BR112016023624B1

BR112016023624B1 - Vetor ou elemento genético móvel, célula bacteriana transgênica, uso de uma proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica, bem como métodos para produzir uma planta transgênica, para aumentar a concentração de sacarose de um órgão de armazenamento de sacarose de uma planta, e para identificar uma planta que é adequada para a produção de uma concentração aumentada de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose

Info

Publication number: BR112016023624B1
Application number: BR112016023624-6A
Authority: BR
Inventors: Wolfgang Koch; Norbert Sauer; Petra Wirsching; Benjamin Pommerrenig; Ekkehard Neuhaus; Benjamin Jung; Ulf-Ingo Flügge; Frank Ludewig; Nicole Wöstefeld; Irene Marten; Rainer Hedrich; Alexander Schulz
Original assignee: Kws Saat Se; Südzucker AG
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2023-10-03
Also published as: CA2945416C; HUE049853T2; DE102014005337A1; ZA201607612B; EA201691953A1; AU2015245634B2; MX2019011224A; CN106471124B; CA2945416A1; ES2778273T3; US10961543B2; PL3129394T3; PH12016502024B1; DK3129394T3; MX2016013211A; LT3129394T; PH12016502024A1; EP3129394A1; AR100122A1; CN106471124A

Abstract

a invenção refere-se a proteínas de antiporte prótons/ açúcar tonoplásticas, particularmente a proteínas de antiporte prótons/ sacarose tonoplásticas, a suas sequências codificadoras de nucleotídeos e à sua utilização para a produção de plantas transgênicas com uma alta concentração de sacarose. a invenção compreende também um processo para produção de plantas transgênicas com uma alta concentração de sacarose, processo para o aumento da concentração de sacarose em plantas, assim como à identificação de plantas que são apropriadas para produzir uma concentração de sacarose mais elevada.

Description

[0001] A presente invenção situa-se no campo do processamento industrial do açúcar de plantas úteis, e refere-se ao aumento da produção de sacarose no cultivo de culturas agrícolas de plantas úteis. Em particular, a invenção refere-se a proteínas de antiporte prótons/ açúcar tonoplásticas, em particular proteínas de antiporte prótons/sacarose, e aos ácidos nucleicos que as codificam, assim como ao seu emprego para o aumento da concentração de sacarose de um órgão armazenador de sacarose de plantas úteis.

[0002] Açúcar, por um lado, é um termo coletivo para todos os monossacarídeos e dissacarídeos com sabor doce, por outro lado, é também a denominação comercialmente usual para o dissacarídeo sacarose. Sacarose é o açúcar caseiro convencional, ou açúcar cristal, e é também denominado sucrose. Sacarose é um dímero de cada molécula α-D-glucose e β-D-frutose, que estão ligadas entre si por uma ligação α,β-1,2-glicosidica.

[0003] Sacarose é formada em plantas por meio da fotossíntese. A biossíntese de sacarose ocorre no citoplasma das células das plantas. Para isso, ambos os triosefosfato glicerinaldeído-3-fosfato e dihidroxiacetonafosfato, que surgem como um ganho líquido na assimilação de carbono da fotossíntese (ciclo de Calvin), são exportados dos cloroplastos para o citosol. No citosol das células das plantas, os monossacarídeos UDP-glucose e frutose-6-fosfato são formados a partir dos triosefosfatos. Para isso é formado, primeiramente, frutose-1,6-bisfosfato por meio de uma reação de condensação entre glicerinaldeído-3-fosfato e dihidroxiacetonafosfato. Frutose-1,6-bisfosfato é então reagido por desfosforilação para formar frutose-6-fosfato. A partir de frutose-6-fosfato também pode ser formado, por isomerização, glucose-6-fosfato que, após transisomerização anterior, para formar glucose-1-fosfato, reage com trifosfato de uridina (UTP) para formar uridinadifosfato-glucose (UDP- glucose). A condensação subsequente de UDP-glucose e frutose-6- fosfato formando sacarose-6-fosfato é catalisada pela enzima sacarose- fosfato-sintase. A energia necessária para isso é fornecida pela dissociação de difosfato de uridina (UDP). Por fim o resíduo de fosfato de sacarose-6-fosfato é dissociado em uma reação irreversível pela enzima sacarose-fosfato-fosfatase, de modo que sacarose é produzida.

[0004] A sacarose é um dissacarídeo não redutor e, portanto, o mais importante transportador de açúcar em plantas. A sacarose é novamente sintetizada nas folhas das plantas e transportada através do floema para seus órgãos armazenadores, onde ela é acumulada nos vacúolos das células das plantas locais como nutriente e fonte de energia.

[0005] Para a produção industrial de sacarose são importantes, sobretudo, as beterrabas (Beta vulgaris subsp. vulgaris), a cana-de- açúcar (Saccharum officinarum) e o açúcar de palmas (Arenga pinnata, Syn.: Arenga saccharifera Labil., principalmente na Indonésia). Em menores quantidades, a sacarose também é obtida do suco do bordo açucareiro (Acer saccharum). Essas plantas são utilizadas para obtenção de sacarose, devido ao seu teor extraordinariamente alto de sacarose.

[0006] Na cana-de-açúcar, o açúcar - principalmente sacarose - é encontrado na medula das plantas (seu órgão armazenador de sacarose) em um teor usual de 10 até 20 %. O açúcar de cana é obtido por cristalização e refino do suco da planta obtido por prensagem.

[0007] A beterraba é uma planta bianual que fornece, no primeiro ano um um estoque de açúcar no corpo da beterraba, que serve no segundo ano como alimento na floração das plantas. A obtenção do açúcar ocorre usualmente a partir de pedaços de beterraba em um processo de extração com água. O extrato pode então ser reagido com óxido de cálcio, para precipitar os ácidos das plantas, tais como, o ácido oxálico ou o ácido tartárico e a albumina. O cálcio em excesso é eliminado pela introdução de dióxido de carbono. Através da evaporação subsequente da água da solução de açúcar, sob vácuo, obtem-se uma solução semelhante a um xarope. O açúcar recristalizado é separado por centrifugação do xarope marrom remanescente. O resíduo, o melaço, é empregado como ração ou é empregado para a fermentação alcoólica. Uma purificação do açúcar (refino) ocorre por recristalização, filtração e por evaporação a vácuo.

[0008] Através de décadas de esforços no melhoramento de plantas armazenadoras de sacarose, conseguiu-se obter um significativo aumento no rendimento dos órgãos armazenadores de sacarose e na concentração de sacarose. Por exemplo, nas variedades de beterrabas cultivadas atualmente para a obtenção de açúcar, a concentração de sacarose do corpo da beterraba é de cerca de 15 até 20 % em peso, baseado no peso fresco do corpo da beterraba. Todavia as concentrações de sacarose obtidas não são sempre satisfatórias.

[0009] A presente invenção tem, portanto, como objeto, fornecer plantas com uma maior concentração de sacarose e encontrar processos com os quais a concentração de sacarose de plantas, em particular a de beterraba e de cana-de-açúcar, possa ser aumentada.

[00010] No pedido de patente internacional aberto à inspeção pública WO 2010/072210 A1 é divulgado um processo para o aumento do rendimento de sacarose na produção agrícola de beterraba. No processo são utilizadas plantas de beterraba ou cana-de-açúcar cuja característica genética está voltada para a redução da atividade enzimática de uma invertase. Para isto, um ácido nucleico que em uma célula de planta é apropriado para a redução da atividade enzimática de uma invertase, é empregado aqui para formação de um órgão de armazenamento de sacarose de uma planta, no qual a concentração de sacarose, comparada com a concentração de sacarose de um órgão de armazenamento de sacarose de controle não modificado do mesmo genótipo, é aumentada em um estágio de desenvolvimento similar.

[00011] Os vacúolos vegetais desempenham um papel central no armazenamento de longo ou curto prazo de açúcares, já que os vacúolos como organelas retêm um volume de cerca de 90% em uma célula de planta fotosintéticamente ativa (Martinola, E. et al. (2007) "Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism", J. Exp. Bot. 58: 83-102). Vacúolos, devido a seu tamanho são, portanto, de imenso significado para o armazenamento de açúcares (Neuhaus, H.E. (2007) "Transport of primary metabolites across the plant vacuolar membrane", FEBS Lett. 581: 2223-2226). Tecidos armazenadores, como o da raiz primária da beterraba sacarina (Beta vulgaris) e a marca de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), acumulam grandes quantidades de sacarose nos vacúolos das células de seus órgãos armazenadores, para poder utilizá-los como fonte de energia para seu metabolismo de planta.

[00012] Em diversas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como Nedicago (número de identificação AC131026), Vitis vinifera (número de identificação AAX47312) e arroz (Oryza sativa; número de identificação Os02g13560), foram descobertas proteínas que são responsáveis para o transporte de açúcar do citoplasma das células das plantas para os seus vacúolos. Nas plantas Arabidopsis identificou-se um gene, cujo produto proteína é um transportador de açúcar, que está localizado na membrana dos vacúolos das células fotossinteticamente ativas, e que pode importar glicose do citosol para os vacúolos (Wormit, A. et al. (2006) "Molecular identification and physiological characterization of a novel monosaccharide transporte from Arabidopsis involved invacuolar sugar transport", Plant Cell 18: 3476-3490). Essa proteína transporte, designada de transportadora de monossacarídeos tonoplástica (TMT), está localizada na membrana dos vacúolos, os tonoplastos. A proteína transportadora de monossacarídeos tonoplástica (TMT) compreende três isoformas na Arabidopsis thaliana, que são denominadas AtTMT1, AtTMT2 e AtTMT3. Os genes para AtTMT1 e AtTMT2 apresentam uma amostra de expressão específica de tipo de tecido e tipo de célula, enquanto o gene AtTMT3 é expresso apenas muito fracamente. Com o nocaute de genes TMT pode-se mostrar que as plantas assim modificadas, em comparação com as plantas do tipo selvagem, acumulam visivelmente menos glicose e frutose em seus vacúolos. Tendo em vista a acumulação de sacarose, entretanto, não puderam ser comprovadas diferenças entre as plantas do tipo selvagem e os nocautes de genes TMT.

