CN111073897B

CN111073897B - GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用

Info

Publication number: CN111073897B
Application number: CN202010036151.8A
Authority: CN
Inventors: 杨细燕; 岳丹丹; 邓晋武; 张献龙
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN111073897A

Abstract

本发明涉及GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在调节棉花中可溶性糖积累的应用。超表达GhTMT2基因能促进棉花可溶性糖的积累，敲除GhTMT2基因能降低棉花葡萄糖的含量，可以为培育高产棉花新品种提供理想的途径。

Description

GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物，转基因技术作为棉花遗传改良快速有效的方法，为棉花遗传育种带来了巨大的发展空间。通过基因工程技术培育的抗虫棉已经成为我国推广最为成功的转基因作物，其有效提高了棉花对鳞翅目害虫特别是棉铃虫的抵抗能力，挽回了重大的经济损失，极大程度降低了农药的使用，在保护环境，降低人畜中毒风险，提高植棉效益等方面发挥着重大作用。

糖作为生命活动中最重要的基础代谢物质，参与了植物细胞壁的建成，细胞内渗透压的平衡，提供了细胞生命活动的能量以及各种代谢物的基本骨架。在植物生长发育和对环境的响应中，糖扮演了极其重要的角色。对绝大多数植物而言，从外界获取糖的唯一方式是光合作用，为了将光合作用产生的糖类进行合理有效的分配，植物进化出了数量众多，功能丰富的糖转运子，分别为单糖转运子家族、蔗糖转运子家族和SWEET转运子家族。植物通过多样性的调节途径对糖转运子进行调节来实现糖的合理分配。但并没有一种利用对糖的调节来实现棉花增产的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用。超表达GhTMT2基因能促进棉花可溶性糖的积累，敲除GhTMT2基因能降低棉花葡萄糖的含量，可以为培育高产棉花新品种提供理想的途径。

本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQID NO.2所示的GhTMT2蛋白在调节棉花中可溶性糖积累的应用。

本发明还提供了超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在促进棉花中可溶性糖积累的应用。

本发明还提供了超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在促进棉花中葡萄糖积累的应用。

本发明还提供了敲除核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在降低棉花中葡萄糖含量的应用。

本发明还提供了包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的pK2GW7.0载体在调节棉花中可溶性糖积累的应用。

本发明还提供了包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的pRGEB32-7载体在调节棉花中可溶性糖积累的应用。

本发明还提供了包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的农杆菌在调节棉花中可溶性糖积累的应用。

本发明还提供了超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在培育可溶性糖和/或葡萄糖积累量高的棉花中的应用。

本发明还提供了超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在培育高产棉花中的应用。

本发明提供了GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用。超表达GhTMT2基因能促进棉花可溶性糖的积累，敲除GhTMT2基因能降低棉花葡萄糖的含量，可以为培育高产棉花新品种提供理想的途径。可溶性糖可以作为重要的能源物质，对提高植物的非生物逆境抗性具有很大的作用，因此利用本发明，可以改良作物的性状，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为本发明提供的候选基因GhTMT2功能鉴定图；其中，(A)为GhTMT2 VIGS植株中GhTMT2表达量检测；(B)为GhTMT2 VIGS植株中可溶性糖含量测定；(C)为GhTMT2 VIGS植株中葡萄糖含量测定；

