CN105441460B

CN105441460B - 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1及应用

Info

Publication number: CN105441460B
Application number: CN201610001896.4A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 王国东; 普丽梅; 李金晶; 杨野; 关瑞攀; 白志伟; 葛锋
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2016-01-06
Filing date: 2016-01-06
Publication date: 2018-08-10
Anticipated expiration: 2036-01-06
Also published as: CN105441460A

Abstract

本发明公开了一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实LrWRKY1基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌LrWRKY1基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，结果转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，实验结果显示超表达LrWRKY1的转基因烟草对葡萄座腔菌、核盘菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌等四种真菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1及应用。

背景技术

植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是真菌病害，约占到植物总病害的80％，严重影响农作物的产量和品质。传统的病害防治方法取得了一定成效，一是依靠传统育种方法培育抗性品种，二是化学农药的使用，三是采取轮作等耕作制度。然而，这些方法都存在或多或少的弊端，如抗性品种培育的周期长、化学农药残留高且极易造成环境污染、耕作制度调整则费时费力，所以传统控制植物病害的方法均不能彻底解决问题。随着重组DNA技术的创立和发展，利用基因工程技术来培育抗病植物新品种已取得初步成效，且有望从根本上解决真菌病害问题。

植物以一种高度可变且时序性的方式对转录组进行大规模重新编程以应对病原物入侵或其它逆境胁迫，而这种赋予植物对不同环境条件具有可塑性适应的调控反应是多种转录因子网络作用的结果。WRKY转录因子是植物防卫反应相关转录因子网络中的一个调控蛋白基因家族，主要参与植物免疫系统应对多种不同的生物和非生物胁迫(Pandey SP,Somssich IE. The role of WRKY transcription factors in plant immunity. PlantPhysiol, 2009, 150(4): 1648–1655 ; Bakshi M, Oelmüller R. WRKY transcriptionfactor: Jack of many trades in plants. Plant Signal Behav, 2014, 9(2):e27700)。WRKY转录因子是植物中最大的几类转录因子之一，在其氨基酸序列的N端具有WRKY结构域。WRKY结构域具有保守的WRKYGQK氨基酸序列，通常与名为W盒(W box，C/TTGACT/C)的顺式作用元件结合。WRKY蛋白与靶基因启动子区的顺式作用元件核心结构是TTGAC(C/T)的W-box特异结合，即所有启动子中含W-box的基因都可能是WRKY的靶基因，包括WRKY本身(Dong J X, Chen C H, Chen Z X. Expression profiles of theArabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response. Plant MolBiol, 2003, 51(1): 21-37)。WRKY结构域由四股β折叠构成，保守的WRKYGQK残基对应于N端的β折叠(strand β-1)，能够进入DNA沟并与DNA上的W盒发生作用(Ciolkowski I，WankeD， Birkenbihl R，et al. Studies on DNA-binding selectivity of WRKYtranscription factors lend structural clues into WRKY-domain function. PlantMol Biol, 2008, 68(1-2): 81–92)。

WRKY转录因子通过调控植物转录组重新编程以应对不同病原物的入侵，其对抗病反应相关基因的转录调控是植物对病原体防卫反应的关键组成部分，在植物防卫反应中起重要作用。目前已从模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)中分离了大量WRKY转录因子。WRKY转录因子是植物对病原体防卫反应的关键组成部分，在植物防卫反应中起重要作用。水稻(Oryza sativa) OsWRKY13的超表达无论在苗期还是成株期都增强了转基因植株对白叶枯病(Xanthomonas campestris pv. Oryzae)和稻瘟病(Magnaporthe oryzae)的抗性(Qiu D, Xiao J, Xie W, et al. Rice Gene networkinferred from expression profiling of plants overexpressing OsWRKY13, apositive regulator of disease resistance. Mol Plant, 2008, 1(3): 538-551.)。OsWRKY22缺失的水稻突变体对稻瘟病的敏感性增强，而超表达OsWRKY22则可以提高转基因水稻对稻瘟病的抗性(Abbruscato P, Nepusz T, Mizzd L，et a1. OsWRKY22, a monocotWRKY gene, plays a role in the resistance response to blast. Mol PlantPathol, 2012，13(8): 828-841.)。在拟南芥中过表达AtWRKY28增强对甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)的抗性(伍林涛, 钟贵买, 王健美等. 转录因子AtWRKY28在拟南芥与甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)亲和性互作中的功能分析. 中国农业科技导报, 2012, 14(1): 65-71.)。过表达PtWRKY23的转基因杨树(Populus tremula)对Melampsora spp.的抵抗能力显著增加(Leve'e V, Major I, Levasseur C.et al.Expression profiling and functional analysis of Populus WRKY23 reveals aregulatory role in defense. New Phtol, 2009, 184(1): 48-70.)。PtWRKY14超表达则可增强烟草(Nicotiana tabacum)对TMV侵染的抵抗能力(王兴, 林善枝. PtWRKY14基因转化烟草及对TMV的抗性影响研究. 广东农业科学, 2014, 41(7): 130-133.)。

