CN104878041B

CN104878041B - 漾濞大泡核桃转录因子基因JsWRKY1的应用

Info

Publication number: CN104878041B
Application number: CN201510244681.0A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 陈瑞; 王国东; 陈朝银; 韩青; 葛锋
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: CN104878041A

Abstract

本发明公开了漾濞大泡核桃转录因子基因JsWRKY1的应用，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实JsWRKY1基因具有提高植物抗真菌病害的功能，将本发明抗真菌基因JsWRKY1构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，JsWRKY1超表达的转基因烟草对葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌以及尖孢镰刀菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

漾濞大泡核桃转录因子基因JsWRKY1的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关研究领域，特别是具有抗真菌活性的漾濞大泡核桃转录因子基因JsWRKY1的应用。

背景技术

21世纪，人类面临耕地减少、人口增加和人民生活水平不断提高三个不可逆转的局面，提高农作物单产是解决这些问题的重要措施。然而植物病害严重影响农作物的产量和质量，其中，真菌病害是最重要的一类植物病害，约占70％-80％，其发病率极高，且大规模发生时导致农作物减产甚至死亡。传统控制真菌病害的方法主要是选育抗性新品种、采用合理的耕作制度和使用化学农药，这些方法虽然取得了一定成效，但均不能从根本上解决真菌病害问题。近年来，随着分子生物学和生物技术的快速发展，利用基因工程方法培育抗真菌病害的新品种取得了一定成效，有望从根本上解决真菌病害问题。

WRKY是植物体内重要的抗病相关转录因子，通过调控植物体内的病程相关蛋白等抗病相关基因的表达来提高植物的抗病性，在植物抵御病原菌侵染的防卫反应中扮演着重要角色。最早被鉴定的植物WRKY基因是甘薯(Impoea batatas) SPF1 (SPF1:SWEET POTATOFACTOR 1)基因(Ishiguro S, Nakamura K. 1994. Characterization of a cDNAencoding a novel DNA-binding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences inthe 5’ upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase fromsweet potato. Mol Gen Genet, 244: 563-571.)。WRKY蛋白被分为三大类，第类含有2个WRKY结构域以及C2H2型锌指结构；第类含有1个WRKY结构域和C2H2型锌指结构，大多WRKY转录因子都属于这一类；第类含有1个WRKY结构域，但所含的锌指结构为C2HC型，此类WRKY转录因子的成员较少(Eulgem T, Rushton PJ, Robatzek S, Somssich IE. 2000.The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci, 5:199-206.)。采用核磁共振技术研究AtWRKY4的结构发现其C端WRKY结构域由4股β折叠构成，其中β折叠的末端含有一个由保守的半胱氨酸/组氨酸残基形成的锌结合口袋结构。WRKYGQK序列存在于β-1链上，并可以通过扭曲进入DNA凹槽中，从而与靶基因中的W-box相互作用(Pandey SP, Somssich IE. 2009. The role of WRKY transcription factorsin plant immunity. Plant Physiol, 150: 1648-1655.)。

多种外源激发因子(细菌、真菌、病毒等病原物)和内源激发因子(水杨酸、乙烯、过氧化氢等)均能诱导WRKY的基因表达。与此同时，WRKY也受多种非生物胁迫的诱导，如盐、热、冷、紫外线等。Wang 和Hao等研究发现水稻(Oryza sativa) OsWRKY89的表达量在茉莉酸处理后以及紫外线损伤后明显增加(Wang HH, Hao JJ, Chen XJ, Hao ZN, Wang X,Lou YG, Peng YL, Gou ZJ. 2007. Overexpression of rice WRKY89 enhancesultraviolet B tolerance and disease resistance in rice plants. Plant MolBiol, 65: 799-815.)。在水稻中，白叶枯病原菌(Xanthomonas oryzae)和SA可诱导OsWRKY6的表达上调(Hwang SH, Yie SW, Hwang DJ. 2011. Heterologous expressionof OsWRKY6 gene in Arabidopsis activates the expression of defense relatedgenes and enhances resistance to pathogens. Plant Sci, 181: 316-323.)。Marchive等在研究葡萄VvWRKY1基因时发现，其表达量受水杨酸、H₂O₂、或乙烯的诱导(Marchive C, Mzid R, Deluc L, Barrieu F, Pirrello J, Gauthier A, Corio-CostetMF, Regad F, Cailleteau B, Hamdi S et al. 2007. Isolation andcharacterization of a Vitis vinifera transcription factor, VvWRKY1, and itseffect on responses to fungal pathogens in transgenic tobacco plants. J ExpBot, 58: 1999-2010.)。

