CN104152465A

CN104152465A - 一种岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5及其应用

Info

Publication number: CN104152465A
Application number: CN201410396729.5A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 张南南; 季博; 韩青; 葛锋; 陈朝银
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2034-08-13
Also published as: CN104152465B

Abstract

本发明涉及一种具有抗真菌活性的岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5及其应用，LrCyt-b5基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码细胞色素b5；本发明通过功能基因组学相关技术研究证实LrCyt-b5基因具有提高植物抗真菌侵染能力的功能；将本发明抗真菌LrCyt-b5基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性。LrCyt-b5超表达的转基因烟草对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌和葡萄座腔菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

一种岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5及其应用。

背景技术

作为不可移动有机体，植物在生长过程中总会遭受各种各样的胁迫，其中由病原微生物引起的植物病害是最主要的胁迫。植物病害发生后会产生一系列生化、生理乃至形态上的病变，阻碍正常的生长及发育，进而对农业生产带来严重的影响。由病原真菌引起的真菌病害发病率极高，且大规模发生时会致使农作物减产甚至死亡，给农业生产带来严重的损失。传统对于真菌病害的预防和处理方法主要是筛选和培育抗性强的品种、及时清理病害植株及果实、使用农药等，但这些措施各有不足之处，不能彻底解决真菌病害问题。随着重组DNA技术的创立和快速发展，利用基因工程技术来培育新的对真菌病害有很强抗性的植物品种已经成为解决植物真菌病害的新出路，目前已取得初步成效，有望从根本上解决真菌病害问题。

植物在遭受病原菌入侵后，在体内会产生大量的活性氧，俗称氧爆发。氧爆发与超敏反应有着密切的关系，并且可以直接杀死病原菌、强化细胞壁、诱导植保素合成、调控抗病相关基因的表达，增强植株对病原菌的抗性。但氧爆发产生过量的活性氧会造成细胞内及生物膜上大量脂质氧化，损伤生物膜流动性，对植物体造成伤害(傅爱根, 罗广华. 活性氧在植物抗病反应中的作用. 热带亚热带植物学报, 2000, 8: 63-69)。

除了氧爆发及超敏反应，在遭受病原菌入侵时，植物体内还会形成一系列的防卫反应，包括病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)激发的免疫(PAMP-triggered immunity, PTI)和效应物激发的免疫(effector-triggered immunity, ETI) (Chisholm S T, Coaker G, Day B, et al. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cell, 2006, 124: 803-814)。PTI通过细胞表面受体识别病原物保守的特异分子而激活，产生的基础防卫反应具有广谱抗病性；ETI由植物抗病蛋白(主要是R基因产物)直接或间接识别特异病原效应物产生，具有物种特异性，能快速而强烈地诱导防卫反应的产生。PTI以及ETI激活局部以及系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)，SAR受植物激素特别是水杨酸(salicylic acid)和茉莉酸(jasmonic acid)的调控(Pandey S P, Somssich I E. The role of WRKY transcription factors in plant immunity. Plant physiology, 2009, 150: 1648-1655)。

细胞色素b5是存在于高等真核生物体内的一种细胞色素，广泛分布于高等动植物的微粒体及线粒体外膜中，具有分子量小(约1.3 kDa)、可溶性大、稳定性高等特点。细胞色素b5作为高等动植物以及真菌体内酰基-CoA脂肪酸去饱和化的电子供体，在生物体组织中的氧化还原反应过程中有重要作用，如脂质的合成代谢等。在高等植物中，细胞色素b5可以为脂肪酸羟基化、三键的形成、鞘脂长链基础羟基化、甾醇脱饱和以及细胞色素P450介导的反应提供电子(Kumar R, Tran L S P, Neelakandan A K, et al. Higher plant cytochrome b5 polypeptides modulate fatty acid desaturation. PloS one, 2012, 7: e31370.)。除此之外，内质网上的细胞色素b5还可以与蔗糖和山梨糖转运蛋白相互作用增加其对底物的亲和性，从而参与细胞中糖水平的调节(Fan R C, Peng C C, Xu Y H, et al. Apple sucrose transporter SUT1 and sorbitol transporter SOT6 interact with cytochrome b5 to regulate their affinity for substrate sugars. Plant physiology, 2009, 150: 1880-1901.)。近年来还有报道称细胞色素b5可能在细胞凋亡中也有着一定作用。

