JP6789922B2 - 液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質および植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるためのその使用 - Google Patents

Description

本発明の分野は有用植物からの工業的な糖生産の分野であり、本発明は、有用植物の農業栽培におけるサッカロース収量の増加に関する。特に本発明は、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質、および該タンパク質をコードする核酸、ならびに有用植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるためのその使用に関する。

糖とは、一方では甘味を示すあらゆる単糖類および二糖類の総称であり、他方では二糖類であるサッカロースに関して商業的に慣用されている名称でもある。サッカロースとは通常の家庭用砂糖あるいはグラニュー糖であり、スクロースとも呼ばれる。サッカロースは、α−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−フルクトースが１分子ずつα，β−１，２−グリコシド結合によって互いに結合された二量体である。

サッカロースは植物中で光合成により形成される。サッカロースの生合成は植物細胞の細胞質中で行われる。その際、光合成の炭素同化（カルビン回路）の際に正味取得分として生じる２つのトリオースリン酸であるグリセルアルデヒド−３−リン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸が、葉緑体から細胞質ゾルに排出される。植物細胞の細胞質ゾル内では、これらのトリオースリン酸から単糖類であるＵＤＰ−グルコースおよびフルクトース−６−リン酸が形成される。このためにまず、グリセルアルデヒド−３−リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸との縮合反応によってフルクトース−１，６−ビスリン酸が形成される。フルクトース−１，６−ビスリン酸は、その後、脱リン酸化によりフルクトース−６−リン酸へと転化される。フルクトース−６−リン酸から異性化によってグルコース−６−リン酸も形成されることができ、このグルコース−６−リン酸はまず転位による異性化が生じることでグルコース−１−リン酸となり、これがウリジン三リン酸（ＵＴＰ）と反応してウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）となる。これに続くＵＤＰ−グルコースとフルクトース−６−リン酸との縮合によるサッカロース−６−リン酸の生成は、サッカロースリン酸シンターゼ酵素によって触媒される。これに必要なエネルギーは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）の分解によって提供される。最後に、不可逆反応においてサッカロース−リン酸−ホスファターゼ酵素によりサッカロース−６−リン酸のリン酸残基が脱離することによって、サッカロースが生成される。

サッカロースは非還元性の二糖であり、したがって植物における極めて重要な輸送糖である。サッカロースは植物の葉において新たに合成され、師部を経て貯蔵器官へ輸送され、この貯蔵器官において、そこでの植物細胞の液胞内に栄養源およびエネルギー源として蓄積される。

サッカロースの工業的な生産には、特にテンサイ（ベータ・ブルガリス亜種ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ（サッカルム・オフィキナルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ））およびサトウヤシ（主にインドネシアにおける、アレンガ・ピンナータ（Ａｒｅｎｇａ ｐｉｎｎａｔａ）：アレンガ・サッカリフェラ・ラビル（Ａｒｅｎｇａ ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ Ｌａｂｉｌ．）と同義）が重要である。比較的少量ではあるが、サッカロースはサトウカエデ（アセル・サッカルム（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ））の樹液からも生産される。こうした植物は、サッカロース含分が格段に高いことからサッカロース生産に利用されている。

サトウキビにおいて、糖 − 主にサッカロース− は、植物の髄（そのサッカロース貯蔵器官）内に通常は１０〜２０％の割合で存在する。サッカロースは、圧搾により得られた樹液の結晶化および精製により生産される。

テンサイは二年生植物であり、一年目に根部に糖分を蓄え、この顕花植物の二年目には養分としての役割を担う。糖の生産は、通常は水での抽出処理においてテンサイを細断することにより行われる。その後、この抽出物を酸化カルシウムと混合することで、例えばシュウ酸や酒石酸といった植物性の酸およびタンパク質を沈殿させることができる。余剰の石灰は、二酸化炭素の導入により排出される。その後、真空中で糖液から水を蒸発させることによりシロップ状の溶液が得られる。晶出する糖は、遠心分離により、残留する褐色のシロップと分離される。残留物である糖蜜は家畜飼料として利用されるか、あるいはアルコール発酵に使用される。糖の精製（純化）は、再結晶化、ろ過、および真空中での蒸発により行われる。

サッカロース貯蔵植物の栽培における数十年来の努力によって、サッカロース貯蔵器官の収量およびサッカロース濃度の顕著な増大を達成することができた。例えば、現在糖生産のために栽培されているビーツ類においては、根部のサッカロース濃度は根部の新鮮重量を基準として約１５〜２０重量％である。しかし、得られるサッカロース濃度は依然として満足のいくものではない。

したがって本発明の課題は、より高いサッカロース濃度を有する植物を提供すること、ならびに、植物のサッカロース濃度、特にサトウキビおよびテンサイのサッカロース濃度を増加させることのできる方法を見出すことであった。

国際公開第２０１０／０７２２１０号（ＷＯ ２０１０／０７２２１０ Ａ１）として公開された国際出願においては、テンサイの農業栽培においてサッカロース収量を増加させるための方法が開示されている。この方法では、その遺伝子構成がインベルターゼの酵素活性を減少させるように調整されているテンサイまたはサトウキビ植物が使用される。この目的のために、植物細胞においてインベルターゼの酵素活性を低下させるのに適した核酸が植物のサッカロース貯蔵器官の形成に使用され、その際、サッカロース濃度は、同等の発育段階における同一の遺伝子型の改変されていない対照サッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度と比較して高められている。

植物の液胞は、糖の長期または短期の貯蔵において中心的な役割を果たしている。なぜならば、この液胞はオルガネラとして光合成活性植物細胞内で約９０％の体積を占めるためである（Ｍａｒｔｉｎｏｌａ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００７） ”Ｖａｃｕｏｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． ５８： ８３−１０２）。したがって、液胞はそのサイズゆえにすでに糖の貯蔵にとって極めて重要である（Ｎｅｕｈａｕｓ， Ｈ．Ｅ． （２００７）”Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｖａｃｕｏｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ”， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８１： ２２２３−２２２６）。例えばテンサイ（ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））の主根やサトウキビ（サッカルム・オフィキナルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ））の髄といった貯蔵組織は、その貯蔵器官の細胞の液胞内にサッカロースを大量に蓄積しており、それによって、このサッカロースをその植物の物質代謝用のエネルギー源として使用することができる。

例えばウマゴヤシ属（メディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ））（アクセッション番号ＡＣ１３１０２６）やヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ））（アクセッション番号ＡＡＸ４７３１２）やイネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）：アクセッション番号Ｏｓ０２ｇ１３５６０）といった様々な単子葉植物および双子葉植物において、植物細胞の細胞質からその液胞への糖輸送を担うタンパク質が発見されている。シロイヌナズナ属（アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））の植物においては、そのタンパク質産物が光合成活性細胞の液胞膜に局在する糖輸送体であってかつグルコースを細胞質ゾルから液胞へ取り込むことのできる遺伝子が特定されている（Ｗｏｒｍｉｔ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００６） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎｖａｃｕｏｌａｒ ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ”， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １８： ３４７６−３４９０）。こうした液胞膜単糖トランスポーター（ＴＭＴ）と呼ばれる輸送タンパク質は、液胞の膜、すなわち液胞膜に局在している。液胞膜単糖トランスポーター（ＴＭＴ）タンパク質には、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）においては３つのアイソフォームが含まれ、これらはＡｔＴＭＴ１、ＡｔＴＭＴ２およびＡｔＴＭＴ３と呼ばれる。ＡｔＴＭＴ１およびＡｔＴＭＴ２についての遺伝子は組織および細胞の種類に特異的な発現パターンを示すのに対して、ＡｔＴＭＴ３遺伝子は極めて弱くしか発現されない。ＴＭＴ遺伝子ノックアウトによって、このように改変された植物がその液胞において蓄積するグルコースおよびフルクトースは、野生型植物と比較して明らかに少ないことが判明した。しかし、サッカロースの蓄積に関しては、野生型植物とＴＭＴ遺伝子ノックアウトとの間には相違は検出されえなかった。

アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの液胞膜単糖トランスポーターＴＭＴ１は、電気生理学的にはプロトン駆動性のグルコースアンチポーターおよびサッカロースアンチポーターとして特徴付けられており、このアンチポーターは、グルコースとサッカロースとをほぼ同一の特異性で以て液胞膜を介して輸送する（Ｓｃｈｕｌｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１１）”Ｐｒｏｔｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｍｐｏｒｔ ａｎｄ ａｎｔｉｐｏｒｔ ａｒｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ＳＵＣ４ ａｎｄ ＴＭＴ１／２”， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６８： １２９−１３６）。この論文においては、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のサッカロース輸送タンパク質ＳＵＣ４もプロトン／サッカロース共輸送体として特徴付けられており、これも同様に液胞膜に局在しているとされている。

国際公開第２０１１／１２０５４９号（ＷＯ ２０１１／１２０５４９ Ａ１）として公開された国際出願においては、植物における液胞膜単糖トランスポーターＡｔＴＭＴ１の過剰発現によって、種子収量の増加や、種子のタンパク質含有量および油含有量の増大や、単子葉植物または双子葉植物の初期成長の促進が可能であることが開示されている。それに対して、貯蔵器官におけるサッカロースの富化については開示されていない。

こうした背景に鑑み、上述の本発明の課題は、テンサイの主根細胞の液胞への糖の取り込みを担うタンパク質、特にテンサイの主根細胞の液胞へのサッカロースの取り込みを担うタンパク質であってサッカロース特異的であるタンパク質を特定することにより解決された。こうしたタンパク質を特定することによって、特にこうしたサッカロース特異的である液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質および該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を特定することによって、植物においてサッカロース濃度を増加させるための植物栽培上のおよび／または分子遺伝学的な方法が提供され、ひいてはサッカロース濃度の増加を示す植物が提供される。

