ES2778273T3 - Proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias y su uso para incrementar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de plantas - Google Patents

Abstract

Un vector o elemento genético móvil, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, caracterizado porque la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria es específica para sacarosa, en el que la especificidad de la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para sacarosa es 5 veces mayor con respecto a un monosacárido y en el que la molécula de ácido nucleico comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo: a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que presenta una identidad de al menos 80% a la secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; b) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que es complementaria a una de las secuencias de nucleótido de acuerdo con a); c) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácido presenta una identidad de al menos 80% a la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias y su uso para incrementar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de plantas

La presente invención se encuentra en el campo de la producción industrial de azúcar de plantas útiles y se refiere al incremento del rendimiento de sacarosa en el cultivo agrícola de plantas útiles. En particular, la invención se refiere a proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias, en particular a proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias, y a los ácidos nucleicos que las codifican así como a su uso para elevar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de plantas útiles.

Azúcar es por una parte el término general para todos los mono- y disacáridos de sabor dulce, y por otra parte también la designación usual en el comercio para el disacárido sacarosa. Sacarosa es el azúcar común para el hogar o cristalina, y también se denomina sucrosa. La sacarosa es un dímero de respectivamente una molécula de a-D-glucosa y p-D-fructosa, las cuales están enlazadas una con otra por vía de un enlacea,p-1,2-glucósido.

La sacarosa es formada en las plantas por medio de la fotosíntesis. La biosíntesis de la sacarosa se efectúa en el citoplasma de las células vegetales. Para este propósito, los dos fosfatos de triosa gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiacetofosfato que resultan como beneficio neto en la asimilación de carbono de la fotosíntesis (ciclo Calvin) se exportan del cloroplasto al citosol. En el citosol de la célula vegetal se forman a partir de los fosfatos de triosa los monosacáridos UDP-glucosa y fructosa-6-fosfato. Para este propósito primero se forma fructosa-1,6-bifosfato mediante una reacción de condensación entre gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiacetofosfato. Luego fructosa-1,6-bifosfato se transforma en fructosa-6-fosfato mediante desfosforilado. A partir de fructosa-6-fosfato es posible mediante isomerización también formar glucosa-6-fosfato, que después de una reisomerización previa a glucosa-1-fosfato reacciona con uridintrifosfato (UTP) en uridindifosfato-glucosa (UDP-glucosa). La siguiente condensación de UDP-glucosa y fructosa-6-fosfato en sacarosa-6-fosfato es catalizada por la enzima sacarosa-fosfato-sintasa. La energía necesaria para esto se proporciona mediante la escisión de uridindifosfato (UDP). Finalmente el residuo de fosfato de sacarosa-6-fosfato es escindido en una reacción irreversible mediante la enzima sacarosa-fosfatofosfatasa, de manera que se produce sacarosa.

La sacarosa es un disacárido no reductor y por este motivo el azúcar de transporte más importante en las plantas. La sacarosa se sintetiza nuevamente en las hojas de las plantas y se transporta por vía del floema a sus órganos de acopio, en donde se acumula como nutriente y fuente de energía en las vacuolas de las células vegetales existentes allí.

Para la producción industrial de sacarosa tienen importancia ante todo la remolacha azucarera (Beta vulgaris subesp. vulgaris), la caña de azúcar (Saccharum officinarum) y la palma sacarina (Arenga pinnata, sin.: Arenga saccharifera Labil., predominantemente en Indonesia). En menores cantidades la sacarosa también se obtiene de la savia del arce sacarino (Acer saccharum). Estas plantas se usan para la producción de sacarosa debido a su contenido extraordinariamente elevado de sacarosa.

En la caña de azúcar se encuentran azúcares - predominantemente sacarosa - con una proporción de por lo general 10 a 20 % en la médula de la planta (su órgano acopiador de sacarosa). El azúcar de caña se produce mediante cristalización y refinación de la savia vegetal obtenida mediante estrujado.

La remolacha azucarera es una planta bienal, la cual en el primer año acopia una reserva de azúcar en el cuerpo de la remolacha, la cual en el segundo año le sirve de nutriente a la planta floreciente. La producción de azúcar por lo general se efectúa de trozos de la remolacha azucarera en un proceso de extracción con agua. Después de esto el extracto se puede mezclar con óxido de calcio, para precipitar los ácidos vegetales como el ácido oxálico y el ácido tartárico y las albúminas. El excedente de cal se segrega mediante la introducción de dióxido de carbono. Mediante la siguiente evaporación al vacío del agua de la solución de azúcar se obtiene una solución espesa. El azúcar que cristaliza se separa del jarabe de color ocre remanente mediante centrifugado. El residuo, la melaza, se usa como forraje o se usa para la fermentación alcohólica. Una purificación del azúcar (refinación) se efectúa mediante recristalización, fltrado y mediante la concentración por evaporación al vacío.

Mediante décadas de esfuerzos en el cultivo de plantas acopiadoras de azúcar fue posible lograr considerables incrementos en el rendimiento del órgano acopiador de sacarosa y en la concentración de sacarosa. Por ejemplo, en el caso de los tipos de remolacha que se cultivan actualmente para la producción de azúcar, la concentración de sacarosa del cuerpo de la remolacha se encuentra en 15 a 20 % en peso con relación al peso fresco del cuerpo de la remolacha. No obstante, las concentraciones de sacarosa logradas todavía no son satisfactorias.

Por lo tanto, la presente invención tuvo por objeto proporcionar plantas con una mayor concentración de sacarosa, y encontrar procedimientos con los que se puede incrementar la concentración de sacarosa de las plantas, en particular de caña de azúcar y remolachas azucareras.

En la solicitud internacional publicada con el n.° WO 2010/072210 A1 se revela un procedimiento para elevar el rendimiento de sacarosa en el cultivo agrícola de remolachas azucareras. En el procedimiento se usan plantas de remolacha azucarera o caña de azúcar cuya dotación genética se dirige a la reducción de la actividad enzimática de una invertasa. Para este propósito, un ácido nucleico que es adecuado para reducir la actividad enzimática de una invertasa en una célula vegetal se usa para formar un órgano de acopio de sacarosa de una planta en el cual se incrementa la concentración de sacarosa en comparación con un órgano de acopio de sacarosa de control no modificado del mismo genotipo en un estado de desarrollo similar.

Las vacuolas vegetales desempeñan un papel central en el acopio a largo y corto plazo de los azúcares, puesto que como orgánulo, la vacuola ocupa un volumen de aproximadamente 90% en una célula vegetal fotosintéticamente activa (Martinola, E. et al. (2007) “Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism”, J. Exp. Bot. 58: 83-102). Por este motivo, ya en virtud de su tamaño las vacuolas son de enorme importancia para el acopio de azúcares (Neuhaus, H.E. (2007) “Transport of primary metabolites across the plant vacuolar membrane”, FEBS Lett.

581: 2223-2226). Los tejidos de acopio como la raíz principal de la remolacha azucarera (Beta vulgaris) y la médula de la caña de azúcar (Saccharum officinarum) concentran grandes cantidades de sacarosa en las vacuolas de las células de sus órganos de acopio, para poderlas usar como fuente de energía para su metabolismo vegetal.

En diferentes plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas como Nedicago (n.° de identificación AC131026), Vitis vinifera (n.° de identificación AAX47312) y arroz (Oryza sativa; n.° de identificación Os02g13560) se descubrieron proteínas que son responsables del transporte de azúcar del citoplasma de la célula vegetal a sus vacuolas. En la planta Arabidopsis se identificó un gen, cuyo producto de proteína es un transportador de azúcar que se localiza en la membrana de la vacuola de células fotosintéticamente activas y puede importar glucosa del citosol a la vacuola (Wormit, A. et al. (2006) “Molecular identificacation and physiological characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved invacuolar sugar transport”, Plant Cell 18: 3476-3490). Esta proteína transportadora calificada como Transportador de Monosacárido Tonoplastidario (TMT) se localiza en la membrana de la vacuola, el tonoplasto. La proteína Transportadora de Monosacárido Tonoplastidaria (TMT) comprende tres isoformas en Arabidopsis thaliana, las cuales se designan como AtTMTI, AtTMT2 y AtTMT3. Los genes para AtTMTI y AtTMT2 tienen un patrón de expresión específico del tipo histológico y celular, mientras que el gen AtTMT3 solo se expresa muy débilmente. A través de eliminaciones de gen TMT se pudo demostrar que las plantas así modificadas acopian en sus vacuolas notablemente menos glucosa y fructosa en comparación con las plantas de tipo salvaje. Sin embargo, en lo referente al acopio de sacarosa no fue posible comprobar diferencias entre las plantas de tipo salvaje y las eliminaciones de gen TMT.

El Transportador de Monosacárido Tonoplastidario (TMT) de Arabidopsis thaliana se caracterizó en forma electrofisiológica como antiporter de glucosa y sacarosa estimulado por protones, el cual transporta glucosa y sacarosa con especificidad aproximadamente igual a través de la membrana de la vacuola (Schulz, A. et al. (2011) “Proton-driven sucrose symport and antiporte are provided by the vacuolar transporters SUC4 and TMT1/2”, The Plant Journal 68: 129-136). En el mismo artículo también la proteína transportadora de sacarosa SUC4 de Arabidopsis thaliana se caracteriza como simporter de protones/sacarosa, el cual igualmente se supone esta localizado en la membrana de la vacuola.

