CN115725601A - 一种棉花细胞色素基因GhCB5b及应用 - Google Patents

一种棉花细胞色素基因GhCB5b及应用 Download PDF

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涂礼莉
金双侠
王茂军
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Abstract

本发明提供了一种棉花细胞色素基因GhCB5b及应用，涉及植物基因工程技术领域。本发明所述基因GhCB5b，与拟南芥AtCB5b高度同源。经实施例验证，在棉花超表达GhCB5b材料中，成熟纤维变长，强度提高，马克隆值降低；敲除GhCB5b基因后，则会抑制棉纤维伸长，强度和马克隆值没有显著变化。因此本发明所述基因GhCB5b可以改良纤维品质，具有广泛的应用价值，并为揭示GhCB5b在棉花纤维中可能的作用机制提供重要的指导思路。

Description

一种棉花细胞色素基因GhCB5b及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花细胞色素基因GhCB5b及应用。
背景技术
棉花是世界上最重要的经济作物。棉纤维作为优良的天然纤维，是重要的纺织工业原料。由于传统遗传育种基础狭窄、产量和品质存在负相关等原因，细胞的伸长或膨大发育与纤维的品质密切相关，因此利用基因工程技术改良棉花纤维产量和品质成为目前研究的新策略和热点。
细胞色素b5蛋白(Cytb5，CB5)是一类存在于植物、动物和真菌中，与内质网膜相关的血红素蛋白，其分子量大约为17kDa。CB5蛋白可作为中间电子传递体参与细胞中的各种氧化还原反应，从而调节生物体内的活性氧(ROS)平衡。在高等植物中已经发现了多种CB5亚型，如在模式植物拟南芥中发现了7个CB5，在水稻中发现了17个CB5。
CB5蛋白在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。Sayanova等从紫草中分离得到含CB5基因N末端的cDNA序列，并通过转烟草验证其功能，发现此基因可使转基因烟草大量积累脂肪酸去饱和酶，最终作用于亚麻酸(GLA)的合成。CB5可参与调节糖运输，使植物抵抗糖饥饿。Kearns等发现苹果中CB5参与的氧化还原反应与细胞中的糖供应存在着相关关系，在糖缺乏的情况下，ER膜会靠近细胞膜，从而促进糖转录因子与CB5的相互作用，可使细胞适应糖饥饿。CB5与糖转录因子SUT4相互作用，可在种子萌发阶段间接调节植物抵抗糖信号诱导。这说明CB5可以在多条通路发挥着更广泛的作用。据报道，CB5还与乙烯受体ETR1上游的RTE1相互作用，植物中CB5与RTE1作为功能性伴侣在ETR1介导的抑制乙烯信号过程中起作用。目前，在棉花中还尚未见到关于CB5基因分离和功能的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种棉花细胞色素基因GhCB5b及应用，超表达GhCB5b基因能促进棉花纤维伸长，强度升高，马克隆值降低；敲除GhCB5b基因会抑制棉纤维伸长，强度和马克隆值没有显著变化，可以为培育优质棉花新品种提供理想途径。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种与棉花纤维长度和强度相关的基因GhCB5b，所述基因GhCB5b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基因GhCB5b编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述基因GhCB5b的超表达载体。
优选的，包括将所述基因GhCB5b重组到pK2GW7.0表达载体上。
本发明还提供了上述基因GhCB5b的敲除载体。
优选的，所述敲除载体的基础载体包括pRGEB32-7载体。
本发明还提供了上述基因GhCB5b或上述超表达载体或上述敲除载体在培育棉花新种质中的应用。
本发明还提供了上述基因GhCB5b或上述超表达载体或上述敲除载体在改良棉花纤维品质中的应用。
本发明还提供了上述超表达载体在促进棉花纤维伸长和强度升高中的应用。
本发明还提供了上述敲除载体在抑制棉花纤维伸长中的应用。
有益效果：本发明提供了一种与棉花纤维长度和强度相关的基因GhCB5b，与拟南芥AtCB5b高度同源。经实施例验证，在棉花超表达GhCB5b材料中，成熟纤维变长，强度提高，马克隆值降低；敲除GhCB5b基因后，则会抑制棉纤维伸长，强度和马克隆值没有显著变化。因此本发明所述基因GhCB5b可以改良纤维品质，具有广泛的应用价值，并为揭示GhCB5b在棉花纤维中可能的作用机制提供重要的指导思路。
附图说明
图1为本发明提供的候选基因GhCB5b的表达模式图；
图2为本发明提供的pK2GW7-GhCB5b超表达质粒载体的图谱；
图3为本发明提供的pRGEB32-7-GhCB5b突变体质粒载体的图谱；
图4为本发明提供的超表达转基因材料PCR阳性检测结果胶图；泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)，阴性表示野生型受体材料，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型没有条带；超表达材料阳检PCR扩增正向引物为35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC，反向引物CB5b-R:TATCACAATCGGAGGCGAATCT；
