转基因小麦与对照的纹枯病病级及病情的调查结果

注：**表示在P<0.01水平上各转基因株系与扬麦16有极显著差异。

实施例4、培育纹枯病抗性降低的小麦进行TaRHP1反向功能分析

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaRHP1基因

1、将序列表中序列1的第474-746位核苷酸所示的DNA片段的两个末端，分别加上NheI识别序列。NheI酶切后，将序列表中序列1的第474-746位核苷酸所示的DNA片段(273bp)以反向插入法插入到NheI酶线性化后的BSMV-γ(BMSV病毒的γ载体)上，使与序列表中序列1的第474-746位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子(antiTaRHP1)被γ载体的T7启动子驱动，得到用于沉默TaRHP1重组载体BSMV：TaRHP1。

2、BSMV-α、BSMV-β和BSMV：TaRHP1质粒分别用Mlu I、Spe I和BssH II进行酶切线性化，参照试剂盒说明书利用体外转录试剂盒(Amplicap-Max T7High Yield MessageMaker in vitro transcription kit(Epicentre,USA))进行体外转录,得到BSMV-α体外转录RNA、BSMV-β体外转录RNA和BSMV：TaRHP1体外转录RNA。将BSMV-α体外转录RNA、BSMV-β体外转录RNA和BSMV：TaRHP1体外转录RNA等量混合,于三叶一心期，转染抗小麦纹枯病材料—小麦CI12633的第二、三片叶，接种完成后，向小麦幼苗(图7中记为BSMV：TaRHP1-1、BSMV：TaRHP1-2、BSMV：TaRHP1-3和BSMV：TaRHP1-4)喷施DEPC水，保鲜膜覆盖保湿24h，之后移去保鲜膜，每隔6h喷施一次DEPC水。

3、接种第12天取第四片叶片，提取RNA，采用qRT-qPCR检测TaRHP1基因沉默情况(TaRHP1-QF：5’-AAAAGCAATCCCAGATGAGGAC-3’和TaRHP1-QR，5’-TTGGTCTGTGCCACCTTATGAA-3’)。

结果如图7所示：与导入BSMV-γ体外转录RNA、BSMV-α体外转录RNA和BSMV-β体外转录RNA的CI12633(图7中记为BMSV：γ00，作为空载体对照)相比，导入BSMV-α体外转录RNA、BSMV-β体外转录RNA和BSMV：TaRHP1体外转录RNA的CI12633植株中TaRHP1基因被沉默，这些植株分别命名为BSMV：TaRHP1-1、BSMV：TaRHP1-2、BSMV：TaRHP1-3和BSMV：TaRHP1-4。

二、被沉默的小麦植株的抗病性鉴定

步骤一的小麦转染BSMV病毒20天后，采用牙签接种法对其接种禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207：将长满禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207菌丝的牙签嵌入到基部第1-2叶鞘之间，菌麦粒置于植株的茎基部，用湿润的脱脂棉将其轻轻包围，保湿7天，以后每天喷施2次DEPC水。禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207接种40天后，进行纹枯病病级鉴定。结果如图8所示，TaRHP1基因表达沉默后的4株BSMV:TaRHP1植株(BSMV：TaRHP1-1、BSMV：TaRHP1-2、BSMV：TaRHP1-3和BSMV：TaRHP1-4)茎部位的纹枯病病斑(平均病级3.59)明显大于对照(BMSV：γ00)植株的病斑(平均病级1.75)，TaRHP1沉默的小麦CI 12633植株与空载体对照小麦CI12633植株的平均病级相差1.84,平均病情指数降低51.25％，表明TaRHP1基因沉默极显著地降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaRHP1是小麦抗纹枯病反应所需的基因。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 抗病耐热相关蛋白TaRHP1及其相关生物材料与培育抗病耐热植物的方法

<130> GNCFH190926

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1219

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum）

<400> 1

cagcagcagc cacctctctc tctccaggcc gagtcgtcag aggggagcag cgccgacgcc 60

catggccgcc gccgccgccg ccggaacagg ggcccagacc ctcggccgga gcagcttctc 120

gcgcgccgcc tcttcgaaga ccgcctcgtc ctcgtcaccc gtcaccccct ccggcgtcaa 180

gctcggcccc aacggcgccg ccttcgtctc ctccggcatc cccgacctcg acaggatcct 240

gggcggcggc ttcctcctcg gctcggtcgt gatggtcatg gaggactccg acgcgccgca 300

ccacctcctc ctgctccggg ccttcatggc gcagggcgtc gtgcacaagc agcccctgct 360

ctttgcggca cctatgaagg agccccgctc gttcctcggc gcactgcctg ctccggcggc 420

gtcctcgaag gaggacgcgc ggcagagggc gatgggtggc ggagcagctg gcgatggacg 480

agcaagtgat gagggtttga ggatagcttg gcagtacagg aaatattttg gggacgaaag 540

gaattccagt tctgaacaca gagacagcaa gcaggaattt agccatgatt ttgatttacg 600

gaagcccctg gaacggcatt tacttaatgc acagcatatt gaatgtttga gcactaaaga 660

tgtggatact ctccatgatc tccaggatcg ctgttctgct ttcttatcca aacatcaaag 720

aaaagagggt ggaaatctta gtgcaggacg tattgctata cagtcactct gtgcaccaca 780

gtgtggatat tttgggaagg actgggacat ggtctcgttt ctcagatcag tgaaggccat 840

ggtgcgctca tctaacgccg ttgccattgt aacatttcca tacacagtcc tatcagattc 900

tttctgcaag agatggcagc acctagcaga cacgctgctg tcaataaaag caatcccaga 960

tgaggacaag gacttggcga agctcctcac ggggtatcag gacatggttg gttttctgca 1020

tgttcataag gtggcacaga ccaacagcca ggttcctgtg atattagagg cgtccacgtt 1080

ttctctgaag ctgcgaaaga ggaggtcgct ggtgctggaa cggctgaacc aggccccggt 1140

ggacgggtcg agcgggccct cgtctggtgg atcaggcagt tgctcctcgt cgacgcaagg 1200

ctcgcagctc gatttctaa 1219

<210> 2

<211> 385

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivum）

<400> 2

Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gln Thr Leu Gly Arg

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ser Arg Ala Ala Ser Ser Lys Thr Ala Ser Ser Ser Ser

