CN107964547B - 一种三七病程相关蛋白10基因PnPR10-3及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三七病程相关蛋白10基因PnPR10‑3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实PnPR10‑3基因具有提高植物抗真菌侵染的功能，将本发明抗真菌基因PnPR10‑3构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，实验结果显示：PnPR10‑3超表达的转基因烟草对茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌、串珠状赤霉菌以及葡萄座腔菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

一种三七病程相关蛋白10基因PnPR10-3及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是具有抗真菌活性的三七病程相关蛋白10基因PnPR10-3及其应用。

背景技术

经典遗传学的发展使人们能够通过杂交育种成功地培育出抗病新品种，从而大幅度地提高粮食产量。然而，植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是真菌病害，约占到植物总病害的80％，严重影响农作物的产量和品质。依靠传统育种方法培育抗性品种、使用化学农药、采取轮作等病害防治方法取得了一定成效，但上述方法中传统育种和轮作具有周期长、费时费力、有利变异少等缺点，农药使用易残留，造成食品安全问题和环境污染，因而都不能从根本上解决植物病害难题。近年来，随着分子生物学理论和技术的不断发展，使人们不但能够从分子水平上深入认识植物与病原物相互作用的机制，而且还可以通过基因工程快速和高效地培育抗病作物新品种。

植物在受到真菌、细菌和病毒等病原微生物侵染或受到非生物胁迫时会诱导表达并积累病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR），这类蛋白是植物防御体系的重要组成部分，在植物防御过程中发挥着重要作用(Wen YJ, He HW, Huang QS, Liang S,Bin JH. Roles of pathogenesis-relative protein 10 in plant defense response.Plant Physiology Communications. 2008, 44: 585-592)。PR蛋白为多基因编码，根据氨基酸序列的相似程度、血清学关系和生物学活性，目前将PR蛋白分为17类(PR1-PR17)，它们在不同的植物中表现为几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂、内肽酶和过氧化物酶等，而PR10蛋白是典型的胞内蛋白，广泛存在于细胞溶质中，在植物自我防御机制中作为可被诱导的组分发挥作用(van Loon LC, Rep M, Pieterse CM. Significance of inducibledefense-related proteins in infected plants. Annu Rev Phytopathol. 2006, 44:135-162)。与大多数胞外PR蛋白不同，PR10是一类胞内蛋白，具有与核酸酶相似的结构，分子量为16~19 kDa，一般呈弱酸性，没有信号肽，具有体外核酸酶活性和抗菌活性(Wang L,Wei J, Zou Y, Xu K, Wang Y, Cui L, Xu Y. Molecular characteristics andbiochemical functions of VpPR10s from Vitis pseudoreticulata associated withbiotic and abiotic stresses. Int J Mol Sci. 2014, 15: 19162-19182)。对PR10基因结构分析表明，PR10基因编码的氨基酸中都具有一个高度保守的GXGGXG(X是任意氨基酸)序列模型，被称为“P-loop”结构域。“P-loop”是一类广泛存在于磷酸化激酶和核酸结合蛋白中的结构域，并且其磷酸化可能与PR10的核糖核酸酶活性有关(Bantignies B, SéguinJ, Muzac I, Dédaldéchamp F, Gulick P, Ibrahim R. Direct evidence forribonucleolytic activity of a PR-10-like protein from white lupin roots.Plant Mol Biol. 2000, 42: 871-881)。

PR10广泛应答生物胁迫，具有抗菌活性。玉米(Zea mays) ZmPR10.1和ZmPR10.2在受到细菌、H₂O₂、黑暗、机械损伤、冷冻等处理时表达量增加 (Xie YR, Chen ZY, Brown RL,Bhatnagar D. Expression and functional characterization of two pathogenesis-related protein 10 genes from Zea mays. J Plant Physiol. 2010, 167: 121-130)。辣椒(Capsicum annuum)的PR10蛋白能与植物免疫系统中的一类LRR (Leucine richrepeat)蛋白结合，且这种结合对于抗病反应非常重要，表明PRl0可以通过调节植物免疫系统来实现其抗病功能(Choi DS, Hwang IS, Hwang BK. Requirement of the cytosolicinteraction between PATHOGENESIS-RELATED PROTEIN10 and LEUCINE-RICH REPEATPROTEIN1 for cell death defense signaling in pepper. Plant Cell. 2012, 24:1675-1690)。辣椒中重组蛋白CaPRl0能抑制辣椒疫霉(Phytophthora capsici)，同时该蛋白还具有RNase活性，能消化烟草花叶病毒RNA (Park CJ, Kim KJ, Shin R, Park JM,Shin YC, Paek KH. Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepperfunctions as a ribonuclease in an antiviral pathway. Plant J . 2004, 37: 186-198)。

