CN116694659B - GhTPPA2基因在促进植物叶片中可溶性糖和淀粉积累的应用 - Google Patents

GhTPPA2基因在促进植物叶片中可溶性糖和淀粉积累的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体公开了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因在促进植物叶片中可溶性糖积累方面的用途，以及在淀粉积累方面的用途。通过转基因方法将超表达GhTPPA2基因的遗传载体导入到烟草、棉花等植物中，可使烟草、棉花等植物叶片中可溶性糖含量和淀粉含量获得显著提升，从而显著提高烟草、棉花等植物对干旱、寒冷、盐碱等非生物逆境的抗性，显著提高作物的产量和经济效益，因而具有广泛的应用价值。

Description

GhTPPA2基因在促进植物叶片中可溶性糖和淀粉积累的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及GhTPPA2基因在促进植物叶片中可溶性糖和淀粉积累方面的用途。
背景技术
可溶性糖是指葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖等易溶于水的糖。可溶性糖在植物的生命周期中具有重要作用，它不仅为植物的生长发育提供能量和代谢中间产物，而且具有信号功能。可溶性糖还是植物体内重要的渗透调节物质，与植物的抗逆性(如抗寒性、抗旱性等)密切相关。
海藻糖(Trehalose，简称为Tre)是一种典型的应急代谢物，能够在高温、高寒或干旱等恶劣条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。6-磷酸海藻糖(Trehalose-6-phosphate，简称为Tre6P)可作为细胞内可利用糖水平的指示信号，参与糖稳态调节。改变植物内源Tre代谢水平可以优化源库关系，对作物产量提升展现出巨大潜力。6-磷酸海藻糖磷酸酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase，亦称为海藻糖-6-磷酸磷酸酶，简称为TPP)可将Tre6P水解为Tre。对水稻、玉米或拟南芥等研究表明过表达TPP基因可显著提高植株对干旱、寒冷或盐胁迫的耐受性并增加作物产量。
在陆地棉中具有TPP结构域的基因共有50个，其中TPS(Trehalose-6-phosphatesynthase，6-磷酸海藻糖合成酶，简称TPS)基因家族有26个成员，TPP基因家族有24个成员。
经检索，没有发现有关棉花TPP基因促进可溶性糖和淀粉在植物叶片中积累方面作用的报道。
发明内容
本发明人在对棉花TPP基因家族24个成员的研究中意外发现，棉花TPP基因家族的GhTPPA2基因在棉花叶片和棉铃中优势表达；进一步研究发现该基因促进可溶性糖和淀粉在叶片中的积累，从而提高植物的非生物逆境抗性，尤其是干旱耐受性及逆境胁迫后的生长恢复有很大的作用。本发明是在上述意外发现的基础上完成的。
本发明目的在于提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTPPA2蛋白在促进植物叶片中可溶性糖积累或/和淀粉积累上的应用。
上述应用中所述的植物是指棉花、烟草、水稻或玉米等。
本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTPPA2蛋白在培育叶片中可溶性糖含量高或/和淀粉含量高的植物上的应用。
本发明还提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因或氨基酸序列如SEQID NO.2所示的GhTPPA2蛋白在培育抗逆性强的植物上的应用。
上述应用中所述的植物是指棉花、烟草、水稻或玉米等。
所述的抗逆性是指耐旱性、耐寒性或耐盐性等。
本发明还提供含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因的超表达载体在促进植物叶片中可溶性糖积累或/和淀粉积累上的应用。
所述的超表达载体是指pCambia2300、pCambia2301、pBI121、pCAMBIA1300或pCAMBIA1301等。
上述应用中所述的植物是指棉花、烟草、水稻或玉米等。
本发明还提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因的农杆菌在促进植物叶片中可溶性糖积累或/和淀粉积累的应用。