第一の態様によれば、本発明は、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする核酸分子に関する。好ましくは、この核酸分子は、サッカロース特異的である液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする。以下に、こうしたサッカロース特異的であるプロトン／糖アンチポータータンパク質を、プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質とも呼ぶ。

第二の態様によれば、本発明は、組換え遺伝子であって、
第一の態様による核酸分子、または、
液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする、好ましくは液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子
を含む、組換え遺伝子に関する。この核酸分子は、少なくとも１つの調節エレメントに作動的に連結されていてもよい。

第三の態様によれば、本発明は、ベクターまたは可動遺伝因子であって、
第一の態様による核酸分子、または、
第二の態様による組換え遺伝子
を含む、ベクターまたは可動遺伝因子に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、真核宿主細胞または原核宿主細胞であって、
第一の態様による核酸分子、好ましくは導入遺伝子としての第一の態様による核酸分子、
第二の態様による組換え遺伝子、または
第三の態様によるベクターもしくは可動遺伝因子
を含む、真核宿主細胞または原核宿主細胞に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、タンパク質であって、
好ましくはサッカロース特異的である液胞膜プロトン／糖アンチポーターとして機能する、あるいは好ましくは液胞膜プロトン／サッカロースアンチポーターとして機能するタンパク質に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、遺伝子導入された植物細胞であって、
導入遺伝子としての、第一の態様による核酸分子、
導入遺伝子としての、第二の態様による組換え遺伝子、または
第三の態様によるベクターもしくは可動遺伝因子
を含む遺伝子導入された植物細胞、
ならびに
こうした遺伝子導入された植物細胞を少なくとも１つ含む、遺伝子導入された植物またはその一部
に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、前述の態様による遺伝子導入された植物の種子に関し、その際、この種子は、
導入遺伝子としての、第一の態様による核酸分子、
導入遺伝子としての、第二の態様による組換え遺伝子、または
第三の態様によるベクターもしくは可動遺伝因子
を有する。

もう１つの態様によれば、本発明は、遺伝子導入された植物の製造方法に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための方法に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物を特定するための方法に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、第一の態様による核酸分子を診断のために検出するための分子マーカーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドに関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、抗体であって、
好ましくはサッカロース特異的である液胞膜プロトン／糖アンチポーターとして機能するタンパク質に関する診断用の抗体か、あるいは好ましくは液胞膜プロトン／サッカロースアンチポーターとして機能するタンパク質に関する診断用の抗体に関する。

もう１つの態様によれば、本発明は、植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の使用に関する。

図１に、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の３つのパラロガスな液胞膜単糖トランスポーター（ＴＭＴ）タンパク質のアミノ酸配列と、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの４つのパラロガスな液胞膜糖トランスポーター（ＴＳＴ）タンパク質のアミノ酸配列との同一性および類似性を示す表を示す。 図２に、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の３つのパラロガスな液胞膜単糖トランスポーター（ＴＭＴ）タンパク質と、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの４つのパラロガスな液胞膜糖トランスポーター（ＴＳＴ）タンパク質との系統関係を示す分岐図を示す。 図３に、２つのテンサイ品種の異なる齢の主根におけるサッカロース濃度を示す棒グラフを示す。 図４に、異なる発育時点での２つの異なるテンサイ品種におけるベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の４つのパラロガスなＴＳＴ遺伝子のｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフを示す。 図５に、異なる発育時点でのテンサイ品種「ベラドンナＫＷＳ」の葉における異なる糖の濃度を示す棒グラフを示す。 図６に、異なる発育時点でのテンサイ品種「ベラドンナＫＷＳ」の葉における４つのパラロガスなＢｖＴＳＴ遺伝子に関するｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフを示す。 図７に、一過的に形質転換させた葉肉細胞の液胞での異なる糖（糖類）により誘発された電流密度の変化を示す棒グラフを示す。

本発明者らは、本明細書においてＢｖＴＳＴ２．１と呼ぶタンパク質を、テンサイの主根細胞の液胞膜において量的に非常に多く存在するタンパク質のうちの一つとして特定し、そして驚くべきことに、このタンパク質ＢｖＴＳＴ２．１が、液胞膜糖トランスポーターとして特異的にサッカロースを細胞質ゾルから植物細胞の液胞に取り込みうることを見出した。したがって、このタンパク質および同様の機能を有するタンパク質を、液胞膜糖トランスポーター（ＴＳＴ）のみではなく、以下で、液胞膜サッカローストランスポーター、または液胞膜プロトン／サッカロースアンチポーター、または液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質とも呼び、その際、本明細書において用いる略称における「Ｂｖ」とは、このタンパク質が最初に特定された生体であるベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）を表す。このタンパク質ＢｖＴＳＴ２．１は、本発明者らによってサッカロース高特異的プロトン／糖アンチポータータンパク質であると特定されたものであり、これは、これらの植物の糖輸送タンパク質ファミリーのうちの最初に判明した代表物である。この他に、他の３つのパラロガスなアイソフォームであるＢｖＴＳＴ１、ＢｖＴＳＴ２．２およびＢｖＴＳＴ３の特定にも成功した。これらは、機能的には恐らく、知られているアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＴＭＴタンパク質に分類することができるものと考えられる。

こうしたサッカロース特異的な新種のアンチポーターの特定から出発して、本発明者らはさらに、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列、および他のアイソフォームをコードするヌクレオチド配列をも特定した。

したがって本発明は、第一の態様によれば、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする核酸分子に関し、好ましくは液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードする核酸分子に関する。

一実施形態によれば、液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードする核酸分子には、以下の群：
ａ） 配列番号２によるヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、配列番号２によるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｂ） ａ）によるヌクレオチド配列のうちの１つと相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｃ） ａ）またはｂ）による核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；
ｄ） 配列番号１によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、ポリペプチドであって該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１によるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；および
ｅ） 配列番号１によるポリペプチドのホモログ、アナログまたはオルソログをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子
から選択される核酸分子が含まれる。

もう１つの実施形態によれば、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする核酸分子には、以下の群：
ａ） 配列番号４、６もしくは８によるヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、配列番号４、６もしくは８によるヌクレオチド配列対して少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｂ） ａ）に記載のヌクレオチド配列のうちの１つと相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｃ） ａ）またはｂ）による核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；
ｄ） 配列番号３、５もしくは７によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、ポリペプチドであって該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３、５もしくは７によるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；および
ｅ） 配列番号３、５もしくは７によるポリペプチドのホモログ、アナログまたはオルソログをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子
から選択される核酸分子が含まれる。

「ヌクレオチド配列を有する核酸分子」という概念には、そのヌクレオチド配列が詳細に示されているヌクレオチド配列からなる核酸分子だけではなく、詳細に示されているヌクレオチド配列の他に少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を有する核酸分子も含まれる。

代替的および／または付加的な一実施形態によれば、核酸分子は配列番号１、３、５または７によるアミノ酸配列をコードする。しかし、核酸分子が、アミノ酸配列であって該アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が類似の化学的特性を示すアミノ酸と置換されているアミノ酸配列をコードすることも可能である（保存的または半保存的アミノ酸置換）。保存的アミノ酸置換の場合には、アミノ酸は類似の化学的特性を示す他のアミノ酸と置換される。半保存的なアミノ酸置換の場合には、アミノ酸は、類似の立体配座を有する他のアミノ酸と置換される。この置換は、好ましくはタンパク質機能に影響を及ぼさない。アミノ酸置換の例は、ＡｓｐとＧｌｕ、ＬｅｕとＩｌｅ、ＡｌａとＶａｌ、ＡｒｇとＬｙｓ、およびＰｈｅとＴｒｐである。

代替的および／または付加的な一実施形態によれば、核酸のヌクレオチド配列および／または該ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２、４、６または８によるヌクレオチド配列に対して、あるいは配列番号１，３、５または７によるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９８％、極めて好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。

本明細書において使用される「ハイブリダイズする」という概念は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているような通常の条件下に、好ましくはストリンジェントな条件下にハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば以下の通りである：６５℃で４×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、次いで合計で約１時間にわたって６５℃で０．１×ＳＳＣ中で数回洗浄する。あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件は、例えば以下の通りである：３７℃で４×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、次いで室温で１×ＳＳＣ中で数回洗浄する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下のものを意味することもできる：６８℃で、０．２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＢＳＡ中で１６時間ハイブリダイズし、次いで６８℃で２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで２回洗浄する。

「サッカロース特異的」または「サッカロース高特異的」または「サッカロース特異的な輸送」または「サッカロース高特異的な輸送」または「サッカロースに対する特異性」または「サッカロース特異性」とは、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質のサッカロースに対する特異性が、他の糖と比較して、少なくとも５倍、１０倍または１５倍、好ましくは少なくとも１８倍、２０倍、２２倍、２４倍、２６倍または２８倍の高さであり、特に好ましくは少なくとも３０倍、少なくとも３１倍、少なくとも３２倍、少なくとも３３倍、少なくとも３４倍、少なくとも３５倍、少なくとも３６倍、少なくとも３７倍、少なくとも３８倍または少なくとも３９倍の高さであり、極めて特に好ましくは少なくとも４０倍の高さであることと理解される。このことはさらに、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質のサッカロースに対する特異性が、例えばグルコースやフルクトースといった単糖と比較して、少なくとも５倍、１０倍または１５倍、好ましくは少なくとも１８倍、２０倍、２２倍、２４倍、２６倍または２８倍の高さであり、特に好ましくは少なくとも３０倍、少なくとも３１倍、少なくとも３２倍、少なくとも３３倍、少なくとも３４倍、少なくとも３５倍、少なくとも３６倍、少なくとも３７倍、少なくとも３８倍または少なくとも３９倍の高さであり、極めて特に好ましくは少なくとも４０倍の高さであることをも意味しうる。

本発明の趣意において、「ホモログ」とは、同一の系統発生の起源を有するタンパク質であると理解され、「アナログ」とは、同一の機能を発揮するものの異なる系統発生の起源を有するタンパク質であると理解され、「オルソログ」とは、同一の機能を発揮する異なる種からのタンパク質であると理解される。