WRKY转录因子在植物抵御真菌病害过程中具有重要的调控作用。AtWRKY70在水杨酸和茉莉酸介导的信号传导途径中具有中心控制作用，对受SA调控的基因具有激活作用，而对受JA调控的基因具有抑制作用(Pieterse CMJ, Van Loon LC. 2004. NPR1: thespider in the web of induced resistance signaling pathways. Curr Opin PlantBiol, 7: 456-464.)。稻瘟病菌(Magnaporter grisea)侵染、物理损伤以及外源生长素的处理均可诱导水稻OsWRKY31的表达，在水稻中过量表达OsWRKY31增加了抗病相关基因OsSci2 (subitilisin-chymotrypsin inhibitor)和PBZ1 (a probenazole-induciblegene)的表达量并增强了转基因植株对稻瘟病菌的抗性(Zhang J, Peng YL, Guo ZJ.2008. Constitutive expression of pathogen-inducible OsWRKY31 enhances diseaseresistance and affects root growth and auxin response in transgenic riceplants. Cell Res, 18: 508-521.) 。拟南芥被死体营养型真菌Botrytis cinerea和Alternaria brassicicola侵染以及水杨酸、茉莉酸处理后，AtWRKY33的表达量增加。与野生型相比，AtWRKY33缺失突变体对于B. cinerea和A. brassicicola的抗性降低，而AtWRKY33过表达植株对这些病原菌的抗性则明显增强(Zheng ZY, Qamar SA, Chen ZX,Mengiste T. 2006. Arabidopsis WRKY33 transcription factor is required forresistance to necrotrophic fungal pathogens. Plant J, 48: 592-605. )。

本发明中转录因子基因JsWRKY1来自漾濞大泡核桃(Juglans sigillata Dode)。漾濞大泡核桃是云南主要的本地核桃之一，具有果大、壳薄、仁厚、味香、含油率高等优点，对由胶孢炭疽菌引起的病害具有较强的抗性。

发明内容

本发明的目的是提供漾濞大泡核桃转录因子基因JsWRKY1的新用途，即在提高烟草对葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌抗性中的应用。

本发明从漾濞大泡核桃中克隆获得的具有抗真菌活性的全长基因JsWRKY1，JsWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因全长为1012 bp，包含一个564 bp的开放阅读框、154 bp的5′非翻译区(untranslated region, UTR)及294 bp的3′UTR，编码如SEQID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明所述转录因子基因JsWRKY1的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第155-719位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆漾濞大泡核桃的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础。发明人将这个基因命名为JsWRKY1。

WRKY是植物体内研究最多的转录因子之一，定位于细胞核。WRKY转录因子通过与靶基因启动子区域中名为W-box的特定DNA序列结合，诱导或者抑制靶基因的表达。WRKY能响应各种生物和非生物胁迫，是植物防御系统中重要的组成部分。

本发明涉及分离包含JsWRKY1的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表所示，对该基因进行分析，表明JsWRKY1全长cDNA为1012 bp，包含一个564 bp的开放阅读框、154 bp的5′UTR及294 bp的3′UTR，其中ORF编码一个具有187个氨基酸的蛋白质。核酸同源性分析表明漾濞大泡核桃JsWRKY1的第469～758位核苷酸序列与山葡萄(Vitis amurensis) VaWRKY45(JQ728450.1)的第256～545位核苷酸序列具有86％的同源性。 BLASTp分析结果显示JsWRKY1所编码WRKY蛋白与可可树(Theobromacacao) TcWRKY75 (EOY02841.1)和大豆(Glycinemax) GmWRKY53 (NP_001237357.1)的序列同源性较高，分别为67％和60％。这表明其属于漾濞大泡核桃中的WRKY转录因子。超表达序列表SEQ ID NO：1所示序列可以增强烟草对葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)、串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)以及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抗性。

上述JsWRKY1基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

(1)采用扩增JsWRKY1的特异引物，从接种胶孢炭疽菌后的漾濞大泡核桃叶中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)扩增出JsWRKY1的全长编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。

(2)用限制性内切酶BamHI / EcoRI酶切pMD18-T-JsWRKY1载体和植物表达载体pCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段，再将所获得JsWRKY1基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达。