[00013] O transportador de monossacarídeos tonoplásticos TMT1 de Arabidopsis thaliana foi caracterizado eletrofisiologicamente como antiporte de glicose e antiporte de sacarose ativado por prótons, que transportam glicose e sacarose, com quase a mesma especificidade, através da membrana dos vacúolos (Schulz, A. et al. (2011) "Proton- driven sucrose symport and antiport are provided by the vacuolar transporters SUC4 and TMT1/2", The Plant Journal 68: 129-136). No mesmo artigo a proteína de transporte de sacarose SUC4 de Arabidopsis thaliana também é caracterizada como próton/ simporte de sacarose, que igualmente deve estar localizado na membrana dos vacúolos.

[00014] No pedido de patente internacional WO 2011/120549 A1 publicado é divulgado que a superexpressão do transportador de monossacarídeo tonoplástico AtTMT1 em plantas aumenta a produção das sementes, ou que o teor de proteína e de óleo das sementes é aumentado, ou que contrariamente, pode ser promovido o crescimento antecipado de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas em um órgão armazenador. Um enriquecimento de sacarose em um órgão armazenador, por outro lado, não é divulgado.

[00015] Com base neste fundamento, a tarefa que tem como base a presente invenção foi solucionada pela identificação da proteína responsável pela importação de açúcar para os vacúolos das células da raiz primária de beterrabas sacarinas, particularmente a proteína responsável pela importação de sacarose para os vacúolos das células da raiz primária de beterrabas sacarinas, que é específica para sacarose. Com a identificação dessas proteínas, em particular com a identificação dessa primeira proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica específica para sacarose, e das sequências de nucleotídeos que codificam essas proteínas, são assim preparados processos de cultivo e/ou de reprodução e/ou genético moleculares para o aumento da concentração de sacarose em plantas e, portanto, também plantas com uma maior concentração de sacarose.

[00016] De acordo com um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica. De preferência a molécula de ácido nucleico é uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, que é específica para sacarose. A seguir uma tal proteína de antiporte prótons/açúcar, que é específica para sacarose, também é denominada proteína de antiporte prótons/ sacarose.

[00017] De acordo com um segundo aspecto, a invenção se refere a um gene recombinante, compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto, ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, de preferência para uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica. A molécula de ácido nucleico pode estar ligada operativamente com pelo menos um elemento regulatório.

[00018] De acordo com um terceiro aspecto, a invenção se refere a um vetor ou a um elemento genético móvel, compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto ou um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto.

[00019] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira eucariôntica ou a uma célula hospedeira procariôntica que, de acordo com o primeiro aspecto, compreende uma molécula de ácido nucleico, de preferência como transgene, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto, ou um vetor ou elemento genético de acordo com o terceiro aspecto.

[00020] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a uma proteína, que funciona como antiporte de prótons/açúcar tonoplástica, que de preferência é específica para sacarose, ou que funciona, de preferência, como antiporte de prótons/ sacarose tonoplástica.

[00021] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a uma célula de planta transgênica, que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto como transgênico, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto como transgênico, ou um vetor ou elemento genético móvel de acordo com um terceiro aspecto, assim como a uma planta transgênica ou parte delas que compreendem, pelo menos, uma tal célula de plantas transgênicas.

[00022] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a sementes de uma planta transgênica de acordo com o aspecto anterior, sendo que as sementes apresentam uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto como transgênica, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto como transgênico, ou um vetor ou elemento genético móvel de acordo com um terceiro aspecto.

[00023] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere a um processo para a produção de plantas transgênicas.

[00024] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere a um processo para o aumento da concentração de sacarose de um órgão armazenador de sacarose de uma planta.

[00025] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere a um processo para a identificação de uma planta, que é apropriada para produzir um aumento de concentração de sacarose em um órgão de armazenamento de sacarose da planta.

[00026] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere a oligonucleotídeos, que são apropriados para o uso como marcador molecular para a detecção diagnóstica de uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto.

[00027] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere a anticorpos que são para diagnóstico de uma proteína, que funciona como antiporte de prótons/açúcar tonoplástica, que de preferência é específica para sacarose, ou que funciona de preferência como antiporte de prótons/sacarose tonoplástica.

[00028] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere a o emprego de proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas para o aumento da concentração de sacarose de um órgão armazenador de uma planta.

[00029] A Figura 1 mostra uma tabela, a partir da qual aparece a identidade e a similaridade das sequências de aminoácidos das três proteínas transporte de monossacarídeos tonoplásticas parálogas (TMT) de Arabidopsis thaliana com as quatro proteínas transporte (ST) de açúcar tonoplásticas parálogas de Beta vulgaris.

[00030] A Figura 2 mostra um cladograma, no qual são apresentadas as relações filogenéticas das três proteínas transporte de monossacarídeos tonoplásticas parálogas (TMT) de Arabidopsis thaliana e as quatro proteínas transporte de açúcar tonoplásticas parálogas (TST) de Beta vulgaris.

[00031] A Figura 3 mostra um diagrama em colunas, que ilustra a concentração de sacarose em raízes primárias de idades diferentes de duas variedades de beterraba sacarina.

[00032] A Figura 4 mostra um diagrama em colunas, a partir do qual as quantidades relativas de mRNA dos quatro genes TST parálogos de Beta vulgaris de dois diferentes tipos de beterraba sacarina emergem em diferentes tempos de desenvolvimento.

[00033] A Figura 5 mostra um diagrama em colunas, que representa a concentração de diferentes açúcares nas folhas das espécies de beterraba sacarina "Belladonna KWS" em diferentes tempos de desenvolvimento.

[00034] A Figura 6 mostra um diagrama em colunas, a partir do qual a quantidade relativa de mRNA para os quatro genes parálogos BvTST em folhas das espécies de beterraba sacarina "Belladonna KWS" emerge em diferentes tempos de desenvolvimento.

[00035] A Figura 7 é um diagrama em colunas, que mostra a modificação na densidade de corrente de diferentes açúcares (sacarídeos) induzida em vacúolos de células

[00036] mesófilas transientemente transformadas.

[00037] Os inventores identificaram a proteína denominada aqui de BvTST2.1, como uma das proteínas na membrana dos vacúolos das células da raiz primária da beterraba sacarina disponíveis em quantidades mais frequentes e verificaram, surpreendentemente, que a proteína BvTST2.1 pode importar, como transportadores de açúcar tonoplásticos, especificamente a sacarose do citosol para os vacúolos das células de plantas. Portanto essa proteína, assim como, as proteínas com a mesma função - representam não apenas transportadores de açúcar tonoplásticos (TST), mas são a seguir também denominados transportadores de sacarose tonoplásticos ou antiporte de prótons/sacarose tonoplástica, onde "Bv", que na abreviação aqui empregada representa Beta vulgaris, é o organismo no qual essa proteína foi originalmente identificada. A proteína BvTST2.1 foi identificada pelos inventores como uma proteína de antiporte prótons/açúcar altamente específica para sacarose e representa o primeiro substituinte conhecido dessa família de proteínas transporte de prótons/açúcar de plantas. Além disso, a identificação de três outras isoformas parálogas, BvTST1, BvTST2.2 e BvTST3 também teve êxito e, funcionalmente, talvez sejam atribuíveis às proteínas TMT da Arabidopsis conhecidas.

[00038] Partindo da identificação desses novos antiportes, específicos para sacarose, os inventores também identificaram a proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, assim como identificaram as outras isoformas codificadoras das sequências de nucleotídeos.

[00039] Portanto a invenção se refere, segundo o primeiro aspecto a moléculas de ácido nucleico, que codificam uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, de preferência uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica.

[00040] De acordo com uma forma de execução a molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína de antiporte prótons /sacarose tonoplástica, compreeende uma molécula de ácido nucleico, selecionada do grupo: a) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 2, ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que apresenta uma identidade de pelo menos 80% para a sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 2; b) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que complementarmente às sequências de nucleotídeos está de acordo com a); c) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que pode hibridizar acordo com a) ou b); d) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1, ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que codifica um polipeptídeo, cuja sequência de amino ácido apresenta uma identidade de pelo menos 80% em relação à sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1; e e) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que codifica um homólogo, um análogo ou um ortólogo do polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 1. De acordo com uma outra forma de execução a molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, compreende uma molécula de ácido nucleico, selecionada do grupo: a) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 4, 6 ou 8, ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que apresenta uma identidade de pelo menos 80% com relação à sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 4, 6 ou 8; b) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que é complementar a uma das sequências de nucleotídeos de acordo com a); c) uma molécula de ácido nucleido, que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de acordo com a) ou b); d) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, 5 ou 7, ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que codifica um polipeptídeo, cuja sequência de aminoácidos apresenta uma identidade de pelo menos 80% em relação à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 3, 5 ou 7; e e) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que codifica um homólogo, um análogo ou um ortólogo do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 3, 5 ou 7.

[00041] O termo "molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos" compreende não apenas moléculas de ácido nucleico cuja sequência de nucleotídeos consiste na sequência de nucleotídeos aqui referida, mas também moléculas de ácido nucleico que, além das sequências de nucleotídeos aqui referidas, apresentam adicionalmente, pelo menos um nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeos.

[00042] De acordo com uma forma de execução alternativa e/ou adicional, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7. A molécula de ácido nucleico também pode codificar uma sequência de aminoácidos, na qual pelo menos um radical aminoácido da sequência de aminoácidos, que possui propriedades químicas semelhantes, é substituída por um aminoácido (conservadoramente ou semiconservadoramente). Por uma substituição de aminoácidos conservadora, um aminoácido é substituído por um outro aminoácido com propriedades químicas semelhantes. Por uma substituição de aminoácido semiconservadora, um aminoácido é substituído por um outro aminoácido com conformação estérica semelhante. A substituição de preferência não tem consequências para a função proteína. Exemplos de aminoácidos trocadores são Asp e Glu, Leu e Ile, Ala e Val, Arg e Lys, assim como, Phe e Trp.

[00043] De acordo com uma forma de execução alternativa e/ou adicional, as sequências de nucleotídeos dos ácidos nucleicos e/ou as sequências de aminoácidos, que são codificadas pelas sequências de nucleotídeos, apresentam uma identidade de pelo menos 80%, pelo menos 85%, de preferência de pelo menos 90%, particularmente preferido de pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, e muito particularmente preferido de pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 a saber a sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7.

