KR101711848B1 - Onac106 유전자를 이용한 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ONAC106 유전자를 이용한 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 벼 유래 ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체는 기능적 녹색지속성 형질이 나타나고, 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가하므로, ONAC106 단백질 코딩 유전자의 발현 조절을 통해 식물의 노화를 지연시키고 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체를 개발할 수 있으며, 이는 작물의 상품성 및 생산성 증대에 기여할 수 있다.

Description

ONAC106 유전자를 이용한 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing functional stay-green transgenic plant with improved tolerance to abiotic stress using ONAC106 gene and the plant thereof}

본 발명은 ONAC106 유전자를 이용한 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.

식물체에서 잎 발달 마지막 단계인 잎의 노화 이벤트는 여러 고분자 화합물의 분해와 노화관련 유전자들의 대대적인 mRNA 발현량의 변화에 기인한다. 잎의 노화는 여러 내적인 요인에 의해서 과정이 시작 및 진행된다. 노화의 주된 내적 요인은 광합성 단계, 대사산물의 수치 및 식물호르몬의 작용 등이 있다. 반대로 외적 요인은 가뭄, 염분, 빛 및 영양소 부족과 같은 스트레스성 환경요인을 들 수 있다.

잎의 노화 기작을 이해할 수 있는 가장 좋은 실험방법은 잎의 노화가 지연되는 형질을 가진 돌연변이체를 이용한 연구이다. 지금까지 모델 식물 및 여러 작물에서 많은 노화관련 돌연변이체들에 대한 연구가 진행되어 왔으며, 그 결과 잎의 노화 과정 중에서 발현량이 달라지는 많은 노화관련 유전자(SAG)가 동정되었다. 녹색지속의 양상은 크게 두 가지로 분류된다. 하나는 잎의 노화가 지연되면서 광합성 능력이 유지되는 기능적 녹색지속성(functional stay-green) 타입과, 또 다른 하나는 광합성 능력의 상실 속도는 대조구와 비슷하지만, 잎의 노화만 지연되는 비기능적 녹색지속성(nonfunctional stay-green) 타입이다. 등숙기에도 광합성 능력이 오래 유지되는 기능적 녹색지속성이 작물수량의 증가에 기여한다는 연구결과들도 발표되었다(Gregersen et al. 2013, Plant Mol. Biol. 82:603-622). 그러므로 기능적 녹색지속성에 관한 연구는 작물의 수량성 향상을 도모할 수 있다.

모델 식물 잎의 노화과정에는 많은 전사인자(transcription factors; TF)들이 기여한다. 애기장대에는 이미 40여 가지의 노화관련 senTFs들이 동정되어 있다. 여러 식물 종에 걸쳐서 보편적으로 다음과 같은 NAM/ATAF1/ATAF2/CUC2(NAC) TFs가 잎의 노화에 있어서 비슷한 기능을 수행하고 있다. 그 중에서도 애기장대에 존재하는 NAC TFs 중 하나인 ANAC 유전자들에 관련된 여러 연구 결과들이 있다. ORESARA1(ORE1, ANAC092)은 노화를 개시하는 역할을 가진다. 즉 ore1 돌연변이체는 잎의 노화가 지연되며, ORE1-OX는 노화가 빨라진다. 노화 과정에서 ORE1은 핵산과 단백질의 분해 및 당의 이동과 연관되어 있는 수백 가지의 SAGs의 발현을 조절한다. ORE1은 적색광, 앱스시산(abscisic acid; ABA) 및 에틸렌 신호전달과 관련하여 연구되고 있다.

ORE1과 비슷하게, NAP(NAC - LIKE ACTIVATED BY AP3 / PI, ANAC029), ORS1(ORE1 SISTER1/ANAC059), ANAC016 및 ATAF1 / ANAC002는 잎의 노화를 진행하는 역할을 한다고 알려져 있다. 반면에 JUB1 / ANAC042 와 VNI2 / ANAC083는 잎의 노화현상을 지연시킨다고 보고되었다.

애기장대가 40여 개의 senNACs을 가지고 있는 것을 볼 때 벼와 같은 다른 작물에서도 이미 밝혀진 10종의 senNAC TFs 이외에도 더 많은 종류의 senNAC TF가 존재할 가능성이 높지만 현재까지는 연구가 힘든 실정이다. 벼에서는 약 151개의 NAC 유전자(OsNACs)들을 가지고 있지만 대부분의 OsNAC TFs의 기능은 아직 연구되어있지 않다. 최근 벼의 senNAC TF 중 하나인 OsNAP(Os03g0327800)은 OsNAP-과발현(OsNAP-OX) 식물체에서 잎의 노화가 촉진되는 것을 확인하였으며, OsNAP-RNAi 식물체에서는 잎의 노화가 지연되는 것으로 연구되었다. 이는 OsNAP의 기능이 잎의 노화를 개시하는 senTF의 하나로, 애기장대의 NAP과 비슷한 기능을 가진 것으로 판명되었다. 그 기능에 더해 OsNAP는 ABA 합성유전자들의 발현량을 조절하는 것으로 연구되었다. 이는 OsNAP이 ABA 합성 및 신호체계의 핵심임을 의미하며 애기장대의 NAP과 비슷한 기능을 가진 것으로 해석된다. 이와 같이 senNAC TFs에 대한 연구는 앞으로 벼 잎의 노화 기작을 밝히기 위해 계속적으로 필요하다.

한편, 한국등록특허 제1439761호에는 '가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규 전사조절인자 ANAC096'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0003099호에는 '식물의 생산성 증대 기능, 스트레스 내성 기능 및 노화 지연 기능을 갖는 ATPG6 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 ONAC106 유전자를 이용한 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 ONAC106 유전자를 과발현시킨 형질전환체 잎이 노화유도 조건에서 노화가 지연되며, 기능적 녹색지속성(functional stay-green) 표현형을 보이고 염 또는 삼투 스트레스에 대한 내성이 야생형에 비해 증진됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ONAC106 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 기능적 녹색지속성(stay-green) 형질을 유지하거나 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 ONAC106 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 ONAC106 단백질 코딩 유전자를 포함하는, 식물의 기능적 녹색지속성 형질 유지 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 벼 유래 ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체는 기능적 녹색지속성 형질이 나타나고, 염 또는 삼투 스트레스에 대한 내성이 증가하므로, ONAC106 단백질 코딩 유전자의 발현 조절을 통해 식물의 노화를 지연시키고 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체를 개발할 수 있으며, 이는 작물의 상품성 및 생산성 증대에 기여할 수 있다.