本发明的WRKY转录因子基因LrWRKY1来自岷江百合(Lilium regale Wilson)。岷江百合又名王百合，多年生草本植物，我国的百合特有种。仅分布于川西岷江流域海拔800～2700m的河谷到山腰的岩石缝中，具有极强的抗病性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从岷江百合中克隆获得编码具有抗真菌活性的WRKY转录因子的全长基因LrWRKY1，WRKY转录因子基因LrWRKY1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因cDNA全长序列为1984bp，包含一个1659bp的开放阅读框、75bp的5’非翻译区、250bp的3’非翻译区，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明中LrWRKY1基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第76-1734位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为LrWRKY1。

WRKY转录因子是植物防卫反应相关转录因子网络中的一个调控蛋白基因家族，已经明确WRKY转录因子家族是植物免疫系统的关键调控因子，正向或负向调控植物的防卫反应和信号转导途径。WRKY转录因子通过调控植物转录组重新编程以应对不同病原物的入侵，其对抗病反应相关基因的转录调控是植物对病原体防卫反应的关键组成部分，在植物防卫反应中起重要作用。

本发明涉及分离包含LrWRKY1的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵袭的表型，其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO：1所示，对该基因进行序列分析，发现LrWRKY1全长cDNA为1984 bp，包含一个1659 bp的开放阅读框(ORF)、75bp的5’非翻译区(untranslated region，UTR)、250 bp的3’UTR，其中ORF编码一个具有552个氨基酸的蛋白质。LrWRKY1编码蛋白具有WRKY蛋白的保守结构域，BLASTp检索结果表明LrWRKY1编码的蛋白质与油棕(Elaeis guineensis)、拟南芥、山胡椒(Lindera glauca)和大豆(Glycine max)的WRKY转录因子的相似性分别为66%、60%、57%和55%，表明其属于岷江百合中的WRKY转录因子。超表达序列表SEQ ID NO：2所示的蛋白质可以增强烟草对灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、核盘菌、葡萄座腔菌的抗性。

本发明将岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1应用在提高烟草对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)抗性中，具体操作如下：

（1）采用扩增LrWRKY1的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)扩增出LrWRKY1的全长编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

（2）用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切pMD-18T-LrWRKY1载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pCAMBIA2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得LrWRKY1基因片段与pCAMBIA2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的LrWRKY1基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明LrWRKY1转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果示意图，图中：Marker为DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；正对照为质粒pMD-18T-LrWRKY1为模板的PCR结产物；WT为非转基因烟草(野生型)总DNA为模板PCR的产物；

图2是本发明阳性LrWRKY1转基因烟草中LrWRKY1转录水平的表达分析结果图；图中：Marker是DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT是非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；正对照是质粒pMD-18T-LrWRKY1为模板的PCR产物；

图3是本发明LrWRKY1转基因烟草体外抑菌活性效果图；图中a、b、c、d分别是灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、核盘菌、葡萄座腔菌；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：LrWRKY1全长基因克隆以及序列分析