图5为本发明提供的突变体转基因材料PCR阳性检测结果胶图；泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)，阴性表示野生型受体材料，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型没有条带；突变体材料阳检PCR扩增正向引物为U6-7-F:TGTGCCACTCCAAAGACATCAG，反向引物CRISPR-INFT2-2R:TGCTAAAGACTGTTGGCTTGTGCACCAGCCGGGAAT；
图6为本发明提供的超表达转基因材料Southern杂交结果胶图；
图7为本发明提供的超表达转基因材料qRT-PCR检测结果胶图；
图8为本发明提供的突变体转基因材料Hi-TOM检测结果图；
图9为本发明提供的转基因材料手梳纤维图；
图10为本发明提供的转基因材料成熟纤维质量检测机测数据图。
具体实施方式
本发明提供了一种与棉花纤维长度和强度相关的基因GhCB5b，所述基因GhCB5b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述基因GhCB5b优选从陆地棉中克隆得到，具体克隆方法，优选包括：提取陆地棉品系的RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用CB5b-BP-F和CB5b-R为引物进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序，优选包括：94℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1min，28个循环；72℃再延伸5min。本发明优选还包括将利用所述PCR扩增得到的PCR产物经BP反应连接至pDONRTM221载体上后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。本发明进行所述PCR扩增所用的引物序列优选如下所示：
CB5b-BP-F(SEQ ID NO.3)：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGGTGGAGAAAGAAAGGTCTAC；
CB5b-R(SEQ ID NO.4):GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAAGATGAAGCTGGTGTTTTGGT。
本发明还提供了上述基因GhCB5b的超表达载体。
本发明在构建所述超表达载体时，优选包括将所述基因GhCB5b重组到pK2GW7.0表达载体上，更优选地包括将克隆到pDONRTM221上的GhCB5b用LR反应将其重组至植物表达载体pK2GW7.0上，提取阳性质粒即为用于转化的超表达质粒pK2GW7.0-GhCB5b(图2)。
本发明还提供了上述基因GhCB5b的敲除载体。
本发明所述敲除载体的基础载体优选包括pRGEB32-7载体。本发明在构建所述敲除载体时，利用引物pRGEB32-7F和CRISPR-T2-1R，以及CRISPR-T2-2F和CRISPR-T2-2R分别进行第一PCR扩增，再将第一PCR的扩增产物利用引物infpRGEB32-7F和CRISPR-INFT2-2R进行重叠延伸PCR扩增，得到插入基本载体的目标序列。利用BSAⅠ对pRGEB32-7空载体进行酶切，回收大片段后，利用Exnase酶将目的片段和线性化表达载体进行In-fusion连接，构建完成的载体被命名为pRGEB32-7-GhCB5b(图3)。
本发明在构建所述敲除载体时，所涉及到的引物序列如下：
CRISPR-T2-1R(SEQ ID NO.5):TGGTGGTGATGATGTCTTGCTGCACCAGCCGGGAAT；
CRISPR-T2-2F(SEQ ID NO.6):CAAGCCAACAGTCTTTAGCATTAGAGCTAGAAATA；
CRISPR-T2-2R(SEQ ID NO.7):TGCTAAAGACTGTTGGCTTGTGCACCAGCCGGGAAT；
CRISPR-INFT2-2R(SEQ ID NO.8):TTCTAGCTCTAAAACTGCTAAAGACTGTTGGCTTG；
pRGEB32-7F(SEQ ID NO.9):AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG；
infpRGEB32-7F(SEQ ID NO.10):AAGCATCAGATGGGCAAACAAA。
本发明所述第一PCR扩增的体系和程序均相同，所述第一PCR扩增的体系以20μl计，优选包括：ddH2O 16.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板1μl。本发明所述第一PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，3个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，27个循环，72℃延伸5min。
本发明以第一PCR的扩增产物为模板，利用引物infpRGEB32-7F和CRISPR-INFT2-2R进行重叠延伸PCR扩增，所述重叠延伸PCR扩增的体系以20μl计，优选包括：ddH2O 15.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板各1μl。本发明所述重叠延伸PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，28个循环，72℃延伸5min。