도 1은 자연포장에서의 ONAC106 과발현체의 노화지연 표현형을 나타낸다. (A, B) 노쇠한 잎(A) 또는 식물에서 분리된 잎 디스크(B)에서의 NAC106의 상대적 발현량은 RT-qPCR(reverse transcription-quantitative realtime PCR)을 이용하여 UBQ5 전사체 수준에 대해 상대적으로 표준화되었다. DDI(days of dark incubation): 암 조건의 배양 일수. (C) NAC106 프모로터에 삽입된 T-DNA 및 유전자 구조. (D) onac106-1D 돌연변이체에서 ONAC106 과발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과. UBQ5는 대조구로 사용되었다. (E) 파종 후 100일과 150일된 야생형(WT)과 onac106-1D 식물체의 표현형. DAS(days after sowing): 파종 후 일수. (F) 야생형과 onac106 -1D 식물체의 출수일(heading date). (G, H) 야생형과 onac106 -1D 식물체의 종자 등숙 동안(50일간)의 전체 엽록소(Chl) 함량 및 Fv/Fm 비율 변화. DAH(days after heading): 출수 후 일수. 평균 및 표준편차(SD)는 5개 이상의 생물학적 반복 실험을 통해 얻어진 값이다. 상기 실험은 최소한 2번 이상의 반복을 통해 유사한 결과를 나타냈다.
도 2는 ONAC106의 핵 내 위치 분포 결과이다. 35S 프로모터 조절하에서의 ONAC106-GFP 융합 단백질의 양파 표피세포의 핵 내에 일시적으로 발현됨을 확인하였다. 적색 화살표 머리가 핵을 가리킨다.
도 3은 onac106-1D 식물체의 농업형질 특징을 분석한 결과이다. 2014년에 자연포장하여 재배한 식물체에서 이삭 표현형(A), 이삭 길이(B), 이삭당 종자 수(C), 이삭당 가지 수(D), 종자 등숙율(E), 천립중(F), 총 분얼(tiller) 수(G) 및 종자 수확량(H)를 확인하였다. *는 야생형과 onac106 -1D 식물체간의 유의적 차이를 나타낸다(Student's t-test, *P<0.05, **P<0.01).
도 4는 35S:ONAC106 형질전환 벼 라인의 녹색지속 표현형 특성을 나타낸다. (A) 야생형과 비교한 3종의 35S:ONAC106 형질전환 벼 라인에서의 ONAC106 발현 수준 결과. 2달된 식물체에서 총 RNA를 추출하여 ONAC106의 발현 수준은 RT-qPCR 분석을 통해 확인하였다. (B) 야생형과 35S:ONAC106 식물체에서 분리된 잎 디스크의 색 변화. DDI: 암 조건의 배양 일수.
도 5는 암 처리 노화 유도 중 onac106-1D 식물체의 녹색지속 표현형 특징을 나타낸다. (A) 매일 14시간 명조건에서 자란 4주령 야생형 및 onac106-1D 식물체를 10일간 암 처리한 후(10 DDI) 관찰한 결과. (B-G) 4주령 야생형 및 onac106-1D 식물체에서 분리된 잎 디스크를 3일간 암 처리한 후에 나타난 잎 색의 변화(B), 전체 엽록소 함량(C), 광합성 단백질 함량(D), 엽록소 a/b 비율(E), 이온 누출율(F) 및 엽록체 구조(G)의 변화 결과. (D) 야생형 및 onac106-1D 식물에서 분리된 잎의 광합성 단백질 면역 블럿 분석을 위해 PSII 안테나(Lhcb1, Lhcb2 및 Lhcb6), PSI 안테나 (Lhca1, Lhca2및 Lhca3), PSI 코어(PsaA) 및 PSII 코어(D1, CP43)에 대한 항체를 사용하였다. 흑색 및 흰색 막대는 각각 야생형 및 onac106 -1D 식물체를 나타낸다. *는 야생형과 onac106 -1D 식물체간의 유의적 차이를 나타낸다(Student's t-test, *P<0.05, **P<0.01). (G) G, 그라나 틸라코이드, PG, 플라스토과립(plastoglobule). 스케일 바=1㎛. DDI: 암 조건의 배양 일수.
도 6은 암 처리 노화 유도 중 onac106-1D 식물체의 SAG의 발현 변화를 나타낸다. (A) 마이크로어레이 분석 결과. Student's t-test의 P-값이 0.05 미만에서 차등 발현 유전자(differentially expressed genes, DEGs)로 분류하였다. (B, C) 야생형과 비교하여 onac106-1D 식물체에서 과발현된 DEG(B)와 발현이 억제된 DEG(C) 수에 대한 결과. (D) 야생형에 대한 onac106-1D 식물체에서의 알려진 SAG의 상대적 발현 양상 비율(onac106-1D/WT) 결과. 상대적 발현량은 야생형 유전자의 발현량에 대해 상대적으로 표준화되었다.
도 7은 암 처리 노화 유도 중 onac106-1D 식물체의 SAG의 발현 변화를 나타낸다. 매일 14시간 명조건에서 자란 4주령 야생형 및 onac106-1D 식물체를 4일간 암 처리한 후(0, 2, 4DDI) NYC1(A), SGR(B), OsNAP(D), OsNAC5(E), OsEIN3(F) 및 OsS3H(G)의 상대적인 발현량은 RT-qPCR을 이용하여 UBQ5 전사체 수준에 대해 상대적으로 표준화되었다. *는 야생형과 onac106-1D 식물체간의 유의적 차이를 나타낸다(Student's t-test, *P<0.05, **P<0.01). (C) 야생형 및 onac106-1D 식물에서 NYC1과 SGR 단백질 발현량은 면역 블럿 분석을 통해 확인하였다.
도 8은 자연 노화 중 onac106-1D 식물체의 SAG의 발현 변화를 나타낸다. 파종 후 80일(80 DAS) 및 140일(140 DAS)된 식물체의 주간(main culm)의 두번째 잎을 수집하여 NYC1(A), SGR(B), OsNAP(C), OsNAC5(D), OsEIN3(E) 및 OsS3H (F)의 상대적인 발현량은 RT-qPCR을 이용하여 UBQ5 전사체 수준에 대해 상대적으로 표준화되었다. 흑색 및 흰색 막대는 각각 야생형 및 onac106-1D 식물체를 나타낸다. *는 야생형과 onac106-1D 식물체간의 유의적 차이를 나타낸다(Student's t-test, *P<0.05, **P<0.01).
도 9는 onac106-1D 식물체가 염 스트레스에 대한 내성이 증가됨을 확인한 결과이다. (A) 각기 다른 비생물학적 스트레스 조건에서의 ONAC106 발현. 2주령 야생형 유묘를 염(300mM NaCl), 삼투압(400mM 만니톨), 가뭄, 저온(4℃) 및 고온(40℃) 스트레스 조건에서 0, 3, 6, 12시간 처리후 RT-qPCR 분석을 하였다. (B, D) 염 스트레스 조건(300mM NaCl)하에서 두달된 야생형과 onac106-1D 식물체의 표현형(B) 및 이온 누출율의 변화(D). (C, E) 200mM NaCl을 포함한 3mM MES 완충액 내 야생형과 onac106-1D 잎 디스크의 표현형(C) 및 이온 누출율의 변화(E). (F) 염 스트레스 처리(300mM NaCl) 전(0시간)·후(6시간)의 2주령 야생형과 onac106-1D 식물체의 염 스트레스 연관 유전자의 발현 변화 결과. 상대적인 발현량은 RT-qPCR을 이용하여 UBQ5 전사체 수준에 대해 상대적으로 표준화되었다.
도 10은 35S:ONAC106 식물체가 염 스트레스에 대한 내성이 증가됨을 확인한 결과이다. 200mM NaCl를 포함한 3mM MES 완충액 내 야생형과 35S:ONAC106 잎 디스크의 표현형(A) 및 이온 누출율의 변화(B). *는 야생형과 35S:ONAC106 간의 유의적 차이를 나타낸다(Student's t-test, **P<0.01).
도 11은 onac106-1D 식물체가 삼투 스트레스에 대한 내성이 증가됨을 확인한 결과이다. 2달된 야생형과 onac106-1D 식물체를 500mM 만니톨로 0, 1, 3, 5일 처리하였다.
도 12는 ONAC106의 SGR, NYC1, OsNAC5 및 LPA1의 프로모터에 결합한 결과이다. ONAC106의 SGR(pSGR -a 및 pSGR -b), NYC1(pNYC1 -a 및 pNYC1 -b), OsNAC5(pOsNAC5-a 및 pOsNAC5 -b) 및 LPA1(pLPA1 -a 및 pLPA1 -b) 프로모터 절편에 대한 결합 활성을 효모 단일 혼성화 분석을 통하여 확인하였다. 빈 베이트 및 프레이 플라스미드(-)가 음성 대조구로 사용되었다. 평균 및 표준편차(SD)는 5개 이상의 독립된 콜로니로부터 얻어진 값이다(Student's t-test, *P<0.05, **P<0.01, NS, not significant). 상기 실험은 최소한 2번 이상의 반복을 통해 유사한 결과를 나타냈다.
도 13은 SGR, NYC1, OsNAC5 , OsNAP, OsEIN3, OsS3H 및 LPA1의 프로모터 내 NAC 결합 모티프의 코어 서열의 위치 분석 결과이다. 적색 라인은 NAC 결합 모티프의 코어 서열(CACG)을 나타내며, 청색 라인은 효모 단일 혼성화 분석을 위해 표 1의 프라이머로 증폭된 프로모터 절편을 나타낸다.
도 14는 ONAC106가 OsEIN3, OsNAP 및 OsS3H의 프로모터에 결합하지 않음을 나타낸다. ONAC106의 OsEIN3(pOsEIN3-a 및 pOsEIN3-b), OsNAP(pOsNAP-a 및 pOsNAP-b) 및 OsS3H(pOsS3H-a 및 pOsS3H-b) 프로모터 절편에 대한 결합 활성을 효모 단일 혼성화 분석을 통하여 확인하였다. 빈 베이트 및 프레이 플라스미드(-)가 음성 대조구로 사용되었다. 평균 및 표준편차(SD)는 5개 이상의 독립된 콜로니로부터 얻어진 값이다(Student's t-test, NS, not significant). 상기 실험은 최소한 2번 이상의 반복을 통해 유사한 결과를 나타냈다.
도 15는 ONAC106-의존적 조절 네트워크에 대한 모델이다. ONAC106이 SGR/NYC1, OsNAC5 및 LPA1을 직접적으로 조절함으로써 잎 노화 및 염 스트레스 반응을 억제한다. 적색 라인은 본 발명에서 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ONAC106 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 기능적 녹색지속성(stay-green) 형질을 유지하거나 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 ONAC106 단백질의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 녹색지속성 형질을 유지하거나 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 ONAC106 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 ONAC106 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV), 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO(Chinese hamster ovary) 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 염 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 기능적 녹색지속성 형질은 종자 등숙 기간 동안 녹색 및 광합성 능력을 동시에 유지하여 수확량이 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 ONAC106 유전자를 과발현하는 단계; 및