用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种24 h后的根提取总RNA，用液氮将接种后的岷江百合根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV (promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg TotalRNA，依次加入50 ng oligo（dT），2 μL dNTP（2.5mM each）、DEPC水至反应体积为14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-standbuffer、0.5 μL RNasin（200U）、1 μL M-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因LrWRKY1，所用上下游引物序列分别为5’ACCTTCCCATCCTCTTCCCCT3’及5’CTGACCAACCATTGAAGCCCTA3’。采用Advantage^TM 2 PCREnzyme（Clontech）扩增出目的基因；PCR反应条件：95℃ 1 min；95℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 5 min；反应体系（10 μL）为1 μL cDNA、1 μL 10×Advantage 2PCR Buffer、0.5 μL 50×dNTP Mix （10mM each）、0.2 μL 正向引物（10 μM）、0.2μL 反向引物（10 μM）、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、6.9 μL PCR-Grade water；PCR结束后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector（50 ng/μL）和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16 ℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrWRKY1的特异引物鉴定出多克隆位点插入LrWRKY1的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的LrWRKY1全长cDNA为1984bp，通过NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个1659bp的开放读码框（见序列表），LrWRKY1编码一个含552个氨基酸的蛋白质LrWRKY1，其分子量约为61.05 KDa，等电点约为6.30，含有4个半胱氨酸残基。借助生物信息学软件SignalP 4.1分析LrWRKY1编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽。结果显示在LrWRKY1中没有检测到信号肽的存在，表明LrWRKY1是一种非分泌蛋白。LrWRKY1具有2个WRKYGQK保守结构域，在每个WRKY结构域之后紧接一个C2H2 (C-X4-C-X22/23-H-X1-H)型锌指基序。显然，LrWRKY1编码的蛋白质属于Ⅰ类WRKY转录因子。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入LrWRKY1的大肠杆菌质粒pMD-18T-LrWRKY1以及植物表达载体pCAMBIA2300s的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶BamHI（TaKaRa）和XbaI（TaKaRa）分别对质粒pMD-18T-LrWRKY1和pCAMBIA2300s进行双酶切（100 μL体系），反应体系和操作过程为：取20 μL pMD-18T-LrWRKY1和pCAMBIA2300s质粒、依次加入10 μL 10×Kbuffer、4μL BamHI、6 μLXbaI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对LrWRKY1片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）；取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase（TaKaRa），将回收的LrWRKY1 DNA片段和pCAMBIA2300s载体片段连接起来，反应体系（20 μL）和操作过程为：取10 μL LrWRKY1 DNA片段依次加入2 μLpCAMBIA2300s载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素（kanamycin，Km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LrWRKY1的特异引物进行PCR，挑选出LrWRKY1与pCAMBIA2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒（上海生工）提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300s-LrWRKY1质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300s-LrWRKY1转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpCAMBIA2300s-LrWRKY1质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5 min，之后立即冰浴2 min，加入800 μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrWRKY1的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA2300s-LrWRKY1是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1 %的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养6 d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用1/2MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-LrWRKY1质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养2-3 h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶子切成1 cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15 min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L sucrose+6g/L琼脂+50mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素（cefotaxime sodium salt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1 μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增LrWRKY1的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，LrWRKY1转基因烟草共筛选到30株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中LrWRKY1的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增LrWRKY1的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因单株中LrWRKY1转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到17个转基因单株中LrWRKY1在转录水平大量表达，这些单株的编号为L1～L17。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性，供试真菌共有6种：胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、葡萄座腔菌（Botrosphaeria dothidea）。

为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1 g转基因烟草单株（编号分别为L-1、L-3、L-8、L-12、L-15）及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液（1M NaCl，0.1M 乙酸钠，1% PVP，pH6），充分研磨；转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30 min（12,000 g/min），取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价LrWRKY1转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，LrWRKY1转基因烟草蛋白对灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、核盘菌、葡萄座腔菌的生长具有很强的抑制作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1984

<212> DNA

<213> Lilium regale Wilson

<220>

<221> mRNA

<222> (1)..(1984)

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(75)

<220>

<221> CDS

<222> (76)..(1734)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (1735)..(1984)