图2为本发明提供的pK2GW7-GhTMT2超表达质粒载体的图谱；

图3为本发明提供的pRGEB32-7-GhTMT2突变体质粒载体的图谱；

图4为本发明提供的超表达转基因材料PCR阳性检测结果胶图；

图5为本发明提供的突变体转基因材料PCR阳性检测结果胶图；

图6为本发明提供的超表达转基因材料Southern杂交结果胶图；

图7为本发明提供的超表达转基因材料qRT-PCR检测结果胶图；

图8为本发明提供的突变体转基因材料qRT-PCR检测结果胶图；

图9为本发明提供的超表达转基因材料可溶性糖含量及葡萄糖含量分析图；

图10为本发明提供的突变体转基因材料可溶性糖含量及葡萄糖含量分析图。

具体实施方式

本发明从陆地棉中克隆一个与棉花可溶性糖积累相关的功能基因GhTMT2，它的CDS序列是序列表SEQ ID NO.1中第1-2220位碱基所示的序列(ATGAGGGGTGCTGCTTTTGTAGCCATTGCTGCTACAATTGGTAACTTTTTGCAGGGATGGGATAATGCTACCATTGCTGGAGCAATTGTGTACATTAAGAATGACCTCAATCTAGGAACTAGCGTTGAAGGTCTAGTGGTGGCTATGTCACTGATAGGAGCAACAGCTATTACAACATGCTCAGGGGCTATATCAGATTGGCTTGGTCGGCGTCCAATGCTGATAATGTCTTCAATGCTTTATTTTGTCAGTGGTTTGGTAATGTTGTGGTCACCTAATGTCTATATTTTGTGCCTAGCCAGGCTATTAGATGGATTTGGAATTGGTTTAGCCGTGACTCTTGTCCCAGTCTATATATCTGAGACTGCCCCATCTGAGATAAGGGGATTGTTAAATACGTTACCACAATTCACTGGTTCCGGGGGAATGTTTCTATCTTATTGTATGGTTTTTGGGATGTCATTGATGGACTCACCAAGTTGGAGGTTGATGCTTGGGGTTCTATCCATCCCTTCTCTCCTCTATTTTGCCTTTACGGTTTTTTATTTGCCTGAATCTCCTCGGTGGCTTGTGAGTAAAGGAAGAATGCTTGAAGCTAAACAGGTTCTTCAGAGATTACGTGGCAGGGAAGATGTTTCAGGAGAGATGGCTTTGCTGGTTGAGGGCCTTGGCATTGGAGGTGAAACCTCTATAGAAGAGTACATAATAGGTCCAGCTGATGAACTTGATGAAAGTCAGGAACCCGGTGCTGATAAAGACAAAATCAGACTATATGGACCGGAAGAGGGCCTGTCTTGGGTTGCCAAGCCTGTCGCTGGACAAAGCATTCTTAGTATTGCCTCTCGCCCCGGAAGCATGGTGAACCAAAGTATGCCCCTTATGGACCCTCTTGTGACATTATTTGGTAGTGTTCATGAAAAGCTTCCCGAGACAGGGAGCACGCGTAGTATGCTTTTTCCGAATTTTGGAAGCATGTTTAGTACAGCAGAGCCTCATGCTAGAAATGAACAATGGGATGAGGAGAGCTTGCAGAGAGAAGGTGAGGACTATGCATCAGATGCTGCAGGAGGAGACTCGGATGACAATTTGCATAGCCCATTAATCTCACGTCAAACAACAAGCTTGGAAAAGGACATGGTTCCCCCAGCTTCCCATATCAGTTCTCTAAGCATGAGACGCCATAGCACTCTTGTGCAAGATGTTACAGAATCAGTTGGTGGTACAGGGATTGGAGGTGGTTGGCAGTTGGCATGGAAATGGTCTGAGCGAGAAGGTGAGGGTGGAAAGAAGGAAGGAGGGTTTAAAAGGATTTATTTGCACGAGGAGGGAATCCCAGGATCTCGACGTGGCTCTCTTGTATCACTTCCAGGTAATGATATGCCCGCAGAAGGTGAGTTTATCCAGGCAGCTGCACTAGTGAGCCAACCTGCTCTTTATTCCAAGGAGCTTATGGATCAGCATCCTGTTGGACCAGCAATGGTTCATCCAGCTGAAACTGCCTCAGAAGGACCAGTTTGGACTGCTCTCCTTGACCCGGGAGTCAAACGTGCTTTATTAGTTGGGATTGGGATTCAGATTCTTCAGCAGTTTTCCGGCATTAATGGAGTTCTCTACTACACTCCTCAAATTCTTGAAGAGGCAGGTGTTGAAGTGCTTCTTTCAAACTTGGGCCTTGGTTCAGATTCTGCATCATTTCTTATTAGTGCATTTACAACCTTGCTGATGCTGCCCTGTATAGGTGTAGCCATGAAACTCATGGATATATCAGGCAGGAGGCGGCTGCTACTCACCACGATCCCGGTGCTTATAGTGTCACTGATCATTCTAGTTTTTAGTGAACTTGTGGATTTGGGCACGGTTGTGAATGCTGCCATCTCAACTGCATGTGTTATTGTTTACTTCTGCTGCTTTGTGATGGGCTATGGACCAATACCAAATATCCTCTGCTCTGAGATCTTTCCAACAAGGGTCCGGGGGCTTTGTATTGCAATCTGTGCTTTGGTTTATTGGATCGGAGACATCATTGTTACTTACACACTGCCAGTGATGCTGAGTTCTATAGGCCTAGCGGGCATCTTCGGGATATATGCTGTTGTATGTCTGATATCGTGGGTGTTTGTGTTCTTGAAAGTACCAGAGACCAAAGGAATGCCACTTGAAGTCATTACCGAGTTCTTTTCTGTTGGTGCAAGACAAGCTGGTGCTACAAAGAATGAGTGA)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据测序验证后的该基因全长cDNA序列信息构建该基因的超表达载体(pK2GW7-GhTMT2)和CRISPR载体(pRGEB32-7-GhTMT2)，超量表达的核苷选序列是序列表SEQ ID NO.1中的第1-2220位所示的序列，对应的氨基酸序列SEQ ID NO:2是GhTMT2基因编码的蛋白质序列(MRGAAFVAIAATIGNFLQGWDNATIAGAIVYIKNDLNLGTSVEGLVVAMSLIGATAITTCSGAISDWLGRRPMLIMSSMLYFVSGLVMLWSPNVYILCLARLLDGFGIGLAVTLVPVYISETAPSEIRGLLNTLPQFTGSGGMFLSYCMVFGMSLMDSPSWRLMLGVLSIPSLLYFAFTVFYLPESPRWLVSKGRMLEAKQVLQRLRGREDVSGEMALLVEGLGIGGETSIEEYIIGPADELDESQEPGADKDKIRLYGPEEGLSWVAKPVAGQSILSIASRPGSMVNQSMPLMDPLVTLFGSVHEKLPETGSTRSMLFPNFGSMFSTAEPHARNEQWDEESLQREGEDYASDAAGGDSDDNLHSPLISRQTTSLEKDMVPPASHISSLSMRRHSTLVQDVTESVGGTGIGGGWQLAWKWSEREGEGGKKEGGFKRIYLHEEGIPGSRRGSLVSLPGNDMPAEGEFIQAAALVSQPALYSKELMDQHPVGPAMVHPAETASEGPVWTALLDPGVKRALLVGIGIQILQQFSGINGVLYYTPQILEEAGVEVLLSNLGLGSDSASFLISAFTTLLMLPCIGVAMKLMDISGRRRLLLTTIPVLIVSLIILVFSELVDLGTVVNAAISTACVIVYFCCFVMGYGPIPNILCSEIFPTRVRGLCIAICALVYWIGDIIVTYTLPVMLSSIGLAGIFGIYAVVCLISWVFVFLKVPETKGMPLEVITEFFSVGARQAGATKNE)，编码739个蛋白质。