本发明还提供了上述基因GhCB5b或上述超表达载体或上述敲除载体在培育棉花新种质中的应用。
本发明可将上述超表达载体或敲除载体，利用遗传转化的方法转入棉花基因组内，使得所述基GhCB5b进行超表达或敲低表达。本发明对所述遗传转化的方法并没有特殊限定，优选包括农杆菌介导的遗传转化方法。在本发明中，经实施例验证，超表达GhCB5b基因能促进棉花纤维伸长，提高纤维强度，降低马克隆值；敲除GhCB5b基因能抑制纤维伸长，因此可将其应用于棉花纤维品质的改良。
本发明还提供了上述基因GhCB5b或上述超表达载体或上述敲除载体在改良棉花纤维品质中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述超表达载体在促进棉花纤维伸长和强度升高中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述敲除载体在抑制棉花纤维伸长中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种棉花细胞色素基因GhCB5b及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
GhCB5b基因的克隆及表达模式分析及转基因植株表达量检测
A.RNA的提取及cDNA的获得
取陆地棉品系(JIN668，由河南省农业科学院培育成功的Y668，后经我校金双侠教授通过杂交等方法选育，并已在文章中公开：陆地棉GhABF1基因在棉花抗旱中的功能研究)纤维样品，采用异硫氰酸胍的方法提取总RNA，cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RT buffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μl
Figure BDA0003835398510000061
Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μlSuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。
B.GhCB5b基因全长序列的获得
从陆地棉基因组数据库中提取该基因序列(Gh_D07G2042)，设计扩增该基因的引物序列：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸5min。
PCR产物经BP反应连接至pDONRTM221载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，pDONRTM221载体来源于CSIRO PlantIndustry，澳大利亚)后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，10～12h后挑取单克隆进行PCR阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
C.GhCB5b基因表达模式分析及转基因植株表达量检测
按上述方法提取纤维cDNA，以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行特异PCR扩增，棉花GhUb7(GenBank登陆号：DQ116441)基因作为内参对照进行相对定量分析。
结果如图1所示，图中R：根，S：茎，L：叶片，PE：花瓣，AN：花药，0D、10D、15D、20D分别表示开花后0天、10天、15天、20天的纤维；5H代表5天的胚珠和纤维混合样品，结果表明GhCB5b基因在纤维神长期优势表达。
实施例2
GhCB5b基因转基因载体的构建
A.超量表达载体的构建
将克隆到pDONRTM221上的GhCB5b用LR反应(Invitrogen)将其重组至植物表达载体pK2GW7.0(其中：LR酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，载体构建图谱见图2，该载体骨架为pK2GW7，在细菌中的抗性为壮观霉素，转基因植株抗性为卡那霉素，目标基因GhCB5b由组成型启动子35S驱动；表达载体pK2GW7.0来自比利时根特大学)，用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。10～12h后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用35S-F(SEQ ID NO.11)：GACGCACAATCCCACTATCC，反向引物CB5b-R(SEQ ID NO.12):TGTTTTGGTATAGGAGCGGACACC；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的超表达质粒pK2GW7.0-GhCB5b。
B.CRISPR载体的构建
利用引物pRGEB32-7F和CRISPR-T2-1R，以及CRISPR-T2-2F和CRISPR-T2-2R分别进行第一PCR扩增。PCR体系为：ddH2O 16.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板1μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，3个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，27个循环，72℃延伸5min。