상기 ONAC106 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 ONAC106 단백질의 범위 및 비생물학적 스트레스는 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비생물학적 스트레스 내성이 증가된 기능적 녹색지속성 변이 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 ONAC106 단백질 코딩 유전자를 포함하는, 식물의 기능적 녹색지속성 형질 유지 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 ONAC106 단백질 코딩 유전자를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에서 과발현시켜 식물체의 기능적 녹색지속성 형질을 유지하거나 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것이다. 비생물학적 스트레스는 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 대상 식물체 및 성장 조건

실험에 사용된 식물체는 자포니카 품종 중 동진벼가 야생형 대조구로 사용되었다. 동진 및 onac106 -1D은 14시간의 장일 조건에서 키워졌으며, 장소는 챔버와 자연포장에서 각각 재배되었다. 자연포장은 위도 37도의 대한민국 수원에 위치하였다. onac106-1D의 종자는 경희대학교 안진흥 교수 실험실에서 제공받았다.

2. 전체 엽록소 함량 분석

전체 엽록소 함량을 분석하기 위해, 80% 아세톤을 사용하여 각각의 잎에서 광합성 색소들을 추출하였다. 엽록소의 농도는 이전의 보고에 사용된 방법을 이용하여 UV/VIS 분광광도계로 측정하였다(Lichtenthaler, Methods Enzymol. 148: 350-382, 1987).