本发明还提供了包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的pK2GW7.0载体在调节棉花中可溶性糖积累的应用。本发明参考棉花基因组序列，设计带有attB接头的引物对该基因全长进行PCR扩增，引物序列：TMT2-BP-F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGAGGGGTGCTGCTTTTGTAG(SEQ ID NO.3)，TMT2-BP-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTCATTCTTTGTAGCACCAG(SEQ ID NO.4)，对克隆产物进行BP重组反应，将GhTMT2构建到pDONR221质粒上，通过载体上的M13测序引物对克隆片段进行测序，综合多个测序结果及参考序列进行比对。将选取的克隆通过LR重组反应将目的基因GhTMT2重组到pK2GW7表达载体上，构建完成的载体被命名为pK2GW7-GhTMT2(载体图谱见图2)本发明还提供了包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的pRGEB32-7载体在调节棉花中可溶性糖积累的应用。本发明参考棉花基因组序列和CRISPR-P网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行搜索靶标，设计引物进行两次PCR扩增，利用BSAⅠ对pRGEB32-7空载体进行酶切，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大片段挖胶回收，利用Exnase酶将目的片段和线性化表达载体进行连接，构建完成的载体被命名为pRGEB32-7-GhTMT2(载体图谱见图3)。

本发明还提供了包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的农杆菌在调节棉花中可溶性糖积累的应用。在本发明中，所述农杆菌优选包括农杆菌菌株EHA105。本发明优选通过热激转化大肠杆菌TOP10，通过PCR鉴定阳性克隆，扩繁并提取质粒，将质粒通过电转的方法转化到农杆菌菌株EHA105感受态中，将PCR鉴定为阳性的克隆保存备用。将含有pK2GW7-GhTMT2质粒和含有pRGEB32-7-GhTMT2的农杆菌EHA105扩繁，然后通过农杆菌介导的遗传转化方法将T-DNA片段转化到棉花下胚轴，通过组织培养获得再生植株，设计引物对再生植株进行PCR鉴定阳性，转基因阳性材料PCR能扩增出对应的条带。提取阳性植株DNA进行Southern杂交鉴定拷贝数，TO8为单拷贝阳性株系。提取单拷贝阳性植株的RNA并反转录成cDNA，设计qRT-PCR引物进行表达量分析，超表达株系能够提高GhTMT2的表达，突变体株系能够降低GhTMT2的表达。

本发明选取GhTMT2超表达株系、敲除突变体株系及对照种植于转基因试验田和培养室，用于分析可溶性糖的含量的测定分析等。将不同转基因株系分别种植于条件良好的转基因试验田，选取同一部位的叶片，用液氮迅速冻存，在实验室条件下称取等量叶片，分别进行可溶性糖的提取，将提取液稀释后采用硫酸蒽酮比色法和葡萄糖测定试剂盒测定不同株系中可溶性糖和葡萄糖的含量，结果表明超表达株系可以显著提高正常条件下棉花可溶性糖的含量，而GhTMT2敲除突变体中葡萄糖含量显著降低。

本发明从棉花中克隆的单糖转运子基因GhTMT2，利用本发明克隆的GhTMT2基因构建超表达载体和CRISPR载体，借助农杆菌介导的遗传转化，功能验证表明超表达GhTMT2基因能提高棉花可溶性糖积累，也能提高葡萄糖的积累，敲除GhTMT2基因能够降低棉花中葡萄糖含量。

本发明还提供了超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在培育可溶性糖和葡萄糖积累量高的棉花中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

GhTMT2基因的克隆及VIGS功能分析

A.RNA的提取及cDNA的获得

取陆地棉品系(YZ1，又称豫早熟棉1号，来自河南省农业科学院经济作物研究所)叶片样品，采用异硫氰酸胍的方法提取总RNA，cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RT buffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μl

Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μlSuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。

B.病毒诱导的基因沉默实验(VIGS)

将含有目的基因300-500bp的片段构建到TRV:2载体上并用基因名称进行命名，如TRV:TMT2表示含有GhTMT2基因片段的TRV:2载体，不含目的基因的TRV:2载体作为对照并命名为TRV:00。将构建好的TRV:2载体分别转化农杆菌菌株GV3101。将棉花幼苗在光照培养室培养一周至子叶平展，将包含TRV:1和TRV:2载体的农杆菌菌液分别用液体LB(添加适量抗生素)培养过夜并收集菌体，用缓冲液(10mM MES，10mM MgCl2，40μg/mlAS，pH5.6)将其重悬并调整OD₆₀₀为1左右，将菌液等量混合，置于28℃摇床150rpm活化2h。将菌液用不带针头的注射器从子叶下表皮均匀注射至子叶完全被侵染。将侵染后的幼苗避光处理24h后进行正常培养。GhCLA1作为叶绿体合成的关键酶，选取TRV:CLA1作为阳性对照，通过叶片的白化程度对该批次条件下的沉默效果进行初步判断。随后对VIGS实验植株取样用于沉默效果检测和生理指标测定。

对候选基因GhTMT2进行VIGS功能验证，图1为候选基因GhTMT2功能鉴定图；其中，(A)为GhTMT2 VIGS植株中GhTMT2表达量检测；(B)为GhTMT2 VIGS植株中可溶性糖含量测定；(C)为GhTMT2VIGS植株中葡萄糖含量测定；误差线表示3次生物学重复的标准差，**P<0.01，T检验。如图1所示，VIGS结果表明，该基因沉默后对野生型植株可溶性糖含量没有显著影响，但能显著降低超表达植株中可溶性糖和葡萄糖的含量。

C.GhTMT2基因全长序列的获得

从陆地棉基因组数据库中提取该基因序列(Gh_D01G0848)，设计扩增该基因的引物序列，具体如下：

TMT2-BP-F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGAGGGGTGCTGCTTTTGTAG(SEQID NO.3)，

TMT2-BP-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTCATTCTTTGTAGCACCAG(SEQID NO.4)。

以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。PCR产物经BP反应连接至pDONR^TM221载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，pDONR^TM221载体来源于CSIROPlantIndustry，澳大利亚)后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