En la solicitud internacional publicada con el número WO 2011/120549 A1 se revela que la sobreexpresión del Transportador de Monosacárido Tonoplastidario AtTMT1 incrementa en plantas la producción de semillas o se incrementa el contenido de proteína y aceite de las semillas o se puede promover el crecimiento prematuro de plantas monocotiledoneas o dicotiledoneas. Sin embargo no se revela una concentración de sacarosa en un órgano acopiador.

Ante este trasfondo, el problema en que se basa la presente invención se solucionó mediante la identificación de las proteínas responsables de la importación de azúcar a la vacuola de células de la raíz pivotante de remolachas azucareras, en particular de la proteína responsable de la importación de sacarosa a las vacuolas de las células de raíz pivotante que es específica para la sacarosa. Con la identificación de estas proteínas, en particular con la identificación de esta primera proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria específica para sacarosa y de las secuencias de nucleótido que codifican para estas proteínas se proporcionan procedimientos de cultivo y/o genética molecular para aumentar la concentración de sacarosa en plantas y por consiguiente se proporcionan también plantas con una mayor concentración de sacarosa.

De acuerdo con un primer aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico la cual codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria. Preferiblemente la molécula de ácido nucleico codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria que es específica para sacarosa. A continuación, una proteína antiporter de protones/azúcar que se especifica para sacarosa también se denomina como proteína antiporter de protones/sacarosa.

De acuerdo con un segundo aspecto, se desvela un gen recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, preferible para una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria. La molécula de ácido nucleico se puede unir operativamente con al menos un elemento regulador.

De acuerdo con un tercer aspecto, la invención se refiere a un vector o un elemento genético móvil que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto

Se desvela también un vector que contiene un gen recombinante de acuerdo con el segundo aspecto.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped eucariótica o una célula huésped procariótica la cual comprende un vector o elemento genético móvil de acuerdo con el tercer aspecto.

Una célula huésped eucariótica o una célula huésped procariótica, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto, preferentemente como transgén o un gen recombinante de acuerdo con el segundo aspecto, se describen asimismo.

En otro aspecto se describe una proteína que funciona como antiporter de protones/azúcar tonoplastidario, que preferiblemente es específico para sacarosa, o preferiblemente funciona como antiporter de protones/sacarosa tonoplastidario.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a una célula vegetal transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto como transgén o un vector del elemento genético móvil de acuerdo con el tercer aspecto, así como a una planta transgénica o partes de la misma, que comprenden al menos una célula vegetal transgénica.

Una célula vegetal transgénica que contiene un gen recombinante de acuerdo con el segundo aspecto como transgén se describe asimismo.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a semillas de una planta transgénica de acuerdo con el aspecto precedente, presentando la semilla una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto como transgén, un vector o elemento genético móvil de acuerdo con el tercer aspecto.

Semillas de una planta transgénica, que presentan un gen recombinante de acuerdo con el segundo aspecto como transgén, se desvelan asimismo.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir plantas transgénicas.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para incrementar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para identificar una planta que es adecuada para producir una mayor concentración de sacarosa en un órgano acopiador de sacarosa de la planta.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a oligonucleótidos que son adecuados para ser usados como marcadores moleculares para la verificación diagnóstica de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto.

Se desvelan también anticuerpos que son diagnósticos para una proteína que funciona como antiporter de protones/azúcar tonoplastidario, el cual preferiblemente es específico para sacarosa, o bien que funciona preferiblemente como antiporter de protones/sacarosa tonoplastidario.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere al uso de proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias para incrementar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta.

La Figura 1 muestra una tabla de la cual se desprenden las identidades y las similitudes de las secuencias de aminoácido de las tres proteínas transportadoras de monosacárido tonoplastidarias (TMT) paralogenas de Arabidopsis thaliana con las cuatro proteínas transportadoras de azúcar tonoplastidarias (TST) paralogenas de Beta vulgaris.

La Figura 2 muestra un cladograma en el que se representan las relaciones filogenéticas de las tres proteínas transportadoras de monosacárido tonoplastidarias (TMT) paralogenas de Arabidopsis thaliana y las cuatro proteínas transportadoras de azúcar tonoplastidarias (TST) paralogenas de Beta vulgaris.

La Figura 3 muestra un diagrama de columnas que ilustra la concentración de sacarosa en raíces pivotantes de diferente edad de dos variedades de remolachas azucareras.

La Figura 4 muestra un diagrama de columnas del cual se desprenden las cantidades de mRNA relativas de los cuatro genes TST paralogos de Beta vulgaris en dos diferentes variedades de remolacha azucarera en diferentes momentos del desarrollo.

La Figura 5 muestra un diagrama de columnas que representa la concentración foliar de diferentes azúcares en la variedad de remolacha azucarera “Belladonna KWS” en diferentes momentos del desarrollo.

La Figura 6 muestra un diagrama de columnas del cual se desprenden las cantidades de mRNA relativas para los cuatro genes BvTST paralogos en las hojas de la variedad de remolacha azucarera “Belladonna KWS” en diferentes momentos del desarrollo.

La Figura 7 es un diagrama de columnas que muestra el cambio inducido de la densidad de corriente por diferentes azúcares (sacáridos) en vacuolas de células mesófilas transitoriamente transformadas.

Los inventores identificaron la proteína designada en este documento como BvTST2.1 como una de las proteínas más frecuentemente existentes con relación a la cantidad en la membrana de vacuola de células de raíz pivotante de la remolacha azucarera, y comprobaron inesperadamente que la proteína BvTST2.1 puede importar del citosol al interior de las vacuolas de las células vegetales específicamente la sacarosa como transportador de azúcar tonoplastidario. Por este motivo, esta proteína así como las proteínas con función igual no solo constituyen transportadores de azúcar tonoplastidarios (TST) sino que a continuación también se designan como transportadores de sacarosa tonoplastidarios o antiporter de protones/sacarosa tonoplastidarios o proteínas antiporter de protones/sacarosa tonoplastidarias, siendo que “Bv” en la abreviación que se usa en este documento representa Beta vulgaris, el organismo en el cual se identificó originalmente esta proteína. La proteína BvTST2.1 fue identificada por los inventores como una proteína antiporter de protones/azúcar altamente específica para la sacarosa y constituye el primer representante conocido de esta familia de proteínas transportadoras de azúcar vegetales. Adicionalmente también se logró también la identificación de tres otras isoformas paralogas, BvTST1, BvTST2.2 y BvTST3, las cuales probablemente se deben asociar funcionalmente a las proteínas TMT conocidas de Arabidopsis.

A partir de la identificación de este antiporter novedoso específico para sacarosa, los inventores también identificaron las secuencias de nucleótido que codifican para la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria así como para las otras isoformas.

Por lo tanto, se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, preferiblemente una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria.

De acuerdo con el tercer aspecto, la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria comprende una molécula de ácido nucleico que se selecciona del grupo:

a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que presenta una identidad de al menos 80% a la secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2;

b) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que es complementaria a una de las secuencias de nucleótido según a); y

c) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácido tiene una identidad de al menos 80% a la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 d).

Se desvela además una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria, que comprende una molécula de ácido nucleico, que se selecciona del grupo:

e) una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con a) o b); y f) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un análogo o un ortólogo del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

Se divulga también una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria que comprende una molécula de ácido nucleico que se selecciona del grupo:

a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que presenta una identidad de al menos 80% a la secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2;

b) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que es complementaria a una de las secuencias de nucleótido según a);

c) una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico según a) o b);

d) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácido tiene una identidad de al menos 80% a la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; y

e) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un análogo o un ortólogo del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

El concepto “molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido” no abarca solamente moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótido consta de la secuencia de nucleótido caracterizada después más específicamente, sino también moléculas de ácido nucleico que además de la secuencia de nucleótido caracterizada después más específicamente comprenden adicionalmente al menos un nucleótido o secuencias de nucleótido. De acuerdo con una forma de realización alternativa y/o adicional, la molécula de ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7. Pero la molécula de ácido nucleico también puede codificar para una secuencia de aminoácido en la que el al menos un resto de aminoácido de la secuencia de aminoácido se intercambia por un aminoácido que tiene propiedades químicas similares (cambio de aminoácido conservativo o semiconservativo). En el caso de un cambio de aminoácido conservativo se sustituye un aminoácido por otro aminoácido que tiene características químicas similares. En el caso de un cambio de aminoácido semiconservativo se sustituye un aminoácido por otro aminoácido que tiene conformación estérica similar. El cambio preferiblemente no tiene consecuencias para la función proteínica. Los ejemplos para los cambios de aminoácido son Asp y Glu, Leu e Ile, Ala y Val, Arg y Lys, así como Phe y Trp.

De acuerdo con una forma de realización alternativa y/o adicional, las secuencias de nucleótido de los ácidos nucleicos y/o las secuencias de aminoácido, que son codificadas por las secuencias de ácido nucleótido, tienen una identidad de al menos 80%, al menos 85%, de preferencia de al menos 90%, de manera particularmente preferida de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97% o al menos 98%, y de manera muy particularmente preferida de al menos 90% a la secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o bien la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7.