Kumar等人选取细胞色素b5基因(Cb5)缺陷型酵母最为材料，将拟南芥和大豆细胞色素b5基因分别导入酵母中，发现不同的细胞色素b5亚型在ω-6去饱和中的作用存在差异；但将大豆或者拟南芥的Cb5与同源脂肪酸去饱和酶基因共表达则对脂肪酸有同样的去饱和作用，且将大豆和拟南芥的Cb5与对方的脂肪酸去饱和酶基因共表达有相同的作用。这表明细胞色素b5基因的在脂肪酸去饱和中的作用取决于其自身亚型以及脂肪酸去饱和酶的存在与否(Kumar R, Tran L S P, Neelakandan A K, et al. Higher plant cytochrome b5 polypeptides modulate fatty acid desaturation. PloS one, 2012, 7: e31370.)。

不饱和脂肪酸是植物体内生物膜的重要组成成分，可保证并修复生物膜的流动性，增强细胞对环境变化的适应性；同时，不饱和脂肪酸还是茉莉酸等植物防卫反应中重要信号分子的合成前体。在内质网中合成的脂肪酸的去饱和作用需要细胞色素b5为脂肪酸脱氢酶FAD2和FAD3提供电子(Z?uner S, Jochum W, Bigorowski T, et al. A cytochrome b5-containing plastid-located fatty acid desaturase from Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic cell, 2012, 11: 856-863.)。总之，细胞色素b5作为合成长链不饱和脂肪酸的重要电子供体，可以从生物膜修复以及促进抗病相关植物激素茉莉酸等的合成两方面增强植株对病原菌的抗性。

本发明中细胞色素b5基因LrCyt-b5来自岷江百合(Lilium regale Wilson)。岷江百合又名王百合，多年生草本植物，我国的百合特有种。仅分布于四川西岷江流域海拔800～2700m的河谷到山腰的岩石缝中，具有极强的抗病性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从岷江百合中克隆获得具有抗真菌活性的细胞色素b5的全长基因LrCyt-b5，LrCyt-b5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因全长为724bp，包含一个408bp的开放阅读框、63bp的5’非翻译区及253bp的3’非翻译区，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明所述细胞色素b5基因LrCyt-b5的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第64-471位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础。发明人将这个基因命名为LrCyt-b5。

细胞色素b5是植物体内一种重要的蛋白，可以为长链不饱和脂肪酸在内质网中的合成提供电子。长链不饱和脂肪酸作为生物膜中重要的组成部分，可以增强并维护生物膜的流动性，增强生物体的抗逆性。在遭受病原菌入侵时，植物体内会产生一系列的防卫反应，包括氧爆发以及SAR。氧爆发是在体内形成大量的活性氧，这些活性氧在抵御外源病原菌入侵的同时还会对植物体内的生物膜造成损伤。细胞色素b5可以为脂质脱氢酶提供电子，促使植物体内不饱和脂肪酸的合成，修复受损的生物膜，维持其流动性。同时，不饱和脂肪酸也是植物抗病相关的重要激素合成的前体，因而细胞色素b5在植物体抗病防卫反应中有重要的作用。

本发明涉及分离包含LrCyt-b5的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵袭的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO：1所示，对该基因进行分析，表明LrCyt-b5全长cDNA为724bp，包含一个408bp的开放阅读框、63bp的5’非翻译区及253bp的3’非翻译区，其中开放阅读框编码一个具有135个氨基酸的蛋白质。LrCyt-b5的核苷酸序列与麝香百合(L. longiflorum)的细胞色素b5类基因LP26的部分序列(DQ019482.1)有96%的相似性。LrCyt-b5编码的蛋白具有细胞色素b5的特征基序HPGGD。BLASTp检索结果表明LrCyt-b5编码的蛋白质与马铃薯(Solanum tuberosum) A-like细胞色素b5蛋白有89%的相似性，与菠萝(Ananas comosus)和油橄榄(Olea europaea)细胞色素b5氨基酸序列有88%的相似性，与川桑(Morus notabilis)细胞色素b5氨基酸序列有87%的相似性，这就表明其属于岷江百合中的细胞色素b5。超表达序列表SEQ ID NO：2所示序列可以增强烟草对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌和葡萄座腔菌的抗性。