GhTMT2基因转基因载体的构建

A.超量表达载体的构建

将克隆到pDONR^TM221上的GhTMT2用LR反应(Invitrogen)将其重组至植物表达载体pK2GW7.0(其中：LR酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，载体构建图谱见图2(附图标记说明：该载体骨架为pK2GW7，在细菌中的抗性为壮观霉素，转基因植株抗性为卡那霉素，目标基因GhTMT2由组成型启动子35S驱动)；表达载体pK2GW7.0来自比利时根特大学)，用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用35S-S：CCACTATCCTTCGCAAGACCCT(SEQ ID NO.5)和TMT2-BP-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTCATTCTTTGTAGCACCAG(SEQ ID NO.4)，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的超表达质粒pK2GW7.0-GhTMT2。

B.CRISPR载体的构建

参考CRISPR-P网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行搜索靶标，选择分数最高的序列，设计载体构建所用到的引物，具体如下：

CRISPR-T2-1F:

ACAATCCCCTTATCTCAGATGTTTTAGAGCTAGAAATA(SEQ ID NO.6)

CRISPR-T2-1R:

ATCTGAGATAAGGGGATTGTTGCACCAGCCGGGAAT(SEQ ID NO.7)

CRISPR-T2-2R:

AGACAGGGAGCACGCGTAGTTGCACCAGCCGGGAAT(SEQ ID NO.8)

CRISPR-INFT2-2R:

TTCTAGCTCTAAAACAGACAGGGAGCACGCGTAGT(SEQ ID NO.9)

pRGEB32-7F:

AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG(SEQ ID NO.10)

infpRGEB32-7F:AAGCATCAGATGGGCAAACAAA(SEQ ID NO.11)

利用引物pGREB32-7F和CRISPR-T2-1R进行PCR1扩增，利用引物CRISPR-T2-1F和CRISPR-T2-1R进行PCR2扩增，再将PCR1和PCR2进行重叠延伸PCR扩增。利用BSAⅠ对pRGEB32-7空载体37℃酶切6小时，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大片段挖胶回收，利用Exnase酶将第二次PCR扩增的目的片段和线性化表达载体进行In-fusion连接，构建完成的载体被命名为pRGEB32-7-GhTMT2(载体图谱见图3，附图标记说明：该载体骨架为pRGEB32-7用于在细菌中的抗性为卡那霉素，转基因植株抗性为卡那霉素)。用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用U6-7S：TGTGCCACTCCAAAGACATCAG(SEQ ID NO.12)和CRISPR-INFT2-2R:TTCTAGCTCTAAAACAGACAGGGAGCACGCGTAGT(SEQ ID NO.9)，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的超表达质粒pRGEB32-7-GhTMT2。

C.利用载体转化农杆菌

将构建的pK2GW7.0-GhTMT2载体和pRGEB32-7-GhTMT2载体分别转化农杆菌菌株EHA105，分别挑取单克隆菌落接于含100mg/L壮观霉素的LB液体培养基和含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇24h，分别用特异引物对菌液进行阳性检测(所述的引物序列见实施例2A和例2B)，阳性菌液用20％甘油于-70℃下保存。

实施例3

GhTMT2基因的遗传转化及筛选鉴定

A.农杆菌介导的遗传转化

供试材料为陆地棉品系(YZ1)，选择饱满一致YZ1种子，剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-12min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，将种子置于MS培养基表面。30℃暗培养1天后扶苗，继续暗培养4-5天。

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因(即本发明克隆的GhTMT2基因)的EHA105菌株的甘油管在冰上融化，分别接10μl于2ml含100mg/L壮观霉素的LB液体和含100mg/L卡那霉素的LB液体中，28℃震荡培养1天，活化好的菌液分别接20μL于15-20ml含100mg/L壮观霉素的新鲜液体LB和含100mg/L卡那霉素的新鲜液体LB中，于28℃震荡培养过夜，吸取1ml浑浊菌液于2ml无菌离心管，8000-10000rpm离心30s收集菌体，用20ml含50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MGL培养基(具体成分见后描述)重新悬浮菌体，28℃振荡培养30-40min，用于侵染下胚轴。

农杆菌介导的棉花下胚轴的转化具体步骤如下：

(1)在超净工作台中，取30株无菌苗，在无菌滤纸上将下胚轴切成0.5-0.8cm小段接入50ml无菌锥形瓶，分别加入活化好的含有目标载体pK2GW7.0-GhTMT2和含有目标载体pRGEB32-7-GhTMT2的EHA105农杆菌菌液中，侵染10min，期间摇动数次；

(2)倒去菌液，将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10-15min后接入不含抗生素的2，4-D诱导培养基(具体成分见后面描述)上，在19℃黑暗条件下共培养48-60h；

(3)共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/L)和头孢霉素(100mg/L)的2，4D的诱导培养基(具体成分见后面描述)，在28℃弱光下培养；

(4)3周后转入含抗生素吲哚丁酸(IBA)诱导培养基(具体成分见后面描述)连续继代至出现胚性愈伤组织；

(5)将胚性愈伤组织陆续接入胚分化培养基(具体成分见后面描述)继代至体细胞胚成熟，将成熟的子叶胚接入生根培养基(具体成分见后面描述)上萌发，直至获得完整植株。

本实施例中所用的培养配方：

MGL培养基：胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.1g/L，KH₂PO₄ 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L，用蒸馏水补充至1L。

2，4-D诱导培养基：以MS为基础培养基，添加2,4-D 0.1mg/L，细胞激动素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

IBA诱导培养基：以MS为基础培养基，添加IBA 0.5mg/L，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

胚分化培养基：以MS为基础培养基，添加1.9g/L KNO₃，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

生根培养基：以1/2MS为基础培养基，添加葡萄糖15g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH为5.9。