第二の態様によれば、本発明は、組換え遺伝子であって、
第一の態様による核酸分子か、または、
好ましくは液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子
を含む、組換え遺伝子に関する。この核酸分子は、少なくとも１つの調節エレメントに作動的に連結されていてもよい。

「調節エレメント」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部ではないがタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を媒介するヌクレオチド配列と理解される。調節エレメントとは、例えばプロモーター、調節シスエレメント、エンハンサー、イントロンまたはターミネーターである。調節エレメントの種類に応じて、これは、核酸分子上で、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流（すなわち、５’側）または下流（すなわち、３’側）に配置されている。調節エレメントは、生きた植物細胞において機能的である。

「作動的に連結された」という概念は、調節エレメントが、タンパク質をコードするヌクレオチド配列と次のように連結されていること、つまりタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して例えば核酸分子上で次のような位置にあることを意味し、すなわち、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現が生細胞における調節エレメントの制御下に行われうるように連結されていることを意味する。

本発明の趣意において、「プロモーター」とは、遺伝子の発現を調節するヌクレオチド配列であり、通常は遺伝子の５’末端に位置し、特定のＤＮＡ結合タンパク質との相互作用によってＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始を媒介する。植物細胞中で機能的であるプロモーターの例には、構成的プロモーター、例えばウイルスプロモーター、例えばＣａＭ３５Ｓプロモーター、ダブルＣａＭ３５Ｓプロモーター、または例えば植物プロモーター、例えば欧州特許第０３０５６６８号明細書（ＥＰ０３０５６６８）および米国特許第６５２８７０１号明細書（ＵＳ６，５２８，７０１）に記載されているようなユビキチンプロモーターが含まれる。さらに、例えば特定の発育段階での特異的な活性、または例えば生物的なストレスや非生物的なストレスといった環境因子による誘導可能性、または組織特異性を示すプロモーターを使用することもできる。特に、サッカロース貯蔵器官またはその一部に対して高められた特異性を示し、すなわち、特にこのサッカロース貯蔵器官またはその一部において活性であるプロモーターを使用することができる。テンサイに関しては、プロモーターは、例えば根特異的または主根特異的なプロモーターであることができる。こうしたプロモーターは、従来技術から当業者に十分に知られている：国際公開第０２／４０６８７号（ＷＯ ０２／４０６８７）、Ｏｌｔｍａｎｎｓ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２００６） ”Ｔａｐｒｏｏｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｃａｕｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ”， Ｐｌａｎｔａ ２２４： ４８５−４９５、Ｎｏｈ， Ｓｅｏｌ Ａｈ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） ”Ａ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ＳＲＤ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｓｔｒｏｎｇ ｒｏｏｔ−， ｔａｐｒｏｏｔ−， ａｎｄ ｔｕｂｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ， ｃａｒｒｏｔ， ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ”， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１： ２６５−２７８。サトウキビに関しては、好ましくは例えばＧｏｓｈｕ Ａｂｒａｈａ， Ｔｓｉｏｎ． ”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｕｌｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｓｕｇａｒｃａｎｅ”， Ｄｉｓｓ． Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ： Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ， ２００５； Ｇｏｖｅｎｄｅｒ， Ｃ． ”Ｓｔｅｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｓｕｇａｒｃａｎｅ”． Ｄｉｓｓ． Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ： Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２００８；および、Ｍｕｄｇｅ， Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０１３） ”Ｍａｔｕｒｅ−ｓｔｅｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅｓ ｉｓｏｍａｌｔｕｌｏｓｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｕｇａｒｃａｎｅ”， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １： ５０２−５０９から知られているように、茎特異的プロモーターを使用することができる。

さらに、合成プロモーターも適したプロモーターであることが判明した。これは分子生物学的技術により作成されたプロモーターであって、この形では自然においては発見されないものである。合成プロモーターは、最小プロモーターの他に、選択された所定のシスエレメントを１つまたは複数しか含まない最小限のプロモーターである。このシスエレメントは、例えば転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、天然のプロモーターから単離されるか、既に単離されたシスエレメントに由来するか、またはランダムに配向された組換え技術によって工業的に生産され、かつ適切な方法により選択される。天然のプロモーターと比較して合成プロモーターはそれほど複雑な構造ではないため、わずかな外因性および内在性の因子によってのみ活性化され、それによってより特異的に調節されている。

「最小プロモーター」または「コア」プロモーターとは、基本転写因子複合体のための結合部位を有し、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の正確な開始を可能にするヌクレオチド配列である。最小プロモーターの特徴的な配列モチーフは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）、「ＴＦ ＢＩＩ認識エレメント」（ＢＲＥ）および「下流コアプロモーターエレメント」（ＯＰＥ）である。これらのエレメントは、最小プロモーター中で個々に存在していてもよいし組み合わせて存在していてもよい。得られるのは、最小プロモーターか、または例えば任意の植物の、細菌の、真菌のまたはウイルスの遺伝子からのその配列モチーフである。

「シスエレメント」とは、発現されるべきタンパク質をコードするヌクレオチド配列と同一の核酸分子上に存在するヌクレオチド配列である。シスエレメントはＲＮＡもタンパク質もコードする必要がなく、転写方向で、発現されるべきタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流または下流に位置することができる。発現されるべきタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流のシスエレメントは、多くの場合、特に転写因子のための必要な結合モチーフを提供し、これは、本明細書においてはトランス作用エレメント（ラテン語ではｔｒａｎｓ ’ｊｅｎｓｅｉｔｓ’）として分子に関して他の側からこの遺伝子の転写の調節に介入する。シスエレメントが転写の阻害をもたらす場合、このシスエレメントはサイレンサーと呼ばれる。シスエレメントが転写の強化をもたらす場合、このシスエレメントはエンハンサーと呼ばれる。プロモーターにおけるシス／トランス活性の全体によって、最終的に、ＲＮＡポリメラーゼによって転写が行われる強度が決まる。

さらに、プロモーターは、キメラプロモーターであってもよく、かつ／または、シスエレメントにより修飾されたプロモーターであってもよい。その際、プロモーターの修飾とは、例えば自然に既にシスエレメントを有するプロモーターへのシスエレメントの追加的な導入をも意味することができる。さらに、この修飾には、シスエレメントの多量体化、特に天然に存在するシスエレメントの多量体化も含まれる。こうして修飾されたプロモーターは、ネイティブバージョンと比較して、例えば特異性、発現レベルまたはバックグラウンド活性に関して変更された特性を示すことができる。

ターミネーターとは、通常は遺伝子の最後を示し、かつ転写の終結をもたらすＤＮＡ上のヌクレオチド配列である。

代替的および／または付加的な一実施形態によれば、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも１つの調節エレメントのヌクレオチド配列とは、ヘテロログである。このことは、これらが異なる種に由来するか、または１つの種における予定された組み合わせでは天然に存在しないことを意味する。

第三の態様によれば、本発明は、ベクターまたは可動遺伝因子であって、
第一の態様によるヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、
第二の態様による組換え遺伝子
を含む、ベクターまたは可動遺伝因子に関する。

ここで、ベクターとは、第一の態様による核酸分子または第二の態様による組換え遺伝子のための送達ビヒクルであると理解され、特に、生きたレシピエント細胞に外来核酸を導入するための送達ビヒクルであると理解される。この生きたレシピエント細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。ベクターには、例えば、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）、またさらには改変ウイルス、例えばアデノウイルス、レトロウイルスおよびファージが含まれる。

可動遺伝因子とは、生物のゲノム内でのその位置が可変であるヌクレオチド配列である。可動遺伝因子には、例えば利己的なヌクレオチド配列、例えばトランスポゾン、レトロエレメント、挿入配列およびインテイン、またさらにはグループＩＩイントロン、挿入プラスミドおよびいくつかのバクテリオファージ、例えばＭｕファージが含まれる。

もう１つの態様によれば、本発明は、真核宿主細胞または原核宿主細胞であって、
導入遺伝子としての第一の態様による核酸分子、
導入遺伝子としての第二の態様による組換え遺伝子、または
導入遺伝子としての第三の態様によるベクターもしくは可動遺伝因子
含む真核宿主細胞または原核宿主細胞に関する。このことは、核酸分子、組換え遺伝子および／またはベクターまたは可動遺伝因子が、例えば形質転換またはトランスフェクションによって宿主細胞内に導入されたことを意味する。原核宿主細胞の例は、アグロバクテリウム属ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。真核生物宿主細胞の例は、酵母細胞、例えばサッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセス、またさらには動物起源もしくは植物起源の細胞である。

もう１つの態様によれば、本発明は、液胞膜プロトン／サッカロースアンチポーターとして機能するタンパク質に関する。このアンチポーターは、サッカロース特異的である。好ましくは、このタンパク質は第一の態様による核酸分子によりコードされる。

一実施形態によれば、液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質は、以下の群：
ａ） 配列番号１によるアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ） 配列番号１によるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ） 配列番号１によるタンパク質のホモログ、アナログまたはオルソログであるタンパク質
から選択される。

配列番号１による液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質（ＢｖＴＳＴ２．１とも呼ばれる）は、７３５のアミノ酸長を有するアミノ酸配列を有する。疎水性分析によって、ＢｖＴＳＴ２．１は明らかに、１２の疎水性膜貫通領域と、第六の膜貫通領域および第七の膜貫通領域を接続する中央に局在する大きな親水性ループとを有することが判明した。ＢｖＴＳＴ２．１はアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の液胞膜単糖トランスポータータンパク質（ＡｔＴＭＴ２）に対して最も高い配列同一性を示す。これらの２つのアミノ酸配列の同一性は６８％であり、これらは保存的および半保存的なアミノ酸置換を考慮すると８４％の配列類似性を示す（図１）。

もう１つの態様によれば、本発明は、液胞膜プロトン／糖アンチポーターとして機能するタンパク質に関する。好ましくは、このタンパク質は第一の態様による核酸分子によりコードされる。