[00044] O termo aqui empregado "hibridizante" significa hibridizante sob condições usuais, como eles são descritos em Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), de preferência sob condições estritas. Condições de hibridização estritas são por exemplo: Hibridização em 4 x SSC a 65 °C e em seguida múltiplas lavagens em 0,1 x SSC a 65 °C por no total cerca de 1 hora. Condições de hibridização menos estritas são por exemplo: hibridização em 4 x SSC a 37°C e em seguida múltiplas lavagens em 1 x SSC a temperatura ambiente. "Condições de hibridização estritas" também pode significar: Hibridização a 68 °C em fosfato de sódio 0,25 M, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA e 1 % BSA por 16 horas e em seguida duas lavagens com 2 x SSC e 0,1 % SDS a 68°C.

[00045] No sentido da invenção, por "específico para sacarose" ou "altamente específico para sacarose", ou "transporte específico para sacarose" ou, "transporte altamente específico para sacarose", ou "especificidade para sacarose" ou "sacarose especificidade", é compreendido que a especificidade de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica para sacarose, em comparação com um outro açúcar, é pelo menos 5 vezes, 10 vezes ou 15 vezes, de preferência pelo menos 18 vezes, 20 vezes, 22 vezes, 24 vezes, 26 vezes ou 28 vezes, particularmente preferido pelo menos 30 vezes, pelo menos 31 vezes, pelo menos 32 vezes, pelo menos 33 vezes, pelo menos 34 vezes, pelo menos 35 vezes, pelo menos 36 vezes, pelo menos 37 vezes, pelo menos 38 vezes ou pelo menos 39 vezes, e muito particularmente preferido pelo menos 40 vezes maior. Além disso, isto pode representar que a especificidade de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica para sacarose, em comparação com um monossacarídeo, tal como glicose ou frutose, é maior pelo menos 5 vezes, 10 vezes ou 15 vezes, de preferência pelo menos 18 vezes, 20 vezes, 22 vezes, 24 vezes, 26 vezes ou 28 vezes, particularmente preferido pelo menos 30 vezes, pelo menos 31 vezes, pelo menos 32 vezes, pelo menos 33 vezes, pelo menos 34 vezes, pelo menos 35 vezes, pelo menos 36 vezes, pelo menos 37 vezes, pelo menos 38 vezes ou pelo menos 39 vezes, e muito particularmente preferido, pelo menos 40 vezes.

[00046] No sentido da invenção, por "homólogo" compreende-se uma proteína da mesma origem filogenética, por um "análogo" compreende-se uma proteína, que exerce a mesma função, que, entretanto, tem uma outra origem filogenética, e por um "ortólogo" compreende-se uma proteína de uma outra espécie, que exerce a mesma função.

[00047] De acordo com o segundo aspecto, a invenção refere-se a um gene recombinante, compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que de preferência codifica uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica. A molécula de ácido nucleico pode estar conectada operativamente com pelo menos um elemento regulador.

[00048] Compreende-se por um elemento "regulador" as sequências de nucleotídeos, que não fazem parte da sequência de nucleotídeos codificadores de proteína, mas que transmitem a expressão da sequência de nucleotídeos codificadora de proteína. Elementos reguladores são por exemplo, promotores, elementos regulatores cis, aumentadores, introns ou terminadores. Dependendo do tipo do elemento regulador, este está disposto na molécula de ácido nucleico na frente (portanto de 5’) ou atrás (portanto de 3') da sequência de nucleotídeos codificadora de proteína. Os elementos reguladores são funcionais em uma célula de planta viva.

[00049] O termo "operacionalmente ligado" significa que um elemento regulador está conectado de tal forma com a sequência de nucleotídeos codificadora de proteína, posicionado, portanto, por exemplo, em uma molécula de ácido nucleico, que uma expressão da sequência de nucleotídeos codificadora de proteína pode ocorrer, sob controle do elemento regulador, em uma célula viva.

[00050] No sentido da presente invenção, um "promotor" é uma expressão de uma sequência de nucleotídeos reguladora de um gene, que normalmente está na extremidade 5' de um gene e que transmite, via interação com determinadas proteínas de ligação com DNA, o início da transcrição por RNA polimerase. Exemplos de promotores, que são funcionais nas células de plantas, compreendem promotores constitutivos, tais como promotores virais, por exemplo, o promotor CaM35S, um promotor CaM35S duplo, ou como promotores de plantas, por exemplo, promotores de ubiquitina conforme descrito na EP 0 305 668 e US 6.528.701. Além disso, também podem ser empregados promotores que, por exemplo, apresentam atividade específica a determinadas fases de desenvolvimento ou induzibilidade por fatores ambientais, tais como, estresse biótico ou estresse abiótico, ou uma especificidade de tecido. Por exemplo, são empregáveis aqueles promotores que mostram uma elevada especificidade para o órgão de armazenamento de sacarose ou partes dele, portanto, são especialmente ativos no órgão de armazenamento de sacarose ou em partes dele. Para a beterraba sacarina o promotor, por exemplo, pode ser um promotor específico para raízes ou específicos para raizes retas. Esses são conhecidos suficientemente pelo especialista do estado da técnica: WO 02/40687, Oltmanns, H. et al. (2006) "Taproot promoters cause tissue specific gene expression within the storage root of sugar beet", Planta 224: 485-495, Noh, Seol Ah, et al. (2012) "A sweetpotato SRD1 promoter confers strong root-, taproot-, and tuber-specific expression in Arabidopsis, carrot, and potato", Transgenic research 21: 265-278. Para a beterraba sacarina, de preferência, podem ser empregados promotores específicos de talos, como eles são conhecidos, por exemplo, a partir de Goshu Abraha, Tsion. "Isolation and characterisation of a culm-specific promoter element from sugarcane", Diss. Stellenbosch: University of Stellenbosch, 2005; Govender, C. "Stem specific promoters from sorghum and maize for use in sugarcane". Diss. Stellenbosch: Stellenbosch University, 2008; e Mudge, S.R. et al. (2013) "Mature-stem expression of a silencingresistant sucrose isomerase gene drives isomaltulose accumulation to high levels in sugarcane", Plant Biotechnology Journal 1: 502-509).

[00051] Como promotores mostraram ser apropriados, além disso, também os promotores sintéticos. Trata-se aqui de promotores criados por técnicas de biologia molecular, que nesta forma de realização não são encontrados na natureza. Um promotor sintético é um promotor minimalístico, que além de um promotor mínimo contem apenas um ou mais elementos cis definidos selecionados. Esses elementos cis são locais de ligação para proteínas de ligação ao DNA como fatores de transcrição, e são isolados de promotores naturais, derivados dos elementos cis já isolados ou gerados por técnicas de recombinação orientadas ao acaso, e selecionados por processos apropriados, em comparação com um promotor natural, um promotor sintético é ativado, devido a sua construção menos complexa, apenas por poucos fatores exógenos e endógenos e, por isso, é regulado mais especificamente.

[00052] O "promotor mínimo" ou "promotor core" é uma sequência de nucleotídeos, que contem os locais de ligação para o complexo do fator de transcrição basal e permite a iniciação acurada da transcrição por RNA-polimerase II. Motivos de sequência característica do promotor mínimo são as TATA-Box, o elemento iniciador (lnr), o "TFBII recognition element" (BRE) e o "downstream core promoter element" (OPE). Esses elementos podem estar sozinhos no promotor mínimo ou ocorrer em combinação. O promotor mínimo é obtenível, ou são obteníveis seus motivos de sequência, por exemplo, de um gene qualquer de plantas, bacterianos, fúngicos ou virais.

[00053] "Elementos cis" são sequências de nucleotídeos, que estão na mesma molécula de ácido nucleico que a sequência de nucleotídeos codificadora de proteína, a ser expressa. Elementos cis não devem codificar nem RNA nem proteínas e podem estar na direção de transcrição antes ou depois da sequência de nucleotídeos codificadora de proteína a ser expressa. Elementos cis a montante de uma sequência de nucleotídeos codificadora de proteínas a ser expressa representam frequentemente motivos de ligação necessários para fatores de transcrição particulares, que intervêm aqui como elementos que agem trans (do lat. trans ‘através‘) visto molecularmente do outro lado na regulagem da transcrição desse gene. Além disso, os elementos cis que levam a uma inibição da transcrição são denominados Silencer (silenciadores). Elementos cis, que levam a um reforço da transcrição são denominados Enhancer (reforçadores). A totalidade das atividades cis/trans no promotor determina finalmente a intensidade com a qual a RNA-polimerase realiza a transcrição.

[00054] Além disso, um promotor pode se tratar também de um promotor quimérico e/ou de um promotor que foi modificado por um elemento cis. A modificação de um promotor pode representar assim também a introdução adicional de um elemento cis no promotor, que já apresenta por exemplo, naturalmente um elemento cis. Além disso, a modificação também compreende uma multimerização de um elemento cis, especialmente uma multimerização de um elemento cis naturalmente presente. Um tal promotor modificado pode apresentar, em comparação com as propriedades modificadas com a versão nativa tendo em vista por exemplo a especificidade, nível de expressão ou atividade fundamental.

[00055] Terminadores são sequências de nucleotídeos no DNA, que usualmente marcam o término de um gene e resultam na terminação da transcrição.

[00056] De acordo com uma forma de execução alternativa e/ou adicional, a sequência de nucleotídeos codificadora de proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas, em particular a sequência de nucleotídeos codificadora da proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica, e a sequência de nucleotídeos de pelo menos um elemento regulatório são heterólogas. Isto significa que elas provêm de diferentes espécies ou naturalmente não provêm da combinação prevista em uma espécie.

[00057] De acordo com um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um vetor ou a um elemento genético móvel, compreendendo uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos de acordo com o primeiro aspecto ou um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto.

[00058] Aqui, compreende-se por um vetor um veículo de transporte para uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto ou um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto, particularmente para a transferência de um ácido nucleico estranho em uma célula receptora viva. Uma célula receptora viva pode se tratar de uma célula eucariôntica ou uma célula procariôntica. Entre os vetores encontram-se por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, cromossomas de leveduras artificiais (YACs), cromossomas de bactérias artificiais (BACs) ou cromossomas artificiais P1 (PACs), mas também vírus modificados, tais como adenovírus, retrovírus e fagos.