3. SDS - PAGE 및 면역 블럿 분석

각각의 식물체의 잎 10mg을 액체질소로 파쇄하여 100㎕의 추출버퍼(50mM Tris-HCl(pH 6.8), 2 mM EDTA, 10%(w/v) 글리세롤, 2%(w/v) SDS 및 6%(v/v) 2-머캅토에탄올)에 균질화하였다. 균질화된 샘플은 90℃에서 5분간 가열한 후, 원심분리하여 상등액을 얻었다. 10㎕의 상등액은 12.5%(w/v) SDS-PAGE로 단백질을 분리하였고, 분리된 단백질은 CBB(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다. 면역 블럿 분석을 위해 4㎕의 상등액에서 12.5%(w/v) SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리하였고, 단백질 이동장치를 통해 전체 단백질을 Hybond-P 나일론막(GE Healthcare, 미국)으로 전이시켰다. 이후 다양한 항체로 각각의 단백질들의 함량을 측정하여 비교하였다. 면역 블럿 분석을 위해 사용한 항체는 LHCI 소단위체(Lhca1, Lhca2), LHCII 소단위체(Lhcb1, Lhcb2, Lhcb4), CP43, D1, PsaA 및 PAO(Agrisera, 스웨덴)이다. 이들 항체 항원간 결합은 향상된 화학발광검출 시스템인 ECL Plus(GE Healthcare, 미국)를 사용하여 확인하였다.

4. 투과전자현미경 분석

투과전자현미경 분석은 이전 논문을 참조하여 수행하였다(Inada 등, Planta 206: 585-597, 1998). 각각의 잎 조직의 절편들은 수정된 카르노브스키(Karnovsky)의 고정액(2% 파라포름알데하이드, 2% 글루타르알데하이드, 50mM 소듐 카코딜레이트 버퍼(pH 7.2))로 고정한 후 4℃에서 10분간 세 번 세척했다. 이후 1% 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)가 첨가된 pH 7.2의 50mM 소듐 카코딜레이트 버퍼로 4℃에서 2시간 동안 고정하였고, 상온에서 증류수를 이용하여 두 번 세척했다. 각각의 고정된 샘플은 전체적으로 0.5% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 용액으로 4℃에서 최소 30분간 염색하였고, 다양한 농도의 에탄올과 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)로 수분을 제거한 뒤, 스퍼(Spurr) 레진에 삽입하였다. 이후 70℃에서 24시간 동안 중합한 뒤, 초박절편기(Ultramicrotome; MT-X)의 다이아몬드 칼을 이용해 초박형 절편을 준비하였고, 포름바가 코팅된 구리 그리드(Formvar-coated copper grid)에 탑재하였다. 각각의 탑재된 부분들은 2% 우라닐 아세테이트 로 5분, 레이놀드스 레드 시트레이트(Reynolds' lead citrate)로 2분간 상온에서 염색하였으며, JEM-1010 EX 전자 현미경(JEOL, 일본)으로 관찰하였다.

5. RT - qPCR ( reverse transcription - quantitative realtime PCR ) 분석

RT(reverse transcription) 분석을 위해, 각각의 4주된 식물체 잎에서 MG Total RNA Extraction Kit(Macrogen, 한국)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 추출한 2㎍의 RNA 각각은 M-MLV 역전사효소와 oligo(dT)₁₅ 프라이머(Promega, 미국)를 사용하여 최종적으로 25㎕의 첫번째 가닥(first-strand) cDNA를 제작하였고, 이를 1/4로 희석하여 사용하였다. qPCT(quantitative real-time PCR) 분석을 위하여 1㎕의 cDNA(RT 혼합물), 10㎕의 2X Go Tag PCR mix 및 0.25㎕의 프라이머를 함유하는 20㎕의 qPCR 혼합물로부터 Light Cycler 480(Roche Diagnostics, 스위스)을 사용하여 qPCR를 수행하였다.

6. 벡터 및 35S:ONAC106 형질전환 식물체 제작

ONAC106 cDNA는 M-MLV 역전사효소(Promega, 미국) 및 PrimeSTAR 폴리머라아제(TaKaRa, 일본)를 이용하여 RT-PCR로 합성하였다. 합성한 cDNA는 pCR8/GW/TOPO 게이트웨이 벡터(Invitrogen, 미국)에 삽입하여 서열 정보를 확인한 후, pMDC32 (Curtis and Grossniklaus, Plant Physiol. 133: 462-469, 2003) 및 GFP 신호를 확인할 수 있는 pMDC43에 클로닝하였다. 클로닝된 재조합 플라스미드는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 LBA4404에 형질전환하였다. onac106 -1D와 동진의 캘러스에 형질전환된 아그로박테리움을 이동시켜 형질전환 식물체를 만들었다. 형질전환된 결과는 PCR을 통해서 확인하였다.

7. 이온 누출율( Ion leakage rate ) 분석

막 이온 누출은 식물체에서 분리한 잎 디스크(1㎝²)의 전해질(또는 이온) 측정을 통해 분석하였다. 각각의 스트레스 처리된 10개의 잎들은 상온에서 6㎖의 0.4M 만니톨 용액에 넣은 후 3시간 동안 약하게 교반하면서 반응시켰고, 반응시킨 각각의 용액은 전도율 측정기(CON6 METER, LaMOTTE, 미국)를 이용해 전도율을 측정하였다. 전체 전도율은 각각의 샘플을 85℃에서 20분간 처리한 후 측정하였다. 이온 누출율은 각 샘플에서 전체 전도율과 처리 후 전도율을 백분율로 표시하여 서로 비교하여 분석하였다.

8. Fv / Fm 비율 분석

Fv/Fm 비율 측정은 OS-30p+ instrument(Opti-Sciences, 미국) 기계를 이용하였다. 식물체 각 분얼의 플래그 잎의 중앙 부분을 5분간 암처리한 후 값을 측정하였다. 측정은 포장에서 실시하였고 식물체마다 반복적으로 3번 이상의 값을 도출하였다.

9. 염 스트레스 처리

염 스트레스에 대한 분석은 NaCl에 의한 반응을 분석하여 수행하였다(Wu 등, 2012, Plant Cell. 24:482-506). 고염도 스트레스 처리는 4~8주 동안 자란 식물체에서 분리한 잎을 잎의 윗면이 위쪽을 향하게 하여 300mM NaCl를 포함한 3mM MES 완충액(pH 5.8)에 넣어서 수행하였다. 고염도 스트레스에 대한 반응은 22℃ 및 지속적인 광(90μmol m^-2s^-1) 조건 하에서 분석하였다.