再将第一PCR的扩增产物利用引物infpRGEB32-7F和CRISPR-INFT2-2R进行重叠延伸PCR扩增。PCR体系为：ddH2O 15.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板各1μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，28个循环，72℃延伸5min。
利用BSAⅠ对pRGEB32-7空载体37℃酶切6小时，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大片段挖胶回收，利用Exnase酶将重叠延伸PCR扩增的目的片段和线性化表达载体进行In-fusion连接，构建完成的载体被命名为pRGEB32-7-GhCB5b(载体图谱见图3，该载体骨架为pRGEB32-7用于在细菌中的抗性为卡那霉素，转基因植株抗性为卡那霉素)。用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用：
U6-7-F(SEQ ID NO.13)：TGTGCCACTCCAAAGACATCAG；
CRISPR-INFT2-2R(SEQ ID NO.14):TTCTAGCTCTAAAACTGCTAAAGACTGTTGGCTTG；
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的突变体质粒pRGEB32-7-GhCB5b。
C.利用载体转化农杆菌
将构建的pK2GW7.0-GhCB5b载体和pRGEB32-7-GhCB5b载体分别转化农杆菌菌株EHA105，分别挑取单克隆菌落接于含100mg/L壮观霉素的LB液体培养基和含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇24h，分别用特异引物对菌液进行阳性检测(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)，阳性菌液用20％甘油于-70℃下保存。
实施例3
GhCB5b基因的遗传转化及筛选鉴定
A.农杆菌介导的遗传转化
供试材料为陆地棉品系(JIN668)，选择饱满一致JIN668种子，剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10～12min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，将种子置于MS培养基表面。30℃暗培养1天后扶苗，继续暗培养4～5天。
从超低温冰箱内取出保存的实施例2制备得到的含有目标基因的EHA105菌株的甘油管在冰上融化，分别接10μl于2ml含100mg/L壮观霉素的LB液体和含100mg/L卡那霉素的LB液体中，28℃震荡培养1天，活化好的菌液分别接20μL于15～20ml含100mg/L壮观霉素的新鲜液体LB和含100mg/L卡那霉素的新鲜液体LB中，于28℃震荡培养过夜，吸取1ml浑浊菌液于2ml无菌离心管，8000～10000rpm离心30s收集菌体，用20ml含50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MGL培养基(胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4﹒7H2O 0.1g/L，KH2PO40.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L，用蒸馏水补充至1L)重新悬浮菌体，28℃振荡培养30～40min，用于侵染下胚轴。
农杆菌介导的棉花下胚轴的转化具体步骤如下：
(1)在超净工作台中，取30株无菌苗，在无菌滤纸上将下胚轴切成0.5-0.8cm小段接入50ml无菌锥形瓶，分别加入活化好的含有目标载体pK2GW7.0-GhCB5b和含有目标载体pRGEB32-7-GhCB5b的EHA105农杆菌菌液中，侵染10min，期间摇动数次；
(2)倒去菌液，将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10-15min后接入不含抗生素的2,4-D诱导培养基(以MS为基础培养基，添加2,4-D 0.1mg/L，细胞激动素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9)上，在19℃黑暗条件下共培养48～60h；
(3)共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/L)和头孢霉素(100mg/L)的2,4-D的诱导培养基(以MS为基础培养基，添加2,4-D 0.1mg/L，细胞激动素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9)，在28℃弱光下培养，连续继代至出现胚性愈伤组织；