一実施形態によれば、この液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質は、以下の群：
ａ） 配列番号３、５または７によるアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ） 配列番号３、５または７によるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ） 配列番号３、５または７によるタンパク質のホモログ、アナログまたはオルソログであるタンパク質
から選択される。

配列番号３による液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質はＢｖＴＳＴ１とも呼ばれ、配列番号５による液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質はＢｖＴＳＴ２．２とも呼ばれ、配列番号７による液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質はＢｖＴＳＴ３とも呼ばれる。

ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）において特定された液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質ＢｖＴＳＴ２．１は、他の液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質ＢｖＴＳＴ１、ＢｖＴＳＴ２．２およびＢｖＴＳＴ３と同様に、他の植物の輸送タンパク質に対する配列同一性をも示すため、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質には、タンパク質であって該タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１、３、５または７によるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示すタンパク質、ならびに例えばそのホモログ、アナログまたはオルソログも含まれる。ここで、こうしたタンパク質がどのような種で天然に存在するのかということや、こうしたタンパク質が例えば分子遺伝学的方法によって生成される天然には存在しないタンパク質であるのか否かということは、重要でない。

もう１つの態様によれば、本発明は、遺伝子導入された植物細胞であって、
導入遺伝子としての、第一の態様による核酸分子、
導入遺伝子としての、第二の態様による組換え遺伝子、または
導入遺伝子としての、第三の態様によるベクターもしくは可動遺伝因子
を含む遺伝子導入された植物細胞、
ならびに
こうした植物細胞を少なくとも１つ含む、遺伝子導入された植物またはその一部
に関する。この点で、この遺伝子導入された植物またはその一部も、
導入遺伝子としての、第一の態様による核酸分子、
導入遺伝子としての、第二の態様による組換え遺伝子、または
導入遺伝子としての、第三の態様によるベクターもしくは可動遺伝因子
を含む。

もう１つの態様によれば、本発明は、前述の態様による遺伝子導入された植物の種子に関し、その際、この種子、および特にこの種子の少なくとも１つの胚細胞は、
導入遺伝子としての、第一の態様による核酸分子、
導入遺伝子としての、第二の態様による組換え遺伝子、または
第三の態様によるベクターもしくは可動遺伝因子
を含む。

一実施形態においては、植物細胞は単子葉植物の細胞である。他の一実施形態においては、植物細胞は双子葉植物の細胞である。もう１つのおよび／または付加的な実施形態によれば、植物細胞は、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サッカルム・オフィキナルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、アレンガ・サッカリフェラ（Ａｒｅｎｇａ ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ）、アセル・サッカルム（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）およびソルガム種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．）を含む種または上位の属の群から選択される植物の細胞である。したがってもう１つの実施形態によれば、遺伝子導入された植物は、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サッカルム・オフィキナルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、アレンガ・サッカリフェラ（Ａｒｅｎｇａ ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ）、アセル・サッカルム（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）およびソルガム種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．）を含む群から選択される。もう１つの実施形態によれば、遺伝子導入された植物の一部または遺伝子導入された植物の種子の一部は、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サッカルム・オフィキナルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、アレンガ・サッカリフェラ（Ａｒｅｎｇａ ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ）、アセル・サッカルム（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）およびソルガム種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．）を含む植物の群に由来する。

付加的および／または代替的な一実施形態においては、遺伝子導入された植物細胞、遺伝子導入された植物または遺伝子導入された植物の一部（これは、好ましくは該植物のサッカロース貯蔵器官である）は、同一の条件下で培養された同質遺伝子型の植物細胞または植物よりも高いサッカロース濃度を有する。さらに、植物の一部にはインタクトな植物全体が連結されていてもよいし、植物の一部とインタクトな植物全体とは分離されていてもよい。こうした部分には、例えば、植物の器官、組織、細胞および種子が含まれる。

好ましくは、このサッカロース濃度がより高いということは、植物液胞におけるサッカロース濃度がより高いことに基づいており、特に植物のサッカロース貯蔵器官の少なくとも１つの細胞の液胞におけるサッカロース濃度がより高いことに基づいている。特に好ましくは、サッカロース濃度がより高い植物はサッカロース収量の増加をも示す。収量とは、本明細書においては、サッカロース貯蔵器官中の水分を考慮した、所定の作付面積（例えば１ヘクタール）に関する、またはサッカロース貯蔵器官の重量に関する（好ましくは、新鮮重量または乾燥重量への正規化を行った）サッカロース貯蔵器官からのサッカロースの生産量を意味する。

もう１つの態様によれば、本発明は、遺伝子導入された植物の製造方法に関し、その際、この方法は少なくとも以下のステップを含む：
（ａ） 第一の態様による核酸分子、第二の態様による組換え遺伝子、および／または第三の態様によるベクターまたは可動遺伝因子を、植物の少なくとも１つの細胞に導入するステップ、および
（ｂ） ステップ（ａ）において得られた植物細胞から、遺伝子導入された植物を再生させるステップ。

一実施形態によれば、この方法から生じる遺伝子導入された植物は、サッカロースを、該植物の細胞の液胞において、好ましくは該植物のサッカロース貯蔵器官の細胞の液胞において、同一の条件下で培養された同質遺伝子型の対照植物よりも高度に濃縮することができる。

本発明の趣意においては、「同質遺伝子型の植物あるいは対照植物」または「同質遺伝子型の植物細胞」とは、遺伝子導入された植物または遺伝子導入された植物細胞を生成するための出発材料として使用された植物または植物細胞であると理解される。したがって、遺伝子導入された植物のゲノムおよび／または遺伝子導入された植物細胞のゲノムは、それが遺伝子組換え植物または遺伝子組換え植物細胞である場合には、遺伝子導入された遺伝子および／または導入されたヌクレオチド配列を除いては、互いに相違しない。

付加的なおよび／または代替的な一実施形態によれば、遺伝子導入された植物は、少なくとも１つのプロトン／糖アンチポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を少なくとも１つの細胞において発現または過剰発現する。

例えば形質転換による核酸分子の導入は、その是非に関して当業者に知られている技術を用いて行うことができる。例えば、送達すべき核酸配列を植物ゲノムへの組み込みが可能なそのプラスミド上に含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に植物組織または植物細胞を感染させることによって、核酸分子をこの植物細胞に導入することができる。生物的な移入による導入も可能であり、その際、植物細胞に導入すべき核酸を金粒子またはタングステン粒子に施与し、これを引き続き高速で細胞に入れる。当業者に知られている、植物細胞に核酸を導入するためのもう１つの方法は、プロトプラスト形質転換であり、その際、導入すべき核酸分子の存在下でプロトプラストをポリエチレングリコールに添加するかまたはプロトプラストに短い電流パルスをかけることによって、プロトプラスト膜が一過的に核酸分子透過性となる。形質転換させた組織または細胞から植物全体を再生するための方法も、同様に従来技術から当業者に知られている。

好ましくは、第一の態様による核酸分子、第二の態様による組換え遺伝子および／または第三の態様によるベクターまたは可動遺伝因子は、植物細胞のゲノムに安定的に導入される。このことは、送達された核酸配列が植物の再生後にこの植物から子孫植物へと継承されうることを意味する。

好ましくは、テンサイの形質転換および再生は、Ｌｉｎｄｓｅｙにより記載された方法により行われる（Ｌｉｎｄｓｅｙ Ｋ． （１９９１） ”Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ”． Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｎｕａｌ Ｂ７： １−１３， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）。

植物の形質転換は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって確認することができる。再生後、種子を得るためにこの形質転換体を温室内で成長させ、自家受粉させることができる。

一実施形態においては、形質転換すべき植物細胞は、単子葉植物の細胞である。もう１つの実施形態においては、形質転換すべき植物細胞は、双子葉植物の細胞である。もう１つのおよび／または付加的な実施形態によれば、形質転換すべき植物細胞は、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サッカルム・オフィキナルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、アレンガ・サッカリフェラ（Ａｒｅｎｇａ ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ）、アセル・サッカルム（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）およびソルガム ｓｐ．（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．）を含む種または上位の属の群から選択される植物の細胞である。

もう１つの態様によれば、本発明は、植物の少なくとも１つの細胞における、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質の発現または過剰発現によって、この植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための方法に関する。この発現または過剰発現は、植物の少なくとも１つの細胞の遺伝的改変によって行われることができ、かつ、以下のこと：
（１） 第一の態様による核酸分子、第二の態様による組換え遺伝子、および／または第三の態様によるベクターまたは可動遺伝因子を、植物の少なくとも１つの細胞に導入し、それによって、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の付加的な発現または過剰発現を生じさせること、または、
（２） 内在性調節エレメントの遺伝的改変、例えば液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする内在性遺伝子の発現を調節するプロモーターの遺伝的改変を、例えば付加的なシスエレメントまたはエンハンサーの挿入によって行い、それにより、調節された液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の発現の増加を生じさせること
を含む。

植物の少なくとも１つの細胞における液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質の発現または過剰発現によって、遺伝的に改変された細胞の液胞へのサッカロースの取り込みが改善される。それによって、この細胞の液胞におけるサッカロース濃度も、同質遺伝子型の植物細胞と比較して高められる。

「サッカロース濃度の増加」あるいは「増加したサッカロース濃度」あるいは「植物のサッカロース貯蔵器官のより高いサッカロース濃度」とは、サッカロース貯蔵器官の新鮮重量を基準とした平均サッカロース濃度の増加が、同一の条件下で培養された、遺伝子導入がなされていない（同質遺伝子型の）対照植物と比較して、少なくとも０．２％、０．４％、０．６％、０．８％または１％であり、好ましくは少なくとも１．２％、１．４％、１．６％、１．８％または２％であり、特に好ましくは少なくとも２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％または１０％であり、極めて特に好ましくは少なくとも１５％であることを意味する。