<400> 1

ctggtggatt gacgatcttg aaagcaggga tatcaacgca gagtacatgg gaccttccca 60

tcctcttccc ctcccatggc ctcctccacc ggaagcttag aaacgtcctc caattccctc 120

cctcccccct tctacttctc cagccccttc gccgcctcct tctccgagct cctctccggc 180

gccgctgaca tcgaagatgt cgacgataac cgctcgagag ctccggctgc ccgagcagcc 240

ggcatcccca agttcaagac cctcaatcca ccctccctcc caatttccac gccacccatc 300

tccccatctt cttacttcgc catccccgcc ggtctcagcc ccgccgaatt gctcgactcg 360

ccggtcctac tctcttctta tatacttcca tctccaacaa ctggcacctt accaacacag 420

tatcacaatt ggaagttcac tccgtccaat ttccaacagg gaatgaagga agaaaacaaa 480

ccctacccgg gtttcacctt tccaactccg gcgaaaactg atcagaatcc atcgttcgta 540

caatctgaag aagcattcaa gggagataat caacaatcat ggagctacca agattccacc 600

accaccaaca ccaccaacaa taacatgaag accgaagtcc cggcgcctat acgaacaaac 660

tcgactgaga tcctaacttt gccggcaccc agtcaaggca gcaaagtcgg gtttcaatct 720

gattacaacc actctattca gccagctcag atcctcagag aaccgaggaa gtccgacgac 780

ggatacaact ggaggaagta tgggcagaaa caggtgaagg ggagcgagaa cccgcggagc 840

tactataagt gcacctatcc taattgtccg acgaagaaga aggtggagag ggctttggat 900

gggcagatta ctgagattgt gtacaagggt agccacaacc acccgaaacc tttggccact 960

aggaggaact cgtcttctct ctcgcagtcg attcaggctt cagttacttc ggaagtgtct1020

gatcactcca ctgccacacc ggagaactct tcagtctctt ttggggaaga tgagattgat1080

gtagtctctc agagaagcaa tttgggggga gaggaggttg atgatgagga gcctgatgcc1140

aaacgctgga agcaagaggg gatcttggct tcaggtaaca agacagtgag ggagccaagg1200

gtggtggtgc agacgacgag cgatatcgat atcctcgatg atggctatag gtggaggaag1260

tatgggcaga aggttgtgaa ggggaatcca aacccaagga gctactacaa gtgcactact1320

gcgagttgcc cagtgcgaaa gcatgttgag agagcgtccc atgacctgag ggcagtgatc1380

actacctacg aggggaagca caaccatgat gtccctgcag ctaggggaag cgggggacat1440

gcggccagcc gtccactccc cccaaacaac aacaacaaca tggcaataag gccatcagca1500

gtggccaacc actcaaccaa ctctatctat ggccaaaggt tcaacacatc tgataaccaa1560

ggtcagttcg atatgcggat gttgcagcag aaccaaggga tgtacggata ccctggttac1620

gagaattcga tgaattcatc ctatatggat caacaacaac aagaagaaag tatcttttcc1680

aaagctaaag aggaaccaag agatgacttg cttctcgact catggctggc ctagggcttc1740

aatggttggt caggggtgtt atagttttca atgtatattt tgatagttga ttttgtgtaa1800

attatgtgag gtagaggaca tcagtctagc tcatttgttt atttgttgga ctattggtga1860

aataagatcc attatactga aggattgtca aactgttgta gcagatttgt gcaagtgagg1920

gagatggact aaattgagaa agaaatgata attagatagt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1980

aaaa 1984

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> Lilium regale Wilson

<400> 2

Met Ala Ser Ser Thr Gly Ser Leu Glu Thr Ser Ser Asn Ser Leu Pro

1 5 10 15

Pro Pro Phe Tyr Phe Ser Ser Pro Phe Ala Ala Ser Phe Ser Glu Leu

20 25 30

Leu Ser Gly Ala Ala Asp Ile Glu Asp Val Asp Asp Asn Arg Ser Arg

35 40 45

Ala Pro Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ile Pro Lys Phe Lys Thr Leu Asn

50 55 60

Pro Pro Ser Leu Pro Ile Ser Thr Pro Pro Ile Ser Pro Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Phe Ala Ile Pro Ala Gly Leu Ser Pro Ala Glu Leu Leu Asp Ser Pro