上述LrCyt-b5基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

(1)采用扩增LrCyt-b5的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出LrCyt-b5的全长编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。

(2)用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pMD18-T-LrCyt-b5载体和植物表达载体pCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段；再将所获得LrCyt-b5基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体。之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达。

(3)以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自岷江百合的LrCyt-b5基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本，减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明部分LrCyt-b5转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)，由2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp六条DNA片段组成；正对照：质粒pMD18-T-LrCyt-b5为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

图2是本发明部分阳性LrCyt-b5转基因烟草中LrCyt-b5转录水平的表达分析结果图；其中Marker：DL2000 DNA Marker(大连宝生物)；WT：非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；正对照：质粒pMD18-T- LrCyt-b5为模板的PCR产物；

图3是本发明LrCyt-b5转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、c、d图示中的真菌分别是灰葡萄孢、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和葡萄座腔菌；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：LrCyt-b5全长cDNA克隆以及序列分析

用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种12 h后的根提取总RNA。用液氮将处理过的岷江百合根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。采用逆转录酶M-MLV (promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg total RNA，依次加入50 ng oligo (dT)，2 μL dNTP Mix (2.5mM each)，加DEPC水将反应体积补齐至14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin (200U)、1 μL M-MLV (200U)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因LrCyt-b5，所用上下游引物序列分别为及采用Advantage^TM 2 PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件：95℃ 2 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，32个循环；72℃ 5 min。反应体系(20 μL)为1 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix (10mM each)、0.2 μL 正向引物(10 μM)、0.2μL 反向引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Grade water。PCR结束后，取8 μL进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector (50 ng/μL)和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16 ℃过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中。用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrCyt-b5的特异引物检测多克隆位点插入LrCyt-b5的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的LrCyt-b5全长cDNA为724bp，通过NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个408bp的开放读码框(见序列表)。LrCyt-b5编码一个含135个氨基酸的蛋白质LrCyt-b5，其分子量约为14.99 KDa，等电点为4.81。借助生物信息学软件SignalP 4.1分析LrCyt-b5编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽。结果显示在LrCyt-b5中不存在信号肽，ExPASy预测结果显示LrCyt-b5中存在一个跨膜螺旋区，这表明LrCyt-b5可能是一种胞内跨膜蛋白。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入LrCyt-b5的大肠杆菌质粒pMD18-T-LrCyt-b5以及植物表达载体pCAMBIA2300S质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶EcoRI (TaKaRa)和BamHI (TaKaRa)分别对质粒pMD18-T-LrCyt-b5和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20 μL pMD18-T-LrCyt-b5和pCAMBIA2300S质粒、依次加入10 μL 10×K buffer、5 μL EcoRI、5 μL BamHI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37 ℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)对LrCyt-b5片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收。取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20 ℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的LrCyt-b5DNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL LrCyt-b5DNA片段依次加入2 μL pCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μL ddH₂O，混匀后短时离心，然后16 ℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LrCyt-b5的特异引物进行PCR，挑选出LrCyt-b5与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，并向检测得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80 ℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒(上海生工)提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pCAMBIA2300S-LrCyt-b5质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-LrCyt-b5转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2 μg pCAMBIA2300S-LrCyt-b5质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，再冰浴2 min，之后加入500 μL LB液体培养基于28 ℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28 ℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrCyt-b5的特异性引物进行PCR反应，检测pCAMBIA2300S-LrCyt-b5是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80 ℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(Nicotiana tabacum L.)。将烟草种子用75%的酒精浸泡30 s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28 ℃暗培养5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25 ℃，16 h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

从-80 ℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-LrCyt-b5质粒的农杆菌LBA4404菌种，取20 μL接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 ℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28 ℃培养48 h。随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28 ℃振荡培养5-8 h以活化农杆菌。

取无菌烟草苗叶子切成约1 cm²的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，25 ℃浸染15 min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上，22 ℃无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L琼脂。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素(cefotaxime sodium salt，Cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16 h/d光照，8 h/d黑暗)。待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选。将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗进行下面的实验。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1 μL所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用LrCyt-b5的特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示。LrCyt-b5转基因烟草共筛选到36株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中LrCyt-b5的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