上述应用中所述的植物是指棉花、烟草、水稻或玉米等。
本发明所述的应用，首先将从棉花中克隆出来的GhTPPA2基因构建到超表达载体上，再借助农杆菌遗传转化到烟草或棉花等植物中。
本发明具有的优点和有益技术效果：本发明超表达棉花GhTPPA2基因可使棉花、烟草等植物叶片中可溶性糖含量和淀粉含量获得显著提升，从而显著提高棉花、烟草等植物对干旱、寒冷、盐碱等非生物逆境的抗性，为培育耐旱、耐寒、耐盐碱等抗逆性强的植物新品种提供了新途径；同时，可溶性糖和淀粉是光合作用主要产物，还可以作为重要的能源物质，显著提高作物的产量和经济效益，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1.GhTPPA2蛋白亚细胞定位荧光照片。
图2.超表达GhTPPA2基因烟草的分子检测电泳图谱；其中M为Marker；“+”为载体阳性对照；“-”为野生型受体材料NC89；1-12为转基因材料。
图3.超表达GhTPPA2基因烟草的分子检测电泳图谱；其中M表示Marker；“+”为载体阳性对照；“-”为野生型受体材料NC89；1-4为转基因材料。
图4.超表达GhTPPA2基因烟草T0代植株qRT-PCR定量表达量检测柱形图；1为野生型受体材料NC89；2、3、4、5分别是指转基因材料TPPOE-1、TPPOE-2、TPPOE-3和TPPOE-4。
图5.本发明超表达GhTPPA2基因的T1代烟草植株叶片中可溶性糖含量柱形图；其中1是指野生型材料NC89；2是指转基因材料TPPOE-4。
图6.本发明超表达GhTPPA2基因的T1代烟草植株叶片中淀粉含量柱形图；其中1是指野生型材料NC89；2是指转基因材料TPPOE-4。
具体实施方式
如无特殊说明，以下实施例中所用试剂均为常规化学试剂，均可于市场上购买。如无特殊说明，以下实施例中所述方法均为本领域技术人员熟知的常规实验方法，或按照产品说明书操作。
通过Trehalose_PPase结构域(PF02358)在陆地棉(Gossypium hirsutum)中检索得到棉花TPP基因家族(简写为：GhTPP)中有24个基因。通过在线蛋白理化性质预测(https://web.expasy.org/)和在线蛋白结构域预测等(http://smart.embl- heidelberg.de/)发现GhTPPA基因在陆地棉中共有4个同源基因。同时，通过对陆地棉TPP基因家族成员在各组织中相对表达水平由pheatmap R包进行可视化分析发现，GhTPPA同源基因中的一个基因在叶片和棉铃中优势表达，将其命名为：GhTPPA2。
参考棉花基因组序列，设计带有15bp载体同源序列的In-fusion连接引物对该GhTPPA2基因的CDS全长进行PCR扩增，所述引物序列如下：
GhTPPA2-F:
5’-ATTTGGAGAGGACAGGGTACCATGGACCTGAAATCCAATCACAC-3’(SEQ ID NO.3)，
GhTPPA2-R：5’-ACCTTCACCGGATCCGAGAACACTTGTCTTCTTCC-3’(SEQ ID NO.4)。
对克隆产物进行无缝克隆重组，并连接到带有RFP标签的pCambia2300质粒载体上，获得含有GhTPPA2基因的质粒表达载体。
测序结果显示，GhTPPA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例1GhTPPA2基因的克隆及组织表达鉴定
(1)RNA提取与cDNA合成
按照产品说明书所述方法用植物RNA提取试剂盒(购于北京天根公司)从陆地棉品种TM-1(中国农业科学院生物技术研究所保存)叶片中提取总RNA，然后用逆转录试剂盒(HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit，购自南京诺唯赞公司)以总RNA为模板合成cDNA。将合成所得的cDNA保存于-20℃，备用。
(2)GhTPPA2基因的筛选和鉴定
陆地棉基因组中共有24个GhTPP成员，根据转录组数据，不同GhTPP成员存在明显的组织表达差异，其中来自At亚基因组的GhTPPA2(Gh_A12G223300.1)在叶片组织中优势表达，两者在序列上高度一致，另外，GhTPPA2在棉铃发育过程中具有更高的表达水平，所以将GhTPPA2作为候选基因。
以步骤(1)中提取的cDNA为模板，以GhTPPAGFP-F和GhTPPAGFP-R为引物进行PCR扩增。所述引物为：