10. 효모 단일 혼성화 ( Yeast One - Hybrid ) 분석

ONAC106은 pGAD424 벡터(Clontech, 미국)에 클로닝하였다. 또한 7개의 senNAC 유전자(SGR , NYC1 , OsNAC5 , OsNAP , OsEIN3 , OsS3H 및 LPA1)의 프로모터 부분을 pLacZi 벡터(Clontech, 미국)에 클로닝하였다. 클로닝한 프로모터 부위는 750bp의 DNA 부위를 선택하였다. 각각의 벡터들은 효모 균주 YM4271에 형질전환하였으며, 형질전환이 확인된 효모는 β-갈락토시다아제의 활성도를 측정하여 ONAC106 전사인자가 각각의 유전자의 프로모터 부위에 반응하는지 여부를 확인하였다. β-갈락토시다아제의 활성도 측정은 CPRG(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside; Roche Applied Science) 방법을 사용하였고, 측정 방법은 Yeast Protocol Handbook(Clontech, 미국)을 참조하였다.

11. 분석에 사용된 유전자 정보( NCBI 에서 확인)

LAZY1, Os11g0490600; LPA1, Os03g0237250; MAX3, Os04g0550600; MAX4, Os01g0746400; NOL, Os03g0654600; NYC1, Os01g0227100; NYC3, Os06g0354700; OsNAC5, Os11g0184900; OsNAC6, Os01g0884300; OsNAC10, Os11g0126900; OsNAC45, Os11g0127600; ONAC106, Os08g0433500; OsbZIP23, Os02g0766700; OsDREB2A, Os01g0165000; OsEEL, Os07g0686100; OsEIN3, Os03g0324200; OsLEA3, Os05g0542500; OsMYB2, Os03g0315400; OsNAP, Os03g0327800; OsPAO, Os03g0146400; OsS3H, Os04g0581100; UBQ5, Os01g0328400; OsRCCR, Os10g0389200; PROG1, Os07g0153600; SERF1, Os05g0420300; SGR, Os09g0532000; SNAC1, Os03g0815100; TAC1, Os09g0529300; TRAB1, Os06g0211200; ZFP179; Os01g0839100; ZFP252; Os12g0583700.

실시예 1. 잎의 노화를 지연시키는 NAC 전사인자 ONAC106 동정

잎의 노화가 진행되는 동안 잎 내 유전자들의 발현량의 변화 분석을 통해 노화시 특이적으로 발현량이 증가하는 senescence-associated NAC(senNAC) 전사인자들이 분리되었다. 그 예로 애기장대의 senNAC 유전자들(ANAC029/AtNAP, ANAC092/ORE1, ANAC042/JUB1, ANAC016)의 발현량이 인위적으로 유도된 노화나 자연적 노화시기에 급격하게 증가하는 것으로 잘 알려져 있다. 자연적으로 노화가 진행 중인 벼 잎에서 ONAC106 유전자 발현이 노화가 시작되지 않은 초록색 부위와 노화가 완료된 황색 잎 부위보다는 노화가 한창 진행 중인 연녹색 부위에서 가장 높은 것을 발견하였고(도 1A) 암처리로 노화유도 조건을 주었을 경우 또한 높게 발현하였다(도 1B). 상기 현상은 ONAC106 유전자가 잎의 노화와 관련된 senNAC 유전자 그룹에 속한다는 것을 보여주었다. 또한 다른 NAC TFs의 세포 내 발현 부위과 비슷하게 ONAC106 또한 양파의 표피세포의 핵에서 발현됨을 확인하였다(도 2).

ONAC106 유전자가 식물체에 미치는 생리적인 기능을 연구하기 위해 RiceGE database(http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)에서 활성화 태깅(activation tagging)에 의해 ONAC106 유전자가 과발현되는 형질전환체(PFG_3A.05034)를 찾아 본 발명에 사용하였다. 상기 식물체는 35S 프로모터 4개를 포함하는 T-DNA가 ONAC106의 프로모터 지역에 삽입되어 있는 식물체였다(도 1C). 형질전환체 잎에서의 ONAC106 mRNA 발현량을 측정해 본 결과, 야생형인 동진벼의 ONAC106 발현량보다 과발현(over-expression)됨을 확인했다(도 1D). 이 사실을 기반으로 상기 T-DNA 삽입 형질전환체가 ONAC106 과발현체라고 결론지었고 onac106 -1D으로 명명하고 이 후 사용하였다.

이어서 자연적인 잎의 노화 조건(평균 14-시간 명조건/일, 수원, 위도 37°N)에서 onac106 -1D의 노화속도에 야생형과 차이가 있는지 관찰하였다. 식물의 생장 단계 내내 onac106 -1D와 야생형의 생장속도 및 개화시기는 비슷하였지만(도 1E 왼쪽패널, 도 1F), 종자성숙기에서는 onac106 -1D의 잎의 노화속도가 야생형보다 느린 것을 확인하였다(도 1E의 오른쪽). 잎의 노화속도가 늦어지는 표현형에 맞아 떨어지게, onac106 -1D 식물체에 전체 엽록소의 감소속도는 야생형의 감소속도보다 느린 것으로 나타났다(도 1G). 두 식물체 간의 광합성 효율의 차이를 알아보기 위해 개화 후에 Fv/Fm 비율(광합성시스템 II의 효율(efficiency of photosystem II))을 측정하였다. 야생형의 Fv/Fm 값은 개화 후 40일 후에 갑자기 감소되는 모습을 보였지만, onac106 -1D의 경우 개화 후 50일 이후에도 높은 값이 유지되는 것을 확인하였다(도 1H). 상기 결과로부터 ONAC106의 기능이 강력하게 잎의 노화 억제에 연관되어 있으며, Fv/Fm 값에 근거하여 onac106 -1D가 기능적 녹색지속성(functional stay-green) 식물체임을 확인하였다.

선행연구 결과에 따르면, 기능적 녹색지속성 식물체들은 종자성숙기에 광합성 능력이 활발하여 광합성능력이 떨어지는 보통 식물체보다 수확량 증가에 기여하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 onac106 -1D의 생산량을 알아보기 위해 파종 후 180일된 식물체에서 여러 가지 농업형질을 조사했다. onac106 -1D는 야생형에 비해서 이삭의 길이가 길었으며(도 3A 및 3B), 그에 비례해서 야생형보다 이삭당 종자의 수 및 가지의 수가 더 많은 것을 확인했다(도 3C 및 3D). 그러나 천립중과 종자의 등숙율은 야생형에 비해서 약간 적음을 확인했다(도 3E 및 3F). 분얼수는 야생형과 거의 동일했으며, 전체 식물체에서 수확한 종자의 무게는 야생형보다 더 많은 것을 확인하였다(도 3G 및 3H). 이 사실은 ONAC106의 과발현에 의해 생겨난 기능적 녹색지속성 형질이 벼의 잎의 노화방지와 수확량의 증가에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 확인시켜 주었다.