[00059] Elementos genéticos móveis são sequências de nucleotídeos, cuja posição no genoma de um organismo é mutável. Entre os elementos genéticos móveis estão, por exemplo, as sequências de nucleotídeos egoístas, tais como transposons, retroelementos, sequências de inserção e inteínas, mas também grupos-II-Introns, plasmídeos inseridos e alguns bacteriófagos, tais como o fago Mu.

[00060] De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira eucariôntica ou célula hospedeira procariôntica, que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto como transgene, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto como transgene, ou um vetor ou elemento genético móvel de acordo com o terceiro aspecto como transgene. Isto significa que a molécula de ácido nucleico, o gene recombinante, e/ou o vetor ou o elemento genético móvel, foram introduzidos na célula hospedeira, por exemplo, por meio de transformação ou transfecção. Exemplos de células hospedeiras procariônticas são as bactérias do gênero A. tumefaciens, E. coli e B. subtilis. Exemplos de células hospedeiras eucariônticas são células de levedura, tais como Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, mas também células de origem animal ou de origem vegetal.

[00061] De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se a proteínas que funcionam como antiporte de prótons/sacarose tonoplásticas. Esse antiporte é específico para sacarose. De preferência a proteína é codificada por uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto.

[00062] De acordo com uma forma de execução, a proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica é selecionada do grupo das proteínas, que compreendem: a) uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1; b) uma sequência de aminoácidos, que tem uma identidade de pelo menos 80% à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1; c) um homólogo, um análogo ou um ortólogo da proteína de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[00063] A proteína de antiporte prótons / açúcar tonoplástica de acordo com a SEQ ID NO: 1, também denominada BvTST2.1, apresenta uma sequência de aminoácidos com um comprimento de 735 aminoácidos. Uma análise de hidrofobicidade indica, além disso, que BvTST2.1 aparentemente compreende 12 domínios de transmembrana hidrofóbicos e um grande loop hidrofílico localizado no centro, que conecta a sexta e a sétima transmembranas. A maior identidade de sequência é apresentada por BvTST2.1 com relação à proteína 2 transportadora de monossacarídeo tonoplástica de Arabidopsis thaliana (AtTMT2). A identidade de ambas essas sequências de aminoácidos é de 68% e elas apresentam, considerando-se as substituições de aminoácidos conservadores e semiconservadores, uma semelhança de sequência de 84% (Fig. 1).

[00064] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a proteínas que funcionam como antiporte de prótons/açúcar tonoplásticas. De preferência, a proteína é codificada por uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto.

[00065] De acordo com um modo de execução, a proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica do grupo das proteínas é selecionada, e a) apresentam uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, 5 ou 7; b) apresentam uma sequência de aminoácidos, que tem uma identidade de pelo menos 80% com relação à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, 5 ou 7; c) são um homólogo, um análogo ou um ortólogo da proteína de acordo com a SEQ ID NO: 3, 5 ou 7.

[00066] A proteína de antiporte de prótons/açúcar tonoplástica de acordo com a SEQ ID NO: 3 também é denominada de BvTST1, de acordo com a SEQ ID NO: 5 também é denominada de BvTST2.2 e de acordo com a SEQ ID NO: 7 também é denominada de BvTST3.

[00067] Já que a proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica identificada como Beta vulgaris BvTST2.1, como também as outras proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas BvTST1, BvTST2.2 e BvTST3 também apresentam identidades de sequências com relação às proteínas de transporte de outras plantas, as proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas compreendem, especialmente as proteínas de antiporte prótons/sacarose tonoplásticas, também proteínas, cuja sequência de aminoácidos tem uma identidade de pelo menos 80% em relação à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7, de preferência de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, da mesma forma que os seus homólogos, análogos ou ortólogos. Aqui é irrelevante, em quais espécies essa proteína ocorre naturalmente ou se se trata de proteínas que não ocorrem naturalmente, e que são geradas por exemplo, por meio de métodos genéticos moleculares.

[00068] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere a uma célula de plantas transgênicas, que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto como transgene, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto como transgênico, ou um vetor ou um elemento genético móvel de acordo com o terceiro aspecto como transgene, assim como um transgênico de plantas ou partes dele, que compreendem pelo menos uma tal célula de planta. Até agora, as plantas transgênicas ou suas partes compreendem também uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto como transgene, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto como transgene, ou um vetor ou elemento genético móvel de acordo com o terceiro aspecto como transgene.

[00069] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a sementes de uma planta transgênica de acordo com o aspecto anterior, sendo que as sementes, e particularmente pelo menos uma célula embrionária da semente, compreendem uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto como transgene, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto como transgene ou um vetor ou elemento genético móvel de acordo com o terceiro aspecto.

[00070] Em uma forma de execução a célula da planta trata-se de uma célula de uma planta monocotiledônea. Em uma outra forma de execução a célula da planta trata-se de uma célula de uma planta dicotiledônea. De acordo com uma outra forma de execução e/ou forma de execução adicional, a célula da planta trata-se da célula de uma planta, que é selecionada do grupo das espécies ou gêneros ascendentes, que compreende Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum e Sorghum sp.. Por conseguinte, de acordo com uma outra forma de execução, a planta transgênica é selecionada do grupo que compreende Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum e Sorghum sp. De acordo com uma outra forma de execução, as partes de uma planta transgênica ou da semente de uma planta transgênica, provêm do grupo de plantas que compreende as Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum e Sorghum sp.

[00071] Em uma forma de execução adicional e/ou alternativa, a célula da planta transgênica, a planta transgênica, ou a parte da planta transgênica, que se trata de preferência se trata do órgão de armazenamento de sacarose da planta, apresenta uma maior concentração de sacarose do que a célula de plantas ou plantas isogênicas cultivadas sob condições de cultivo idênticas. Além disso, partes de uma planta podem estar ligadas com ou separadas das plantas inteiras intactas. Tais partes incluem por exemplo órgãos, tecidos, células, e sementes das plantas.

[00072] De preferência, a maior concentração de sacarose refere-se a uma alta concentração de sacarose nos vacúolos das plantas, em particular nos vacúolos de pelo menos uma célula do órgão armazenador de sacarose da planta. Particularmente preferido, uma planta com uma maior concentração de sacarose apresenta também um ganho de sacarose aumentado. Ganho aqui significa o rendimento de sacarose do órgão armazenador de sacarose com referência a uma área de cultivo definida (p. ex. um hectare) ou com referência ao peso de um órgão armazenador de sacarose levando em conta o teor de água no órgão armazenador de sacarose (de preferência, a normalização ocorre no peso fresco ou peso seco).

[00073] De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para preparação de plantas transgênicas, sendo que o processo compreende pelo menos as seguintes etapas: (a) introdução de uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto e/ou um vetor ou um elemento genético móvel de acordo com o terceiro aspecto, em pelo menos uma célula ou uma planta; e (b) regeneração da planta transgênica a partir da célula da planta obtida na etapa (a).

[00074] De acordo com uma forma de execução, a planta transgênica do processo anterior consegue concentrar mais sacarose nos vacúolos de suas células, de preferência nos vacúolos das células de seu órgão armazenador de sacarose, do que uma planta de controle isogênica, cultivada sob condições idênticas.

[00075] No sentido da presente invenção, são compreendidas por "plantas isogênicas" ou plantas de controle" ou "células de plantas isogênicas" aquelas plantas ou células de plantas que foram empregadas como material de partida para geração das plantas transgênicas ou células de plantas transgênicas. Assim, o genoma das plantas transgênicas e/ou células de plantas, na medida em que se referem a plantas ou células de plantas geneticamente modificadas, não se diferem uns dos outros nos genes geneticamente transferidos e/ou sequências de nucleotídeos introduzidas.

[00076] De acordo com uma forma de execução adicional e/ou alternativa, as plantas transgênicas exprimem ou superexprimem a sequência de nucleotídeos codificadora de proteína de antiporte prótons/açúcar em pelo menos uma célula.

[00077] A introdução da molécula de ácido nucleico, por exemplo, na via da transformação, pode ocorrer com técnicas, que são conhecidas basicamente pelo especialista. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico, por infecção de um tecido de planta ou uma célula de planta com Agrobacterium tumefaciens, que contem a sequência de ácido nucleico a ser transferida ao seu plásmídeo integrável no genoma da planta, pode ser introduzida nas células das plantas. Também é possível que a introdução seja aplicada por meio de um transferidor biolístico, com o qual o ácido nucleico a ser introduzido nas células das plantas é aplicado em partículas de ouro ou partículas de tungstênio, que em seguida são disparados com alta velocidade nas células. Uma outra possibilidade conhecida pelo especialista, qual seja a de introduzir ácido nucleico em uma célula de planta, consiste na transformação dos protoplastos, na qual ou polietileno glicol é acrescentado aos protoplastos na presença das moléculas de ácido nucleico ou os protoplastos são submetidos a um curto impulso de corrente, de modo que a membrana dos protoplastos se torna transientemente permeável às moléculas de ácido nucleico. Processos para a regeneração das plantas totais a partir de tecidos transformados ou células são igualmente conhecidos do estado da técnica pelos especialistas.

[00078] De preferência a molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto, o gene recombinante de acordo com o segundo aspecto e/ou o vetor ou o elemento genético móvel de acordo com o terceiro aspecto são incorporados estavelmente no genoma da célula das plantas. Isto significa que a sequência de ácido nucleico transferida pode ser estavelmente herdada após a regeneração de uma planta destas a uma planta progênie.

[00079] De preferência a transformação e a regeneração de beterrabas sacarinas ocorre segundo o método descrito por Lindsey (Lindsey K. (1991) "Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens". Plant Tissue Culture Manual B7: 1-13, Kluwer Academic Publisher).

[00080] A transgenia das plantas pode ser verificada por meio da reação em cadeia de polimerase com o emprego de iniciadores de oligonucleotídeos apropriados. Após a regeneração, os transformantes podem ser cultivados e autofecundados em estufas para obtenção de sementes.