上述培养基配方中所述的基础MS培养基配方为:大量元素(KNO₃ 1.9g/L，NH₄NO₃1.65g/L，KH₂PO₄ 0.17g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.37g/L，CaCl₂﹒2H₂O 0.44g/L)，微量元素(KI0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/LMnSO₄﹒4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄﹒2H₂O0.25mg/L，CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂ 0.025mg/L)，铁盐(Na₂﹒EDTA 37.3mg/L，FeSO₄﹒7H₂0 27.8mg/L)，有机成分(肌醇100mg/L，Gly 2mg/L，VB₁ 0.1mg/L，VB₆ 0.5mg/L，VB₅0.5mg/L)。

B.转基因植株的鉴定

(1)转基因植株阳性检测及纯系检测

提取转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化(北京)科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)，以35s启动子正向引物35S-S：CCACTATCCTTCGCAAGACCCT(SEQ ID NO.5)和目的基因反向引物TMT2-BP-R:

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTCATTCTTTGTAGCACCAG(SEQ ID NO.4)及U6-7S：TGTGCCACTCCAAAGACATCAG(SEQ ID NO.12)和CRISPR-INFT2-2R:TTCTAGCTCTAAAACAGACAGGGAGCACGCGTAGT(SEQ ID NO.9)，两对引物进行PCR分别检测是否有相应T-DNA插入。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。转基因植株阳性检测结果见图4、图5。

图4为本发明提供的超表达转基因材料阳性检测结果胶图；附图标记说明：WT表示野生型受体，TO2到TO27为26个超表达株系，泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为300，500，800，1000，1500，2000，3000，5000bp)。转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型没有条带；超表达材料阳检PCR扩增正向引物为35S-F：CTGACGTAAGGGATGACGC(SEQ IDNO.13)，反向引物TMT2-BP-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTCATTCTTTGTAGCACCAG(SEQ ID NO.4)。

图5为本发明提供的突变体转基因材料阳性检测结果胶图；附图标记说明：WT-1、WT-2表示突变体受体，1到45为32个突变体株系，泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为300，500，800，1000，1500，2000，3000，5000bp)。转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型没有条带；突变体材料阳检PCR扩增正向引物为U6-7S:TGTGCCACTCCAAAGACATCAG(SEQID NO.12)，反向引物CRISPR-T2-2R:AGACAGGGAGCACGCGTAGTTGCACCAGCCGGGAAT(SEQ IDNO.8)。

将收取的T₁代的种子剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-12min，期间不断摇动，用无菌水冲洗3次，将种子置于棉花无菌苗培养基(含100mg/L卡那霉素)表面。30℃暗培养1天后扶苗，转移至光照室(光照强度为3000Lux，15h光照/9h黑暗)培养，5-6天观察是否有抗性分离(若有长侧根的转基因植株鉴定为阳性转基因植株)。之后每一代单株保留自交种进行筛选直至不发生抗性分离的即为转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。

(2)转基因植株的拷贝数检测：

棉花基因组DNA的提取：

1)称取0.1-0.2g转基因棉花植株的幼嫩叶片，加入200μL DNA抽提缓冲液，磨样机打60s频率60Hz，磨匀后补加600μL DNA抽提缓冲液立即混匀，离心5min(室温，11000rpm)。

2)弃上清，加入GP1，即DNA抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)700μL，混匀。65℃水浴40min，中间每隔几分钟颠倒混匀一次，离心8min(室温，11000rpm)。

3)取上清加入到新的离心管中，加酚氯仿800μL，轻摇20min，离心8min(室温，12000rpm)。

4)取上清，加入800μL氯仿，轻摇15min，离心8min(室温，12000rpm)。

5)将上一步所得上层水相转入新的离心管中，加入700μL的GP2，充分混匀。

6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中(可分多次加入)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

7)向吸附柱CB3中加入500μL的缓冲液GD(DNA抽提试剂盒自带，天根生化科技(北京)有限公司)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

8)向吸附柱CB3中加入600μL的PW(使用前检查是否加无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。再重复一遍。然后空离心2min；将吸附柱置于室温晾干。

9)将吸附柱CB3转移到新的1.5mL的离心管中，向吸附膜中间部位加入60μL洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将DNA收集到离心管中。

DNA酶切及电泳分离DNA

1)在200μl微量离心管中加入15-20μg DNA样品，80U限制性内切酶(HindIII-HF)，8μl相应的CutSmart Buffer，在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37℃酶切72h。

2)于DYY-Ⅲ 34A型电泳槽中制备0.8％的0.5×TBE琼脂糖凝胶；向每个样品中加入2μl上样缓冲液，混匀后稍微离心后点样；在0.5×TBE电泳缓冲液中250V高压电泳10分钟，再在40V电泳12～14h。

DNA变性及转膜

1)切胶：停止电泳，拿出胶板，上端切去点样孔，两边距点样孔0.5cm左右，下端沿溴酚蓝处边缘切开，切左上角以示方位。

2)变性：酸变性15min，碱变性20min，变性期间不时的温和晃动胶块。

3)搭盐桥：一块洗净的20×30cm瓷盘，倒入碱转液，把干净玻璃板横放于盘上，调平衡后用碱转液湿润玻璃板，把搭盐桥的滤纸平整地铺在玻板上，使纸的两端自然下垂到盘中，用玻棒赶尽玻板与纸之间的气包后，再按同样的方法铺上第二层滤纸，将胶的正面朝上放于滤纸中央，赶尽气泡，用X光片条将胶的四周约0.5cm宽处与滤纸隔开，使碱转液必须经过凝胶进入吸水纸，以保证胶中的DNA充分转移到尼龙膜上。取与胶块等大的尼龙膜准确放于胶上，赶尽气泡，在尼龙膜上放两张等大的滤纸，再放约10cm厚的吸水纸，再放一个玻璃板及约500g的重物，调水平，印记18-24h。