本発明の趣意においては、「過剰発現」という概念は、植物、植物細胞またはその液胞膜における液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の量が、同質遺伝子型の植物、同質遺伝子型の植物細胞またはその液胞膜における量よりも高いことと理解される。

一実施形態によれば、植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための方法は、本発明の第一の態様による核酸分子の、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現および／または過剰発現を含む。

この目的のために、上記の方法により遺伝子導入された植物が製造され、その際、この遺伝子導入された植物におけるプロトン／糖アンチポータータンパク質の発現および／または過剰発現を、上記の通り様々な遺伝的改変によって可能にすることができる。

さらに、例えば、強力なプロモーターと本発明の第一の態様によるヌクレオチド配列とからのコンストラクトを、形質転換すべき植物細胞に導入することができる。あるいは、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする遺伝子の内在性プロモーター、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードする遺伝子の内在性プロモーターを、このプロモーターが、遺伝子導入された植物において、同質遺伝子型の対照植物よりも強力な活性を示すように改変することができる。内在性プロモーターを改変するための方法は、例えばＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーヌクレアーゼでありうる。もう１つの方法によれば、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする内在性の遺伝子の、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードする内在性の遺伝子の、付加的なゲノコピー（その天然のプロモーターを含む）を、植物細胞に導入することができる。

代替的および／または付加的な一実施形態においては、液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質は、ＢｖＴＳＴ２．１タンパク質、そのホモログ、アナログおよびオルソログを含む群から選択される。

もう１つの態様によれば、本発明は、植物であって該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物を特定するための方法に関する。

一実施形態によれば、特定すべき植物をマーカーアシストによる特定に供することができる。このために、試験すべき各々の植物のＤＮＡを単離し、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、そしてこのＰＣＲの反応産物を分析することによって（この分析は、ゲルクロマトグラフィーによってかまたは例えばＲＴ−ＰＣＲのような蛍光検出法により行われる）、植物であって該植物の遺伝子構成に基づき該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物を特定することができる。付加的および／または代替的な一実施形態によれば、特定すべき植物の遺伝子構成を制限酵素断片長多型分析法により行うこともでき、その際、単離されたＤＮＡを様々な制限酵素エンドヌクレアーゼを用いて加水分解し、この制限酵素断片をクロマトグラフィーにより分離し、ブロッティングし、適切なプローブを用いてハイブリダイズする。遺伝子導入された植物であって、該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物であって、その理由が、該植物が配列番号２によるヌクレオチド配列を発現または過剰発現することによるものである植物を特定するのに適した例示的なオリゴヌクレオチドは、配列番号１５から配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドの群から得ることができる。配列番号２のホモログ、アナログまたはオルソログにも適したオリゴヌクレオチドをどのように提供することができるかについては、当業者に知られている。

付加的および／または代替的な一実施形態によれば、植物であって該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物の特定は、該植物の遺伝子構成によってではなく、該植物の液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質の発現によって行われる。このことを、例えばｍＲＮＡのレベルに関して次のように行うことができ、すなわち、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチド配列のｍＲＮＡの量を、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチド配列のｍＲＮＡの量を、例えば「リアルタイム定量的ＰＣＲ」により測定することによって行うことができる。植物における、植物組織もしくは植物細胞における、特に植物の組織かもしくは植物のサッカロース貯蔵器官の細胞における、少なくとも１つの上記の液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードするｍＲＮＡが、同一の種の比較植物もしくはその一部と比較して、または同一の植物の他の植物組織かもしくはその植物のサッカロース貯蔵器官の一部ではない植物細胞と比較して、より多量に測定されることは、ある植物が、該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適していることの証明であると考えられる。

植物であって該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物の特定は、植物部分における、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質の量の定量的検出により行われることもできる。この目的のためにいわゆるウェスタンブロットが用いられ、その際、この植物部分の、好ましくはこの部分の液胞の、特に好ましくはこの部分の液胞膜の、電気泳動により分離されたタンパク質が、１つまたは複数の上記の液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質に特異的な抗体を用いてインキュベートされる。１つまたは複数の上記の液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質に特異的な抗体に結合しかつ検出可能な標識を有する二次抗体を用いることで、植物部分における、液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の量、特に液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質の量を測定することができ、かつ、植物であって該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物を特定することができる。植物における、植物部分または植物細胞における、特に植物の組織かもしくは植物のサッカロース貯蔵器官の細胞における、少なくとも１つの液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質が、同一の種の比較植物もしくはその一部と比較して、または同一の植物の他の植物組織かもしくはその植物のサッカロース貯蔵器官の一部ではない植物細胞と比較して、より多量に測定されることは、ある植物が、該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適していることの証明であると考えられる。

したがって本発明は、上記の方法により特定された植物であって該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適している植物にも関する。もう１つの態様によれば、本発明は、第一の態様による核酸分子を診断のために検出するための分子マーカーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドに関する。

一実施形態によれば、適切なオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６によるオリゴヌクレオチドを含む群から選択される。これらを、配列番号２によるヌクレオチド配列を有する核酸分子を診断のために検出するための分子マーカーとして使用することができる。

もう１つの態様によれば、本発明は、液胞膜プロトン／糖アンチポーターとして機能するタンパク質に関する診断用の抗体に関し、好ましくは液胞膜プロトン／サッカロースアンチポーターとして機能するタンパク質に関する診断用の抗体に関する。

一実施形態においては、この診断用の抗体はモノクローナル抗体である。代替的な一実施形態においては、この診断用の抗体はポリクローナル抗血清の一部である。

付加的および／または代替的な一実施形態においては、この診断用の抗体あるいはポリクローナル抗血清は、所定の液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質、例えば液胞膜プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質に特異的である。好ましくは、この診断用の抗体は、プロトン／サッカロースアンチポータータンパク質の第六の貫通領域と第七の膜貫通領域と間のループ上のエピトープを認識してこれに結合する。

もう１つの態様によれば、本発明は、植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の使用に関する。

一実施形態によれば、植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の使用には、この液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする核酸分子の発現または過剰発現によるサッカロース濃度の増加が含まれる。好ましくは、この核酸分子には、以下：
ｉ． 配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４によるヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４によるヌクレオチド配列のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｉｉ． ｉ．によるヌクレオチド配列のうちの１つと相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｉｉｉ． ｉ．もしくはｉｉ．による核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；または
ｉｖ． 配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子か、または、配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３によるアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子
が含まれる。

配列番号２による核酸分子は、配列番号１によるアミノ酸配列を有するベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の液胞膜プロトン／糖アンチポーターＴＳＴ２．１をコードする。

配列番号４による核酸分子は、配列番号３によるアミノ酸配列を有するベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の液胞膜プロトン／糖アンチポーターＴＳＴ１をコードする。

配列番号６による核酸分子は、配列番号５によるアミノ酸配列を有するベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の液胞膜プロトン／糖アンチポーターＴＳＴ２．２をコードする。

配列番号８による核酸分子は、配列番号７によるアミノ酸配列を有するベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の液胞膜プロトン／糖アンチポーターＴＳＴ３をコードする。

配列番号１０による核酸分子は、配列番号９によるアミノ酸配列を有するアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の液胞膜プロトン／糖アンチポーターＴＭＴ１をコードする。

配列番号１２による核酸分子は、配列番号１１によるアミノ酸配列を有するアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の液胞膜プロトン／糖アンチポーターＴＭＴ２をコードする。

配列番号１４による核酸分子は、配列番号１３によるアミノ酸配列を有するアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の液胞膜プロトン／糖アンチポーターＴＭＴ３をコードする。

植物におけるｉ．からｉｖ．に挙げた少なくとも１つのヌクレオチド配列を植物の少なくとも１つの細胞に導入した後にこのヌクレオチド配列がこの植物において発現および／または過剰発現することによって、この植物の液胞膜における、特にこの植物のサッカロース貯蔵器官の液胞膜におけるプロトン／糖アンチポータータンパク質の量を増加させることができ、それによって、同一の条件下で培養された同質遺伝子型の対照植物と比較して、より多くのサッカロースをこの植物の液胞に輸送することができ、かつこの植物のサッカロース貯蔵器官におけるサッカロース濃度が増加する。それにより、植物当たりの、サッカロース貯蔵器官当たりのおよび／または作付面積当たりのサッカロース収量を増加させることができる。

本発明を、実施例をもとに以下に説明するが、これらの実施例は例示を目的としたものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明は特許請求の範囲によってのみ定められる。「ある〜」という表現は、数を特定するものと理解されるべきではない。

これらの実施例は、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のＴＳＴ２．１が、プロトン／糖アンチポーターとして高特異的にサッカロースを植物細胞の液胞に取り込むことのできる液胞膜の膜タンパク質であることを明らかに示している。

実施例１：植物材料および成長条件
以下の試験のために、テンサイ品種「ベラドンナＫＷＳ」および「ブリガディエール」を使用した。品種「ベラドンナＫＷＳ」の種子はドイツ連邦共和国アインベック所在、ＫＷＳ Ｓａａｔ ＡＧより提供されたものであり、ビーツ品種「ブリガディエール」の種子は地元の種子小売店より購入した。

さらに、ニコチアナ・ベンサミアーナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）およびアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の植物および植物細胞を使用した。これらの植物を、成長室内で、Ｅｉｎｈｅｉｔｓｅｒｄｅ− ｕｎｄ Ｈｕｍｕｓｗｅｒｋｅ Ｇｅｂｒ． Ｐａｔｚｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ社の標準基材ＥＤ−７３上で、明所１０時間および暗所１４時間の明暗サイクルで、２２℃で１２５μｍｏｌ ｑｕａｎｔａ ｍ^−２ｓ^−１で成長させた。

アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ａｔｔｓｔ１−２ Ｔ−ＤＮＡ 遺伝子ダブルノックアウト変異体は、従来技術において記載されている（Ｗｏｒｍｉｔ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００６） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｖａｃｕｏｌａｒ ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ”， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １８， ３４７６−３４９０）。２−デオキシグルコースを用いた成長試験のために、表面殺菌したアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の種子を、半濃縮したムラシゲスクーグ（１／２ ＭＳ）寒天平板培地に記載通りに播種した（Ｒｅｉｓｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００４） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｌａｓｔｉｄｉｃ ＡＴＰ／ＡＤＰ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ”， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３６： ３５２４−３５３６）。ｐＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰおよび３５Ｓ：ＢｖＴＳＴ１を過剰発現する植物の選択を、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンかまたは４０μｇ／ｍｌのカナマイシンのいずれかを含む１／２ＭＳ寒天平板培地上で行った。

実施例２：テンサイの組織における糖の定量的測定
テンサイの主根組織を、野菜用スライサーを用いて採取し、直ちに液体窒素中で凍結させ、定量的な糖の測定を行うまで−８０℃で貯蔵した。糖含分の測定のために、この植物組織を液体窒素中で粉砕し、この粉砕した組織５０μｇを８０％エタノールで、８０℃で２０分間にわたって２回抽出した。上清を合一し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（ドイツ連邦共和国ハンブルク所在、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて蒸発させた。乾燥させた糖を水に溶解させ、記載されている通りに、マイクロプレートリーダーにおいてＮＡＤＰ結合酵素アッセイを用いて定量化した（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ， Ｈ． Ｕ． ａｎｄ Ｂｅｒｎｔ， Ｅ． （１９７４） ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ”， ｖｏｌ．３， Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ． ｅｄ．， Ｖｅｒｌａｇ−Ｃｈｅｍｉｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．１１７６−１１７； Ｌｅｅ， Ｙ．Ｃ． （１９７２） ”α−Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ， β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ａｎｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｓｗｅｅｔ ａｌｍｏｎｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ”． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８： ６９９−７０２）。

実施例３：遺伝子発現解析
ｍＲＮＡの相対的蓄積を、記載されている通りに、ノーザンブロット解析により行った（Ｊｕｎｇ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） ”Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｎｅｓ”． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６５： ７０３−７１１）。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以前に記載されている通りに行った（Ｌｅｒｏｃｈ Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００５） ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｔｉｄｉｃ ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｕｎｉｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ”． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０： １７９９２−１８０００）。使用した遺伝子特異的プライマーを表１に示す：

実施例４：主根組織からの液胞および液胞膜の単離
液胞の単離を、ＬｅｉｇｈおよびＢｒａｎｔｏｎによる方法によって行ったが（Ｌｅｉｇｈ， Ｒ． Ａ． ａｎｄ Ｂｒａｎｔｏｎ， Ｄ． （１９７６）． ”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｕｏｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｒｏｏｔ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ”， Ｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５８： ６５６−６６２）、但し次のような変更を加えた：主根組織を野菜用スライサーで切断して厚さ０．１〜０．２ｍｍの切片にし、これを直ちに回収培地（１Ｍソルビトール、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）内で、室温でインキュベートした。その後、この主根組織の薄い切片をかみそりの刃を用いてこの回収培地（１Ｍソルビトール、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）内で粉砕し、ステンレス鋼ふるい（１００μｍのメッシュサイズ）を通してろ過し、遠心分離（２，０００×ｇ、２０分間、４℃）で沈殿させた。この沈殿物を、３０％ニコデンツ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）（ドイツ連邦共和国ハイデルベルク所在、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＧｍｂＨ）を含む回収培地に再懸濁させ、１７ｍｌの遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ）に移した。後続のスイングアウト遠心分離（１，５００×ｇ、１５分間、８℃）において、ニコデンツは密度勾配を形成し、かつ液胞はこの密度勾配の上層に浮いていた。

液胞膜の単離を、従来技術に記載されている通りに行った（Ｓｃｈｕｌｚｅ Ｗ．Ｘ． ｅｔ ａｌ． （２０１２） ”Ｃｏｌｄ ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ”， Ｐｌａｎｔ． Ｊ． ６９： ５２９−５４１）。超音波処理した液胞におけるα−マンノシダーゼの活性を、他に記載されている通りに行った（Ｂｏｌｌｅｒ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｅｎｄｅ， Ｈ． （１９７９） ”Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｖａｃｕｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ”． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ６３： １１２３−１１３２； Ｌｅｅ， Ｙ．Ｃ． （１９７２） ”α−Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ， β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ａｎｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｓｗｅｅｔ ａｌｍｏｎｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ”． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８： ６９９−７０２）。

実施例５：液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析
２カ月齢または５カ月齢の植物の単離した液胞膜の沈殿物を、濃度１μｇ／ｍｌの緩衝液（４％ＳＤＳ、５０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）中に取り込んだ。この取り込んだタンパク質を８０％アセトン中で、−２０℃で一晩沈殿させ、さらにＭｕｅｈｌｈａｕｓにより記載されている通りに処理した（Ｍｕｅｈｌｈａｕｓ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） ”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｈｏｔｇｕｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｕｎｉｆｏｒｍ １５Ｎ−ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ”， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０： Ｍ１１０ ００４７３９）。抽出したペプチドを、２００μｌの緩衝液（２％アセトニトリル、０．４％酢酸）に再懸濁させた。

抽出したこれらのペプチド各３μｌのサンプルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析）に供した。このクロマトグラフィーによる分離を、ｎａｎｏＡｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（ドイツ連邦共和国エシュボルン所在、Ｗａｔｅｒｓ）で、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ（粒子径５ｍｍ、カラムサイズ１８０μｍ×２０ｍｍ）およびＢＥＨ １３０ Ｃ１８カラム（粒子径１．７μｍ、カラムサイズ７５ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いて行った。溶出を二重勾配で行い、まず１００％緩衝液Ａ（０．４％酢酸、１％ ２−プロパノール、２％アセトニトリル）から４０％緩衝液Ｂ（０．４％酢酸、１％ ２−プロパノール、９０％アセトニトリル）へ２または３時間以内に行い、次いで９０％緩衝液Ｂへ５分以内に行い、最後に９０％緩衝液Ｂを用いて１５分間行った。最後に、このカラムを１５分間にわたって１００％緩衝液Ａを用いて再平衡化した。Ｈｙｂｒｉｄ ＬＴＱ ＸＬ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ドイツ連邦共和国ハンブルク所在、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、データ依存モードで、測定スペクトル３００〜１５００ｍ／ｚ（オービトラップ）のフルスキャンサイクルで、分解能を４００ｍ／ｚで６０，０００に設定して作動させ、次いで最も強いイオンの連続する７回のデータ依存的ＭＳ^２スキャン（ＬＴＱ）を行った。個々に帯電したイオンをＭＳ^２分析から除外し、ＭＳ^２分析のための親イオンを２０秒間にわたって除外リストに入力した。各サンプルに対して三重の分析を行った。

タンパク質を、ＭａｘＱｕａｎｔ ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＡｎｄｒｏｍｅｄａ Ｓｕｃｈｍａｓｃｈｉｎｅ（Ｃｏｘ， Ｊ． ａｎｄ Ｍａｎｎ， Ｍ． （２００８） ”ＭａｘＱｕａｎｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ， ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｐ．ｐ．ｂ．−ｒａｎｇｅ ｍａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６： １３６７−７２）を用いて、本発明者の社内で作成されたテンサイタンパク質に関するデータベースにおいて特定した。

実施例６：核酸コンストラクト
ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、主根または葉から単離したＲＮＡの逆転写により作製した。すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ−ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。

ベクターｐＵＢＣ−ＧＦＰ−Ｄｅｓｔ（Ｇｒｅｆｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１０） ”Ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｔ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇｇｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ”， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６４： ３５５−３６５）を用いて、ｐＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ１−ＧＦＰ融合コンストラクトを作製した。このために、ＢｖＴＳＴ１のｃＤＮＡを増幅させ、終止コドンを、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２部位を含むＢｖＴＳＴ１プライマーを使用したＰＣＲによって削除した。この増幅産物を、ＢＰ反応によってｐＤＯＮＲＺＥＯ（ドイツ連邦共和国ハイデルベルク所在、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、次いでｐＵＢＣ−ＧＦＰ−ＤｅｓｔへのＬＲ反応を行った。

ｐＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰコンストラクトは、以下のように作製した：ＢｖＴＳＴ２．１遺伝子のオープンリーディングフレーム全体を、プライマーＢｖＴＳＴ２．１ｆｗ＿ＸｈｏＩ／ＢｖＴＳＴ２．１ｒｅｖ＿ＸｂａＩを用いて増幅させた。得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩを用いて開裂させたベクターｐＵＢＣ−ｃＧＦＰ−Ｄｅｓｔ（Ｇｒｅｆｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１０））に連結した。このようにして作製したコンストラクトはｂａｒ遺伝子を含んでおり、これは形質転換させた植物においてバスタ耐性をもたらす。次いで、ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰをコードする完全なヌクレオチド配列をＸｈｏＩ／ＰｓｔＩを用いてこのコンストラクトから切断し、相応してＸｈｏＩおよびＰｓｔＩを用いて開裂させたベクターｐＵＢＮ−ｎＹＦＰ−Ｄｅｓｔに挿入し、これによって、形質転換させた植物においてハイグロマイシン耐性がもたらされる。ＸｈｏＩ／ＰｓｔＩによるｐＵＢＮ−ｎＹＦＰ−Ｄｅｓｔの消化によって、ｎＹＦＰ配列の完全な除去と標的ベクターの「ゲートウェイ」特性とがもたらされ、その結果として、これはアグロバクテリウムを用いたＡｔｔｓｔ１−２遺伝子ダブルノックアウト変異体の形質転換に適している（Ｃｌｏｕｇｈ Ｓ．Ｊ．， Ｂｅｎｔ， Ａ．Ｆ． （１９９８） ”Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ： ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ”． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６： ７３５−７４３）。作製したすべての遺伝子コンストラクトのヌクレオチド配列を、配列解析により確認した。