[00081] Em uma forma de execução, as células de plantas a serem transformadas tratam-se de células de plantas monocotiledôneas. Em uma outra forma de execução, as células de plantas a serem transformadas tratam-se de células de plantas dicotiledôneas. De acordo com uma outra e/ou forma de execução adicional, as células das plantas a serem transformadas tratam-se de células de uma planta, que é selecionada do grupo das espécies ou dos gêneros ascendentes, que compreende Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum e Sorghum sp..

[00082] De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para elevação da concentração de sacarose de um órgão armazenador de sacarose de uma planta por expressão ou superexpressão de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, em particular de uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica, em pelo menos uma célula das plantas. A expressão ou superexpressão pode ocorrer por modificação genética de pelo menos uma célula das plantas e compreende: (1) a introdução de uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto, um gene recombinante de acordo com o segundo aspecto, e/ou um vetor ou elemento genético móvel de acordo com o terceiro aspecto, em pelo menos uma célula de uma planta, com o que uma expressão adicional ou uma superexpressão de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica é efetuada, ou (2) a modificação genética de um elemento regulador endógeno, tal como um promotor, que regula a expressão de um gene endógeno, que codifica uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, por exemplo, por inserção de elementos cis adicionais ou reforçadores, com o que é efetuada uma expressão aumentada da proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica.

[00083] Através da expressão ou superexpressão de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, especialmente de uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica, em pelo menos uma célula da planta, a importação de sacarose nos vacúolos da célula geneticamente modificada é aperfeiçoada. Com isso também a concentração de sacarose nos vacúolos dessa célula, comparado com a célula das plantas isogênicas, é aumentada.

[00084] Um "aumento da concentração de sacarose" ou uma "alta concentração de sacarose" ou uma "maior concentração de sacarose de um órgão armazenador de sacarose de uma planta" significa um aumento da concentração média de sacarose, baseado no peso fresco do órgão armazenador de sacarose, em comparação com uma planta de controle não transgênica (isogênica) cultivada sob condições idênticas, de pelo menos 0,2 %, 0,4 %, 0,6 %, 0,8 % ou 1 %, de preferência de pelo menos 1,2 %, 1,4 %, 1,6 %, 1,8% ou 2 %, particularmente preferido de pelo menos 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, ou 10%, e muito particularmente preferido de pelo menos 15 %.

[00085] No sentido da invenção, sob o termo "superexprimido" compreende-se que a quantidade de proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplásticos em uma planta célula de plantas ou seus tonoplastos é maior do que nas plantas isogênicas, células de plantas isogênicas ou seus tonoplastos.

[00086] De acordo com uma forma de execução, o processo para o aumento da concentração de sacarose de um órgão armazenador de sacarose de uma planta, compreende a expressão e/ou a superexpressão da sequência de nucleotídeos codificadora de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica de uma molécula de ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[00087] Para esse propósito, uma planta transgênica de acordo com o processo anteriormente descrito é preparada, sendo que a expressão e/ou superexpressão da(s) proteína(s) de antiporte prótons/açúcar tonoplástica(s) na planta transgênica conforme acima descrito pode ser possibilitada por diversas modificações genéticas.

[00088] Além disso, por exemplo, pode ser introduzido um construto de um promotor forte e uma sequência de nucleotídeos de acordo com o primeiro aspecto da invenção em uma célula de planta a ser transformada. Alternativamente, o promotor endógeno de um gene codificador de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, em particular de um gene codificador de uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica, pode ser de tal modo modificado que, na planta transgênica ele é mais fortemente ativo do que na planta de controle isogênica. Agentes para modificação de um promotor endógeno podem ser por exemplo, TALENs ou nucleases dedo de zinco. De acordo com uma outra alternativa, podem ser introduzidas na célula de plantas, cópias de genes adicionais do gene endógeno codificador de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, especialmente do gene endógeno codificador de uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica, inclusive seu promotor natural.

[00089] Em uma forma de execução alternativa e/ou adicional, a proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica é selecionada do grupo, que compreende proteínas BvTST2.1, homólogos, análogos e ortólogos deles.

[00090] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a um processo para identificação de uma planta que é apropriado para produzir uma concentração elevada de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose.

[00091] De acordo com uma forma de execução, as plantas a serem identificadas podem ser submetidas a uma identificação assistida por marcadores. Aqui o DNA de cada planta a ser pesquisada é isolado e ou submetido a uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores de oligonucleotídeo apropriados, de modo que da análise do produto de reação do PCR, ou por cromatografia em gel ou por meio de comprovação de fluorescência como em RT-PCR, podem ser identificadas aquelas plantas, que devido a sua composição genética, são apropriadas para produzir uma alta concentração de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose. De acordo com uma forma de execução adicional e/ou alternativa, a composição genética das plantas a serem identificadas também ocorre por meio de um polimorfismo de restrição de comprimento, no qual o DNA isolado é hidrolisado com diferentes endonucleases de restrição, os fragmentos de restrição são separados por cromatografia em gel, submetidos a "blotting" e hibridizados com uma sonda apropriada. Oligonucleotídeos exemplares apropriados para uma identificação de plantas transgênicas, que são apropriadas para produzir uma elevada concentração de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose, porque eles exprimem, ou superexprimem a sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 2, podem ser deduzidos do grupo de oligonucleotídeos que compreende a SEQ ID NO: 15 até a SEQ ID NO: 26. É do conhecimento do especialista como ele pode preparar oligonucleotídeos apropriados também para homólogos, análogos ou ortólogos da SEQ ID NO: 2.

[00092] De acordo com uma forma de execução adicional e/ou alternativa, a identificação das plantas, que são apropriadas para produzir uma elevada concentração de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose, ocorre não por meio de sua composição genética, mas por meio da expressão de suas proteínas de antiporte prótons/sacarose tonoplásticas. Isto pode ocorrer, por exemplo, no campo dos mRNA, no qual a quantidade de mRNA das sequências de desoxiribonucleotídeos codificadoras das proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas, especialmente das sequências de desoxiribonucleotídeos codificadoras das proteínas de antiporte prótons / sacarose tonoplásticas, é determinada por exemplo por "PCR quantitativo em tempo real". A determinação de uma quantidade maior de mRNA, codificadora de pelo menos uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, acima descrita, em uma planta, em um tecido de planta ou uma célula de planta, particularmente em um tecido ou uma célula do órgão armazenador de sacarose da planta, em relação com uma planta de comparação da mesma espécie ou uma parte dela ou em relação com um outro tecido de planta ou uma célula de planta da mesma planta, que não fazem parte do órgão armazenador de sacarose das plantas, vale como comprovação da adequação de uma planta para produzir uma concentração mais elevada de sacarose em seu órgão armazenador de sacarose.

[00093] Uma identificação das plantas, que são apropriadas para produzir uma elevada concentração de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose, também pode ocorrer em uma parte da planta pela comprovação quantitativa da quantidade de proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas, especialmente em proteínas de antiporte prótons/sacarose tonoplásticas. Para isso, é empregado o denominado Western-Blot, pelo qual as proteínas da parte da planta separadas eletroforeticamente, de preferência dos vacúolos, particularmente preferido da membrana dos vacúolos dessa parte, são incubadas com um anticorpo específico para uma ou mais proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas acima descritas. Por meio de um anticorpo secundário, que conecta um anticorpo específico a uma ou mais proteínas de antiporte prótons/açúcar tonoplásticas acima descritas, e que apresenta uma marcação detectável, pode-se determinar a quantidade de proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, especialmente de proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplástica, na parte da planta, e são identificadas as plantas que são apropriadas para produzir uma concentração de sacarose elevada em um órgão de armazenamento de sacarose. A determinação de uma quantidade maior de pelo menos uma proteína de antiporte prótons/sacarose tonoplásticas em uma planta, em uma parte de planta, ou uma célula de planta, especialmente em um tecido ou uma célula do órgão de armazenamento de sacarose da planta, em relação a uma planta de comparação da mesma espécie, ou uma parte dela, ou em relação a um outro tecido de planta, ou uma célula de planta da mesma planta, que não são parte do órgão de armazenamento de sacarose da planta, vale como comprovação da adequação de uma planta para produzir uma elevada concentração de sacarose em seu órgão armazenador de sacarose.

[00094] A presente invenção estende-se assim também às plantas identificadas com o processo anteriormente mencionado, que são apropriadas para produzir uma elevada concentração de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose. De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a oligonucleotídeos, que são apropriados para o emprego como marcador molecular para a comprovação diagnóstica de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspecto.

[00095] De acordo com uma forma de execução pelo menos um dos oligonucleotídeos apropriados do grupo é selecionado, que compreende os oligunucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. Esses podem ser empregados como marcadores moleculares, para a comprovação por diagnóstico de uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 2.

[00096] De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere ao anticorpo da invenção, que é diagnóstico para uma proteína, que funciona como antiporte prótons/açúcar tonoplástico, de preferência como antiporte prótons/sacarose tonoplásticos.

[00097] Em uma forma de execução, o anticorpo diagnóstico é um anticorpo monoclonal. Em uma forma de execução alternativa o anticorpo diagóstico é parte de um antisoro policlonal.

[00098] Em uma forma de execução adicional e/ou alternativa, o anticorpo diagóstico, por exemplo, é o antisoro policlonal específico para uma determinada proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica, como uma proteína de antiporte prótons / sacarose tonoplástica. De preferência, o anticorpo diagnóstico reconhece e acopla um epítopo no loop entre o sexto e o sétimo domínio da transmembrana de uma proteína de antiporte prótons/sacarose.

[00099] De acordo com um outro aspecto a invenção se refere ao emprego de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica para o aumento da concentração de sacarose de um órgão armazenador de sacarose de uma planta.

[000100] De acordo com uma outra forma de execução, o emprego de uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica compreende, para o aumento da concentração de sacarose de um órgão armazenador de sacarose de uma planta, o aumento da concentração de sacarose pela expressão ou sobreexpressão de uma molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína de antiporte prótons/açúcar tonoplástica. De preferência a molécula de ácido nucleico compreende: i. uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 14, ou com uma sequência de nucleotídeos, que apresenta uma identidade de pelo menos 80% em relação a uma das sequências de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 14; ii. uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, que é complementar a uma das sequências de nucleotídeos de acordo com i.; iii. uma molécula de ácido nucleico, que hibridiza com uma das moléculas de ácido nucleico de acordo com i. ou ii.; ou iv. uma molécula de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ou 13, ou que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos, que apresenta uma identidade de pelo menos 80% em relação a uma das sequências de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ou 13.