4)将转好的尼龙膜用2×SSC浸泡15min，重复一次，捞出后用滤纸吸干水分，再用干净的滤纸包好，于80℃烘干2h后用保鲜膜包好放在-20℃保存。

Southern杂交

1)预杂交：将预杂交的尼龙膜用2×SSC浸泡15-30min，取出尼龙膜装入杂交管中，赶尽气泡，在杂交管中加入25ml预杂交液，并于42℃预杂交，保持低速转动，几分钟后检查是否漏液。若不漏加入320μL/403μL鲑鱼精。

2)杂交：吸取500μL杂交管中的杂交液于一新离心管中，加入探针，在98℃变性5分钟后，立即置于冰上3min。将变性好的探针加入杂交管中，充分混匀，42℃杂交10～12h。

3)洗膜：2×SSC+0.1％SDS于室温洗2次，每次15min；0.1×SSC+0.1％SDS于68℃洗3次，前2次15min，第3次10min；Washing Buffer洗1次，2～3min；马来酸缓冲液洗1次，2～3min；用马来酸缓冲液将10×Blocking Solution稀释成1×Blocking Solution，取其中80ml用来封阻背景，常温轻摇1h后弃掉溶液；试剂盒中4号管(Anti-AP)，用前12000rmp，离心5min，取2μL加入20ml的1×Blocking Solution，将配好的Blocking Solution加入杂交管中，37℃杂交炉轻摇40min，之后取出尼龙膜，在瓷盘中用500ml的Washing Buffer清洗3次，每次15min。

压膜及显影

1)将尼龙膜用检测缓冲液漂洗，室温3～5分钟。

2)压膜：将足够大的自封袋剪开，平铺于桌面，吸取800μL的CSPD均匀地滴在塑料袋上，取出尼龙膜将DNA面朝下，置于自封袋上，压好膜，用封口机封口，防止气泡的产生。室温孵育10min后将膜置于37℃孵育5-10min，以增强化学发光反应。

3)压磷屏：将膜的DNA面朝上放置于磷屏中，放入1张X光片，盖好磷屏，曝光10～20min。

4)显影：将X光片浸入显影液中，反复几次后，用水冲洗干净X光片，浸入定影液中5min，冲洗干净即可。

转基因株系拷贝数鉴定结果见图6。图6为本发明提供的超表达转基因材料Southern杂交结果胶图；附图标记说明：泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为2027，2322，4361，6557，9416，23130bp)，野生型株系没有杂交信号，作为阴性对照，其余转基因TO8株系为单拷贝，TO16和TO17株系为双拷贝。

(3)转基因植株表达量检测

取T₃代转基因棉花植株主茎倒一叶提取RNA，RNA的抽提用常规异硫氰酸胍法。cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RTbuffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μl

Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μl SuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用实施例1中的引物进行特异PCR扩增，棉花GhUb7(GenBank登陆号：DQ116441)基因作为内参对照进行相对定量分析。

结果表明：本发明克隆的GhTMT2基因在超表达株系中高量表达，在突变体株系中表达量明显降低。后续的功能验证研究中选取具有高量表达的株系系TO16、TO17和TO19，表达量降低的tmt2-1、tmt2-2、tmt2-3和tmt2-4进行进一步分析(见图7、图8)。图7为本发明提供的超表达转基因材料qRT-PCR检测结果图；附图标记说明：WT表示野生型受体，TO2到TO23为14个超表达株系；超表达株系能够提高GhTMT2的表达；图8为本发明提供的突变体转基因材料qRT-PCR检测结果图；附图标记说明：WT表示野生型受体，tmt2-1到tmt2-4为四个突变体株系；突变体株系能够降低GhTMT2的表达。

实施例4

利用转基因棉花对GhTMT2基因进行功能验证

具体步骤如下：

GhTMT2转基因株系可溶性糖和葡萄糖含量测定

将转基因纯系材料TO16、TO17、TO19、tmt2-1、tmt2-2、tmt2-3、tmt2-4及阴性对照(NμLl)和野生型材料(WT)九个株系的材料种植于转基因试验田，每个株系各20株，待植株生长至开花期时，分别选取向光侧同一部位的叶片，每个株系4个生物学重复，样品取完后迅速放入液氮中冻存。在实验室条件下用液氮将样品研磨后每份样品称取0.1g，加入1ml蒸馏水，置于水浴锅中80℃下水浴提取30min，期间混匀数次。

将提取好的样品取出冷却至室温，离心后取上清，将上清稀释10倍，以葡萄糖配置梯度标准溶液，将标准溶液和样品稀释液各取100μL，加入硫酸蒽酮溶液(100ml98％硫酸溶液中加入0.2蒽酮)200μL，混匀后将样品至于90℃水浴10min，水浴完成后取200μL加入酶标板中，用酶标仪检测630nm下的吸光值，根据标准曲线换算出可溶性糖含量样品中葡萄糖的含量用葡萄糖测定试剂盒(GAHK-20，Sigma)进行测定，主要原理为葡萄糖被己糖激酶催化生成6-磷酸-葡萄糖，在NAD存在的条件下继续被6-磷酸-葡萄糖脱氢酶催化生成6-磷酸-葡萄糖酸，同时体系中生成NADH，通过测定其在340nm下的特征吸光值可以计算出溶液中葡萄糖的含量，数据结果使用EXCEL软件进行统计分析和差异显著性检测，结果见图9、图10。

与野生型及NμLl比较，超表达GhTMT2可以显著提高可溶性糖的含量，敲除GhTMT2可以显著降低可溶性糖中的葡萄糖糖含量。图9为本发明提供的超表达转基因材料可溶性糖含量及葡萄糖含量分析图；附图标记说明：与野生型比较，本发明的超表达株系相比野生型植株极大的促进了植株可溶性糖及葡萄糖的含量；本发明的超表达株系中阴性分离株系NμLl与野生型植株比较没有显著差异；