20 25 30

Pro Val Thr Pro Ser Gly Val Lys Leu Gly Pro Asn Gly Ala Ala Phe

35 40 45

Val Ser Ser Gly Ile Pro Asp Leu Asp Arg Ile Leu Gly Gly Gly Phe

50 55 60

Leu Leu Gly Ser Val Val Met Val Met Glu Asp Ser Asp Ala Pro His

65 70 75 80

His Leu Leu Leu Leu Arg Ala Phe Met Ala Gln Gly Val Val His Lys

85 90 95

Gln Pro Leu Leu Phe Ala Ala Pro Met Lys Glu Pro Arg Ser Phe Leu

100 105 110

Gly Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ser Ser Lys Glu Asp Ala Arg Gln

115 120 125

Arg Ala Met Gly Gly Gly Ala Ala Gly Asp Gly Arg Ala Ser Asp Glu

130 135 140

Gly Leu Arg Ile Ala Trp Gln Tyr Arg Lys Tyr Phe Gly Asp Glu Arg

145 150 155 160

Asn Ser Ser Ser Glu His Arg Asp Ser Lys Gln Glu Phe Ser His Asp

165 170 175

Phe Asp Leu Arg Lys Pro Leu Glu Arg His Leu Leu Asn Ala Gln His

180 185 190

Ile Glu Cys Leu Ser Thr Lys Asp Val Asp Thr Leu His Asp Leu Gln

195 200 205

Asp Arg Cys Ser Ala Phe Leu Ser Lys His Gln Arg Lys Glu Gly Gly

210 215 220

Asn Leu Ser Ala Gly Arg Ile Ala Ile Gln Ser Leu Cys Ala Pro Gln

225 230 235 240

Cys Gly Tyr Phe Gly Lys Asp Trp Asp Met Val Ser Phe Leu Arg Ser

245 250 255

Val Lys Ala Met Val Arg Ser Ser Asn Ala Val Ala Ile Val Thr Phe

260 265 270

Pro Tyr Thr Val Leu Ser Asp Ser Phe Cys Lys Arg Trp Gln His Leu

275 280 285

Ala Asp Thr Leu Leu Ser Ile Lys Ala Ile Pro Asp Glu Asp Lys Asp

290 295 300

Leu Ala Lys Leu Leu Thr Gly Tyr Gln Asp Met Val Gly Phe Leu His

305 310 315 320

Val His Lys Val Ala Gln Thr Asn Ser Gln Val Pro Val Ile Leu Glu

325 330 335

Ala Ser Thr Phe Ser Leu Lys Leu Arg Lys Arg Arg Ser Leu Val Leu

340 345 350

Glu Arg Leu Asn Gln Ala Pro Val Asp Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ser

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ser Ser Thr Gln Gly Ser Gln Leu Asp

370 375 380

Phe

385

Claims

1.蛋白质或生物材料在调控小麦抗病性中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

B9）含有B8）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

所述抗病性为抗纹枯病和/或抗灰霉病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

3.蛋白质或生物材料在制备提高小麦抗病性的产品中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

所述抗病性为抗纹枯病和/或抗灰霉病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

5.蛋白质或生物材料在培育抗病小麦中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

所述抗病为抗纹枯病和/或抗灰霉病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

7.蛋白质或生物材料在制备小麦抗病产品中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

所述抗病为抗纹枯病和/或抗灰霉病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

9.蛋白质或生物材料在调控拟南芥耐热性中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

B9）含有B8）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

11.蛋白质或生物材料在制备提高拟南芥耐热性的产品中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

13.蛋白质或生物材料在培育耐热拟南芥中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

15.蛋白质或生物材料在制备拟南芥耐热产品中的应用；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B8）降低所述蛋白质表达的核酸分子；

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列1的第62-1219位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列1的DNA分子。

17.一种培育抗病小麦的方法，包括提高目的小麦中蛋白质或其编码基因的表达量，得到抗病小麦；所述抗病小麦的抗病性高于所述目的小麦的抗病性；所述抗病性为抗纹枯病和/或抗灰霉病；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述提高目的小麦中蛋白质或其编码基因的表达量是通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的小麦实现的。

19.一种培育耐热拟南芥的方法，包括提高目的拟南芥中蛋白质或其编码基因的表达量，得到耐热拟南芥；所述耐热拟南芥的耐热性高于所述目的拟南芥的耐热性；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于：所述提高目的拟南芥中蛋白质或其编码基因的表达量是通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的拟南芥实现的。

21.一种培育抗病性降低的转基因小麦的方法，包括降低目的小麦中蛋白质的编码基因的表达，得到抗病性低于目的植物的转基因小麦；所述抗病性为抗纹枯病和/或抗灰霉病；所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述降低目的小麦中蛋白质的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第474-746位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的小麦实现的。