[000101] A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 2 codifica o antiporte de prótons/açúcar tonoplástico TST2.1 de Beta vulgaris com a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000102] A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 4 codifica o antiporte de prótons/açúcar tonoplástico TST1 de Beta vulgaris com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3.

[000103] A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 6 codifica o antiporte de prótons/açúcar tonoplástico TST2.2 de Beta vulgaris com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5.

[000104] A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 8 codifica o antiporte de prótons/açúcar tonoplástico TST3 de Beta vulgaris com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 7.

[000105] A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 10 codifica o antiporte de prótons/açúcar tonoplástico TMT1 de Arabidopsis thaliana com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 9.

[000106] A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 12 codifica o antiporte de prótons/açúcar tonoplástico TMT2 de Arabidopsis thaliana com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 11.

[000107] A molécula de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 14 codifica o antiporte de prótons/açúcar tonoplástico TMT3 de Arabidopsis thaliana com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 13.

[000108] Pela expressão e/ou superexpressão de pelo menos uma das sequências de nucleotídeos mencionadas em i. até iv. em uma planta, após a introdução delas em pelo menos uma célula das plantas, a quantidade de proteína de antiporte prótons/açúcar na membrana de vacúolos dessas plantas é aumentada, especialmente nas membranas dos vacúolos do órgão armazenador de sacarose dessas plantas, de modo que mais sacarose pode ser transportada nos vacúolos das plantas e a concentração de sacarose no órgão armazenador de sacarose das plantas é aumentada, comparado com uma planta de controle isogênica, cultivada sob condições idênticas. Com isso, o rendimento de sacarose por planta, por órgão armazenador de sacarose, e/ou por superfície de cultivo, pode ser aumentado.

[000109] A presente invenção é a seguir ilustrada por meio de exemplos de execução, sendo que os exemplos de execução servem apenas para esclarecimento, mas não limitam a presente invenção. A presente invenção é definida exclusivamente pelas reivindicações. A expressão "um" ou "uma" não deve ser compreendida como o número especificado.

[000110] Os exemplos de execução mostram claramente que a TST2.1 de Beta vulgaris é a proteína da membrana tonoplástica, que pode importar, como antiporte prótons/açúcar, sacarose de forma altamente específica nos vacúolos de uma célula de planta.

Exemplo 1: Material de planta e condições de crescimento

[000111] Para os experimentos a seguir foram utilizadas beterrabas sacarinas da variedade "Belladonna KWS" e "Brigadier". As sementes para a variedade "Belladonna KWS" foram fornecidas pela firma KWS Saat AG, Einbeck, DE, as sementes de beterrabas da variedade "Brigadier" foram adquiridas no comércio local de sementes.

[000112] Além disso, foram utilizadas plantas e células de plantas de Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana. As plantas cresceram em câmaras de crescimento no substrato padrão ED-73 da firma Einheitserde- und Humuswerke Gebr. Patzer GmbH & Co. KG em um ciclo de claro-escuro de 10 horas de luz e 14 horas de escuridão, 22 °C e 125 μmol quanta m-2s-1.

[000113] O duplo mutante nocaute de gene de Arabidopsis Attst1-2 T- DNA foi descrito no estado da técnica (Wormit, A. et al. (2006) "Molecular identification and physiological characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolar sugar transport", Plant Cell 18, 3476-3490). Para experimentos de crescimento com 2-desoxiglicose foram semeadas, conforme descrito, sementes de Arabidopsis esterilizadas na superfície em placas de agar semi concentradas de Murashige e Skoog (1^MS), conforme descrito (Reiser, J. et al. (2004) "Molecular physiological analysis of the two plastidic ATP/ADP transporters from Arabidopsis", Plant Physiol. 136: 3524-3536). A seleção das plantas superexpressas por pUBQ: BvTST2.1-GFP e 35S: BvTST1 ocorreu em placas agar 1^MS, que ou continham 50 μg/ml de higromicina ou 40 μg/ml de canamicina.

Exemplo 2: Determinação quantitativa de açúcares em tecidos da beterraba sacarina

[000114] O tecido da raiz primária da beterraba foi colhido com um cortador de vegetais, imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C, para a determinação quantitativa de açúcar. Para a determinação do teor de açúcar, o tecido da planta foi triturada em nitrogênio líquido e 50 μg tecido triturado foi extraído duas vezes por 20 minutos, a 80°C, com etanol 80%. Os resíduos foram purificados e evaporados com um SpeedVac (Firma Eppendorf, Hamburg, DE). O açúcar seco foi dissolvido em água e quantificado por meio de um teste enzimático acoplado com NADP em um aparelho de leitura de placas de microtitração conforme descrito (Bergmeyer, H. U. and Bernt, E. (1974) "Methods of Enzymatic Analysis", vol.3, Bergmeyer,H.U. ed., Verlag-Chemie New York, págs.1176-117; Lee, Y.C. (1972) "α- Mannosidase, β-glucosidase, and β-galactosidase from sweet almond emulsion". Methods Enzymol. 28: 699-702).

Exemplo 3: Análise da expressão genética

[000115] A acumulação relativa de mRNA ocorreu por análises Northern-Blot conforme descrito (Jung, B. et al. (2011) "Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines". Plant J. 65: 703-711). RT-PCR quantitativo foi realizado conforme anteriormente descrito (Leroch M. et al. (2005) "Identification and characterization of a novel plastidic adenine nucleotide uniporter from Solanum tuberosum". J. Biol. Chem. 280: 17992-18000). Os iniciadores gene específicos que foram empregados são indicados na Tabela 1:Tabela 1: Iniciadores gene específicos para a amplificação das sequências de nucleotídeos codificadoras de BvTST1 e BvTST2.1, assim como para a PCR quantitativa para análise da expressão dos 4 genes TST parálogos de Beta vulgaris.

Exemplo 4: Isolamento dos vacúolos e membrana tonoplástica do tecido da raiz principal

[000116] Vacúolos foram preparados segundo o processo de acordo com Leigh e Branton (Leigh, R. A. and Branton, D. (1976). "Isolation of Vacuoles from Root Storage Tissue of Beta vulgaris", L. Plant Physiol. 58: 656-662) com as seguintes modificações: Tecido de raiz primária foi cortado com um cortador de legumes em fatias de 0,1 até 0,2 mm de espessura, que foram imediatamente incubadas em um meio coletor (1M de sorbitol, 1mM de DTT, 5 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl, pH, 7,6) à temperatura ambiente. A seguir fatias finas do tecido da raiz primária foram cortadas com uma lâmina de barbear no meio coletor (1 M de sorbitol, 1 mM de DTT, 5 mM de EDTA, 50 mM de tris-HCl, pH 7,6), filtradas através de uma peneira de aço inoxidável (100 μm de largura de malha) e sedimentadas por centrifugação (2.000 x g, 20 min., 4°C). O sedimento foi ressuspenso em um meio coletor com 30% de Nycodenz (Axis-Shield GmbH, Heidelberg, DE) e transferido para tubinhos de centrifugação (Beckmann UltraClear) de 17 ml. Na centrifugação subsequente (1.500 x g, 15 min., 8°C) o Nycodenz formou um gradiente de densidade e os vacúolos flutuaram sobre a fase superior do gradiente de densidade.

[000117] As membranas dos vacúolos foram isoladas conforme descrito no estado da técnica (Schulze W.X. et al. (2012) "Cold acclimation induce changes in Arabidopsis tonoplast protein abundance and activity and alters phosphorylation of tonoplast monosaccharide transporters", Plant. J. 69: 529-541). A atividade de α-manosidase em vacúolos tratados com ultrassom ocorreu como descrito de outra forma (Boller, T. and Kende, H. (1979) "Hydrolytic enzymes in the central vacuole of plant cells". Plant Physiol. 63: 1123-1132; Lee, Y.C. (1972) "α-Mannosidase, β-glucosidase, and β-galactosidase from sweet almond emulsion". Methods Enzymol. 28: 699-702)

Exemplo 5: Cromatografia líquida e espectroscopia de massa tandem

[000118] Os sedimentos das membranas tonoplásticas isolados de plantas com 2 até 5 meses de idade foram introduzidos em soluções tampão (4% de SDS, 50 mM de NH4HCO3) em uma concentração de 1 μg/ml. As proteínas introduzidas foram precipitadas durante a noite a - 20°C em 80% de acetona e posteriormente elaboradas como descrito por Mühlhaus (Mühlhaus, T. et al. (2011) "Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii", Mol. Cell. Proteomics 10: M110 004739). Os peptídeos extraídos foram ressuspensos em 200 μl de solução tampão (2% de acetonitrila, 0,4% de ácido acético).

[000119] Amostras cada qual de 3 μl dos peptídeos extraídos foram levadas a uma cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas tandem (Análise LC-MS/MS). A separação cromatográfica ocorreu em um nanoAquity UPLC (Waters, Eschborn, DE) por meio de uma "Symmetry C18 trap column (tamanho de partícula de 5 mm, dimensão das colunas 180 μm x 20 mm) e uma coluna BEH 130 C18 (tamanho das partículas 1,7 μm, dimensão das colunas 75 mm x 150 mm). Eluiu-se com um gradiente duplo, primeiramente de 100% solução tampão A (0,4% de ácido acético, 1% de 2-propanol, 2% de acetonitrila) em 40 % de solução tampão B (0,4% ácido acético, 1% de 2-propanol, 90% de acetonitrila) em um espaço de tempo de 2 ou 3 horas, em seguida a 90% da solução tampão B em um espaço de tempo de 5 minutos e em seguida 15 min com 90% da solução tampão B. A coluna foi novamente equilibrada, ao final de 15 minutos, com 100% de solução tampão A. O espectrômetro de massa híbrido LTQ XL-Orbitrap (ThermoScientific, Hamburgo, DE) trabalhou em modo dependente de dados, com um ciclo de uma varredura completa do espectro de massa 300 - 1500 m/z (Orbitrap), a uma resolução ajustada de 60.000 a 400 m/z, seguido de sete varreduras consecutivas dependentes de dados MS2 (LTQ) dos íons mais intensos. Íons carregados individuais, foram excluídos da análise MS2 e os íons de partida para a análise MS2, foram colocados por 20 s em uma lista de exclusão. Cada amostra foi analisada três vezes.