実施例７：形質転換させたニコチアナ・ベンサミアーナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物の液胞のパッチクランプ試験
Ｎ．ベンサミアーナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉肉細胞におけるユビキチンプロモーター（ｐＵＢＱ１０）の制御下での、そのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を標識した糖輸送タンパク質（ＢｖＴＳＴ１−ＧＦＰおよびＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰ）の、またはＧＦＰのみを用いた、一過性過剰発現のために、Ｌａｔｚら（２００７）により記載された５〜７週齢の植物でのアグロインフィルトレーション法を用いた（Ｌａｔｚ ｅｔ ａｌ． （２００７） ”Ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＡＫＴ２ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ａ ｐＨ− ａｎｄ Ｃａ^２＋−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎｗａｒｄ ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ Ｋ^＋ ｃｈａｎｎｅｌ”， Ｐｌａｎｔａ， ２２５： １１７９−１１９１）。従来技術に記載されている方法とは異なり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１株を、遺伝子１９Ｋをコードするヌクレオチド配列のキャリアとして、および相応する糖輸送タンパク質／ＧＦＰコンストラクトのキャリアとして、使用した。この細菌を５ｍｌのＹＥＢ培地内で一晩培養し、室温で８，０００×ｇで１分間遠心分離し、アグロミックス（Ａｇｒｏｍｉｘ）で２回洗浄した（Ｌａｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００７））。これらの細菌細胞を３ｍｌのアグロミックスに再懸濁させ、暗所で、２８℃で２〜３時間保持した。インフィルトレーションのために、１９Ｋを含有するアグロバクテリウムを含む懸濁液１ｍｌを、ｐＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ１−ＧＦＰ、ｐＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰまたはｐＵＢＱ：ＧＦＰを含有するアグロバクテリウムの懸濁液１ｍｌと混合し、そしてアグロミックス２ｍｌと混合した。

このアグロインフィルトレーションの２日後に、葉肉細胞のプロトプラストを、実質的にＢｅｙｈｌらにより記載されている通りに単離した（Ｂｅｙｈｌ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００９） ”Ｔｈｅ ｆｏｕ２ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｖａｃｕｏｌａｒ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ＴＰＣ１ｃｏｎｆｅｒｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｌｕｍｉｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ”， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５８： ７１５−７２３）。葉切片を１時間にわたって酵素インキュベーションした後、遊離したプロトプラストを５００ｍＭのソルビトールおよび１ｍＭのＣａＣｌ_２で洗浄した。液胞を、２８ ｍＯｓｍｏｌ×ｋｇ^−１のオスモル濃度を有する溶解バッファーに曝露することにより（１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；オスモル濃度をＤ−ソルビトールで調整）、この液胞をプロトプラストからパッチクランプチャンバへ直接遊離させた。巨視的電流を「液胞全体」の構成で測定し（Ｂｅｙｈｌ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００９） ”Ｔｈｅ ｆｏｕ２ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｖａｃｕｏｌａｒ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ＴＰＣ１ｃｏｎｆｅｒｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｌｕｍｉｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ”． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５８： ７１５−７２３）、かつ１００Ｈｚでローパスフィルタをかけた。浴およびピペット溶液は、ｐＨ値を除いてそれらの組成に関して同一であった（１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、４５０〜５００ Ｏｓｍｏｌ×ｋｇ^−１、調整をＤ−ソルビトールを用いて行った）。浴のｐＨ値を７．４（Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ）に調整し、かつピペット溶液のｐＨ値を５．５（Ｍｅｓ／Ｔｒｉｓ）に調整した。糖により誘導されたプロトンの流れを測定するために、グルコースまたはサッカロースを、それぞれ５０ｍＭの最終濃度で液胞膜の細胞質側に添加した。

実施例８：テンサイの主根の細胞からの液胞の膜プロテオームの解析
テンサイの主根細胞の液胞膜のタンパク質構造を解析するために、５カ月齢のテンサイ（ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））の品種「ベラドンナＫＷＳ」の主根細胞の液胞を単離し、高速遠心分離により液胞膜を富化させた。数回洗浄した液胞膜画分からアセトンを用いて疎水性の膜タンパク質を沈殿させ、続いて尿素溶液（８Ｍ尿素）に再懸濁させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の前にトリプシン消化に供した。

富化されたそれぞれの液胞膜プレパレーションにおいて、合計で約４００の異なるタンパク質を特定した。これらのタンパク質のうちの１つ（以下、ＢｖＴＳＴ２．１と呼ぶ、（配列番号１））が、互いに独立して実施したすべてのプレパレーションにおいて多量に存在しており、これは（［ＬＩＶＭＳＴＡＧ］−［ＬＩＶＭＦＳＡＧ］−（ＳＨ）−（ＲＤＥ）−［ＬＩＶＭＳＡ］−［ＤＥ］−（ＴＤ）−［ＬＩＶＭＦＹＷＡ］−Ｇ−Ｒ−［ＲＫ］ −ｘ（４，６）−［ＧＳＴＡ］； Ｐｒｏｓｉｔｅ Ｐａｔｔｅｒｎ ＰＳ００２１６， ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）に糖トランスポーターのシグネチャーを示し、かつアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの液胞単糖トランスポーターＴＭＴ２に対して最も高い類似性を示していた（図１）。

実施例９：テンサイゲノムにおける液胞膜糖輸送タンパク質の遺伝子
Ｂ．ブルガリス（Ｂ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）のゲノムの検索に際して、液胞膜糖輸送タンパク質をコードする４つのパラロガスな遺伝子を特定することができた。系統解析（図２）は、糖トランスポーターＢｖＴＳＴ１およびＢｖＴＳＴ３が、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のオルソロガス遺伝子ＡｔＴＭＴ１あるいはＡｔＴＭＴ３と最も類似していることを示しており、一方で、ＢｖＴＳＴ２．１およびＢｖＴＳＴ２．２は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のオルソログＡｔＴＭＴ２に対して最も高い配列類似性を示す遺伝子の極めて類似したペアである（図１）。ＢｖＴＳＴ２．１のアミノ酸配列は、ＡｔＴＭＴ２のアミノ酸配列と約６８％一致しており、類似性は８４％である（図１）。

実施例１０：ＢｖＴＳＴ２．１の細胞内局在
ＢｖＴＳＴ２．１の細胞内局在を、安定的にｐＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰを用いて形質転換させたＡｔｔｓｔ１−２遺伝子ダブルノックアウト変異体において調べた。

葉肉細胞からのプロトプラストの単離および液胞の遊離を、知られている方法により行った（Ｙｏｏ， Ｓ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００７） ”Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ： ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ”， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ １５６５−１５７２）。

共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５、ドイツ連邦共和国ウェッツラー所在、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、蛍光顕微鏡画像の撮影に使用した。いずれの画像も、Ｌｅｉｃａ ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ６３ｘ／１．２０ｗ ｍｏｔＣＯＲＲ ＣＳ対物レンズで撮影した。画像処理を、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｓｕｉｔｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。

完全なＢｖＴＳＴ２．１のｍＲＮＡのクローニングの後に、ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰ融合タンパク質をアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において安定的に発現させることによってタンパク質の細胞内局在を調べた。ＢｖＴＳ２．１−ＧＦＰを安定的に発現するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異体の葉の葉肉細胞において緑色蛍光が観察されたことは、この融合タンパク質が、葉緑体を密に取り囲む液胞の膜に局在することを示していた。

ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰを発現する植物の葉肉組織の酵素消化によって、個々のインタクトなプロトプラストが得られた。その後、これらのプロトプラストを低浸透圧処理することによって、安定した緑色蛍光の液胞の遊離が生じ、これによって液胞膜におけるＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰの局在を確認した。

実施例１１：テンサイの主根におけるＢｖＴＳＴ２．１の発現とサッカロース濃度との相関関係
テンサイの主根におけるＢｖＴＳＴ２．１の発現とテンサイのサッカロース濃度との考えられうる相関関係を調べるために、テンサイ品種「ベラドンナＫＷＳ」および「ブリガディエール」のＢｖＴＳＴ２．１遺伝子の発現を調べた。

品種「ベラドンナＫＷＳ」は、高いサッカロース濃度を示しかつ定植のすでに２カ月後には主根において約１６０μｍｏｌ×ｇ^−１ 新鮮重量のサッカロース濃度を示すテンサイ品種であることが知られている（図３）。この高いサッカロース濃度は、後続の３カ月間の発育の間に増加して約４５０μｍｏｌ×ｇ^−１ 新鮮重量に達した。これは、２カ月齢の主根に対して約３倍の増加に相当する。

これとは対照的に、品種「ブリガディエール」の主根が２カ月間の成長の後に含有していたサッカロースは、新鮮重量当たり７０μｍｏｌ未満であり、この主根は、後続の３カ月において新鮮重量１ｇ当たり約１９５μｍｏｌのサッカロースしか蓄積していなかった（図３）。

葉のサッカロース濃度と主根のサッカロース濃度とを比較すると、葉と比較して、主根において約３０倍の高さのサッカロース含分を検出することができた。一方で、葉におけるグルコース濃度は主根における濃度の約８０倍の高さであった。

異なるテンサイ品種間でのサッカロース蓄積における相違は、ＢｖＴＳＴ２．１をコードするｍＲＮＡの量にも反映されていた（図４）。品種「ベラドンナＫＷＳ」の主根においても「ブリガディエール」においても、２カ月間の成長後に、ｍＲＮＡの量は、４つのいずれのパラロガスな糖トランスポーターに関しても低かった。

さらに１カ月間成長および発育させた後、双方の品種におけるＢｖＴＳＴ２．１に関するｍＲＮＡの量は、ＢｖＴＳＴ１、ＢｖＴＳＴ２．２およびＢｖＴＳＴ３をコードするｍＲＮＡの量よりも明らかに高かった。さらに、品種「ベラドンナＫＷＳ」の主根におけるＢｖＴＳＴ２．１のｍＲＮＡの量は、品種「ブリガディエール」の主根における量の約２．６倍の高さであった（図４）。