El concepto “hibridar” que se usa en este documento significa hibridación en condiciones usuales, como se describe en Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), preferiblemente en condiciones astringentes. Las condiciones de hibridación astringente son por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 65 °C y subsiguiente lavado múltiple en 0,1 x SSC a 65 °C durante un total de aproximadamente 1 hora. Las condiciones de hibridación poco astringentes son por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 37 °C y subsiguiente lavado repetido en 1 x SSC a la temperatura ambiente. “Condiciones de hibridación astringente” también puede significar: hibridación a 68 °C en fosfato de sodio 0,25 M, pH 7,2, 7% de SDS, 1 mM de EDTA y 1% de BSA durante 16 horas y a continuación lavar dos veces con 2 x SSC y 0,1% de SDS a 68 °C.

Por “específico para sacarosa” o “altamente específico para sacarosa” o “transporte específico de sacarosa” o “transporte altamente específico de sacarosa” o “especificidad para sacarosa” o “especificidad de sacarosa”, se entiende que la especificidad de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para la sacarosa es al menos 5 veces, 10 veces o 15 veces, preferiblemente al menos 18 veces, 20 veces, 22 veces, 24 veces, 26 veces o 28 veces, de manera particularmente preferida al menos 30 veces, al menos 31 veces, al menos 32 veces, al menos 33 veces, al menos 34 veces, al menos 35 veces, al menos 36 veces, al menos 37 veces, al menos 38 veces o al menos 39 veces, y de manera muy particularmente preferida al menos 40 veces mayor que para otro azúcar. En el sentido de la invención se entiende por “específico para sacarosa” que la especificidad de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para sacarosa es al menos 5 veces mayor que para otro azúcar. Además, esto también puede significar, que la especificidad de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para la sacarosa es al menos 5 veces, 10 veces o 15 veces, preferiblemente al menos 18 veces, 20 veces, 22 veces, 24 veces, 26 veces o 28 veces, de manera particularmente preferida al menos 30 veces, al menos 31 veces, al menos 32 veces, al menos 33 veces, al menos 34 veces, al menos 35 veces, al menos 36 veces, al menos 37 veces, al menos 38 veces o al menos 39 veces, y de manera muy particularmente preferida al menos 40 veces mayor que para un monosacárido como glucosa o fructosa.

En el sentido de la invención se entiende por un “homólogo” una proteína del mismo origen filogenético, por un “análogo” se entiende una proteína que ejerce la misma función, pero sin embargo tiene un origen filogenético diferente, y por un “ortólogo” una proteína de otra especie, que ejerce la misma función.

Se desvela también un gen recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido, que preferiblemente codifica para una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria. La molécula de ácido nucleico puede estar conectada operativamente con al menos un elemento regulador.

Por un “elemento regulador” se entienden secuencias de nucleótido, que no son parte de la secuencia de nucleótido que codifica la proteína, pero intervienen en la expresión de la secuencia de nucleótido que codifica la proteína. Los elementos reguladores son por ejemplo promotores, elementos cis-reguladores, intensificadores, intrones o terminadores. En función del tipo de elemento regulador, este se dispone sobre la molécula de ácido nucleico delante (o sea en sentido 5' de) o detrás (o sea en sentido 3' de) la secuencia de nucleótido que codifica la proteína. Los elementos reguladores son capaces de funcionar en una célula vegetal viva.

El concepto “conectado operativamente” significa que un elemento regulador se conecta de esta manera con la secuencia de nucleótido que codifica la proteína, o sea de manera que con relación a la secuencia de nucleótido que codifica la proteína se localiza por ejemplo sobre una molécula de ácido nucleico de manera que puede tener lugar una expresión de la secuencia de nucleótido que codifica la proteína bajo control del elemento regulador en una célula viva.

En el sentido de la presente invención, un “promotor” es una secuencia de nucleótido que regula la expresión de un gen, la cual usualmente se encuentra en el extremo 5' de un gen y que por vía de la interacción con determinadas proteínas enlazadoras de DNA interviene en el inicio de la transcripción mediante RNA-polimerasa. Los ejemplos de promotores que son funcionales en células vegetales comprenden los promotores constitutivos como promotores virales, por ejemplo el promotor CaM35S, un promotor CaM35S doble, o como promotores vegetales, por ejemplo promotores de ubiquitina, como los descritos en el documento EP 0305668 y el documento US 6.528.701. Además, también es posible usar promotores que tienen por ejemplo una actividad específica respecto a determinadas fases de desarrollo o de inducción mediante factores del entorno, como tensión biótica o abiótica, o una especificidad histológica. En particular es posible usar aquellos promotores que muestra una mayor especificidad para el órgano acopiador de sacarosa o partes de este, o sea que en particular son activos en este órgano acopiador de sacarosa o partes de este. Para la remolacha azucarera el promotor puede ser por ejemplo un promotor específico de la raíz o bien específico de la raíz pivotante. Estos los conoce suficientemente el experto por el estado de la técnica: WO 02/40687, Oltmanns, H. et al. (2006) “Taproot promoters cause tissue specific gene expression within the storage root of sugar beet”, Planta 224: 485-495, Noh, Seol Ah, et al. (2012) “A sweetpotato SRD1 promoter confers strong root-, taproot-, and tuber-specific expression in Arabidopsis, carrot and potato”, Transgenic research 21: 265-278. Para la caña de azúcar se pueden usar preferiblemente promotores específicos del tallo, como se conocen por ejemplo de Goshu Abraha, Tsion. “Isolation and characterisation of a culm-specific promoter element from sugarcane”, Diss. Stellenbosch: University of Stellenbosch, 2005; Govender, C. “Stem specific promoters from sorghum and maize for use in sugarcane”, Diss. Stellenbosch: Stellenbosch University, 2008; y Mudge, S.R. et al. (2013) “Mature-stem expression of silencing-resistant sucrose isomerase gene drives isomaltulose accumulation to high levels in sugarcane”, Plant Biotechnology Journal 1: 502-509).

Como promotores adecuados también se han evidenciado además los promotores sintéticos. En este aspecto se trata de promotores producidos mediante técnicas de trabajo molecular-biológicas que no se encuentran de este tipo en la naturaleza. Un promotor sintético es un promotor minimalista el cual, además de un promotor mínimo ya solo contiene uno o varios elementos cis definidos, seleccionados. Estos elementos cis son puntos de enlace para proteínas enlazadoras de DNA como factores de transcripción y se aíslan de promotores naturales, se derivan de elementos cis ya aislados o se producen técnicamente mediante técnicas de recombinación aleatorias y se seleccionan mediante procesos adecuados, en comparación con un promotor natural, un promotor sintético solo se activa mediante pocos factores exógenos y endógenos debido a su estructura menos compleja y por consiguiente esta regulado de manera más específica.

El “promotor mínimo” o promotor “core” es una secuencia de nucleótido que contiene los puntos de enlace para el complejo de factor de transcripción basal y permite el inicio exacto de la transcripción mediante la RNA polimerasa II. Los motivos de secuencia característicos del promotor mínimo son la secuencia llamada TATA Box, el elemento iniciador (lnr), el “elemento de reconocimiento TFBII” (BRE) y el “elemento promotor central corriente abajo” (DPE). Estos elementos pueden estar presentes en el promotor mínimo de manera individual o en combinación. El promotor mínimo o sus motivos de secuencia se pueden obtener por ejemplo de cualquier gen vegetal, bacterial, micótico o viral.

Los “elementos cis” son secuencias de nucleótido que se encuentran sobre la misma molécula de ácido nucleico que la secuencia de nucleótido a ser expresada que codifica para la proteína. Los elementos cis que se encuentran corriente arriba de una secuencia de nucleótido a ser expresada que codifica la proteína constituyen frecuentemente motivos de enlace necesarios para en particular factores de transcripción, los cuales en este caso elementos trans­ activos (del latín trans “del otro lado”) vistos molecularmente intervienen desde otro lado en la regulación de la transcripción en este gen. Sí además estos elementos cis conducen a una inhibición de la transcripción, se denominan silenciadores. Los elementos cis que conducen a un refuerzo de la transcripción se denominan intensificadores. La totalidad de las actividades cis/trans en el promotor determina finalmente la intensidad con la que la RNA-polimerasa lleva a cabo la transcripción.

Además es posible que en el caso de un promotor se trate también de un promotor quimérico y/o de un promotor que fue modificado mediante elemento cis. La modificación de un promotor puede en este aspecto también significar la introducción adicional de un elemento cis en el promotor, el cual por ejemplo naturalmente ya tiene un elemento cis. Adicionalmente, la modificación comprende también una multimerización de un elemento cis, en particular una multimerización de un elemento cis naturalmente existente. Un promotor de estos modificado puede, en comparación con la versión nativa, tener propiedades modificadas en lo referente de por ejemplo especificidad, nivel de expresión o actividad de fondo.

Los terminadores son secuencias de nucleótido sobre el DNA que generalmente marcan el final de un gen y conducen a la terminación de la transcripción.

De acuerdo con una forma de realización alternativa y/o adicional, la secuencia de nucleótido que codifica para la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, en particular la secuencia de nucleótido que codifica para la proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria, y la secuencia de nucleótido del al menos un elemento regulador son heterólogas. Esto significa que provienen de diferentes especies o que no están presentes naturalmente en una especie en la combinación prevista.

De acuerdo con un tercer aspecto la invención se refiere a un vector o un elemento genético móvil, que comprende una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido según el primer aspecto o un gen recombinante según el segundo aspecto.

En este sentido se entiende por un vector un vehículo de transporte para una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto o un gen recombinante de acuerdo con el segundo aspecto, en particular para la transferencia de un ácido nucleico extraño en una célula receptora viva. En el caso de la célula receptora viva se puede tratar de una célula eucariótica o de una célula procariótica. Entre los vectores se cuentan por ejemplo plásmidos, cósmidos, cromosomas de levadura sintéticos (YACs), cromosomas de bacterias sintéticos (BACs) o cromosomas P1 sintéticos (PACs), pero también virus modificados como adenovirus, retrovirus y fagos.