[000120] Proteínas foram identificadas, com o auxílio do software MaxQuant e Andromeda Suchmaschine (Cox, J. and Mann, M. (2008) "MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification". Nat. Biotechnol. 26: 1367-72) em um banco de dados elaborado na casa de um dos inventores para proteínas de beterraba sacarina.

Exemplo 6: Construto de ácido nucleico

[000121] DNA (cDNA) complementar de Beta vulgaris foi preparado por transcrição reversa da raiz primária ou de folhas de RNA isoladas. Todas as reações em cadeia de polimerase (PCR) foram realizadas com a fusão HF de DNA polimerase (Thermo Scientific).

[000122] O construto da fusão pUBQ:BvTST1-GFP foi preparado utilizando o vetor pUBC-GFP-Dest (Grefen et al. (2010) "A ubiquitin-10 promoter-based vector set for fluorescent protein tagging facilitates temporal stability and native protein distribution in transient and stable expression studies", Plant J. 64: 355-365). Para isso, o cDNA de BvTST1 foram ampliados e o stopcódon foi afastado por meio de PCR utilizando os iniciadores BvTST1, que contêm os sítios attB1 e attB2. O produto da ampliação foi clonado com uma reação BP em pDONRZEO (Invitrogen, Heidelberg, DE), seguido de uma reação LR em pUBC- GFP-Dest.

[000123] O construto pUBQ:BvTST2.1-GFP foi preparado como a seguir: todo quadro de leitura aberta do gene BvTST2.1 foi amplificado com os iniciadores BvTST2.1fw_XhoI/BvTST2.1rev_XbaI. O produto PCR obtido foi digerido com XhoI e XbaI e ligado no vetor pUBC-cGFP- Dest (Grefen et al. (2010)) aberto com XhoI e SpeI. O construto assim produzido contém o gene bar, que nas plantas transformadas, leva a uma resistência a Basta®. Em seguida, toda a sequência de nucleotídeos codificadora de BvTST2.1-GFP com XhoI/PstI foi cortada deste construto e inserida em um vetor pUBN-nYFP-Dest respectivamente com os vetores XhoI e PstI abertos, que transmitiu uma resistência a higromicina em plantas transformadas. Uma digestão de pUBN-nYFP-Dest com XhoI/PstI, levou a um afastamento completo da sequência de nYFP e das propriedades de "Gateway" do vetor alvo, de modo que esses são apropriados para a transformação dos mutantes do nocaute de genes duplos Attst1-2 por meio de agrobactérias apropriadas (Clough S.J., Bent, A.F. (1998) „Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana". Plant J. 16: 735-743). As sequências de nucleotídeos de todos os construtos de genes gerados foram verificadas por meio de análises sequenciais.

Exemplo 7: Estudos de vacúolos de plantas de nicotiana bentamina transformadas

[000124] Para a superexpressão transiente de proteínas do transporte de açúcar marcadas (BvTST1-GFP e BvTST2.1-GFP) em suas extremidades C terminais com a proteína fluorescente verde (GFP) ou apenas com GFP sob o controle do promotor de ubiquitina (pUBQ10) em células mesófilas de N. benthamiana, foi empregado o processo de agroinfiltração de Latz et al (2007) descrito para plantas com 5 até 7 semanas de idade (Latz et al. (2007) "In planta AKT2 subunits constitute a pH- and Ca2+-sensitive inward rectifying K+ channel", Planta, 225: 1179-1191). Sem prejuízo dos processos descritos do estado da técnica, a cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101 foi empregada como carreador da sequência de nucleotídeos codificadora do gene 19K, assim como do construto GFP foi empregado para a proteína de transporte de açúcar. As bactérias foram cultivadas durante a noite em 5 ml de um meio YEB, centrifugadas a 8.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e lavadas 2 vezes com Agromix (Latz et al. (2007)). As células das bactérias foram ressuspensas em 3 ml de Agromix e mantidas por 2 até 3 horas a 28°C no escuro. Para a infiltração, 1 ml da suspensão com as agrobactérias contendo 19K foram misturados com 1 ml da suspensão em agrobactérias que contêm pUBQ:BvTST1-GFP, pUBQ:BvTST2.1-GFP ou pUBQ:GFP, e adicionadas com 2 ml de Agromix.

[000125] Dois dias após a agroinfiltração, os protoplastos das células mesófilas foram isolados, essencialmente como descrito por Beyhl et al. (Beyhl, D. et al. (2009) "The fou2 mutation in the major vacuolar cation channel TPC1confers tolerance to inhibitory luminal calcium", Plant J. 58: 715-723). Após a incubação da enzima dos discos de folhas por 1 hora, os protoplastos liberados foram lavados com 500 mM de sorbitol e com 1 mM de CaCl2. Os vacúolos foram liberados dos protoplastos diretamente nas câmeras Patch-Clamp, nas quais eles foram submetidos a uma solução tampão de lise com uma osmolaridade de 280 mOsmol x kg-1 (10 mM de EGTA, 10 mM de Hepes/Tris, pH 7,4; Osmolaridade ajustada com D-Sorbitol). Fluxos macroscópicos foram medidos na configuração "whole-vacuolar" (Beyhl, D. et al. (2009) "The fou2 mutation in the major vacuolar cation channel TPC1confers tolerance to inhibitory luminal calcium". Plant J. 58: 715-723); e filtrados por passagem baixa a 100 Hz. O banho e a solução das pipetas foram idênticas ao valor do pH em relação à suas composições (100 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 1mM de CaCl2, 450-500 Osmol x kg-1, ajustado com D-Sorbitol). O valor do pH do banho foi ajustado a 7,4 (Hepes/Tris) e o valor do pH da solução da pipeta ajustado a 5,5 (Mes/Tris). Para medir o fluxo de prótons induzido por açúcar, foram introduzidos glucose ou sacarose para o lado citoplasmático da membrana dos vacúolos, respectivamente em uma concentração final de 50 mM.

Exemplo 8: Análise do proteoma da membrana dos vacúolos de células da raiz primária da beterraba sacarina

[000126] Para analisar a característica das proteínas da membrana dos vacúolos, das células da raiz primária da beterraba sacarina, os vacúolos das células da raiz primária de beterrabas de cinco meses de idade (Beta vulgaris) da variedade "Belladonna KWS" foram isoladas e a membrana dos vacúolos enriquecida por centrifugação a alta velocidade. As proteínas da membrana hidrofóbica foram precipitadas com acetona, a partir da fração tonoplástica repetidamente lavada, subsequentemente ressuspensa em uma solução de uréia (ureia 8 M) e, submetida a uma digestão tríptica, antes da análise por LC-MS/MS.

[000127] No total foram identificadas cerca de 400 diferentes proteínas em cada uma das preparações tonoplásticas enriquecidas. Uma dessas proteínas, a seguir designada BvTST2.1 (SEQ ID NO: 1), está disponível em todas as preparações realizadas independentes entre si em grandes quantidades, apresentou a assinatura de um transporte de açúcar ([LIVMSTAG] - [LIVMFSAG] - (SH) - (RDE) - [LIVMSA] - [DE] - (TD) - [LIVMFYWA] - G - R - [RK] - x (4,6) - [GSTA]; Prosite Pattern PS00216, http://prosite.expasy.org/) e tinha a maior semelhança ao transporte de monossacarídeos vacuolares TMT2 de Arabidopsis thaliana (Fig. 1).

Exemplo 9: Genes para proteínas de transporte de açúcar tonoplásticas no genoma da beterraba sacarina

[000128] Na procura do genoma de B. vulgaris puderam ser identificados 4 genes parálogos, que codificam proteínas de transporte de açúcar tonoplásticas. A análise filogenética (Fig. 2) mostrou que o transportador de açúcar BvTST1 e BvTST3 a seguir são parentes próximos dos genes ortológicos AtTMT1 ou AtTMT3 de Arabidopsis, enquanto BvTST2.1 e BvTST2.2 um par de genes muito similar, apresentam a maior similaridade das sequências com o ortólogo de Arabidopsis AtTMT2 (Fig. 1). A sequência de aminoácidos de BvTST2.1 corresponde cerca de 68 % com aquela de AtTMT2, e a similaridade é de 84% (Fig. 1).

Exemplo 10: Localização subcelular de BvTST2.1

[000129] A localização subcelular de BvTST2.1 foi verificada por mutantes estáveis de duplo-nocaute de genes Attst1-2 transformados com pUBQ:BvTST2.1-GFP.

[000130] O isolamento de protoplastos de células mesófilas de folhas e a liberação de vacúolos ocorreu segundo um processo conhecido (Yoo, S.D. et al. (2007) "Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis", Nat Protocol 15651572).

[000131] Um microscópio confocal de varredura a laser (Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Wetzlar, DE) foi empregado para fotografias por microscópio de fluorescência. Todas as fotografias foram feitas com uma objetiva Leica HCX PL APO 63x/1.20w motCORR CS. O processamento das fotos ocorreu com o software Leica ApplicationSuite Advanced Fluorescence Lite Software.

[000132] Após a clonagem completa do BvTST2.1 mRNA, determinou-se a localização subcelular da proteína, na qual uma proteína de fusão BvTST2.1-GFP que foi estavelmente expressa em Arabidopsis. A fluorescência verde, que foi observada nas células mesófilas das folhas de mutantes de Arabidopsis que expressam de forma estável BvTS2.1-GFP, mostrou que a proteína de fusão na membrana dos vacúolos, que circundam estreitamente os cloroplastos, foi localizada.

[000133] Uma digestão enzimática do tecido mesófilo de plantas expressas por BvTST2.1-GFP levou a protoplastos individuais intactos. O tratamento hiposomótico desses protoplastos levou à liberação estável dos vacúolos com fluorescência verde, com o que a localização de BvTST2.1-GFP em tonoplásticos foi confirmada.