人参(Panax ginseng C. A. Meyer) PgPR10-1基因在拟南芥中异源表达，接种丁香假单胞菌(Pseudomonas syringe)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和灰霉病菌(Botrytis cinerea) 4天后，统计转基因和野生型植株感病叶片数，结果表明，与野生型植株相比，转基因拟南芥增强了对以上三种病原菌的抗性(Lee OR, Kim YJ, Balusamy SRD,Khorolragchaa A, Sathiyaraj G, Kim YK, Yang DC. Expression of the ginsengPgPR10-1 in Arabidopsis confers resistance against fungal and bacterialinfection. Gene. 2012, 506: 85-92)。从感染黄曲霉(Aspergillus flavus)的花生(Arachis hypogaea)中克隆得到ARAhPR10，并转入花生中高效表达，ARAhPR10转基因花生种子抗A. hypogaea能力明显提高(Xie CZ, Wen SJ, Liu HY, ChenX P, Li HF, HongYB, Liang XQ. Overexpression of ARAhPR10, a member of the PR10 family,decreases levels of Aspergillus flavus infection in peanut seeds. Am J PlantSci. 2013, 4: 602-607)。在Escherichia coli BL21中表达棉花(Gossypium barbadense) GbPR10-1，体外抑菌实验显示，GbPR10-1蛋白可以抑制Verticillium dahliae菌丝的生长(Chen LJ, Sun N, Wang J, Ling H, Zhang LD, Zuo KJ.Functional analysis of a wilt fungus inducible PR10-1 gene from cotton. Am JPlant Sci. 2013, 4: 417-426)。

三七是我国传统中药材的一颗璀璨明珠，有“南国神草”、“参中之王”等美称。三七主要分布在云南、广西等地，尤其云南省文山州，主要化学成分有皂苷、多糖、氨基酸和挥发油，具有止血、活血、补血、抗肿瘤、降血糖、调节免疫和抗炎等作用。尽管三七药材的市场需求量逐年上升，由于三七的生长周期长，三年生三七才能入药，三七喜温湿环境，生长过程中极易滋生病虫害，尤其是根腐病、黑斑病等几种真菌病害，三七原药材仍供不应求。分离克隆三七的抗病基因，培育三七抗病品种，对保证三七种植业及相关产业的可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种三七病程相关蛋白10基因PnPR10-3及其应用，即在提高烟草对茄腐镰刀菌(F. solani)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)以及葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)抗性中的应用。

本发明从三七中克隆获得的具有抗真菌活性的三七病程相关蛋白10基因PnPR10- 3的全长基因，PnPR10-3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因全长为836bp，包含一个477bp的开放阅读框、102bp的5′非翻译区(untranslated region, UTR)及257bp的3′UTR，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明所述病程相关蛋白10基因PnPR10-3的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第103-579位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为PnPR10-3。

本发明涉及分离包含PnPR10-3的DNA片段并鉴定其功能。其中所述DNA片段如序列表所示，对该基因进行分析，表明PnPR10-3全长cDNA为836 bp，包含一个477 bp的开放阅读框、102 bp的5′UTR及257 bp的3′UTR，其中ORF编码一个具有158个氨基酸的蛋白质。BLAST分析结果显示三七PnPR10-3编码的蛋白质分别与香芹(Petroselinum crispum，P27538.1)、胡萝卜(Daucus carota，XP_017218034)和人参(ADW93868.1) PR蛋白的氨基酸序列具有77%，75%和72%的相似性。PnPR10-3不含有N端信号肽，且蛋白质序列中存在一个高度保守的氨基酸模体GXGGXG (X为任意氨基酸)，即“P-loop”基序，这表明其属于三七中的病程相关蛋白10基因。超表达序列表SEQ ID NO ：1所示序列可以增强烟草对茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌、串珠状赤霉菌以及葡萄座腔菌的抗性。