GhTPPAGFP-F：5’-acgggggactcttgaccatggggATGGACCTGAAATCCAATCACAC-3’(SEQID NO.5)；
GhTPPAGFP-R：5’-tactagtcagatctaccatgggGAGAACACTTGTCTTCTTCCAATTCA-3’(SEQ IDNO.6)。
其中PCR反应体系(50μL)：高保真Mix(南京诺唯赞公司)25μL，cDNA模板1μL，无缝克隆正反向引物各1μL，ddH2O 22μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s，循环30次；72℃终延伸1min。将所得PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳30min，回收PCR扩增产物。将PCR扩增产物经过同源重组连接至NcoⅠ单酶切的pCambia2300-CaMV35s::eGFP亚细胞定位载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Fast-T1(南京诺唯赞公司)过夜培养，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆子进行测序，获重组载体(CaMV35S::GhTPPA2-eGFP)，其中GhTPPA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将亚细胞定位重组载体电击转化农杆菌感受态细胞GV3101(购于北京博迈德公司)，注射本氏烟草叶片，48-72h后，在激光共聚焦显微镜下观察叶片组织侵染部位，在650nm激发波长下，叶绿体呈现自发红色荧光；在488nm激发波长下，能够检测到eGFP的绿色荧光信号。
结果(见图1)在亚细胞定位空载体对照组(35S::GFP)中，能够观察到eGFP的绿色荧光信号分布在细胞核，细胞膜和细胞质各处；而在目的基因重组载体实验组(35S::GhTPPA2-eGFP)中，能够观察到融合蛋白的绿色荧光被定位在烟草表皮细胞的叶绿体中，绿色和红色荧光亮点在叶绿体中重叠为黄色，因而可以确定GhTPPA2蛋白亚细胞定位于叶绿体中。
实施例2 GhTPPA2基因超表达载体的构建
(1)超表达载体的构建
将GhTPPA2的CDS序列与REP红色荧光标签融合表达，中间连接一段T2A自剪切多肽序列。具体方法为：以实施例1中克隆了GhTPPA2基因的重组载体为模板，设计去终止子的扩增引物(反向引物去除3’端3个碱基序列)与RFP红色荧光标签(见SEQ ID NO.7)使用重叠延伸PCR方法扩增，引物设计中间连接一段T2A自剪切多肽序列(见SEQ ID NO.8)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。并将融合基因通过无缝克隆连接到pCambia2300-CaMV35S(载体抗性为卡那霉素，KpnⅠ/SalⅠ双酶切位点)载体使用DNA无缝克隆试剂盒(HDCloning Kit，购自Takara)，50℃连接反应15min，所得连接产物转化感受态细胞E.coliHST08 Premium Competent Cells(Takara)，挑取克隆子，经过菌液PCR鉴定阳性，送至北京擎科生物公司进行测序验证。验证正确的克隆子扩大培养后提取质粒，获得超表达质粒载体，命名为：pCambia2300-CaMV35S：：GhTPPA2-T2A-RFP。
(2)利用重组载体转化农杆菌
用电击转化法将构建的pCambia2300-CaMV35S：：GhTPPA2-T2A-RFP超表达质粒载体转化农杆菌菌株GV3101，挑取单菌落进行PCR鉴定(设计的引物JDTPP-F位于GhTPPA2基因上，引物JDRED-R位于RFP序列上)；所述的鉴定引物为：
JDTPP-F：5’-CGCACATGGATGGCTAAGTAT-3’(SEQ ID NO.9)；
JDRED-R：5’-ATGAACTCGGTGATGACGTTC-3’(SEQ ID NO.10)。
结果所得PCR扩增产物大小为968bp。将鉴定正确的阳性克隆子在含有100mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中扩大培养，并加入终浓度30％甘油，于-80℃保存。
实施例3含有GhTPPA2-T2A-RFP融合基因超表达载体的遗传转化试验
按照如下方法进行：
(一)农杆菌介导的烟草遗传转化