图10为本发明提供的突变体转基因材料可溶性糖含量及葡萄糖含量分析图；附图标记说明：与野生型比较，本发明的突变体株系可溶性总糖含量与野生型比没有显著差异，但是突变体中葡萄糖含量均显著低于野生型。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaggggtg ctgcttttgt agccattgct gctacaattg gtaacttttt gcagggatgg 60

gataatgcta ccattgctgg agcaattgtg tacattaaga atgacctcaa tctaggaact 120

agcgttgaag gtctagtggt ggctatgtca ctgataggag caacagctat tacaacatgc 180

tcaggggcta tatcagattg gcttggtcgg cgtccaatgc tgataatgtc ttcaatgctt 240

tattttgtca gtggtttggt aatgttgtgg tcacctaatg tctatatttt gtgcctagcc 300

aggctattag atggatttgg aattggttta gccgtgactc ttgtcccagt ctatatatct 360

gagactgccc catctgagat aaggggattg ttaaatacgt taccacaatt cactggttcc 420

gggggaatgt ttctatctta ttgtatggtt tttgggatgt cattgatgga ctcaccaagt 480

tggaggttga tgcttggggt tctatccatc ccttctctcc tctattttgc ctttacggtt 540

ttttatttgc ctgaatctcc tcggtggctt gtgagtaaag gaagaatgct tgaagctaaa 600

caggttcttc agagattacg tggcagggaa gatgtttcag gagagatggc tttgctggtt 660

gagggccttg gcattggagg tgaaacctct atagaagagt acataatagg tccagctgat 720

gaacttgatg aaagtcagga acccggtgct gataaagaca aaatcagact atatggaccg 780

gaagagggcc tgtcttgggt tgccaagcct gtcgctggac aaagcattct tagtattgcc 840

tctcgccccg gaagcatggt gaaccaaagt atgcccctta tggaccctct tgtgacatta 900

tttggtagtg ttcatgaaaa gcttcccgag acagggagca cgcgtagtat gctttttccg 960

aattttggaa gcatgtttag tacagcagag cctcatgcta gaaatgaaca atgggatgag 1020

gagagcttgc agagagaagg tgaggactat gcatcagatg ctgcaggagg agactcggat 1080

gacaatttgc atagcccatt aatctcacgt caaacaacaa gcttggaaaa ggacatggtt 1140

cccccagctt cccatatcag ttctctaagc atgagacgcc atagcactct tgtgcaagat 1200

gttacagaat cagttggtgg tacagggatt ggaggtggtt ggcagttggc atggaaatgg 1260

tctgagcgag aaggtgaggg tggaaagaag gaaggagggt ttaaaaggat ttatttgcac 1320

gaggagggaa tcccaggatc tcgacgtggc tctcttgtat cacttccagg taatgatatg 1380

cccgcagaag gtgagtttat ccaggcagct gcactagtga gccaacctgc tctttattcc 1440

aaggagctta tggatcagca tcctgttgga ccagcaatgg ttcatccagc tgaaactgcc 1500

tcagaaggac cagtttggac tgctctcctt gacccgggag tcaaacgtgc tttattagtt 1560

gggattggga ttcagattct tcagcagttt tccggcatta atggagttct ctactacact 1620

cctcaaattc ttgaagaggc aggtgttgaa gtgcttcttt caaacttggg ccttggttca 1680

gattctgcat catttcttat tagtgcattt acaaccttgc tgatgctgcc ctgtataggt 1740

gtagccatga aactcatgga tatatcaggc aggaggcggc tgctactcac cacgatcccg 1800

gtgcttatag tgtcactgat cattctagtt tttagtgaac ttgtggattt gggcacggtt 1860

gtgaatgctg ccatctcaac tgcatgtgtt attgtttact tctgctgctt tgtgatgggc 1920

tatggaccaa taccaaatat cctctgctct gagatctttc caacaagggt ccgggggctt 1980

tgtattgcaa tctgtgcttt ggtttattgg atcggagaca tcattgttac ttacacactg 2040

ccagtgatgc tgagttctat aggcctagcg ggcatcttcg ggatatatgc tgttgtatgt 2100

ctgatatcgt gggtgtttgt gttcttgaaa gtaccagaga ccaaaggaat gccacttgaa 2160

gtcattaccg agttcttttc tgttggtgca agacaagctg gtgctacaaa gaatgagtga 2220

<210> 2

<211> 739

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Gly Ala Ala Phe Val Ala Ile Ala Ala Thr Ile Gly Asn Phe

1 5 10 15

Leu Gln Gly Trp Asp Asn Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ile Val Tyr Ile