(3)以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对于植物病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自漾濞大泡核桃的JsWRKY1基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分JsWRKY1转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)，由2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp六条DNA片段组成；正对照：质粒pMD18-T-JsWRKY1为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

图2是本发明中部分阳性JsWRKY1转基因烟草中JsWRKY1转录水平的表达分析结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT：非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；正对照：质粒pMD18-T-JsWRKY1为模板的PCR产物；

图3是本发明中JsWRKY1转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、c、d、图示中的真菌分别是葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：JsWRKY1全长cDNA克隆以及序列分析

用胶孢炭疽菌接种漾濞大泡核桃的嫩叶，用接种后4 h的叶提取总RNA，用液氮将处理过的漾濞大泡核桃的叶研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。采用M-MLV逆转录酶(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg 总RNA，依次加入50 ng oligo (dT)，2 μL dNTP Mix (2.5 mM each)，用DEPC水将反应体积补齐至14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin (200 U)、1 μL M-MLV (200 U)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应，cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因JsWRKY1，所用上下游引物序列分别为及。采用Advantage^TM 2 PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件：95℃ 1 min；94℃30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 s，32个循环；72℃ 5 min。反应体系(20μL)为1 μL cDNA、2 μL10×Advantage 2 PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix (10mM each)、0.2 μL 正向引物(10 μM)、0.2 μL 反向引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Grade water。PCR结束后，取8 μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector (50 ng/μL)和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16℃过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中。用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增JsWRKY1的特异引物检测多克隆位点插入JsWRKY1的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的JsWRKY1全长cDNA为1012 bp，通过NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个 564 bp的开放读码框(见序列表)。JsWRKY1编码一个含187个氨基酸的蛋白质JsWRKY1，其分子量约为21.3 kDa，等电点为 9.23。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入JsWRKY1的大肠杆菌质粒pMD18-T-JsWRKY1以及植物表达载体pCAMBIA2300S质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶EcoRI (TaKaRa)和BamHI(TaKaRa)分别对质粒pMD18-T-JsWRKY1和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20 μL pMD18-T-JsWRKY1和pCAMBIA2300S质粒、依次加入10 μL 10×H buffer、5 μL EcoRI、5 μL BamHI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)对JsWRKY1片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，其余回收产物置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的JsWRKY1DNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL JsWRKY1DNA片段依次加入2 μLpCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增JsWRKY1的特异引物进行PCR，挑选出JsWRKY1与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，在得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒(上海生工)提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pCAMBIA2300S-JsWRKY1质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-JsWRKY1转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取0.2 μg pCAMBIA2300S-JsWRKY1质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，再冰浴2 min，之后加入500μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增JsWRKY1的特异性引物进行PCR反应，检测pCAMBIA2300S-JsWRKY1是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(Nicotiana tabacum L.)。将烟草种子用75%的酒精浸泡30 s，无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-JsWRKY1质粒的农杆菌LBA4404菌种，取20 μL接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h。随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养5-8 h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗幼嫩叶切成约1 cm²的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，25℃浸染15 min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上，22℃无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+50mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素(cefotaxime sodium salt，Cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16 h/d光照，8 h/d黑暗)。待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选。将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1 μL所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用JsWRKY1的特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，JsWRKY1转基因烟草共筛选到49株阳性转基因植株，这些单株的编号为1～49。

实施例4：转基因烟草中JsWRKY1的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

分别取阳性转基因植株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增JsWRKY1的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因植株中JsWRKY1转录水平的表达量。总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同。PCR结束之后，取8 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到35个转基因单株中JsWRKY1在转录水平大量表达。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基(200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3 cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。供试真菌共有8种：胶孢炭疽菌(Colletorichum gloeosporioides)、核盘菌(Sclerotinia scleroterum)、葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)、串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰刀菌(F. solani)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、轮枝镰刀菌(F. verticillioides)。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1 g转基因烟草单株(编号分别为8、17、18、43)及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液(1 M NaCl，0.1 M 乙酸钠，1% PVP，pH6.0)，充分研磨。转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜。4℃离心30 min (12,000 g)，取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度；将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(蛋白提取液)；28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价JsWRKY1转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，JsWRKY1转基因烟草蛋白对葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌以及尖孢镰刀菌的生长具有明显的抑制作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 漾濞大泡核桃转录因子基因JsWRKY1的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1012