ONAC106의 과발현이 잎의 노화방지에 영향을 주는지 다시 확인하기 위해, ONAC106 cDNA를 정상식물체에서 RT-PCR 방법으로 클로닝하여 35S:ONAC106 벡터를 동진벼에 형질전환시켜 ONAC106 과발현체를 만들었다. RT-PCR 방법을 통하여 35S:ONAC106 형질전환체에서 ONAC106가 과발현됨을 확인하였고(도 4A), 그 식물체들에서 강한 녹색지속성 표현형이 나타나는 것을 반복 확인하였다(도 4B). 이 결과로 ONAC106의 과발현이 잎의 노화를 억제한다는 것이 재확인되었다.

실시예 2. ONAC106 과발현에 의한 암처리 조건에서 잎의 노화 지연 확인

ONAC106 전사인자의 노화방지 메커니즘을 자세히 알기 위해 onac106 -1D 식물체를 암처리하는 인위적인 노화유도 실험이 필요했다. 실험을 위해 3주 동안 키운 식물체가 암처리 실험에 사용되었다. 암처리 10일 후(10 DDI), 야생형의 잎은 노랗게 되었지만, onac106 -1D의 잎들은 여전히 진한 녹색상태를 유지하고 있는 것을 확인했다(도 5A).

onac106 -1D의 녹색지속성은 잎 조각들의 암처리 실험에서도 확인되었다. MES 완충액(pH 5.8)에 onac106 -1D과 야생형의 1cm×1cm 로 자른 잎 디스크를 띄어놓은 후 암처리를 실시하였다. 4 DDI 후 잎의 노화 상태를 확인해 본 결과, 야생형의 잎은 노화되었지만(도 5A), onac106-1D의 잎은 여전히 녹색을 유지하고 있음을 확인되었다(도 5B).

녹색지속성 특성에 맞게, 전체 엽록소의 양도 onac106-1D 식물체의 양이 야생형보다 많은 것이 확인되었다(도 5C). 다음으로 광합성시스템 관련 단백질의 수준을 측정할 수 있는 면역 블럿 검사를 통해 암처리시킨 잎을 샘플로 사용하여 실시했다. 야생형으로는 기능적 녹색지속성 형질을 지닌 oscoi1b -1 돌연변이체와 비기능적 녹색지속성 형질을 지닌 nyc1 -1 돌연변이체(Lee et al. 2014; Kusaba et al. 2007)가 사용되었다. 실험결과, 광합성시스템-II 안테나 단백질들(Lhcb1, Lhcb2 및 Lhcb6)과 코어 단백질(D1 및 CP43)과 광합성시스템-I 안테나 단백질들(Lhca1, Lhca2, and Lhca3)과 코어 단백질(PsaA)을 포함한 광합성시스템 단백질들은 onac106-1D에서, 야생형보다 많은 양이 있음을 확인했으며, 비슷한 양상을 기능적 녹색지속성 형질을 지닌 oscoi1b -1 돌연변이체에서 확인했다(도 5D). 그 중, 특히 3개의 Lhcb 단백질들은 onac106 -1D 식물체에서 보존이 잘 되어 있었고(도 5D), 이것이 onac106-1D에서 Chl a/b 값을 감소시킨 이유가 된다(도 5E).

세포막 파괴의 정도를 나타내는 이온 누출 측정 실험에서도, 암처리 조건하에서 onac106 -1D의 이온누출 수치는 야생형보다 훨씬 낮은 수준을 보여줬다(도 5F). 엽록체의 구조에서도 onac106 -1D와 야생형은 차이를 보이고 있었다. 암처리 전(0 DDI)에는 두 식물체 모두 정상적이고 풍만한 그라나 틸라코이드(grana thylakoid)를 가지고 있었지만, 암처리 4일 후(4 DDI)에는 대부분의 그라나 틸라코이드가 onac106 -1D 잎에서는 정상적으로 유지된 데 반해 야생형에서는 거의 분해되어 있는 것을 확인하였다(도 5G). 전체적으로 상기 실험결과들을 연결시켜 보았을 때, ONAC106의 과발현은 암처리 조건에서 광합성시스템 복합체의 밸런스 및 세포막의 기능을 온전히 유지시켜서, 잎의 노화를 지연시키는 것으로 확인하였다.

실시예 3. 암처리 조건에서 ONAC106 과발현에 의한 노화관련 유전자( SAG )들의 발현에 미치는 영향 확인

ONAC106이 잎의 노화조절 네트워크에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 유전자군 전체에 대한 마이크로어레이(microarray)를 실시한 결과, 야생형과는 다른 발현양상을 보이는 유전자군을 분리하였다. 한 달 정도 자란 식물에서 야생형과 onac106-1D의 잎을 암조건에서 3일(3 DDI) 처리한 잎이 마이크로어레이의 재료가 되었다(도 6A). 이 마이크로어레이 실험결과로, 총 0 DDI 샘플에서 385개의 과발현된 유전자들과 358개의 발현이 억제된 유전자들, 3 DDI 샘플에서 209개의 과발현된 유전자와 267개의 발현이 억제된 유전자들을 찾았다(도 6B 및 6C).

그 결과 중에서 노화와 관련된 유전자들을 선별한 결과, 엽록소의 분해와 관련된 유전자인 SGR과 NYC1의 발현이 강하게 억제된 것을 밝혀냈다(도 6D). 또한 OsNAP , OsORE1 , SNAC1 , OsNAC5 및 OsNAC6와 같은 잠정적인 senNAC TFs 유전자들의 발현량이 변화된 것을 알 수 있었다. OsNAP는 발현이 억제된 반면 OsNAC5과 같은 유전자는 발현이 증가되었다(도 6D). 전반적으로 발현량이 저하된 유전자들 중에는 SAGs , SAG12, 에틸렌 반응 유전자인 ETHYLENE INSENSITIVE3 ( EIN3 / OsEIL ), ABA 합성과 반응에 관여된 유전자인 ABSCISIC ALDEHYDE OXIDASE ( AAO3 ), ENHANCED EM LEVEL ( EEL ), 그리고 살리실산(SA) 합성유전자인 SALICYLIC ACID 3 HYDROXYLASE (S3H)가 있었다. 반면에 발현량이 증가한 유전자는 잎의 노화 억제자 역할을 하는 DELAY OF THE ONSET OF SENESCENCE ( OsDOS )가 있었다.