上述PnPR10-3基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

(1)采用扩增PnPR10-3的特异引物，从接种茄腐镰刀菌后的三七根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出PnPR10-3的编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。

(2)用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pMD18-T-PnPR10-3载体和植物表达载体pCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段。再将所获得PnPR10-3基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体。之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达。

(3)以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到阳性转基因植株，分析转基因植株对于病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自三七的PnPR10-3基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分PnPR10-3转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)，由2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp六条DNA片段组成；阳性对照：质粒pMD18-T-PnPR10-3为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

图2是本发明中部分阳性PnPR10-3转基因烟草中PnPR10-3转录水平的表达分析结果图，其中Marker：DL2000 DNA Marker(大连宝生物)；WT：非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照：质粒pMD18-T-PnPR10-3为模板的PCR产物；

图3是本发明中PnPR10-3转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、c、d图示中的真菌分别是葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌以及茄腐镰刀菌；WT为野生型烟草的总蛋白；Buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：PnPR10-3全长cDNA克隆以及序列分析

用茄腐镰刀菌接种三七，用接种后24 h的根提取总RNA，用液氮将处理过的三七根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。采用逆转录酶M-MLV(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg total RNA，依次加入50 ng oligo (dT)，2 μL dNTP Mix (2.5 mM each)，用DEPC水将反应体积补齐至14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin (200U)、1 μL M-MLV (200U)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因PnPR10-3，所用上下游引物序列分别为及。采用Advantage^TM 2 PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件：95℃ 1 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，32个循环；72℃ 5 min。反应体系(20 μL)为1 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix (10mM each)、0.2 μL 正向引物(10 μM)、0.2 μL 反向引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μLPCR-Grade water。PCR结束后，取8 μL进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector (50 ng/μL)和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16℃过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中。用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增PnPR10的特异引物检测多克隆位点插入PnPR10-3的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的PnPR10-3全长cDNA为836 bp，通过NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个477 bp的开放读码框(见序列表)。PnPR10-3编码一个含158个氨基酸的蛋白质PnPR10-3，其分子量约为15.3 KDa，等电点为4.37。借助生物信息学软件SignalP 4.1分析PnPR10-3编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽。结果显示在PnPR10-3的N端不存在信号肽，因此推测该蛋白是胞内蛋白。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入PnPR10-3的大肠杆菌质粒pMD18-T-PnPR10-3以及植物表达载体pCAMBIA2300S质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶EcoRI (TaKaRa)和BamHI(TaKaRa)分别对质粒pMD18-T-PnPR10-3和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20 μL pMD18-T-PnPR10-3和pCAMBIA2300S质粒、依次加入10 μL10×K buffer、5 μL EcoRI、5 μL BamHI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对PnPR10-3片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的PnPR10-3 DNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL PnPR10-3DNA片段依次加入2 μLpCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增PnPR10-3的特异引物进行PCR，挑选出PnPR10-3与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，并向检测得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pCAMBIA2300S-PnPR10-3质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-PnPR10-3转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2 μg pCAMBIA2300S-PnPR10-3质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，再冰浴2 min，之后加入500 μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增PnPR10-3的特异性引物进行PCR反应，检测pCAMBIA2300S-PnPR10-3是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(Nicotiana tabacum L.)。将烟草种子用75%的酒精浸泡30 s，无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16 h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-PnPR10-3质粒的农杆菌LBA4404菌种，取20 μL接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h。随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养5-8 h以活化农杆菌。

取烟草无菌烟草幼嫩叶片切成约1 cm²的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，25℃浸染15 min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上，22℃无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+50mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素(cefotaxime sodium salt，Cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16 h/d光照，8 h/d黑暗)。待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗进行PCR检测。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1 μL所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用PnPR10-3的特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，PnPR10-3转基因烟草共筛选到41株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中PnPR10-3的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