(1)烟草叶盘预培养：在超净工作台中，将无菌种植的NC89烟草苗培养至4-6周龄，选取厚实的较大叶片为取材部位，用无菌手术刀切除叶尖和叶基部，避开主叶脉切成0.5-1cm2见方的小块，置于预培养固体培养基中，边缘压实，26℃黑暗条件下培养2天，得烟草叶盘。
(2)农杆菌扩大培养：实施例2中所得的含有GhTPPA2-T2A-RFP融合基因的农杆菌菌液50μL，加入50mL LB液体培养基(100mg/L kan+50mg/LRif)于灭菌的三角瓶内，在28℃、200rpm摇床中过夜培养至OD600接近0.8左右。
(3)菌液富集重悬：将步骤(2)中培养好的农杆菌菌液在常温、5000rpm条件下离心10min，弃上清，收集菌体，用MMA稀释培养基重悬稀释至OD600接近0.4左右。
(4)侵染烟草叶盘和共培养：将步骤(1)中预培养的烟草叶盘取出并将叶盘完全浸入步骤(3)的重悬菌液中侵染30min，取出，用灭菌滤纸吸干叶盘上残留菌液，然后摆放在共培养固体培养基上，在叶盘上下均覆盖一张无菌滤纸，滤纸边缘压实；用封口膜将平板密封好，于28℃、黑暗培养箱中共培养3天。
(5)选择培养：将步骤(4)中共培养所得的外植体转移到选择培养基上，叶盘边缘压入培养基中。在26℃、光暗周期16h L/8h D条件下培养2-3周，每周更换到新的选择培养基中。
(6)生根培养：叶盘边缘愈伤组织逐渐分化出再生幼芽，待再生芽长到约3cm左右，用镊子可以轻松取下边缘的再生幼芽，插入诱导生根培养基中生根培养2-3周。
(7)炼苗、移栽：再生苗长出不定根，将培养瓶封口膜打开，使幼苗适应外界湿度，2天后将再生苗从培养瓶中取出，用水冲去根部附着的残留培养基，将根部浸没于自来水中，室温25℃自然光下培养炼苗5天。按照1:2比例混合栽培土和蛭石并用水润透，经过1周炼苗的抗性再生苗移栽入育苗盘中盖上透明罩保湿，一周内不再浇水使根部自然向下生长。待幼苗完全成活生长到10cm以上，将幼苗移入大盆自然生长。结果共获得12株再生幼苗。
本实施例中所使用培养基的配方
农杆菌菌液扩大培养：50ml LB(高压灭菌)液体培养基，500μL MES(10mM)，20μLAS(40μM)；重悬培养基MMA配制(100mL)10mM MgCl2·6H2O100mL，MES(10mM)母液1mL，AS(0.1mM)母液200μL；MgCl2·6H2O母液：203.30g/mol 200mL—0.4066g，高压灭菌121℃，20min；AS母液(乙酰丁香酮)：0.1M溶于DMSO，0.1μm滤膜过滤除菌；MES母液：1M(pH 5.6)，213.2g/mol 50mL—10.66g；
预培养培养基(1L)：4.43g MS519粉末(货号：M519，Phytotechnology)、30g葡萄糖溶于1L蒸馏水，用KOH溶液(1M)调节pH至5.8，加入2.8gphytagel粉末(货号：P8169，Sigma)，115℃高压蒸汽灭菌15分钟，待冷却至80℃以下，加入终浓度2mg/L细胞分裂素6-BA和0.5mg/L生长素IAA；
共培养培养基(1L)：(1)预培养培养基+终浓度100μM的AS；
选择培养基(1L)：(1)预培养培养基+终浓度500mg/L羧苄青霉素(Carbenicillin，Car)+200mg/L Kan；
诱导生根培养基(1L)：2.215g MS519粉末、15g蔗糖溶于1L蒸馏水，用KOH溶液(1M)调节pH至6.0，加入2.8g phytagel粉末，115℃高压蒸汽灭菌15分钟，待冷却至80℃以下，加入终浓度0.5mg/L生长素IAA、500mg/L头孢霉素(Cephalosporin，Cep)、200mg/L Kan。
(二)转基因植株鉴定
(1)转基因烟草植株基因组阳性检测
利用植物基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根公司)提取上述步骤(一)中所得的转基因烟草叶片的基因组DNA，以正向引物JDTPPA-F(见SEQ ID NO.9)和反向引物JDRED-R(见SEQ ID NO.10)为引物进行PCR扩增，以检测是否相应的GhTPPA2-T2A-RFP融合基因整合进入受体材料基因组。
结果(见图2)在12株再生烟草植株中第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12的转基因材料PCR能扩增出对应的条带，阳性植株出现的条带大小为968bp，而野生型没有条带，共得到10株转基因烟草。
(2)转基因烟草植株表达阳性检测