onac106 -1D 식물체에서의 유전자의 상대적 발현 수준도 마이크로어레이 결과와 비슷한 양상을 보였다. onac106 -1D를 암조건 처리한 후 2일 동안 SGR과 NYC1의 발현량이 강하게 줄어들었다(2 DDI 및 4 DDI; 도 7A 및 7B). 또한 면역 블럿 검사 결과 SGR과 NYC1 단백질의 양이 야생형보다 onac106 -1D의 잎에서 훨씬 적게 나오는 것을 확인하였다(도 7C). 또한, 마이크로어레이 결과와 마찬가지로, 암처리한 onac106 -1D에선 OsNAP , OsEIN3 및 OsS3H의 발현량은 줄어들었고, OsNAC5의 발현량은 증가한 것을 확인하였다(도 7D-7G). 그리고 이러한 유전자들의 발현 양상이 자연조건에서 노화되는 잎에서도 비슷하게 나타나는 것을 확인하였다(도 8). 상기 결과를 통해서, ONAC106에 의한 잎의 노화경로에 관련된 주요 유전자들을 찾아낼 수 있었다.

실시예 4. ONAC106 과발현 벼 식물체의 염 스트레스 반응 신호전달을 억제한 내염성 증대 확인

ONAC106의 발현 양상이 비생물학적 스트레스 환경에서 어떤 변화를 보이는지 실험하였다. 스트레스 환경 조성으로 높은 염도(300mM NaCl), 삼투(400mM 만니톨), 가뭄, 저온(4℃) 및 고온(40℃) 스트레스 조건을 2주간 자란 야생형에 처리하고 관찰했다. 각각의 스트레스 조건에서 자란 야생형의 샘플링은 두 번째 잎을 이용하였고, 샘플링 시기는 스트레스 처리 후 3일, 6일 및 12일로 했다. 샘플 분석을 통해 RT-qPCR 수행 결과, 높은 염도와 삼투 조건하에서 ONAC106 mRNA의 발현량이 의미 있게 증가한 것이 확인됐다. 다른 스트레스 조건하에서는 발현량에 큰 변화가 관찰되지 않았다(도 9A). 이 결과는 ONAC106의 기능이 염 스트레스와 삼투 스트레스 반응체계와 연관되어 있음을 보여줬다. 좀 더 구체적인 사실 확인을 위해 onac106 -1D이 염 스트레스 조건하에서 어떤 반응을 보이는지 알아보는 실험을 수행했다. 두 달 자란 식물체를 300mM NaCl 용액에 5일 동안 처리하였을 때 야생형은 3일 만에 시들기 시작하여, 5일째에 완전히 시들어 버렸다(도 9B). 대조적으로 onac106 -1D 식물체는 처리 후 5일째에도 생기를 잃지 않고 잎의 녹색을 유지하였다(도 9B). 이러한 고염도 스트레스에 대한 저항성은 35S: ONAC106 형질전환 식물체들에서도 똑같이 관찰되었다(도 10).

onac106 -1D의 잎 디스크 또한 200mM NaCl 조건에서 녹색지속성 형질을 보여주었다(도 9C). 상기 두 실험에서 ONAC106의 기능은 고염도 스트레스에 대한 저항성을 보여주는 기능을 가진다는 것을 알 수 있다. 게다가 세포막의 이온 검출 측정 결과, 전체 식물체와 조각난 잎(도 9D 및 9E) 모두에서 onac106 -1D가 야생형에 비해 적은 수치를 보여주었다. 다음 실험인 삼투 스트레스 조건하에서, onac106 -1D가 야생형에 비해 전체 식물체와 조각난 잎에서 모두 삼투 스트레스 저항성을 보였고, 일관적으로 야생형보다 적은 수치의 세포막 이온 누출 수치가 적은 것을 확인하였다(도 11). 염 스트레스(salt stress)의 반응체계 안에서 ONAC106이 어떻게 관여하고 있는지를 알아보기 위해 염 스트레스와 관련된 유전자들의 발현량 차이를 높은 염도 조건하에서 자란 onac106 -1D의 샘플에서 확인해 보았다(도 9F).

SALT - RESPONSIVE ERF1 ( SERF1 ), DEHYDRATION - RESPONSIVE ELEMENT BINDING 2A (OsDREB2A), TRAB1 , OsbZIP23 , ZINC FINGER PROTEIN179 ( ZFP179 ), ZFP252 , LATE -EMBRYOGENESIS ABUNDANT3 ( OsLEA3 ), OsMYB2 및 5종의 염 스트레스 관련 NAC TFs(OsNAC5, OsNAC6 , OsNAC10 , OsNAC45 및 SNAC1) 유전자의 발현량을 야생형과 onac106-1D의 샘플링된 잎(0 and 6 HT)에서 비교하였다. 상기 유전자들은 모두 고염도 스트레스 반응체계에 대해 음성조절자 역할을 한다고 알려져 있다. 그 중에서 OsDREB2A , OsbZIP23 , OsLEA3 , OsNAC5 및 OsNAC45 유전자의 발현량이 onac106 -1D(6 HT) 샘플에서 유의적으로 증가하였다. 종합하면, 상기 결과들이 ONAC106이 잎의 노화뿐만 아니라 염 스트레스 내성에도 관여되어 있다는 것을 보여준다.

실시예 5. ONAC106 senTF에 의한 직접적인 SGR , NYC1 , OsNAC5 및 LPA1 의 발현 조절 확인

본 발명에서 ONAC106 전사인자에 의해 조절되어지는 타겟 유전자들을 동정하였다. 잎의 노화경로 안에서, SGR , NYC1 및 OsS3H의 발현량이 낮아진 반면에 OsNAC5의 발현량은 onac106-1D의 노화 전(0 DDI), 노화 후(3 DDI) 샘플 모두에서 높게 발현되었다(도 5). OsEIN3와 OsNAP는 오직 3 DDI에서만 현저히 낮게 발현되었다(도 5). OsNAC5은 고염도 스트레스 조건하의 onac106 -1D 식물체에서 높게 발현되었다. 이는 아마도 OsNAC5 TF의 직접적인 타겟 유전자 중 하나인 OsLEA3의 발현이 높아졌기 때문으로 사료된다(도 9F). ONAC106과 7개의 타겟 후보유전자(SGR , NYC1 , OsS3H , OsNAC5 , OsEIN3 및 OsNAP)의 결합능력을 실험하기 위해서 효모 단일 하이브리드 분석을 실행하였다(도 12). 현재까지 ONAC106이 결합하는 특정한 모티프는 정확히 밝혀지지 않았다. 그러나 대부분의 NAC TFs는 CACG 서열에 결합한다고 밝혀져 있다. 그리고 7종의 후보유전자들은 하나 이상의 CACG 서열을 가지고 있다(도 13). 이에 본 발명자는 ONAC106 단백질이 SGR , NYC1 , OsNAC5 및 LPA1의 프로모터에 결합한다는 것(도 12)과 OsS3H , OsEIN3 및 OsNAP의 프로모터에는 결합하지 않는 것을 밝혀냈다(도 14). 이것으로 SGR , NYC1 , OsNAC5 및 LPA1 발현은 ONAC106 전사인자에 의해 조절됨을 확인하였다(도 15).