Exemplo 11: Correlação da expressão BvTST2.1 e da concentração de sacarose em raízes primárias da beterraba sacarina

[000134] Para descobrir uma possível correlação entre a expressão de BvTST2.1 nas raízes primárias da beterraba sacarina e a concentração de sacarose da beterraba, determinou-se a expressão do gene BvTST2.1 das variedades beterraba sacarina "Belladonna KWS" e "Brigadier".

[000135] A variedade "Belladonna KWS" é conhecida como uma variedade de beterraba que apresenta uma alta concentração de sacarose, e dois meses após o plantio apresenta uma concentração de sacarose de cerca de 160 μmol x g-1 peso fresco nas raizes primárias (Fig. 3). Essa alta concentração de sacarose aumenta durante os seguintes três meses de desenvolvimento e atingem cerca de 450 μmol x g-1 de peso fresco. Esse corresponde, baseado nas raizes primárias de dois meses de idade, a um aumento três vezes maior.

[000136] Diferentemente disto, as raizes primárias da variedade "Brigadier" continham menos do que 70 μmol de sacarose para cada peso fresco após um crescimento de dois meses, e elas acumularam apenas cerca de 195 μmol de sacarose para cada g de peso fresco nos três meses seguintes (Fig. 3).

[000137] Na comparação da concentração de sacarose de folhas e raizes primárias, pode ser comprovado um teor cerca de 30 vezes maior de sacarose nas raizes primárias, se comparado com as folhas, enquanto a concentração de glucose nas folhas esteve em torno de um fator 80 acima daquele das raizes primárias.

[000138] As diferenças na acumulação de sacarose entre as diferentes variedades de beterraba refletiram-se também na quantidade do mRNA codificador de BvTST2.1 (Fig. 4). Tanto nas raízes primárias da variedade "Belladonna KWS" como também na variedade "Brigadier", as quantidades de mRNA para todos os quatro transportes de açúcar parálogos foram menores após dois meses de crescimento.

[000139] Após um outro mês de crescimento e desenvolvimento, a quantidade de mRNA para BvTST2.1 em ambas as variedades foi visivelmene mais alta do que as quantidades dos mRNAs codificadores de BvTMT1, BvTMT2.2 e BvTMT3. Além disso, a quantidade de mRNA BvTST2.1 nas raízes primárias da variedade "Belladonna KWS" foi cerca de 2,6 vezes maior do que nas raizes primárias da variedade "Brigadier" (Fig. 4).

[000140] Durante outros dois meses de crescimento, a quantidade de mRNA de BvTST2.1 não se modificou essencialmente em ambas as variedades, comparado com a quantidade após 3 meses de crescimento, de modo que também após cinco meses de crescimento e de fase de desenvolvimento a quantidade de mRNA para BvTST2.1 em raízes primárias da variedade "Belladonna KWS", como antes, foi em torno de 2,6 vezes maior do que nas raizes primárias da variedade "Brigadier".

[000141] Para obter outras evidências sobre o significado da proteína BvTST2.1 para o armazenamento de sacarose, as concentrações de glucose, frutose e sacarose em folhas de beterrabas da variedade "Belladonna KWS" de três e cinco meses foram determinadas (Fig. 5) e comparadas com as quantidades de mRNA dos quatro tipos de parálogos TST (Fig. 6). Diferentemente das raízes primárias, nas quais o teor de glucose e de frutose foi muito baixo, ambos esses monossacarídeos se acumularam nas folhas. Nas folhas da beterraba com 3 meses de idade, a concentração de glucose e frutose esteve entre 33 e 35 μmol/g de peso fresco, enquanto a concentração de sacarose esteve abaixo de 15 μmol/g de peso fresco. Após cinco meses de crescimento, a concentração de cada um dos três açúcares esteve entre 6 e 9 μmol/g de peso fresco (Fig. 5).

[000142] Foi notável que a quantidade de mRNA para BvTST2.1 nas folhas foi bem menor do que a quantidade de mRNA para BvTMT1, BvTMT2.2 e BvTMT3, enquanto que a quantidade de mRNA para BvTST2.1 na raiz primária foi sempre maior do que a quantidade de mRNA para as outras isoformas (Fig. 6).

Exemplo 12: Transporte tonoplástico de sacarose mediado por BvTST2.1

[000143] Para comprovar a função de transporte de BvTST2.1, a tecnologia "Patch-Clamp" foi empregada em vacúolos isolados. Além disso, uma proteína de fusão BvTST2.1-GFP foi transientemente expressa em células mesófilas de Nicotiana benthaminana. Vacúolos intactos de protoplastos transformados puderam ser identificados, após uma lise hipoosmótica suave, por sua cor verde.

[000144] Para replicar o gradiente dos prótons fisiológicos através dos tonoplastos de vacúolos isolados, o meio na pipeta, que representa o conteúdo luminal dos vacúolos, foi tamponado a um valor de pH de 5,5, enquanto o meio na câmara (=banho), que representa o citsol, foi ajustado a pH 7,5. Quando sacarose foi adicionada ao meio "citosólico", os vacúolos reagiram com uma forte defleção voltada para baixo do fluxo da corrente. A adição de sacarose nos meios que circundam os vacúolos isolados levou a um fluxo de corrente voltado para dentro, que corresponde a um antiporte de prótons do transporte de sacarose.

[000145] Na ausência de BvTST2.1 os vacúolos isolados de N. benthaminana não mostraram atividade significativa de transporte de prótons/sacarose. Diferentemente disto, a adição de sacarose levou no meio da câmara a vacúolos apresentando BvTST2.1 para um fluxo de corrente voltado para dentro em um tamanho de quase -1 pA/pF (Figura 7). Esses fluxos representam a impressão digital tecnológica de uma importação de sacarose acionada por prótons através da membrana de vacúolos contendo BvTST2.1-GFP, e é um sinal claro de que BvTST2.1 acopla a exportação de prótons ao longo do gradiente de prótons através da membrana, com uma importação de sacarose contra o gradiente de sacarose existente. A última função mencionada é uma condição bioquímica, para que a beterraba possa acumular altas quantidades de sacarose nos vacúolos de sua raiz primária.

[000146] Nota-se que BvTST2.1 não garante nenhuma exportação de prótons mediada por glucose. Ao contrário de BvTST2.1, a isoforma BvTST1 provoca um fluxo de corrente tanto de sacarose como também de glucose em uma dimensão da ordem de -03, pA/pF (Fig. 7; Tabela 2). Tabela 2: Modificações induzidas por açúcar na densidade da corrente dos vacúolos individuais.

[000147] Esses dados demonstram a especificidade de BvTST2.1 para sacarose.

Exemplo 13: Especificidade de sacarose de BvTST2.1 in vivo

[000148] Para analisar a elevada especificidade do substrato de BvTST2.1 em células de plantas vivas, os mutantes de nocaute de gene duplo AtTMT, que não apresentam nenhuma das duas proteínas de transporte de monossacarídeos tonoplásticas essenciais, foram transformados ou com um construto PUBQ:BvTST2.1-GFP ou um construto pUBQ:BvTST1. Os transformantes cresceram na presença do análogo de glucose tóxico 2-deoxiglucose. Em testes de controle sem 2-deoxiglucose, todas as linhas de plantas apresentaram um crescimento comparável. Na presença de 2-deoxiglucose, os mutantes de nocaute de gene duplo tst1-2 não se desenvolveram bem, enquanto plantas do tipo selvagem e as linhas que exprimem BvTST1 mostraram um crescimento essencialmente melhor. As plantas do tipo selvagem e os mutantes de nocaute de genes duplos exprimindo BvTST1 cresceram mais na presença de 2-deoxiglucose, possivelmente porque 2-deoxiglucose pode ser transportado para desintoxicar os vacúolos. O mutante de nocaute de gene duplo, não é capaz disso. Aquelas plantas nocaute de gene duplo que exprimem BvTST2.1, o mutante de nocaute de gene duplo Attst1-2 na presença de 2-deoxiglucose não pode compensar a parada de crescimento, apesar da proteína de fusão BvTST2.1-GFP estar presente nas membranas dos vacúolos.

[000149] A notável sensibilidade das plantas Attst1-2::BvTST2.1-GFP em comparação com 2-deoxiglucose in vivo é consistente com os dados eletrofisiológicos e a especificidade da sacarose de BvTST2.1 que foi obtida nos vacúolos isolados.

Claims

1. Vetor ou elemento genético móvel, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica, em que a proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica é específica para sacarose, em que a especificidade da proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica para sacarose é pelo menos cinco vezes maior que para um monossacarídeo e em que a molécula de ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) uma molécula de ácido nucleico que possui uma sequência nucleotídica de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1; (b) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência nucleotídica que é completamente complementar à sequência nucleotídica de acordo com (a).

2. Célula bacteriana transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor ou o elemento genético móvel, como definido na reivindicação 1.

3. Método para produzir uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) incorporar uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica, como definida na reivindicação 1, como um transgene, ou o vetor ou elemento genético móvel, como definido na reivindicação 1, em pelo menos uma célula de uma planta, e (b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal obtida na etapa (a).

4. Método para aumentar a concentração de sacarose de um órgão de armazenamento de sacarose de uma planta, caracterizado pelo fato de que é pela superexpressão de uma molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1, que codifica a proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica, em pelo menos uma célula da planta.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína é endógena à célula hospedeira e operacionalmente ligada a um elemento regulador endógeno geneticamente modificado.

6. Método para identificar uma planta que é adequada para a produção de uma concentração aumentada de sacarose em seu órgão de armazenamento de sacarose, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de uma molécula de ácido nucleico no DNA da planta que codifica uma proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica, como definida na reivindicação 1, através do uso de um marcador molecular selecionado de uma ou mais de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26.

7. Uso de uma proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica, caracterizado pelo fato de que é para aumentar a concentração de sacarose de um órgão de armazenamento de sacarose de uma planta pela superexpressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de antiporte próton/açúcar tonoplástica e em que a molécula de ácido nucleico compreende os seguintes: (i) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7; (ii) uma molécula de ácido nucleico com uma sequência nucleotídica que é completamente complementar à sequência nucleotídica de acordo com (i).

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína é endógena à célula hospedeira e operacionalmente ligada a um elemento regulador endógeno geneticamente modificado.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida detecção é realizada por uma reação em cadeia da polimerase (PCR) ou por uma reação de polimorfismo de comprimento de restrição.