为进行RT-PCR检测相应的表达盒是否能够转录出目的mRNA，并测序验证是否SNP突变。取步骤(1)中所得10株转基因烟草叶片分别提取总RNA并反转录成cDNA。以所得cDNA为底物，以正向引物GhTPPAGFP-F1和反向引物DsRed2为引物进行RT-PCR扩增过表达基因全长，其中所述的引物为：
GhTPPAGFP-F1：5’-ATGGACCTGAAATCCAATCACAC-3’(SEQ ID NO.11)；
DsRed2-R：5’-CTACAGGAACAGGTGGTGGC-3’(SEQ ID NO.12)。
结果(见图3)从上述(1)中所得的10株GhTPPA2转基因烟草植株中，仅获得4株阳性表达的转基因植株。
收取阳性表达植株的T1代种子，30％次氯酸钠溶液杀菌10min，期间不断摇动，无菌水漂洗5次，将种子铺设于无菌1/2MS抗性培养基(100mg/L)表面。暗处放置2天，转移至光照培养箱(光照强度为3000Lux，27℃，16h光照/8h黑暗)中培养一周后，将长出5-6片真叶的T1代阳性幼苗移植入盆，少量取叶片组织经过基因组PCR扩增和RT-PCR扩增皆得到1887bp全长片段，说明获得了稳定遗传的转基因植株。
(3)转基因植株表达量检测
取上述T1代转基因烟草主茎倒一叶提取总RNA并反转录成cDNA。使用BIO-RAD的实时PCR检测系统检测外源GhTPPA2基因的相对表达水平，
qGhTPPA-F：5’-GGCATCCACTCTGCTTTGAT-3’(SEQ ID NO.13)，
qGhTPPA-R：5’-GAGGGGTACTTGAGCATCCA-3’(SEQ ID NO.14)。
按照通用型高灵敏度染料法定量PCR检测试剂盒(南京诺唯赞公司)说明书将cDNA模板、基因特异引物和qPCR Mix混合，每个基因表达都用肌动蛋白基因NtActin标准化，
qNtactin-F：5’-GGATGCATATGTTGGTGACG-3’(SEQ ID NO.15)，
qNtactin-R：5’-TTTGGATTCAAGGGTGCTTC-3’(SEQ ID NO.16)。
执行3个实验重复，3个样本重复。荧光定量PCR反应程序：预变性95℃3分钟；然后是40个循环反应，95℃5秒，60℃10秒；最后在熔化曲线采集阶段是95℃15秒，60℃1分钟，97℃15秒。
结果(见图4)4个超表达株系高水平表达外源GhTPPA2基因，其中TPPAOE-4表达水平最高，其次为TPPAOE-2，而野生型材料没有任何表达。说明TPPAOE-4高水平表达了外源GhTPPA2基因。
实施例4GhTPPA2基因超表达株系叶片可溶性糖含量测定试验
将实施例3中所得转基因材料TPPAOE-4及相应的野生型材料NC89种植于中国农科院生物技术研究所温室，每个株系各种植10株，待植株长至15片真叶时，分别选取向光侧同一部位叶片，每个株系5个重复，样品取完于冰上保存，然后称取约0.1g样品放置于烘箱100℃约20min杀青，接着在75℃烘箱中过夜烘干至恒重，常温研磨粉碎，12000rpm离心2min富集于管底。加入蒸馏水1mL振荡5min匀浆，沸水浴10min(盖紧，防止飞溅和蒸发)，冷却后，常温、10000g下离心10min，取上清液100μL置于试管中，加入ddH2O 900μL稀释10倍；酶标仪预热，调节波长于620nm，ddH2O调零；水浴锅调节至95℃；标准品配置：10mg无水葡萄糖溶解于1mL蒸馏水配置成10mg/mL母液，将标准母液用蒸馏水稀释至0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3mg/mL浓度梯度。
冷水浴中按照如下所示加样，充分混匀，95℃水浴10min(在1.5mL EP管中进行，盖紧防止水分蒸发)。空白管：ddH2O 80μL，0.2％蒽酮试剂(浓硫酸配置)220μL；标准管：标准溶液(6个)40μL，ddH2O 40μL，蒽酮试剂220μL；测定管：样品溶液40μL，ddH2O 40μL，蒽酮试剂220μL。
自然冷却至室温后，吸取200μL转移至96孔酶标板，于620nm处测定吸光值，分别记为A空白、A标准、A测定，ΔA标准＝A标准-A空白，ΔA测定＝A测定-A空白；建立标准曲线：以浓度(x)为横坐标，吸光值ΔA标准(y)为纵坐标建立标准曲线。根据y＝k*x+b线性回归方程，将ΔA测定代入公式计算样本浓度x(mg/mL)；可溶性糖含量计算：可溶性糖(mg/g)＝10*x÷W，W样本质量(g)。数据结果使用EXCEL软件进行统计分析和差异显著性检测。