分别取阳性转基因植株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增PnPR10-3的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因植株中PnPR10-3转录水平的表达量。总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同。PCR结束之后，取8 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到28个转基因单株中PnPR10-3在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～28。

将实验室保存的几种植物病原真菌接种于PDA固体培养基(200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20 g/L葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1 g转基因烟草单株(编号分别为2、9、16、20)及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液(1 M NaCl，0.1 M 乙酸钠，1% PVP，pH6.0)，充分研磨。转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜。4℃离心30 min (12,000 g)，取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至1 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(蛋白提取液)。28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价PnPR10-3转基因烟草的体外抗真菌活性。结果如图3所示，PnPR10-3转基因烟草蛋白对茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌、串珠状赤霉菌以及葡萄座腔菌的生长具有明显的抑制作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种三七病程相关蛋白10基因PnPR10-3及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 836

<212> DNA

<213> 三七(Panax notoginseng)

<400> 1

ggcaccaaat taatcctctc atctagctct ctcatttcct agctacgtac tctccttctt 60

cttgtgttgt tatatctgat ttatcaagtt caaaacttca taatgggtgc catcactatc 120

aatgtagagg ctccatcctc agtaccagca caaacaattt acaagggatt cctccttgac 180

atggataatc tcatccccaa gattttgcct caggccatca agagtgtcga gatccttgaa 240

ggagatggtg gagttggaac catcaagctg gccactcttg gcgaactgag ccaattcaac 300

agcttgaaac aaagggttga tggaatcgac aaggatgcat tgacctacag ctacaccatt 360

atcgatggtg atattttgtt gggaaaactc gagtccatca ctaatcaatt cacggtggtg 420

cctactgaag aagggtgcat tgtcaaaaat acaaccatat ataaccccat aggcgacgcc 480

gtgatcccag aagagaatat taaggaagct actgagaagt ctggactcat attcaaggct 540

gttgaggcct acctccttgc aaatcctggt gcctactaag tgaaactcat tccatattct 600

atatatgaat gaggcttaat taatttatat gcttttattt cggctgaaga acatgatata 660

taattgtgtt ggctctccgg taccatgata tatatatatg gtccaagttt gttgttatta 720

ttatgagtta tgtgttgcac tctcctttga tatgtaacca ctatatcaat aaaaaggcat 780

ctgttaattg caatgatttt tatgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 836

<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213> 三七(Panax notoginseng)

<400> 2

Met Gly Ala Ile Thr Ile Asn Val Glu Ala Pro Ser Ser Val Pro Ala

1 5 10 15

Gln Thr Ile Tyr Lys Gly Phe Leu Leu Asp Met Asp Asn Leu Ile Pro

20 25 30

Lys Ile Leu Pro Gln Ala Ile Lys Ser Val Glu Ile Leu Glu Gly Asp

35 40 45

Gly Gly Val Gly Thr Ile Lys Leu Ala Thr Leu Gly Glu Leu Ser Gln

50 55 60

Phe Asn Ser Leu Lys Gln Arg Val Asp Gly Ile Asp Lys Asp Ala Leu

65 70 75 80

Thr Tyr Ser Tyr Thr Ile Ile Asp Gly Asp Ile Leu Leu Gly Lys Leu

85 90 95

Glu Ser Ile Thr Asn Gln Phe Thr Val Val Pro Thr Glu Glu Gly Cys

100 105 110

Ile Val Lys Asn Thr Thr Ile Tyr Asn Pro Ile Gly Asp Ala Val Ile

115 120 125

Pro Glu Glu Asn Ile Lys Glu Ala Thr Glu Lys Ser Gly Leu Ile Phe

130 135 140

Lys Ala Val Glu Ala Tyr Leu Leu Ala Asn Pro Gly Ala Tyr

145 150 155

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

caagttcaaa acttcataat gggt 24

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

agaatatgga atgagtttca cttagtag 28

Claims (2)

1.一种三七病程相关蛋白10基因PnPR10-3，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的三七病程相关蛋白10基因PnPR10-3在提高烟草对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)以及葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)抗性中的应用。