20 25 30

Lys Asn Asp Leu Asn Leu Gly Thr Ser Val Glu Gly Leu Val Val Ala

35 40 45

Met Ser Leu Ile Gly Ala Thr Ala Ile Thr Thr Cys Ser Gly Ala Ile

50 55 60

Ser Asp Trp Leu Gly Arg Arg Pro Met Leu Ile Met Ser Ser Met Leu

65 70 75 80

Tyr Phe Val Ser Gly Leu Val Met Leu Trp Ser Pro Asn Val Tyr Ile

85 90 95

Leu Cys Leu Ala Arg Leu Leu Asp Gly Phe Gly Ile Gly Leu Ala Val

100 105 110

Thr Leu Val Pro Val Tyr Ile Ser Glu Thr Ala Pro Ser Glu Ile Arg

115 120 125

Gly Leu Leu Asn Thr Leu Pro Gln Phe Thr Gly Ser Gly Gly Met Phe

130 135 140

Leu Ser Tyr Cys Met Val Phe Gly Met Ser Leu Met Asp Ser Pro Ser

145 150 155 160

Trp Arg Leu Met Leu Gly Val Leu Ser Ile Pro Ser Leu Leu Tyr Phe

165 170 175

Ala Phe Thr Val Phe Tyr Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Ser

180 185 190

Lys Gly Arg Met Leu Glu Ala Lys Gln Val Leu Gln Arg Leu Arg Gly

195 200 205

Arg Glu Asp Val Ser Gly Glu Met Ala Leu Leu Val Glu Gly Leu Gly

210 215 220

Ile Gly Gly Glu Thr Ser Ile Glu Glu Tyr Ile Ile Gly Pro Ala Asp

225 230 235 240

Glu Leu Asp Glu Ser Gln Glu Pro Gly Ala Asp Lys Asp Lys Ile Arg

245 250 255

Leu Tyr Gly Pro Glu Glu Gly Leu Ser Trp Val Ala Lys Pro Val Ala

260 265 270

Gly Gln Ser Ile Leu Ser Ile Ala Ser Arg Pro Gly Ser Met Val Asn

275 280 285

Gln Ser Met Pro Leu Met Asp Pro Leu Val Thr Leu Phe Gly Ser Val

290 295 300

His Glu Lys Leu Pro Glu Thr Gly Ser Thr Arg Ser Met Leu Phe Pro

305 310 315 320

Asn Phe Gly Ser Met Phe Ser Thr Ala Glu Pro His Ala Arg Asn Glu

325 330 335

Gln Trp Asp Glu Glu Ser Leu Gln Arg Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Ser

340 345 350

Asp Ala Ala Gly Gly Asp Ser Asp Asp Asn Leu His Ser Pro Leu Ile

355 360 365

Ser Arg Gln Thr Thr Ser Leu Glu Lys Asp Met Val Pro Pro Ala Ser

370 375 380

His Ile Ser Ser Leu Ser Met Arg Arg His Ser Thr Leu Val Gln Asp

385 390 395 400

Val Thr Glu Ser Val Gly Gly Thr Gly Ile Gly Gly Gly Trp Gln Leu

405 410 415

Ala Trp Lys Trp Ser Glu Arg Glu Gly Glu Gly Gly Lys Lys Glu Gly

420 425 430

Gly Phe Lys Arg Ile Tyr Leu His Glu Glu Gly Ile Pro Gly Ser Arg

435 440 445

Arg Gly Ser Leu Val Ser Leu Pro Gly Asn Asp Met Pro Ala Glu Gly

450 455 460

Glu Phe Ile Gln Ala Ala Ala Leu Val Ser Gln Pro Ala Leu Tyr Ser

465 470 475 480

Lys Glu Leu Met Asp Gln His Pro Val Gly Pro Ala Met Val His Pro

485 490 495

Ala Glu Thr Ala Ser Glu Gly Pro Val Trp Thr Ala Leu Leu Asp Pro

500 505 510

Gly Val Lys Arg Ala Leu Leu Val Gly Ile Gly Ile Gln Ile Leu Gln

515 520 525

Gln Phe Ser Gly Ile Asn Gly Val Leu Tyr Tyr Thr Pro Gln Ile Leu

530 535 540

Glu Glu Ala Gly Val Glu Val Leu Leu Ser Asn Leu Gly Leu Gly Ser

545 550 555 560

Asp Ser Ala Ser Phe Leu Ile Ser Ala Phe Thr Thr Leu Leu Met Leu

565 570 575

Pro Cys Ile Gly Val Ala Met Lys Leu Met Asp Ile Ser Gly Arg Arg

580 585 590

Arg Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Val Leu Ile Val Ser Leu Ile Ile

595 600 605

Leu Val Phe Ser Glu Leu Val Asp Leu Gly Thr Val Val Asn Ala Ala

610 615 620

Ile Ser Thr Ala Cys Val Ile Val Tyr Phe Cys Cys Phe Val Met Gly

625 630 635 640

Tyr Gly Pro Ile Pro Asn Ile Leu Cys Ser Glu Ile Phe Pro Thr Arg

645 650 655

Val Arg Gly Leu Cys Ile Ala Ile Cys Ala Leu Val Tyr Trp Ile Gly

660 665 670

Asp Ile Ile Val Thr Tyr Thr Leu Pro Val Met Leu Ser Ser Ile Gly

675 680 685

Leu Ala Gly Ile Phe Gly Ile Tyr Ala Val Val Cys Leu Ile Ser Trp

690 695 700

Val Phe Val Phe Leu Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Met Pro Leu Glu

705 710 715 720

Val Ile Thr Glu Phe Phe Ser Val Gly Ala Arg Gln Ala Gly Ala Thr

725 730 735

Lys Asn Glu

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catgaggggt gctgcttttg tag 53

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcactcattc tttgtagcac cag 53

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccactatcct tcgcaagacc ct 22

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acaatcccct tatctcagat gttttagagc tagaaata 38

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atctgagata aggggattgt tgcaccagcc gggaat 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agacagggag cacgcgtagt tgcaccagcc gggaat 36

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctagctct aaaacagaca gggagcacgc gtagt 35

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcatcaga tgggcaaaca aagcaccagt ggtctag 37

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagcatcaga tgggcaaaca aa 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgtgccactc caaagacatc ag 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgacgtaag ggatgacgc 19

Claims

1.超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在促进棉花叶片中可溶性糖积累中的应用。

2.超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在促进棉花叶片中葡萄糖积累中的应用。

3.敲除核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在降低棉花叶片中葡萄糖含量中的应用。

4.包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的pK2GW7.0载体在促进棉花叶片中可溶性糖积累中的应用。

5.包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因的农杆菌在促进棉花叶片中可溶性糖积累中的应用。

6.超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTMT2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTMT2蛋白在培育叶片可溶性糖和/或葡萄糖积累量高的棉花中的应用。