Los elementos genéticos móviles son secuencias de nucleótido cuya posición en el genoma de un organismo es variable. Entre los elementos genéticos móviles se cuentan por ejemplo secuencias de nucleótido codiciosas como transposones, retroelementos, secuencias de inserción e inteínas, pero también intrones del grupo II, plásmidos de inserción y algunos bacteriófagos como el fago Mu.

De acuerdo con otro aspecto la invención se refiere a una célula huésped eucariótica o una célula huésped procariótica, que comprende un vector o elemento genético móvil de acuerdo con el tercer aspecto como transgén. Esto significa que el vector o el elemento genético móvil se introdujo en la célula huésped, por ejemplo mediante transformación o transfección. Los ejemplos de células huésped procarióticas son las bacterias de la especie A. tumefaciens, E. coli y B. subtilis. Los ejemplos para las células huésped eucarióticas son células de levadura como Saccharomyces o Schizosaccharomyces, pero también células de origen animal o vegetal.

Se desvelan también proteínas que funcionan como antiporter de protones/sacarosa tonoplastidario. Este antiporter es específico para sacarosa. Preferiblemente la proteína es codificada mediante una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto.

De acuerdo con una forma de realización, la proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria se selecciona del grupo de proteínas que

a) presentan una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1;

b) presentan una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos 80% a la secuencia de aminoácido de acuerdo SEQ ID NO: 1;

c) son un homólogo, un análogo o un ortólogo de la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

La proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, también designada BvTST2.1, tiene una secuencia de aminoácido con una longitud de 735 aminoácidos. Un análisis de capacidad hidrofóbica indica que BvTST2.1 evidentemente comprende 12 dominios transmembranosos hidrófobos y un bucle hidrófilo grande que se localiza central, el cual conecta uno con otro el sexto y el séptimo dominio transmembranoso. La mayor identidad de secuencia la tiene BvTST2.1 con relación a la proteína transportadora de monosacárido tonoplastidaria 2 de Arabidopsis thaliana (AtTMT2). La identidad de estas dos secuencias de aminoácido se encuentra en 68%, y considerando los cambios de aminoácido conservadores y semiconservadores tiene una similitud de secuencia de 84% (figura 1).

Se desvelan también proteínas que funcionan como antiporter de protones/azúcar tonoplastidario. Preferiblemente la proteína es codificada mediante una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto.

De acuerdo con una forma de realización, la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria se selecciona del grupo de proteínas que

a) tienen una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, 5 o 7;

b) tienen una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos 80% con relación a la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, 5 o 7;

c) son un homólogo, un análogo o un ortólogo de la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, 5 o 7.

La proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 también se designa como BvTST1, de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 también como BvTST2.2 y de acuerdo con la SEQ ID NO: 7 también como BvTST3.

En virtud de que la proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria BvTST2.1 identificada en Beta vulgaris así como también las otras proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria BvTSTI, BvTST2.2 y BvTST3 también tienen identidades de secuencia a las proteínas de transporte de otras plantas, las proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias, en particular las proteínas antiporter de protones/sacarosa tonoplastidarias comprenden también proteínas cuya secuencia de aminoácido tiene una identidad de al menos 80% con respecto a la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7, preferiblemente de al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, así como homólogos, análogos u ortólogos de estas. En este aspecto no importa en qué especie se encuentran naturalmente estas proteínas o si se trata de proteínas que no se encuentran naturalmente, las cuales se producen por ejemplo mediante métodos moleculares genéticos.

De acuerdo con otro aspecto la invención se refiere a una célula vegetal transgénica, la cual comprende una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto como transgén, o un vector o elemento genético móvil de acuerdo con el tercer aspecto como transgén, así como también se refiere a una planta transgénica o partes de esta que comprenden al menos una célula vegetal de este tipo. En cuanto a esto también la planta transgénica o partes de esta comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto como transgén, o un vector o elemento genético móvil de acuerdo con el tercer aspecto como transgén.

De acuerdo con otro aspecto la invención se refiere a semillas de una planta transgénica de acuerdo con el aspecto precedente, siendo que las semillas y en particular al menos una célula embrional de la semilla comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto como transgén, o un vector o elemento genético móvil de acuerdo con el tercer aspecto.

En una forma de realización, en el caso de la célula vegetal se trata de una célula de una planta monocotiledónea, en otra forma de realización se trata en el caso de la célula vegetal de una célula de una planta dicotiledónea. De acuerdo con otra forma de realización y/o forma de realización adicional se trata en el caso de la célula vegetal de células de una planta que se selecciona del grupo de los géneros o las especies superordenadas que comprende Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum y Sorghum sp. Según esto, de acuerdo con otra forma de realización, la planta transgénica se selecciona del grupo que comprende Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum y Sorghum sp. De acuerdo con otra forma de realización, las partes de una planta transgénica o las partes de las semillas de una planta transgénica provienen del grupo de plantas que comprende Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum y Sorghum sp.

En una forma de realización adicional y/o alternativa, la célula de planta transgénica, la planta transgénica o las partes de la planta transgénica, en las que preferiblemente se trata del órgano acopiador de sacarosa de la planta, comprende una mayor concentración de sacarosa que la célula de planta o planta isógena cultivada en condiciones idénticas. Además es posible que las partes de una planta estén conectadas con o estén separadas de la planta intacta total. Estas partes incluyen por ejemplo órganos, tejidos, células y semillas de la planta.

Preferiblemente la mayor concentración de sacarosa se funda en una mayor concentración de sacarosa en la vacuola vegetal, en particular en la vacuola de al menos una célula del órgano acopiador de sacarosa de la planta. Preferiblemente una planta que tiene una mayor concentración de sacarosa también tiene una producción de sacarosa elevada. Producción significa en este sentido el rendimiento de sacarosa del órgano acopiador de sacarosa con relación a una superficie de cultivo definida (por ejemplo, una hectárea) o con relación al peso de un órgano acopiador de sacarosa teniendo en cuenta la proporción de agua en el órgano acopiador de sacarosa (preferiblemente la normatividad se basa en peso fresco o peso seco).

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de plantas transgénicas, siendo que el procedimiento comprende al menos las etapas siguientes:

(a) la introducción de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto, y/o de un vector o de los elementos genéticos móviles de acuerdo con el tercer aspecto en al menos una célula de una planta; y

(b) la regeneración de la planta transgénica de la célula vegetal obtenida en la etapa (a).

De acuerdo con una forma de realización, la planta transgénica que resulta del procedimiento está en condiciones de efectuar una mayor concentración de sacarosa en las vacuolas de sus células, preferiblemente en la vacuolas de las células de su órgano acopiador de sacarosa que una planta de control isógena cultivada bajo condiciones idénticas.

En el sentido de la presente invención, por “plantas isógenas o plantas de control” o “células vegetales isógenas” se entienden aquellas plantas o

células vegetales que se usaron como material inicial para producir las plantas transgénicas o células vegetales transgénicas. Por consiguiente, el genoma de las plantas y/o células vegetales transgénicas, en cuanto se trata de plantas o células vegetales modificadas con técnica genética solo difieren una de otra por los genes transferidos y/o secuencias de nucleótido introducidas con técnica genética.

De acuerdo con una forma de realización adicional y/o alternativa, la planta transgénica expresa o sobreexpresa en al menos una célula la secuencia de nucleótido que codifica para al menos una proteína antiporter de protones/azúcar.

La introducción de la molécula de ácido nucleico, por ejemplo por vía de la transformación se puede efectuar con técnicas que son fundamentalmente conocidas por el experto. Por ejemplo es posible que la molécula de ácido nucleico se introduzca en las células vegetales mediante la infección de un tejido vegetal o una célula vegetal con Agrobacterium tumefaciens, la cual contiene la secuencia de ácido nucleico a ser transferida en su plásmido que se puede integrar en el genoma vegetal. También es posible una introducción mediante transferencia biolística, en la que el ácido nucleico a ser introducido en la célula vegetal se aplica sobre partículas de oro o partículas de tungsteno, las cuales a continuación se dispara con alta velocidad al interior de las células. Otra posibilidad conocida por el experto de introducir ácido nucleico en una célula vegetal consiste en la transformación de protoplastos, en la cual a los protoplastos o bien se les adiciona polietilenglicol en presencia de las moléculas de ácido nucleico a ser introducidas o los protoplastos se exponen a una corta aplicación de corriente, de manera que la membrana del protoplasto se torna transitoriamente permeable para las moléculas de ácido nucleico. Los procedimientos para la regeneración de plantas completas de tejido o células transformados los conoce igualmente el experto por el estado de la técnica.

De preferencia la molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, el gen recombinante según el segundo aspecto y/o el vector o el elemento genético móvil según el tercer aspecto se introduce de manera estable en el genoma de la célula de la planta. Esto significa que después de la regeneración de una planta la secuencia de ácido nucleico transferida puede ser heredada de manera estable por esta planta a una planta descendiente.

Preferiblemente la transformación y la regeneración de remolachas azucareras se efectúa de acuerdo con el método descrito por Lindsey (Lindsey K. (1991) “Regeration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens”. Plant Tissue Culture Manual B7: 1-13, Kluwer Academic Publisher).