(4)将胚性愈伤组织陆续接入胚分化培养基(以MS为基础培养基，添加1.9g/LKNO3，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9)继代至体细胞胚成熟，将成熟的子叶胚接入生根培养基(以1/2MS为基础培养基，添加葡萄糖15g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH为5.9)上萌发，直至获得完整植株。
B.转基因植株的鉴定
(1)转基因植株阳性检测及纯系检测
提取转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化(北京)科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取，根据说明书方法进行提取；
以35s启动子正向引物35S-F(SEQ ID NO.11)和目的基因反向引物CB5b-R(SEQ IDNO.12)，U6-7-F(SEQ ID NO.13)和CRISPR-INFT2-2R(SEQ ID NO.14)，两对引物进行PCR分别检测是否有相应T-DNA插入。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。
转基因植株阳性检测结果如图4和图5所示，成功构建得到超表达转基因材料和敲除基因的突变体转基因材料。
将收取的T1代的种子剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10～12min，期间不断摇动，用无菌水冲洗3次，将种子置于棉花无菌苗培养基(含100mg/L卡那霉素)表面。30℃暗培养1天后扶苗，转移至光照室(光照强度为3000Lux，15h光照/9h黑暗)培养，5～6天观察是否有抗性分离(若有长侧根的转基因植株鉴定为阳性转基因植株)。之后每一代单株保留自交种进行筛选直至不发生抗性分离的即为转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。
(2)转基因植株的拷贝数检测：
DNA酶切及电泳分离DNA
1)在200μl微量离心管中加入15-20μg DNA样品(利用DNA抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)提取棉花基因组DNA)，80U限制性内切酶(HindIII-HF)，8μl相应的CutSmart Buffer，在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37℃酶切72h。
2)于DYY-Ⅲ34A型电泳槽中制备0.8％的0.5×TBE琼脂糖凝胶；向每个样品中加入2μl上样缓冲液，混匀后稍微离心后点样；在0.5×TBE电泳缓冲液中250V高压电泳10分钟，再在40V电泳12～14h。
DNA变性及转膜
1)切胶：停止电泳，拿出胶板，上端切去点样孔，两边距点样孔0.5cm左右，下端沿溴酚蓝处边缘切开，切左上角以示方位。
2)变性：酸变性15min，碱变性20min，变性期间不时的温和晃动胶块。
3)搭盐桥：一块洗净的20×30cm瓷盘，倒入碱转液，把干净玻璃板横放于盘上，调平衡后用碱转液湿润玻璃板，把搭盐桥的滤纸平整地铺在玻板上，使纸的两端自然下垂到盘中，用玻棒赶尽玻板与纸之间的气包后，再按同样的方法铺上第二层滤纸，将胶的正面朝上放于滤纸中央，赶尽气泡，用X光片条将胶的四周约0.5cm宽处与滤纸隔开，使碱转液必须经过凝胶进入吸水纸，以保证胶中的DNA充分转移到尼龙膜上。取与胶块等大的尼龙膜准确放于胶上，赶尽气泡，在尼龙膜上放两张等大的滤纸，再放约10cm厚的吸水纸，再放一个玻璃板及约500g的重物，调水平，印记18～24h。
4)将转好的尼龙膜用2×SSC浸泡15min，重复一次，捞出后用滤纸吸干水分，再用干净的滤纸包好，于80℃烘干2h后用保鲜膜包好放在-20℃保存。
Southern杂交
1)预杂交：将预杂交的尼龙膜用2×SSC浸泡15～30min，取出尼龙膜装入杂交管中，赶尽气泡，在杂交管中加入25ml预杂交液，并于42℃预杂交，保持低速转动，几分钟后检查是否漏液。若不漏加入320μL/403μL鲑鱼精。
2)杂交：吸取500μL杂交管中的杂交液于一新离心管中，加入探针，在98℃变性5分钟后，立即置于冰上3min。将变性好的探针加入杂交管中,充分混匀，42℃杂交10～12h。
3)洗膜：2×SSC+0.1％SDS于室温洗2次，每次15min；0.1×SSC+0.1％SDS于68℃洗3次，前2次15min，第3次10min；Washing Buffer洗1次，2～3min；马来酸缓冲液洗1次，2～3min；用马来酸缓冲液将10×Blocking Solution稀释成1×Blocking Solution，取其中80ml用来封阻背景，常温轻摇1h后弃掉溶液；试剂盒中4号管(Anti-AP)，用前12000rmp，离心5min，取2μL加入20ml的1×Blocking Solution，将配好的Blocking Solution加入杂交管中，37℃杂交炉轻摇40min，之后取出尼龙膜，在瓷盘中用500ml的Washing Buffer清洗3次，每次15min。
压膜及显影
1)将尼龙膜用检测缓冲液漂洗，室温3～5分钟。
2)压膜：将足够大的自封袋剪开，平铺于桌面，吸取800μL的CSPD均匀地滴在塑料袋上，取出尼龙膜将DNA面朝下，置于自封袋上，压好膜，用封口机封口，防止气泡的产生。室温孵育10min后将膜置于37℃孵育5-10min，以增强化学发光反应。
3)压磷屏：将膜的DNA面朝上放置于磷屏中，放入1张X光片，盖好磷屏，曝光10～20min。
4)显影：将X光片浸入显影液中，反复几次后，用水冲洗干净X光片，浸入定影液中5min，冲洗干净即可。