结果(见图5)GhTPPA2基因超表达株系TPPAOE-4叶片的可溶性总糖含量为12.84±1.28mg/g，而野生型材料的可溶性总糖含量为9.18±1.33mg/g，即转基因株系叶片的可溶性总糖含量显著高于野生型材料，说明GhTPPA2基因超表达显著促进了植株叶片可溶性糖的积累。
实施例5超表达GhTPPA2基因株系叶片的淀粉含量测定试验
按照如下方法进行：
用酸水解-硫酸蒽酮显色定量法测定淀粉含量。向实施例4中可溶性糖提取后的沉淀中加入80％乙醇漂洗两次，室温开盖放置5分钟使乙醇挥发，向沉淀中加入300μL双蒸水，振荡混匀后放入沸水浴15min；冷却后，加入1％高氯酸600μL，常温水解15min，期间振荡3～5次；冷却后，在8000g、常温条件下离心15min；吸取50μL上清液加双蒸水稀释至1000μL，稀释20倍；标准样品配置：无水葡萄糖10mg溶解至1mL双蒸水中配制成10mg/mL葡萄糖标准液。将标准母液进行稀释，得到0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL标准溶液，设置为标准曲线的的8个标准点；酶标仪预热，调节波长于620nm处，双蒸水调零。
冷水浴中按照如下所示加样，充分混匀，95℃水浴10min(在1.5mL EP管中进行，盖紧防止水分蒸发)。空白管：ddH2O 50μL，0.2％蒽酮试剂(用浓硫酸配置)250μL；标准管：50μL标准溶液(8个)，0.2％蒽酮试剂250μL；测定管：样品溶液(已稀释)50μL，0.2％蒽酮试剂250μL。
自然冷却，吸取200μL于96孔酶标板中，在620nm波长下测量吸光度值。绘制标准曲线。按照样本质量计算：淀粉含量(mg/g)＝0.81*x÷W*F，W为样本质量(g)，F为样品稀释倍数(20)。数据结果使用EXCEL软件进行统计分析和差异显著性检测。
结果(见图6)GhTPPA2基因超表达株系TPPAOE-4叶片的淀粉含量为28.90±1.85mg/g，而野生型材料NC89叶片的淀粉含量仅为22.6±1.17mg/g，即GhTPPA2转基因株系叶片的淀粉含量显著高于野生型材料。说明本发明超表达GhTPPA2基因促进了植株叶片中淀粉含量的积累。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来讲，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTPPA2蛋白在促进植物叶片中淀粉积累上的应用；其中所述的植物是指棉花或烟草。
2.超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhTPPA2蛋白在培育叶片中淀粉含量高的植物上的应用；其中所述的植物是指棉花或烟草。
3.含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因的超表达载体在促进植物叶片中淀粉积累上的应用；其中所述的植物是指棉花或烟草。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的超表达载体是指pCambia2300、pCambia2301、pBI121、pCAMBIA1300或pCAMBIA1301。
5.含有超表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhTPPA2基因的农杆菌在促进植物叶片中淀粉积累的应用；其中所述的植物是指棉花或烟草。
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CN111073897A (zh) * 2020-01-14 2020-04-28 华中农业大学 GhTMT2基因在调节棉花中可溶性糖积累的应用

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Genome-Wide Identification of Cotton (Gossypium spp.) Trehalose-6-Phosphate Phosphatase (TPP) Gene Family Members and the Role of GhTPP22 in the Response to Drought Stress;Weipeng Wang等;Plants;第11卷;第4页表1，第9页图7，第10页图8c *

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