La transgenidad de las plantas se puede verificar mediante reacción en cadena de polimerasa con el uso de oligonucleótidos cebadores adecuados. Después de la regeneración es posible que los transformados se cultiven y se reproduzcan a sí mismos en el invernadero para la obtención de semillas.

En una forma de realización se trata en el caso de las células vegetales a ser transformadas de células de plantas monocotiledóneas. En otra forma de realización se trata en el caso de las células vegetales a ser transformadas de células de plantas dicotiledóneas. De acuerdo con otra forma de realización y/o forma de realización adicional se trata en el caso de las células vegetales a ser transformadas de células de una planta que se selecciona del grupo de los tipos o especies superordenadas que comprende Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum y Sorghum sp.

De acuerdo con otro aspecto la invención se refiere a un procedimiento para aumentar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta mediante la expresión o sobreexpresión de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, en particular una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria, en al menos una célula de la planta. La expresión o sobreexpresión se puede efectuar mediante modificación genética de al menos una célula de la planta y comprende

(1) la introducción de una molécula de ácido nucleico según el primer aspecto, de un gen recombinante según el segundo aspecto y/o de un vector o elemento genético móvil según el tercer aspecto en al menos una célula de una planta, mediante lo que se efectúa una expresión adicional o una sobreexpresión de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, o

(2) la modificación genética de un elemento regulador endógeno como un promotor, el cual regula la expresión de un gen endógeno que codifica una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, por ejemplo mediante la introducción de elementos cis o intensificadores adicionales, mediante la cual se efectúa una expresión aumentada de la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria regulada.

Mediante la sobreexpresión de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, en particular de una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria, en al menos una célula de la planta se mejora la importación de sacarosa en las vacuolas de la célula genéticamente modificada. Mediante esto también se aumenta la concentración de sacarosa en las vacuolas de esta célula, en comparación con una célula vegetal isógena.

Un “aumento de la concentración de sacarosa” o una “concentración de sacarosa incrementada” o una “mayor concentración de sacarosa de un órgano de acopio de sacarosa de una planta” significa un incremento de la concentración promedio de sacarosa, con relación al peso fresco del órgano acopiador de sacarosa en comparación con una planta de control (isógena) no transgénica cultivada en condiciones idénticas, de al menos 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% o 1%, preferiblemente de al menos 1,2%, 1,4%, 1,6%, 1,8% o 2%, de manera particularmente preferida de al menos 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 6%, 7%, 8%, o 10%, y de manera muy particularmente preferida de al menos 15%.

En el sentido de la invención se entiende por el concepto “sobreexpresión” que la cantidad de proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria en una planta, célula vegetal o sus tonoplastos es mayor que en la planta isógena, la célula vegetal isógena o sus tonoplastos.

De acuerdo con una forma de realización, el procedimiento para aumentar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta comprende la expresión y/o sobreexpresión de una secuencia de nucleótido que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Para este propósito se produce una planta transgénica de acuerdo con el procedimiento precedentemente descrito, siendo que la expresión y/o sobreexpresión de la(s) proteína(s) antiporter de protones/azúcar en la planta transgénica se puede posibilitar mediante diversas modificaciones genéticas como se describió en lo precedente. Así es posible además introducir un constructo de un promotor fuerte y una secuencia de nucleótido de acuerdo con el primer aspecto de la invención en una célula vegetal a ser transformada. Alternativamente es posible modificar el promotor endógeno de un gen que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, en particular de un gen que codifica para una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria de manera que es más intensamente activo en la planta transgénica que en la planta de control isógena. Los medios para la modificación de un promotor endógeno pueden ser por ejemplo TALENs o nucleasas de dedo de cinc. De acuerdo con otra alternativa es posible introducir en la célula vegetal copias de gen adicionales del gen endógeno que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, en particular del gen endógeno que codifica para una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria, incluido su promotor natural.

En una forma de realización alternativa y/o adicional, la proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria se selecciona del grupo que comprende proteínas BvTST2.1, homólogos, análogos y ortólogos de estas.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para identificar una planta que es adecuada para producir una concentración de sacarosa más elevada en su órgano acopiador de sacarosa.

De acuerdo con una forma de realización es posible que las plantas a ser identificadas se sometan a una identificación apoyada por marcadores. Para esto se aísla el DNA de cada planta a ser investigada y o bien se somete a una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con oligonucleótidos cebadores adecuados, de manera que del análisis de los productos de reacción de la PCR, ya sea por vía de cromatografía de gel o mediante identificación por fluorescencia como en la RT-PCR, se pueden identificar aquellas plantas que en virtud de su dotación genética son adecuadas para producir una concentración de sacarosa más elevada en su órgano acopiador de sacarosa. De acuerdo con una forma de realización adicional y/o alternativa, la dotación genética de las plantas a ser identificadas también se puede efectuar mediante un polimorfismo de longitud de restricción, en el cual el DNA aislado se hidroliza con diferentes endonucleasas de restricción, los fragmentos de restricción se separan mediante cromatografía de gel, se transfieren por elusión y se hibridan con una sonda adecuada. Los ejemplos de oligonucleótidos adecuados para una identificación de plantas transgénicas que son adecuadas para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa debido a que expresan o sobre-expresan la secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 se pueden tomar del grupo de oligonucleótidos que abarca SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO. 26. El experto sabe como puede proporcionar oligonucleótidos adecuados también para homólogos, análogos u ortólogos de la SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con una forma de realización adicional y/o alternativa, la identificación de las plantas que son adecuadas para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa no se efectúa en base a su dotación genética sino mediante la expresión de sus proteínas antiporter de protones/sacarosa tonoplastidarias. Esto puede tener lugar por ejemplo a nivel de los mRNA, al determinar la cantidad de mRNA de las secuencias de desoxirribonucleótido que codifican para las proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias, en particular de las secuencias de desoxirribonucleótido que codifican para las proteínas antiporter de protones/sacarosa tonoplastidarias, por ejemplo mediante “PCR cuantitativa en tiempo real”. La determinación de una cantidad mayor de mRNA, que codifica para al menos una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria precedentemente descrita en una planta, en un tejido vegetal o una célula vegetal, en particular en un tejido o en una célula del órgano acopiador de sacarosa de la planta, con relación a otro tejido vegetal o una célula vegetal de la misma planta, que no son parte del órgano acopiador de sacarosa de la planta, vale como comprobación de la adecuación de una planta para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa.

Una identificación de las plantas que son adecuadas para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa también se puede efectuar mediante identificación cuantitativa de la cantidad de proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, en particular de proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria en una parte de la planta. Para este propósito se usa la llamada transferencia Western, en la cual las proteínas divididas mediante electroforesis de la parte de planta, preferiblemente de las vacuolas, de manera particularmente preferida de la membrana de vacuola de esta parte se incuban con un anticuerpo específico para una o varias de las proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias precedentemente descritas. Por medio de un anticuerpo secundario que liga el anticuerpo específico para una o varias de las proteínas antiporter de protones/azúcar tonoplastidarias precedentemente descritas, y que tiene una marcación identificable, es posible determinar la cantidad de proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, en particular de proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria en la parte de la planta e identificar las plantas que son adecuadas para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa. La determinación de una cantidad mayor de al menos una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria en una planta, en una parte de planta o en una célula vegetal, en particular en un tejido o en una célula del órgano acopiador de la planta, con relación a una planta comparativa de la misma especie o una parte de esta o con relación a otro tejido vegetal o una célula vegetal de la misma planta, que no son parte del órgano acopiador de sacarosa de la planta, vale como comprobación de la adecuación de una planta para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa.

Se desvelan también a las plantas identificadas con el procedimiento precedentemente mencionado, que son adecuadas para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a oligonucleótidos que son adecuados para ser usados como marcadores moleculares para la identificación diagnóstica de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto.

De acuerdo con una forma de realización, al menos uno de los oligonucleótidos adecuados se elige del grupo que comprende los oligonucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID No : 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26. Estos se pueden usar como marcadores moleculares para la identificación diagnóstica de una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

Además se desvela un anticuerpo que es diagnóstico para una proteína que funciona como antiporter de protones/azúcar tonoplastidario, preferiblemente como antiporter de protones/sacarosa tonoplastidario.

En una forma de realización el anticuerpo diagnóstico es un anticuerpo monoclonal. En una forma de realización alternativa el anticuerpo diagnóstico es parte de un antisuero policlonal.

En una forma de realización adicional y/o alternativa el anticuerpo diagnóstico o bien el antisuero policlonal es específico para una determinada proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria como una proteína antiporter de protones/sacarosa tonoplastidaria. Preferiblemente el anticuerpo diagnóstico identifica y liga un epítopo en el bucle entre el sexto y el séptimo dominio transmembranoso de una proteína antiporter de protones/sacarosa.