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Method for producing functional stay-green transgenic plant with improved tolerance to abiotic stress using ONAC106 gene and the plant thereof <130> PN15258 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1005 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggaagagg agcagcggtt gccggcgggg ttccggttct tccccaccga cgaggagctc 60 gtcacctact acctcgccag gaaggccatg gacgccacct tcacctccgc cgccatccgc 120 gacgtcgacc tctacacctc cgatccatgg cacctcccat gcgactcgtc ggcggcgagc 180 accggaggcg gcggcggcgg cgagtgctac ttcttctgca gacggagcag caagtacccg 240 tccggcgcgc gcgtccgccg cgcgacggcc ggcggctact ggaagtcgac ggggaaggac 300 aagggcgtgt acgctgccgg cggcggcggc gggctcgtgg ggacgaagaa gacgctggtg 360 ttctacgaag ggagggcgcc gcgaggggag aagacgagct gggtgatgca cgagtactct 420 agagcaccga gcaccaactt catcagagga gctcaggcac gtacacataa tcttctcgat 480 attatctaca gcgagtgggt gatctgcagg gtgttcaaga agcagcctcc aattgaacac 540 tggctggaaa tggaggaggt ggagacgacg acgacgacga cgacagtgca ggagcacacg 600 ccaaaccggc gccgtctccc tccggcggag gctgcggcgg cgccgccgcc gccgtccggt 660 cagccgtggc aacacacgag tcgccggtcc ggcgatggcc gtgctgccat cgatggtggc 720 aaccgtgagg aggaggagga tgaacatggc ctggctcgag aggagtcgtc gtctccggtg 780 gtcatcagct caccatcacg ctgcacctcc tcaccgtcgt ctcggcttct caaccatgag 840 caccttggtg cttcgtcgtc agatgacctg ccggagttga tggagttcgg cgacatctac 900 ggcgggatcg ccgccggtgg cccgacggac cagcaggcct catcatcaaa ctcaaattcc 960 atttgcaact ttctcgacga gccatactac tgctggaact tctga 1005 <210> 2 <211> 334 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Glu Glu Gln Arg Leu Pro Ala Gly Phe Arg Phe Phe Pro Thr 1 5 10 15 Asp Glu Glu Leu Val Thr Tyr Tyr Leu Ala Arg Lys Ala Met Asp Ala 20 25 30 Thr Phe Thr Ser Ala Ala Ile Arg Asp Val Asp Leu Tyr Thr Ser Asp 35 40 45 Pro Trp His Leu Pro Cys Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Glu Cys Tyr Phe Phe Cys Arg Arg Ser Ser Lys Tyr Pro 65 70 75 80 Ser Gly Ala Arg Val Arg Arg Ala Thr Ala Gly Gly Tyr Trp Lys Ser 85 90 95 Thr Gly Lys Asp Lys Gly Val Tyr Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Leu 100 105 110 Val Gly Thr Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Glu Gly Arg Ala Pro Arg 115 120 125 Gly Glu Lys Thr Ser Trp Val Met His Glu Tyr Ser Arg Ala Pro Ser 130 135 140 Thr Asn Phe Ile Arg Gly Ala Gln Ala Arg Thr His Asn Leu Leu Asp 145 150 155 160 Ile Ile Tyr Ser Glu Trp Val Ile Cys Arg Val Phe Lys Lys Gln Pro 165 170 175 Pro Ile Glu His Trp Leu Glu Met Glu Glu Val Glu Thr Thr Thr Thr 180 185 190 Thr Thr Thr Val Gln Glu His Thr Pro Asn Arg Arg Arg Leu Pro Pro 195 200 205 Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Pro Pro Pro Ser Gly Gln Pro Trp Gln 210 215 220 His Thr Ser Arg Arg Ser Gly Asp Gly Arg Ala Ala Ile Asp Gly Gly 225 230 235 240 Asn Arg Glu Glu Glu Glu Asp Glu His Gly Leu Ala Arg Glu Glu Ser 245 250 255 Ser Ser Pro Val Val Ile Ser Ser Pro Ser Arg Cys Thr Ser Ser Pro 260 265 270 Ser Ser Arg Leu Leu Asn His Glu His Leu Gly Ala Ser Ser Ser Asp 275 280 285 Asp Leu Pro Glu Leu Met Glu Phe Gly Asp Ile Tyr Gly Gly Ile Ala 290 295 300 Ala Gly Gly Pro Thr Asp Gln Gln Ala Ser Ser Ser Asn Ser Asn Ser 305 310 315 320 Ile Cys Asn Phe Leu Asp Glu Pro Tyr Tyr Cys Trp Asn Phe 325 330

Claims (9)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ONAC106 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 종자 등숙 기간 동안 녹색 및 광합성 능력을 동시에 유지하여 수확량이 증가하는 기능적 녹색지속성(functional stay-green) 형질을 유지하거나 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 염 또는 삼투 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 삭제
5. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 ONAC106 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 ONAC106 유전자를 과발현하는 단계; 및
   상기 ONAC106 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비생물학적 스트레스 내성이 증가되고, 종자 등숙 기간 동안 녹색 및 광합성 능력을 동시에 유지하여 수확량이 증가하는 기능적 녹색지속성 변이 식물체의 제조 방법.
6. 삭제
7. 제5항의 방법에 의해 제조된 비생물학적 스트레스 내성이 증가되고, 종자 등숙 기간 동안 녹색 및 광합성 능력을 동시에 유지하여 수확량이 증가하는 기능적 녹색지속성 변이 식물체.
8. 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 ONAC106 단백질 코딩 유전자를 포함하는, 식물의 종자 등숙 기간 동안 녹색 및 광합성 능력을 동시에 유지하여 수확량이 증가하는 기능적 녹색지속성 형질 유지 또는 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물.

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