さらに２カ月間の成長の間に、双方の品種におけるＢｖＴＳＴ２．１のｍＲＮＡの量は、３カ月間の成長の後の量と比較して実質的には変化しなかったため、５カ月間の成長および発育の段階の後であっても、品種「ベラドンナＫＷＳ」の主根におけるＢｖＴＳＴ２．１に関するｍＲＮＡの量は、依然として、品種「ブリガディエール」の主根における量の約２．６倍の高さであった。

サッカロース貯蔵に関するＢｖＴＳＴ２．１タンパク質の重要性についてのさらなる示唆を得るために、３カ月齢および５カ月齢のテンサイ品種「ベラドンナＫＷＳ」の葉におけるグルコース、フルクトースおよびサッカロースの濃度を測定し（図５）、４つのＴＳＴ−パラログのｍＲＮＡの量と比較した（図６）。グルコース含分およびフルクトース含分が極めて低かった主根とは異なり、葉にはこれら双方の単糖が蓄積されていた。３カ月齢のテンサイの葉において、グルコースの濃度およびフルクトースの濃度は３３〜３５μｍｏｌ／ｇ 新鮮重量であったのに対して、サッカロースの濃度は１５μｍｏｌ／ｇ 新鮮重量未満であった。５カ月間の成長の後、これら３つの糖のそれぞれの濃度は、６〜９μｍｏｌ／ｇ 新鮮重量であった（図５）。

注目すべきことは、葉におけるＢｖＴＳＴ２．１に関するｍＲＮＡの量はＢｖＴＳＴ１、ＢｖＴＳＴ２．２およびＢｖＴＳＴ３に関するｍＲＮＡの量よりも一貫して低かったのに対して、主根におけるＢｖＴＳＴ２．１に関するｍＲＮＡの量は他のアイソフォームに関するｍＲＮＡの量よりも常に高かった、ということであった（図６）。

実施例１２：ＢｖＴＳＴ２．１により媒介されたサッカロースの液胞膜輸送
ＢｖＴＳＴ２．１の輸送機能を証明するために、「パッチクランプ」技術を、単離した液胞に適用した。このために、ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰ融合タンパク質を、ニコチアナ・ベンサミアーナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉肉細胞において一過的に発現させた。形質転換させたプロトプラストのインタクトな液胞を、軽度の低浸透性溶解後にその緑色着色によって特定することができた。

単離した液胞の液胞膜上での生理的プロトン勾配を再現するために、ピペット内の培地（これは、液胞の管腔の内容物の代わりとなるものである）を緩衝してｐＨ値を５．５にし、一方で、チャンバ（＝浴）内の培地（これは、細胞質ゾルの代わりとなるものである）をｐＨ７．５に調整した。サッカロースを「細胞質ゾル」の培地に添加した場合には、液胞が反応すると共に、電流が下向きに強度に偏向した。単離した液胞の周囲の培地へサッカロースを添加した場合には内向き電流が生じ、これは、サッカロース輸送のプロトン対向輸送に相当する。

ＢｖＴＳＴ２．１が存在しない場合には、Ｎ．ベンサミアーナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉｎａｎａ）の単離液胞は顕著なサッカロース／プロトン輸送活性を示さなかった。これとは対照的に、ＢｖＴＳＴ２．１を有する液胞の場合には、チャンバ培地へのサッカロースの添加によって、約−１ｐＡ／ｐＦの大きさの内向き電流が生じた（図７）。この電流は、ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰを含有する液胞膜を介したプロトン駆動によるサッカロースの取り込みの生物学的指紋を表すものであり、これは、ＢｖＴＳＴ２．１が、膜を介したプロトン勾配に沿ったプロトンの排出と、既存のサッカロース勾配に反したサッカロースの取り込みとを併せ示すことの明確な証拠である。最後に挙げたこの機能は、テンサイがその主根の液胞において多量のサッカロースを蓄積しうるための生化学的な必要条件である。

注目に値するのは、ＢｖＴＳＴ２．１は、グルコースにより媒介されるプロトン排出を可能にしうるものではない、ということである。ＢｖＴＳＴ２．１とは対照的に、アイソフォームＢｖＴＳＴ１は、サッカロースによって誘導されるだけでなくグルコースによっても誘導される、約−０．３ｐＡ／ｐＦの大きさの電流をもたらす（図７；表２）。

これらのデータは、ＢｖＴＳＴ２．１のサッカロース特異性を明確に示している。

実施例１３：インビボでのＢｖＴＳＴ２．１のサッカロース特異性
生きた植物細胞におけるＢｖＴＳＴ２．１の基質特異性が高いことを実証するために、ＡｔＴＭＴ遺伝子ダブルノックアウト変異体（これら２つのいずれも、実質的に液胞膜単糖トランスポータータンパク質を有していない）を、ＰＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰコンストラクトかまたはｐＵＢＱ：ＢｖＴＳＴ１コンストラクトのいずれかを用いて形質転換させた。これらの形質転換体を、毒性グルコースの類似物である２−デオキシグルコースの存在下で成長させた。２−デオキシグルコースを含まない対照実験では、すべての植物系統が同様の成長を示した。２−デオキシグルコースの存在下では、ｔｓｔ１−２遺伝子ダブルノックアウト変異体は正常に発育しなかったが、一方で、野生型植物およびＢｖＴＳＴ１を発現する系列は、はるかにより良好な成長を示した。野生型植物およびＢｖＴＳＴ１を発現する遺伝子ダブルノックアウト変異体が２−デオキシグルコースの存在下でより良好に成長した理由は恐らく、２−デオキシグルコースが解毒のために液胞に輸送されえたことにあるものと考えられる。この遺伝子ダブルノックアウト変異体はこうしたことを行うことができない。ＢｖＴＳＴ２．１を発現する遺伝子ダブルノックアウト植物は、液胞膜にＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰ−融合タンパク質が存在していたにもかかわらず、２−デオキシグルコースの存在下ではＡｔｔｓｔ１−２遺伝子ダブルノックアウト変異体の成長の停止を補償することができなかった。

こうしたインビボでの２−デオキシグルコースに対するＡｔｔｓｔ１−２：：ＢｖＴＳＴ２．１−ＧＦＰ植物の顕著な感受性は、単離した液胞に関して得られたＢｖＴＳＴ２．１の電気生理学的データおよびサッカロース特異性と一致している。

Claims (14)

1. 液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする核酸分子において、前記液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質がサッカロース特異的であって、サッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させることが可能であり、かつ、
   以下の群：
   ａ） 配列番号２によるヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、配列番号２によるヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸分子；
   ｂ） ａ）によるヌクレオチド配列のうちの１つと相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子；および
   ｄ） 配列番号１によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、ポリペプチドであって該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１に対して少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子
   から選択される核酸分子を含む、核酸分子。
2. 請求項１に記載の核酸分子を含む、組換え遺伝子。
3. ベクターまたは可動遺伝因子であって、請求項１に記載の核酸分子か、または請求項２に記載の組換え遺伝子を含む、前記ベクターまたは可動遺伝因子。
4. 真核宿主細胞または原核宿主細胞であって、導入遺伝子としての請求項１に記載の核酸分子、導入遺伝子としての請求項２に記載の組換え遺伝子、または請求項３に記載のベクターもしくは可動遺伝因子を含む、前記真核宿主細胞または原核宿主細胞。
5. 請求項１において定められた液胞膜プロトン／糖アンチポーターとして機能する、タンパク質。
6. 遺伝子導入された植物細胞であって、導入遺伝子としての請求項１に記載の核酸分子、導入遺伝子としての請求項２に記載の組換え遺伝子、または請求項３に記載のベクターもしくは可動遺伝因子を含む、前記遺伝子導入された植物細胞。
7. 請求項６に記載の遺伝子導入された植物細胞を少なくとも１つ含む、遺伝子導入された植物またはその一部。
8. 請求項７に記載の遺伝子導入された植物の種子であって、導入遺伝子としての請求項１に記載の核酸分子、導入遺伝子としての請求項２に記載の組換え遺伝子、または請求項３に記載のベクターもしくは可動遺伝因子を有する、前記種子。
9. 遺伝子導入された植物の製造方法であって、以下のステップ：
   （ａ） 請求項１に記載の核酸分子、請求項２に記載の組換え遺伝子、または請求項３に記載のベクターもしくは可動遺伝因子を、植物の少なくとも１つの細胞に導入するステップ、および
   （ｂ） ステップ（ａ）において得られた植物細胞から、遺伝子導入された植物を再生させるステップ
   を含む、前記方法。
10. 植物の少なくとも１つの細胞における請求項１に記載の核酸分子の発現または過剰発現によって該植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための方法。
11. 植物であって該植物のサッカロース貯蔵器官においてサッカロース濃度の増加を生じさせるのに適した植物を特定するための方法において、請求項１に記載の核酸分子の検出、請求項５に記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡの量の測定、または請求項５に記載のタンパク質の量の検出を含む、前記方法。
12. 請求項１に記載の核酸分子を検出するための診断用の分子マーカーとしての使用に適した、オリゴヌクレオチドであって、以下の群：配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６によるオリゴヌクレオチドの群から選択される、前記オリゴヌクレオチド。
13. 請求項５に記載のタンパク質の診断用の抗体。
14. 液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質をコードする核酸分子の発現または過剰発現によって植物のサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度を増加させるための前記液胞膜プロトン／糖アンチポータータンパク質の使用であって、前記核酸分子には、以下：
    ｉ． 配列番号２、４、６、もしくは８によるヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または、配列番号２、４、６、もしくは８によるヌクレオチド配列のうちの１つに対して少なくとも９９％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸分子；
    ｉｉ． ｉ．によるヌクレオチド配列のうちの１つと相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子；または
    ｉｉｉ． 配列番号１、３、５、もしくは７によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子か、または、配列番号１、３、５、もしくは７によるアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも９９％の同一性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子
    が含まれるものとする、前記使用。

Images