De acuerdo con otro aspecto la invención se refiere al uso de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para aumentar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta. De acuerdo con una forma de realización, el uso de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para aumentar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta comprende el aumento de la concentración de sacarosa mediante la expresión o sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria. Preferiblemente la molécula de ácido nucleico comprende

i. una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, o con una secuencia de nucleótido que tiene una identidad de al menos 80% con respecto a una de las secuencias de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14;

ii. una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que es complementaria a una de las secuencias de nucleótido según i.;

iii. una molécula de ácido nucleico que hidroliza con una de las moléculas de ácido nucleico según i. o ii.; o iv. una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13, o que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que presenta una identidad de al menos 80% con respecto a una de las secuencias de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 codifica para el antiporter de protones/azúcar tonoplastidario TST2.1 de Beta vulgaris con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 codifica para el antiporter de protones/azúcar tonoplastidario TST1 de Beta vulgaris con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 3.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 codifica para el antiporter de protones/azúcar tonoplastidario TST2.2 de Beta vulgaris con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 codifica para el antiporter de protones/azúcar tonoplastidario TST3 de Beta vulgaris con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 7.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 codifica para el antiporter de protones/azúcar tonoplastidario TMT1 de Arabidopsis thaliana con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 9. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 codifica para el antiporter de protones/azúcar tonoplastidario TMT2 de Arabidopsis thaliana con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 11. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 14 codifica para el antiporter de protones/azúcar tonoplastidario TMT3 de Arabidopsis thaliana con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 13. Mediante la expresión y/o sobreexpresión de al menos una de las secuencias de nucleótido mencionadas bajo i. a iv. en una planta después de introducirlas en al menos una célula de la planta es posible aumentar la cantidad de proteína antiporter de protones/azúcar en la membrana de vacuola de esta planta, en particular en las membranas de las vacuolas de los órganos acopiadores de sacarosa de esta planta, de manera que es posible transportar más sacarosa a las vacuolas de la planta y se incrementa la concentración de sacarosa en el órgano acopiador de sacarosa de la planta en comparación con una planta de control isógena cultivada en condiciones idénticas. Mediante esto es posible aumentar el rendimiento de sacarosa por planta, por órgano acopiador de sacarosa y/o por superficie cultivada.

La presente invención se explicará a continuación mediante ejemplos de realización, siendo que los ejemplos de realización solamente sirven para explicar, pero no limitan la presente invención. La presente invención se define exclusivamente mediante las reivindicaciones. La expresión “un” o “una” no se debe entender en el sentido de que especifica el número/cantidad.

Los ejemplos de realización muestran claramente que la TST2.1 de Beta vulgaris es la proteína de membrana tonoplastidaria que como antiporter de protones/azúcar puede importar de manera altamente específica la sacarosa en la vacuola de una célula vegetal.

Ejemplo 1: Material vegetal y condiciones de crecimiento

Para las pruebas siguientes se usaron remolachas azucareras de los tipos “Belladonna KWS” y “Brigadier”. La simiente para la variedad “Belladonna KWS” fue proporcionada por la KWS Saat AG, Einbeck, DE, la simiente para remolachas de la variedad “Brigadier” se adquirió comprando en el comercio de simientes local.

Además se usaron plantas y células vegetales de Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana. Las plantas crecieron en cámaras de crecimiento sobre el sustrato estándar ED-73 de la firma Einheitserde- und Humuswerke Gebr. Patzer GmbH & Co. KG con un ciclo de claro-oscuro de 10 horas de luz y 14 horas de oscuridad, 22 °C y 125 limol quanta ir rV .

El mutante de doble gen knockout Arabidopsis Attst1-2 T-DNA se describió en el estado de la técnica (Wormit, A. et al. (2006) “Molecular identification and physiological characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolar sugar transport”, Plant Cell 18, 3476-3490). Para las pruebas de crecimiento con 2-desoxiglucosa se cultivaron semillas de Arabidopsis con superficie esterilizada sobre placas de agar Murashige und Skoog medio concentradas (1/2MS) como se describió, (Reiser, J. et al. (2004) “Molecular physiological analysis of the two plastidic ATP/ADP transporters from Arabidopsis”, Plant Physiol. 136: 3524-3536). La selección de las plantas que sobre-expresan pUBQ:BvTST2.1-GFP y 35S:BvTST1 se efectuó sobre placas de agar 1/2MS, las cuales contenían o bien 50 ig/ml de higromicina o 40 ig/ml de canamicina.

Ejemplo 2: Determinación cuantitativa de azúcares en tejidos de la remolacha azucarera

Tejido de raíz pivotante de remolachas azucareras se cosechó con una cortadora de verduras, se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó hasta la determinación cuantitativa de azúcar a -80 °C. Para la determinación el contenido de azúcar el tejido vegetal se machacó en nitrógeno líquido y 50 |ig del tejido molido se extrajeron dos veces durante 20 minutos a 80 °C con etanol al 80%. Los sobrantes se reunieron y se concentraron por evaporación con una SpedVac (Firma Eppendorf, Hamburgo, DE). Los azúcares secos se disolvieron en agua y mediante un análisis enzimático acoplado a NADP se cuantificaron como se describe en un aparato lector de placas de micro-titulación (Bergmeyer, H. U. y Bernt, E. (1974) “Methods of Enzymatic Analysis”, Vol. 3, Bergmeyer, H.U. editores, Editorial Chemie Nueva York, páginas 1176-117; Lee, Y.C. (1972) “a-Mannosidase, p-glucosidase, and pgalactosidase from sweet almond emulsion”. Methods Enzymol. 28: 699-702).

Ejemplo 3: Análisis de expresión de gen

La acumulación relativa de mRNA se efectuó mediante análisis de transferencia Northern como se describe (Jung, B. et al. (2011) “Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines”.

Plant J. 65: 703-711). La RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo como se describió anteriormente (Leroch M. et al. (2005) “ Identification and characterization of a novel plastidic adenine nucleotide uniporter from Solanum tuberosum". J. Biol. Chem. 280: 17992-18000). Los cebadores específicos del gen que se usaron se enumeran en la tabla 1. Tabla 1: Cebadores específicos del gen para la amplificación de las secuencias de nucleótido que codifican para BvTST1 y BvTST2.1 así como para la PCR cuantitativa para el análisis de expresión de los 4 genes TST parálogos de Beta vulgaris.

Ejemplo 4: Aislamiento de vacuolas y membrana de tonoplasto de tejido de raíz pivotante

Los aislamientos de vacuolas se efectuaron de acuerdo con el procedimiento según Leigh y Branton (Leigh, R.A. and Branton, D. (1976). “Isolation of Vacuoles from Root Storage Tissue of Beta vulgaris", L. Plant Physiol. 58: 656­ 662) con las modificaciones siguientes: El tejido de raíz pivotante se cortó con el cuchillo de verduras en rebanadas de 0,1 a 0,2 mm de espesor, las cuales se incubaron inmediatamente en un medio colector (1 M de Sorbitol, 1 mM de DTT, 5 mM de EDT^a , 50 mM de Tris-HCL, pH 7,6) a la temperatura ambiente. A continuación las rebanadas delgadas se desmenuzaron con una navaja de rasurar en el medio colector (1 M de Sorbitol, 1 mM de DTT, 5 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCL, pH 7,6), se filtraron a través de un tamíz de acero inoxidable (100 |im de abertura de malla) y se sedimentaron mediante centrifugado (2,000 x g, 20 min. 4 °C). El sedimento se resuspendió en medio colector con 30% de Nycodenz (Axis-Shield GmbH, Heidelberg, DE) y se transfirió a tubitos de centrifugado de 17 ml (Beckmann UltraClear). En el siguiente centrifugado vibratorio (1,500 x g, 15 min., 8 °C) el Nycodenz formó un gradiente de densidad y las vacuolas flotaron sobre la fase superior del gradiente de densidad.

Las membranas de las vacuolas se aislaron como se describe en el estado de la técnica (Schulze W.X. et al. (2012) “Cold acclimation induce changes in Arabidopsis tonoplast protein abundance and activity and alters phosphorylation of tonoplast monosaccharide transporters", Plant. J. 69: 529-541). La actividad de a-manosidasa en las vacuolas tratadas con ultrasonido se efectuó como se describió en otro punto (Boller, T. y Kendle, H. (1979) “Hydrolityc enzymes in the central vacuole of plant cells". Plant Physiol. 63: 1123-1132; Lee, Y.C. (1972) “a-Mannosidase, pglucosidase, and p-galactosidase from sweet almond emulsion". Methods Enzymol. 28: 699-702).

Ejemplo 5: Cromatografía líquida y espectrometría de masa en tándem

Los sedimentos de las membranas de tonoplastos de plantas de 2 o 5 meses de edad se absorbieron en tampón (SDS al 4%, 50 mM de NH⁴HCO³) en una concentración de 1 |ig/ml). Las proteínas absorbidas se precipitaron durante la noche en acetona al 80% a 20 °C y se siguieron procesando como lo describe Mühlhaus (Mühlhaus, T. et al. (2011) “Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii”, Mol. Cell. Proteomics 10: M110 004739). Los péptidos extraídos se resuspendieron en 200 |il de tampón (acetonitrilo al 2%, acido acético al 0,4%).

Muestras de respectivamente 3 |il de los péptidos extraídos se alimentaron a la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (Análisis LC-MS/MS). La separación cromatográfica se efectuó sobre una nanoAquity UPLC (Waters, Eschborn, DE) mediante una “Symmetry C18 trap column (tamaño de partícula 5 mm, dimensión de columna 180 |im x 20 mm) y una columna BEH 130 C18 (tamaño de partícula 1,7 |im, dimensión de columna 75 mm x 150 mm). Se lixivió con un gradiente doble, primero de 100% de tampón A (ácido acético al 0,4%, 2-propanol al 1%, acetonitrilo al 2%) a 40% de tampón B (ácido acético al 0,4%, 2-propanol al 1%, acetonitrilo al 90%) dentro de 2 o 3 horas, a continuación sobre 90% de tampón B dentro de 5 minutos y para finalizar 15 minutos con 90% de tampón B. Al final la columna se equilibró nuevamente durante 15 minutos con 100% de tampón A. El espectrómetro de masas LTQ XL-Orbitrap híbrido (ThermoScientific, Hamburgo DE) trabajo en el modo dependiente de datos con una ciclo de una exploración completa del espectro de masa 300 - 1550 m/z (Orbitrap) con una resolución ajustada de 60.000 a 400 m/z, seguido de siete exploraciones de MS2 dependientes de datos sucesivas (LTQ) de los iones más intensivos. Los iones cargados individuales se excluyeron del análisis MS2 y los iones de salida para el análisis MS2 se pusieron durante 20 s en una lista de exclusión. Cada muestra se analizó tres veces.