分别取阳性转基因植株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增LrCyt-b5的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因植株中LrCyt-b5转录水平的表达。总RNA提取以及RT-PCR的方法与步骤1)中相同。PCR结束之后，取8 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示。共检测到21个转基因单株中LrCyt-b5在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～21。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基(200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20 g/L葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3 cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。供试真菌共有8种：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)、链格孢 (Alternaria alternata)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、胶孢炭疽菌(Colletorichum gloeosporioides)、串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和核盘菌(Sclerotinia scleroterum)。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1 g转基因烟草单株(编号分别为2、7、10、15)及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液(1M NaCl，0.1M 乙酸钠，1% PVP，pH6)，充分研磨。转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜。4℃离心30 min (12,000 g)，取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.3 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(蛋白提取液)。28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价LrCyT-b5转基因烟草的体外抗真菌活性。结果如图3所示，LrCyT-b5转基因烟草蛋白对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌和葡萄座腔菌的生长具有很强的抑制作用。

序列表(SEQ ID)

<110> 昆明理工大学

<120> 一种岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 724

<212> DNA

<213> Lilium regaleWilson

<220>

<221> mRNA

<222> (1)..(724)

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(63)

<220>

<221> CDS

<222> (64)..(471)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (472)..(724)

<400> 1

acatggggat ccaagaatcc ggagcttttg ttgggggtca gctgctgcct tagatcggag 60

gtgatggcgg gggagcagaa gacgatctat cacttcgatg atgtctcaaa gcacaacgcc 120

actaaggatt gctggctcat catctccggc aaggtgtatg atgtcacccc atttatggag 180

gaccatcctg gtggtgacga ggtcttgcta gccgcaacag gtaaggatgc gacagatgat 240

tttgaagacg tggggcatag cacatccgct agggagatga tggacaagta ctacattggt 300

gaggttgatg tgtcgagtgt tcctacaaag cgtgcctacg ttccacccca gcaggcaccg 360

tacaatcctg ataaaacttc tgactttgtg atcaagatac tgcaatttgc agtgccattg 420

ctgattctag gtttagcctt tggagcccgc cagttcacca aatcggagta ggcactttct 480

gtggcattct caaaggctgt tatgttatcg aatctatttg gaacttttaa atccgtgttt 540

cgccttaaaa cttatgttgt ctgtccctca agggctgctt atcttgctta tgatgaactg 600

gagtttatat atagaattag gcgatgaagt ctgaacttac tcagatttag gcgatgaatt 660

ctgaacttac tcttgcttat gatgaactga agtttataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720

aaaa 724

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> LiliumregaleWilson

<400> 2

Met Ala Gly Glu Gln Lys Thr Ile Tyr His Phe Asp Asp Val Ser Lys

1 5 10 15

His Asn Ala Thr Lys Asp Cys Trp Leu Ile Ile Ser Gly Lys Val Tyr

20 25 30

Asp Val Thr Pro Phe Met Glu Asp His Pro Gly Gly Asp Glu Val Leu

35 40 45

Leu Ala Ala Thr Gly Lys Asp Ala Thr Asp Asp Phe Glu Asp Val Gly

50 55 60

His Ser Thr Ser Ala Arg Glu Met Met Asp Lys Tyr Tyr Ile Gly Glu

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Ser Val Pro Thr Lys Arg Ala Tyr Val Pro Pro Gln

85 90 95

Gln Ala Pro Tyr Asn Pro Asp Lys Thr Ser Asp Phe Val Ile Lys Ile

100 105 110

Leu Gln Phe Ala Val Pro Leu Leu Ile Leu Gly Leu Ala Phe Gly Ala

115 120 125

Arg Gln Phe Thr Lys Ser Glu

130 135

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgctgcctt agatcggagg t 21

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaaatagat tcgataacat aacagcct 28

Claims

1.一种岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5在提高烟草对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌、葡萄座腔菌抗性中的应用。

3.根据权利要求2所述的岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5的应用，其特征在于提高烟草的真菌抗性的具体操作如下：

(1) 将上述细胞色素b5基因LrCyt-b5与植物超表达载体pCAMBIA2300S连接，构建植物超表达载体；

(2) 将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中；

(3) 以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过聚合酶链式反应筛选获得真正的转基因植株，接种特定病原真菌，分析转基因烟草蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。