85 90 95

Val Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Leu Pro Ser Pro Thr Thr Gly Thr Leu

100 105 110

Pro Thr Gln Tyr His Asn Trp Lys Phe Thr Pro Ser Asn Phe Gln Gln

115 120 125

Gly Met Lys Glu Glu Asn Lys Pro Tyr Pro Gly Phe Thr Phe Pro Thr

130 135 140

Pro Ala Lys Thr Asp Gln Asn Pro Ser Phe Val Gln Ser Glu Glu Ala

145 150 155 160

Phe Lys Gly Asp Asn Gln Gln Ser Trp Ser Tyr Gln Asp Ser Thr Thr

165 170 175

Thr Asn Thr Thr Asn Asn Asn Met Lys Thr Glu Val Pro Ala Pro Ile

180 185 190

Arg Thr Asn Ser Thr Glu Ile Leu Thr Leu Pro Ala Pro Ser Gln Gly

195 200 205

Ser Lys Val Gly Phe Gln Ser Asp Tyr Asn His Ser Ile Gln Pro Ala

210 215 220

Gln Ile Leu Arg Glu Pro Arg Lys Ser Asp Asp Gly Tyr Asn Trp Arg

225 230 235 240

Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Gly Ser Glu Asn Pro Arg Ser Tyr

245 250 255

Tyr Lys Cys Thr Tyr Pro Asn Cys Pro Thr Lys Lys Lys Val Glu Arg

260 265 270

Ala Leu Asp Gly Gln Ile Thr Glu Ile Val Tyr Lys Gly Ser His Asn

275 280 285

His Pro Lys Pro Leu Ala Thr Arg Arg Asn Ser Ser Ser Leu Ser Gln

290 295 300

Ser Ile Gln Ala Ser Val Thr Ser Glu Val Ser Asp His Ser Thr Ala

305 310 315 320

Thr Pro Glu Asn Ser Ser Val Ser Phe Gly Glu Asp Glu Ile Asp Val

325 330 335

Val Ser Gln Arg Ser Asn Leu Gly Gly Glu Glu Val Asp Asp Glu Glu

340 345 350

Pro Asp Ala Lys Arg Trp Lys Gln Glu Gly Ile Leu Ala Ser Gly Asn

355 360 365

Lys Thr Val Arg Glu Pro Arg Val Val Val Gln Thr Thr Ser Asp Ile

370 375 380

Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val

385 390 395 400

Val Lys Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Thr Ala

405 410 415

Ser Cys Pro Val Arg Lys His Val Glu Arg Ala Ser His Asp Leu Arg

420 425 430

Ala Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Ala

435 440 445

Ala Arg Gly Ser Gly Gly His Ala Ala Ser Arg Pro Leu Pro Pro Asn

450 455 460

Asn Asn Asn Asn Met Ala Ile Arg Pro Ser Ala Val Ala Asn His Ser

465 470 475 480

Thr Asn Ser Ile Tyr Gly Gln Arg Phe Asn Thr Ser Asp Asn Gln Gly

485 490 495

Gln Phe Asp Met Arg Met Leu Gln Gln Asn Gln Gly Met Tyr Gly Tyr

500 505 510

Pro Gly Tyr Glu Asn Ser Met Asn Ser Ser Tyr Met Asp Gln Gln Gln

515 520 525

Gln Glu Glu Ser Ile Phe Ser Lys Ala Lys Glu Glu Pro Arg Asp Asp

530 535 540

Leu Leu Leu Asp Ser Trp Leu Ala

545 550

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accttcccat cctcttcccc t 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgaccaacc attgaagccc ta 22

Claims

1.一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.根据权利要求1所述岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1，其特征在于：LrWRKY1的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第76-1734位所示的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述的岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1在提高烟草对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)抗性中的应用。

4.根据权利要求3所述岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1的应用，其特征在于提高烟草的真菌抗性的具体操作如下：

（1）将上述基因LrWRKY1与植物表达载体pCAMBIA2300s连接，构建植物超表达载体；

（2）将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转入烟草中；

（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记来筛选转化子，并通过聚合酶链式反应获得阳性转基因植株，分析阳性转基因烟草蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因烟草植株。