转基因株系拷贝数鉴定结果如图6所示，野生型株系没有杂交信号，转基因OE15-12、OE15-28株系均为单拷贝。
实施例4
GhCB5b基因CRISPR转基因株系编辑效率检测
参考实施例3的方法提取棉花叶片DNA。
由于CRISPR-Cas9技术会造成一个单株上有多种编辑类型的现象以及sanger测序无法鉴定多种突变类型，因此使用高通量Hi-TOM测序技术。结合Barcode标记的方法，针对敲除材料被编辑的每一个单株，以接头的方式在检测靶点的正反引物5’端标记上Barcode，因此不同单株获得一对特异的Barcode标记。利用这些含有Barcode的引物扩增独立单株的靶位点序列，构建混合的DNA文库并进行高通量测序。测序结果根据Barcode标记的引物进行分选，获得独立单株对应的测序结果。测序结果经过去掉重复和低质量的序列，再和参考基因序列进行比对分析，从而完成单株靶基因位点突变检测的过程。检测时使用的Barcode引物为：
2P-F-1(SEQ ID NO.15)：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGAACCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT；
2P-R-1(SEQ ID NO.16)：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTAGCCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTT；
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。等量吸取PCR产物，纯化后送测序。编辑效率检测结果分如图8所示：CR2-1-1、CR2-2-1、CR2-3、CR2-5株系均有多种编辑类型，且在At和Dt亚族的编辑类型各有不同。CR2-5在At亚族有两种编辑类型：18和2碱基的缺失；在Dt亚族有4碱基的缺失。CR2-3在At亚族有2碱基的缺失，在Dt亚族分别有2碱基和1碱基的缺失。CR2-1-1、CR2-2-1的编辑类型详见图8。
实施例5
利用转基因棉花对GhCB5b基因进行功能验证
具体步骤如下：
GhCB5b转基因株系成熟纤维长度测定
将转基因纯系材料OE2-4、OE2-26、CR2-3、CR2-5及野生型材料(WT)六个株系的材料种植于转基因试验田，每个株系各20株，待棉纤维成熟，同一时间点摘取转基因及对照株系相同部位的棉桃进行纤维长度测量，每个株系3个生物学重复，采用棉籽分梳法进行测量。先顺棉籽中间腹沟将纤维理直，用梳子进行梳绒。之后，将棉籽腹沟向下贴在黑绒板上，用钢尺进行测量。所得数据用prism软件进行多重比较分析，结果见图9，与野生型比较，超表达GhCB5b可以显著促进棉纤维伸长，敲除GhCB5b显著抑制棉纤维伸长。
GhCB5b转基因株系未成熟纤维长度测定
在华中农业大学试验田中，同一时间点摘取转基因及对照株系相同部位的棉桃进行纤维长度测量。所取棉铃为10、15和20DPA。将棉铃相同部位的胚珠置于煮沸的开水中，用玻璃棒轻轻敲打使纤维散开。之后在流水下冲洗使纤维伸直，再将其放置在干净的桌面上拉直后进行长度测量。所得数据用prism软件进行多重比较分析，结果见图9。与野生型比较，超表达GhCB5b在10、15和20DPA可以显著促进棉纤维伸长，敲除GhCB5b显著抑制棉纤维伸长。
GhCB5b转基因株系成熟纤维品质鉴定
人工摘取同一时期的、植株中部的成熟棉铃，进行机器轧花。每个纤维样品的重量在10g左右。将整理好的样品进行五项指标的测量，所用仪器为大容量棉花纤维测试仪(High Volume Instrumen,HFT9000,Premier,India)。每个转基因株系至少有三次重复。所得数据用prism软件进行多重比较分析。结果如图10，与野生型比较，超表达GhCB5b基因可以显著促进棉纤维伸长，提高强度，降低马克隆值；敲除GhCB5b基因可以显著抑制纤维长度，强度略有降低，马克隆值无显著变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种与棉花纤维长度和强度相关的基因GhCB5b，其特征在于，所述基因GhCB5b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述基因GhCB5b，其特征在于，所述基因GhCB5b编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述基因GhCB5b的超表达载体。
4.根据权利要求3所述超表达载体，其特征在于，包括将所述基因GhCB5b重组到pK2GW7.0表达载体上。
5.权利要求1或2所述基因GhCB5b的敲除载体。
6.根据权利要求5所述敲除载体，其特征在于，所述敲除载体的基础载体包括pRGEB32-7载体。
7.权利要求1或2所述基因GhCB5b或权利要求3或4所述超表达载体或权利要求5或6所述敲除载体在培育棉花新种质中的应用。
8.权利要求1或2所述基因GhCB5b或权利要求3或4所述超表达载体或权利要求5或6所述敲除载体在改良棉花纤维品质中的应用。
9.权利要求3或4所述超表达载体在促进棉花纤维伸长和强度升高中的应用。
10.权利要求5或6所述敲除载体在抑制棉花纤维伸长中的应用。
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