Las proteínas se identificaron con la ayuda del software MaxQuant y de la máquina buscadora Andromeda (Cox, J. y Mann, M. (2008) “MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification”. Nat. Biotechnol. 26: 1367-72) en un banco de datos para proteínas de remolacha azucarera elaborado en la casa de uno de los inventores.

Ejemplo 6: Constructos de ácido nucleico

Se produjo DNA (cDNA) de Beta vulgaris complementario mediante transcripción inversa de RNA aislado de las raíces pivotantes u hojas. Todas las reacciones en cadena de polimerasa (PCR) se efectuaron con DNA polimerasa Phusion-HF (Thermo Scientific).

El constructo de fusión pUBQ:BvTST1-GFP se produjo con el uso del vector pUBC-GFP-Dest (Grefen et al. (2010) “A ubiquitin-10 promoter-based vector set for fluorescent protein tagging facilitates temporal stability and native protein distribution in transient and stable expression studies”, Plant J. 64: 355-365). Para este propósito se amplifico el cDNA de BvTST1 y el codón de terminación se eliminó mediante PCR con el uso de los cebadores BvTST1 que contienen los sitios attB1 y attB2. El producto de la amplificación se clonó por vía de una reacción BP en pDONRZEO (Invitrogen, Heidelberg, DE), seguido de una reacción LR en pUBC-GFP-Dest.

El constructo pUBQ:BvTST2.1-GFP se produjo como sigue: Todo el marco de lectura abierto del gen BvTST2.1 se amplificó con los cebadores BvTST2.1fw_Xhol/BvTST2.1rev_Xbal. El producto de PCR obtenido se digirió con Xhol y Xbal y se ligó en el vector pUBC-cGFP-Dest (Grefen et al. (2010)) abierto con Xhol y Spel. El constructo producido así contiene el gen bar que en las plantas transformadas conduce a una resistencia contra Basta. A continuación la secuencia de nucleótido completa que codifica para BvTST2.1-GFP se corto con Xhol/Pstl fuera de este constructo y se insertó en un vector pUBN-nYFP-Dest correspondientemente abierto con Xhol y Postl, el cual transmite una resistencia a la higromicina en las plantas transformadas. Una digestión de pUBN-nYFP-Dest con Xhol/Pstl llevó a una eliminación completa de la secuencia nYFP y de las propiedades de “compuerta de paso” del vector diana, de manera que este es adecuado para la transformación de los mutantes de doble gen knockout Attst1-2 mediante agrobacterias (Clough S.J., Bent, A.F. (1998) “Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalina”. Plant J. 16: 735-743). Las secuencias de nucleótido de todos los constructos de gen se revisaron mediante análisis de secuencia.

Ejemplo 7: Investigaciones Patch-Clamp de vacuolas de plantas Nicotiana benthamina transformadas

Para la sobreexpresión transitoria de las proteínas tansportadoras de azúcar (BvTST1-GFP y BvTST2.1-GFP) en sus extremos terminales C con la proteína fluorescente verde (GFP) o solo con GFP bajo el control del promotor ubiquitina (pUBQ10) en células mesofilas de N. benthamiana se usó el procedimiento descrito por Latz et al. (2007) de la agroinfiltración en plantas de 5 a 7 semanas de edad (Latz et al. (2007) “In planta AKT2 subunits constitute a pH- and Ca2+-sensitive inward rectifying K+ channel”, Planta, 225: 1179-1191). Discrepando del procedimiento descrito en el estado de la técnica se usó la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens como soporte de la secuencia de nucleótido que codifica para el gen 19K así como para los constructos de proteína transportadora de azúcar/GFP correspondientes. Las bacterias se cultivaron durante la noche en 5 ml de medio YEB, se centrifugaron a 8.000 x g durante 1 minuto a la temperatura ambiente y se lavaron 2 veces con Agromix (Latz et al. (2007)). las células bacterianas se resuspendieron en 3 ml de Agromix y se mantuvieron en la oscuridad durante 2 a 3 horas a 28 °C. Para la infiltración, 1 ml de la suspensión con las agrobacterias que contenían 19K se mezcló con 1 ml de la suspensión de agrobacterias que contienen pUBQ:BvTST1-GFP, pUBQ:BvTST2.1-GFP o pUBQ:GFP y se mezcló con 2 ml de Agromix.

Dos días después de la agroinfiltración se aislaron los protoplastos de las células mesofilas, sustancialmente como se describe por Beyhl et al. (Beyhl, D. et al. (2009) “The fou2 mutation in the major vacuolar catión channel TPC1 confers tolerance to inhibitory luminal calcium”, Plant j. 58: 715-723). Tras la incubación enzimática de discos foliares durante 1 hora, los protoplastos liberados se lavaron con 500 mM de sorbitol y 1 mM de CaCb. Las vacuolas se liberaron de los protoplastos directamente en las cámaras de patch-clamp al ser expuestas a un cebador lisis con una capacidad osmótica de 280 mOsmol x kg-1 (10 mM EGTA, 10 mM Hepes/Tris, pH 7,4; capacidad osmótica ajustada con D-sorbitol). Se midieron corrientes macroscópicas en la configuración “whole-vacuolar” (Beyhl, D. et al. (2009) “The fou2 mutation in the major vacuolar cation channel TPC1 confers tolerance to inhibitory luminal calcium”, Plant j. 58: 715-723); y se filtraron a 100Hz con filtro de paso bajo. El baño y la solución de la pipeta eran idénticas con relación a su formulación con excepción del pH (100 mM KCl, 2 mM MgCb, 1 mM CaCb, 450-500 Osmol x kg-1, ajustadas con D-sorbitol). El valor pH del baño se ajustó en 7,4 (Hepes/Tris) y el valor pH de la solución de la pipeta en 5,5 (Mes/Tris). Para medir un flujo de protones inducido por azúcar se aplicaron glucosa o sacarosa en el lado citoplasmático de la membrana vacuolar, en cada caso en una concentración final de 50 mM.

Ejemplo 8: Análisis del proteoma membranoso de las vacuolas de células de la raíz pivotante de la remolacha azucarera

Para analizar la dotación proteínica de la membrana vacuolar de las células de raíz pivotante de la remolacha azucarera se aislaron las vacuolas de las células de raíz pivotante de remolachas azucareras (Beta vulgaris) de cinco meses de edad de la variedad “Belladonna KWS” y la membrana vacuolar se concentro mediante centrifugado de alta velocidad. Las proteínas de membrana hidrófobas se precipitaron con acetona de la fracción de tonoplasto repetidamente lavada, a continuación se resuspendieron en una solución de urea (8 M urea) y se sometieron a una digestión tríptica previamente al análisis LC-MS/MS.

En total se identificaron aproximadamente 400 proteínas diferentes en cada una de las preparaciones de tonoplasto concentradas. Una de estas proteínas, denominada a continuación BvTST2.1 (SEQ ID NO.: 1), estuvo presente en gran cantidad en todas las preparaciones efectuadas independientemente una de otra, tenía la signatura de un transportador de azúcar ([LIVMSTAG]-[LIVMFSAG]-(SH)-(RDE)-[LIVMSA]-[DE]-(TD)-[LIVMFYWA]-G-R-[RK]-X(4.6)-[GSTA]; Prosite Pattern PS00216, http://prosite.expasy.org/) y tuvo la mayor similitud al transportador de monosacárido vacuolar TMT2 de Arabidopsis thaliana (Figura 1)

Ejemplo 9: Genes para proteínas transportadoras de azúcar tonoplatidarias en el genoma de la remolacha azucarera Al reconocer el genoma de B. vulgaris fue posible identificar 4 genes paralogos que codifican para proteínas transportadoras de azúcar tonoplatidarias. El análisis filogenético (Figura 2) mostró que los transportadores de azúcar BvTST1 y BvTST3 son los más semejantes a los genes ortólogos AtTMT1 y AtTMT3 de Arabidopsis, en tanto que BvTST2.1 y BvTST2.2, un par de genes muy similar, tienen la mayor similitud de secuencia al ortólogo AtTMT2 de Arabidopsis (Figura 1). La secuencia de aminoácido de BvTST2.1 coincide en aproximadamente 68% con la de AtTMT2 y la similitud se encuentra en 84% (Figura 1).

Ejemplo 10: Localización subcelular de BvTST2.1

La localización subcelular de BvTST2.1 se investigó en estabilidad con mutantes de doble gen knockout Attst1-2 transformados con pUBQ:BvTST2.1-GFP.

El aislamiento de protoplastos de células mesófilas foliares y la liberación de vacuolas se efectuó de acuerdo con un procedimiento conocido (Yoo, S.D. et al (2007) “Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis”, Nat Protocol 1565-1572).