<212> DNA

<213> Juglans sigillata Dode

<220>

<221> mRNA

<222> (1)..(1012)

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(154)

<220>

<221> CDS

<222> (155)..(718)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (719)..(1012)

<400> 1

atggggatgc atggtgaatc tgtgcatgct catagccgcc tagctagctt aggcagccgc 60

cccaaccttt tgcatgtttt agtgtaaaac ctattcggac attcttcctg atctccttct 120

tcatcttatt ctttacaaac tcaactggct tcctatggaa aactaccaaa tgttcttccc 180

ctgttcttct actgggcggc agtcaagttt tcctatctca acaaacatgg gaagctctaa 240

tgtttttcag aaacatcttg gtgtgagctc gaatgggacg ttcttggggt tggggacaga 300

aaaccttctc ccaaaaagat cggcagagga cgttaaacaa ccagctgatg atcagtgctg 360

ccctgttagt tcaaatggat gctctgctgg ggaagagagc aagggaaaac aaggtaagat 420

caagaagatc aggaagccca gatatgcttt tcaaactagg tctcaggttg atatactcga 480

tgatggctat cggtggagaa aatatggtca aaaggcagtt aagaacaaca aatttccgag 540

aagctactat cgttgtacgt ttcaagattg ctgtgtaaag aagcaagttc aacgcctaac 600

caaagatgaa ggcatcgtag tgactactta tgaaggggtg cacatccatc caatagagaa 660

gccaactgat aacttcgaac atattttgag tcagatgcaa ttttacactc ctttttgaag 720

ctgtcttcat catgatcaca tgatcatcat tcgattcata tatgtaaccg gccacctgcc 780

tccctcctcg gttaatgtca aaaagatatg gcacaactgc ctagaacttt gaactatttc 840

ttggctttgt aactctttta gagttctgtt ttcttcttca tttttttcct gatcagtttc 900

atgtgtaggt taactcagcc ttgagatgct gatcatgttt taccacctag atattaagaa 960

aataaacata aacctagata tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1012

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> Juglans sigillata Dode

<400> 2

Met Glu Asn Tyr Gln Met Phe Phe Pro Cys Ser Ser Thr Gly Arg Gln

1 5 10 15

Ser Ser Phe Pro Ile Ser Thr Asn Met Gly Ser Ser Asn Val Phe Gln

20 25 30

Lys His Leu Gly Val Ser Ser Asn Gly Thr Phe Leu Gly Leu Gly Thr

35 40 45

Glu Asn Leu Leu Pro Lys Arg Ser Ala Glu Asp Val Lys Gln Pro Ala

50 55 60

Asp Asp Gln Cys Cys Pro Val Ser Ser Asn Gly Cys Ser Ala Gly Glu

65 70 75 80

Glu Ser Lys Gly Lys Gln Gly Lys Ile Lys Lys Ile Arg Lys Pro Arg

85 90 95

Tyr Ala Phe Gln Thr Arg Ser Gln Val Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr

100 105 110

Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ala Val Lys Asn Asn Lys Phe Pro

115 120 125

Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr Phe Gln Asp Cys Cys Val Lys Lys Gln

130 135 140

Val Gln Arg Leu Thr Lys Asp Glu Gly Ile Val Val Thr Thr Tyr Glu

145 150 155 160

Gly Val His Ile His Pro Ile Glu Lys Pro Thr Asp Asn Phe Glu His

165 170 175

Ile Leu Ser Gln Met Gln Phe Tyr Thr Pro Phe

180 185

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtaaaacct attcggacat tcttc 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accgaggagg gaggcaggt 19

Claims

1. 漾濞大泡核桃转录因子基因 JsWRKY1在提高烟草对葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、尖孢镰刀菌抗性中的应用；其中漾濞大泡核桃转录因子基因 JsWRKY1的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.根据权利要求1所述的漾濞大泡核桃转录因子基因 JsWRKY1的应用，其特征在于提高烟草的真菌抗性的具体操作如下：

（1）将漾濞大泡核桃转录因子基因 JsWRKY1与植物超表达载体pCAMBIA2300S连接，构建植物超表达载体；

（2）将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中；

（3）用卡那霉素筛选再生的转基因烟草幼苗，并通过聚合酶链式反应筛选获得阳性转基因植株，接种特定的植物病原真菌，分析转基因烟草蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。