Un microscopio de exploración láser confocal (Leica TCS, Leica Microsystems, Wetzlar, DE) se usó para las tomas microscópicas fluorescentes. Todas las tomas se hicieron con un objetivo Leica HCX PLAPO 63X/1.20w motCORR CS. El procesamiento de las imágenes se efectuó con el Kit de Aplicación Leica “Advanced Fluorescence Lite Software”.

Tras la clonación del BvTST2.1mRNA completo se determinó la localización subcelular de la proteína expresando una proteína de fusión BvTST2.1-GFP estable en Arabidopsis. La fluorescencia verde que se observó en las células mesófilas foliares de mutantes de Arabidopsis que expresan estable BvTST2.1-GFP indicó que la proteína de fusión se localizaba en la membrana de las vacuolas que rodean estrechamente los cloroplastos.

Una digestión enzimática del tejido mesófilo de plantas que expresan BvTST2.1-GFP condujo a protoplastos intactos individuales. El siguiente tratamiento hiposomático de estos protoplastos llevó a la liberación de vacuolas estables de fosforescencia verde, mediante lo cual se confirmó la localización de BvTST2.1-GFP en el tonoplasto.

Ejemplo 11: Correlación de la expresión de BvTST2.1 y la concentración de sacarosa en las raíces pivotantes de la remolacha azucarera

Para investigar sobre una posible correlación entre la expresión de BvTST2.1 en las raíces pivotantes de la remolacha azucarera y la concentración de sacarosa de la remolacha azucarera, se determinó la expresión del gen BvTST2.1 en las variedades de remolacha azucarera “Belladonna KWS” y “Brigadier”.

La variedad “Belladonna KWS” es conocida como una variedad de remolacha azucarera que tiene una elevada concentración de sacarosa y ya a los dos meses de haber sido plantada tiene en las raíces pivotantes una concentración de sacarosa de aproximadamente 160 |imol x g-1 de peso fresco (Figura 3). Esta elevada concentración de sacarosa aumentó durante los siguientes tres meses de desarrollo alcanzó aproximadamente los 450 |imol x g-1 de peso fresco. Esto corresponde, con relación a las raíces pivotantes de dos meses de edad, un incremento del triple.

A diferencia de esto, las raíces pivotantes de la variedad “Brigadier” contenían menos de 70 |imol de sacarosa por peso fresco tras dos meses de crecimiento, y solamente acumularon aproximadamente 195 |imol de sacarosa por g de peso fresco en los tres meses siguientes (Figura 3).

En la comparación de la concentración de sacarosa en hojas y raíces pivotantes se pudo comprobar un contenido de sacarosa aproximadamente 30 veces más alto en las raíces pivotantes en comparación con las hojas, en tanto que la concentración de glucosa en las hojas se encontró por arriba del de las raíces pivotantes aproximadamente por el factor 80.

Las diferencias en la acumulación de sacarosa entre las diferentes variedades de remolachas azucareras también se reflejaron en la cantidad de los mRNA que codifican para BvTST2.1 (Figura 4). Tanto en las raíces pivotantes de la variedad “Belladonna KWS” como también en la variedad “Brigadier” las cantidades de mRNA para todos los cuatro transportadores de azúcar parálogos eran bajas tras dos meses de crecimiento.

Después de otro mes de crecimiento y desarrollo, la cantidad de mRNA para BvTST2.1 fue notablemente mayor en ambas variedades que las cantidades de mRNAs que codifican para BvTMT1, BvTMT2.2 y BvTMT3. Además, la cantidad de mRNA BvTST2.1 en las raíces pivotantes de la variedad “Belladonna KWS” fue aproximadamente 2,6 veces más alta que en las raíces pivotantes de la variedad “Brigadier” (Figura 4).

Durante otros dos meses de crecimiento no varió sustancialmente la cantidad de mRNA BvTST2.1 en ambas variedades, en comparación con la cantidad después de 3 meses de crecimiento, de manera que también después de una fase de crecimiento y desarrollo de cinco meses la cantidad de mRNA para BvTST2.1 en las raíces pivotantes de la variedad “Belladonna KWS” seguía siendo aproximadamente 2,6 veces más alta que en las raíces pivotantes de la variedad “Brigadier”.

Para obtener otras indicaciones sobre la importancia de la proteína BvTST2.1 para el acopio de sacarosa se determinaron las concentraciones foliares de glucosa, fructosa y sacarosa en remolachas azucareras de tres y cinco meses de edad de la variedad “Belladona KWS” (Figura 5), y se compararon con las cantidades de mRNA de los cuatro paralogos TST (Figura 6). A diferencia de las raíces pivotantes en las cuales el contenido de glucosa y fructosa fue muy bajo, estos dos monosacáridos se acumularon en las hojas. En las hojas de las remolachas azucareras de tres meses de edad, la concentración de glucosa y fructosa fue de entre 33 y 35 |imol/g de peso fresco, en tanto que la concentración de sacarosa se encontró por debajo de 15 |imol/g de peso fresco. Después de cinco meses de crecimiento, la concentración de cada uno de los tres azúcares fue de entre 6 y 9 |imol/g de peso fresco (Figura 5).

Fue notable que la cantidad de mRNA para BvTST2.1 en las hojas fue sin excepción generalmente menor que la cantidad de mRNA para BvTMT1, BvTMT2.2 y BvTMT3, en tanto que la cantidad de mRNA para BvTST2.1 en la raíz pivotante siempre fue más alta que la cantidad de mRNA para las otras isoformas (Figura 6).

Ejemplo 12: Transporte tonoplastidario de sacarosa mediado por BvTST2.1

Para comprobar la función de transporte de BvTST2.1 se usó la tecnología “Patch-Clamp” en vacuolas aisladas. Para este propósito se expresó transitoriamente una proteína de fusión BvTST2.1-GFP en células misófilas de Nicotiana benthaminana. Las vacuolas intactas de protoplastos transformados se pudieron identificar mediante su coloración verde tras una moderada lisis hipoosmótica.

Para reproducir el gradiente de protones fisiológico sobre el tonoplasto de las vacuolas aisladas, el medio que representa el contenido luminoso de la vacuola se reguló en la pipeta a un valor pH de 5,5, en tanto que el medio en la cámara (= baño), el cual representa el citosol, se ajustó en pH 7,5. Cuando se adicionó sacarosa al medio “citosólico” las vacuolas reaccionaron con una declinación del flujo de corriente dirigido fuertemente hacia abajo. La adición de sacarosa en el medio que rodea las vacuolas aisladas condujo a una corriente dirigida hacia dentro, que indica un antiporte de protones del transporte de sacarosa.

En ausencia de BvTST2.1 las vacuolas aisladas de N. benthaminana no mostraron una actividad de transporte de sacarosa/protones importante. A diferencia de esto, la adición de sacarosa en el medio de la cámara en el caso de

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un vector o elemento genético móvil, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, caracterizado porque la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria es específica para sacarosa,

en el que la especificidad de la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para sacarosa es 5 veces mayor con respecto a un monosacárido y en el que la molécula de ácido nucleico comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo:

a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, o una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que presenta una identidad de al menos 80% a la secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2;

b) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que es complementaria a una de las secuencias de nucleótido de acuerdo con a);

c) una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácido presenta una identidad de al menos 80% a la SEQ ID No : 1.

2. Una célula huésped eucariótica o procariótica, que comprende el vector o el elemento genético móvil de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una célula vegetal transgénica, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria tal como se define en la reivindicación 1, como transgén, o el vector o el elemento genético móvil de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Una planta transgénica o una parte de la misma, que comprende al menos una célula vegetal transgénica de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una semilla de la planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 4, presentando la semilla una molécula de ácido nucleico, que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria tal como se define en la reivindicación 1, como transgén o el vector o el elemento genético móvil de acuerdo con la reivindicación 1.

6. Un procedimiento para producir una planta transgénica, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: (a) introducir una molécula de ácido nucleico, que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria tal como se define en la reivindicación 1, o del vector o del elemento genético móvil de acuerdo con la reivindicación 1 en al menos una célula de una planta, y

(b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal obtenida en la etapa a).

7. Un procedimiento para elevar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta mediante sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1, que codifica para la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria en al menos una célula de la planta.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la sobreexpresión se consigue mediante modificación genética de un elemento regulador endógeno, estando el elemento regulador endógeno enlazado operativamente con el ácido nucleico que codifica para la proteína.

9. Un procedimiento para identificar una planta que es adecuada para producir una mayor concentración de sacarosa en su órgano acopiador de sacarosa, que comprende identificar una molécula de ácido nucleico, que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, tal como se define en la reivindicación 1.

10. Un oligonucleótido adecuado para el uso como marcador molecular, que es diagnóstico para la identificación de una molécula de ácido nucleico, que codifica para una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, tal como se define en la reivindicación 1, seleccionándose el oligonucleótido del siguiente grupo: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26.

11. El uso de una proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria para elevar la concentración de sacarosa de un órgano acopiador de sacarosa de una planta mediante sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína antiporter de protones/azúcar tonoplastidaria, y comprendiendo la molécula de ácido nucleico lo siguiente:

i. una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, o con una secuencia de nucleótido que presenta una identidad de al menos 80% con respecto a una de las secuencias de nucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14;

ii. una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que es complementaria a una de las secuencias de nucleótido según i.; o

iii. una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13, o que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido que presenta una identidad de al menos 80% con respecto a una de las secuencias de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13.

12. El uso según la reivindicación 1, en el que la sobreexpresión se consigue mediante modificación genética de un elemento regulador endógeno.