KR101926962B1 - 애기장대 RING finger E3 ligase PIR을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 유래 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 유전자에 관한 것으로서, 상기 유전자 및 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진 시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자 (positive regulator) 단백질을 암호화하는 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 유전자에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 식물의 건조 스트레스에 있어 PIR 1 유전자 및 PIR 2 유전자가 PP2Cs와 상호작용하고, ABA 신호전달 기전에서 양성 조절인자 (positive regulator)로서의 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 상기 PIR 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용하고, 이로 인해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

애기장대 RING finger E3 ligase PIR을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{Method for improving the resistance to drought stress using RING finger E3 ligase PIR in plants}

본 발명은 PIR (PP2CA interacting RING finger protein)유전자, 단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

앱시스산(ABA)은 여러 가지 환경요인에 반응하는 신호 분자 역할을 하며, 다양한 생리학적 및 발생과정에서 변화를 유발함으로써, 생물적 및 비 생물적 스트레스에 적응하도록 한다. 예컨대, 식물은 스트레스 상황에서 ABA 수준은 증가하여 기공 폐쇄와 같은 다양한 반응을 유도한다. 이에, ABA에 의한 기공폐쇄와 관련된 세포 및 분자 메커니즘은 널리 연구되어 왔다.

ABA 신호 전달에는 몇 가지 단백질 인산화 효소 2C (PP2C) 유전자가 필요하며, 이 유전자들 중 애기장대에서 ABI1, ABI2, HAB1, HAB2, AHG1 및 PP2CA를 포함한 A 군 PP2C의 6 내지 9 개가 음성 조절인자로 간주되며, PP2CA는 ABA-매개 유전자의 발현을 차단하고, pp2ca 돌연변이체는 종자 발아 및 발아 후 성장 동안 ABA 과민성 표현형을 나타내지만 PP2CA가 과발현된 형질 전환 식물은 ABA 비 감수성 표현형을 나타내며, 또한, PP2CA는 SnRK2.6 키나아제의 억제에 의해 보호 세포에서 음이온 채널 활성을 조절하는 것으로 추가로 보고되었다. 이러한 결과는 PP2CA가 ABA 신호 전달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

ABA 바운드 RCARs는 PP2C의 포스 파타 아제 도메인과 상호 작용하고 활성 사이트를 덮음으로써 이들 PP2C의 활성을 억제하며, PP2C의 억제는 ABF 전사 인자 및 SLAC1 음이온 채널을 포함하는 ABA 시그널링 성분의 활성화를 유도한다. 보호 세포에서 신호 전달 분석의 결과는 RCAR2가 OST1 (SnRK2.6) 키나아제에 대해 PP2CA 포스파타아제 활성과 상호 작용하고 PP2CA 포스파타아제 활성을 억제함을 보여 주었다. 이 과정은 SLAC1 음이온 채널의 인산화와 활성화를 위한 활성 OST1 키나아제를 방출하여 기공 폐쇄를 유도한다.

A 군 PP2C가 ABA-신호 경로의 음성 조절자로서 기능하는 경우, RCAR은 PP2C를 조절함으로써 양성 조절자로 작용할 것으로 기대되어 관련 연구가 진행되고 있고, 다른 조절 인자가 ABA 신호 전달에서 PP2C를 조절하는지에 대한 연구가 진행되어 왔으나 (한국등록특허 10-1513357), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은, 식물의 건조 스트레스에 있어 PIR 1 유전자 및 PIR 2 유전자가 PP2Cs와 상호작용하고, ABA 신호전달 기전에서 양성 조절인자 (positive regulator)로서의 역할을 규명하였으며, 상기 유전자를 과발현 시킬 경우, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하여, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 양성적 조절인자 (positive regulator) 단백질을 암호화하는 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 유전자로서,

상기 PIR 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 유전자인 것을 특징으로 하는, 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 단백질의 발현 또는 활성 증진제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성적 조절인자 (positive regulator) 단백질을 암호화하는 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 유전자로서,

상기 PIR 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 유전자를 제공한다.

본 발명은 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 단백질의 발현 또는 활성 증진제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 단백질 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 단백질일 수 있다.

본 발명은 (a) PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환시키는 단계, 및

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증가방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 PIR 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 유전자일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 PIR 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 단백질 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 단백질일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 PIR 단백질을 암호화하는 유전자는 식물세포 발현벡터를 통하여 식물체에 형질전환될 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 식물체는 애기장대인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자 (positive regulator) 단백질을 암호화하는 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 유전자에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 식물의 건조 스트레스에 있어 PIR 1 유전자 또는 PIR 2 유전자가 PP2Cs와 상호작용하고, ABA 신호전달 기전에서 양성 조절인자 (positive regulator)로서의 역할을 수행하는바, 이를 이용하여 식물체에서 건조에 대한 내성을 조절할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 상기 PIR 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용하고, 이로 인해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는, 글루타티온 S-트랜스퍼라제-PP2CA (GST-PP2CA)단백질을 MG 132의 존재 또는 부재하에 ABA 처리된 야생형 (WT)식물로부터 제조된 조 추출물과 함께 배양한 후, 항 GST 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과이며, 도 1b는, GST-PP2CA 융합 단백질의 수준을 image J 1.46r (http://imagei.nih.gov/ij) 소프트웨어를 사용하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는, PIR 1과 PP2CA 사이의 상호 작용을 보여주는 결과로서, 효모 이중 혼성화 분석 (Yesst two-hybrid assay, Y2H)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 2b는, 이분자 형광 상보성 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는, 애기장대 PIR 1 유전자 구조의 도식을 나타낸 것이며, 도 3b는, 야생형 (WT), pir 1-1 및 pir 1-2 식물에서 PIR 1 유전자 발현을 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이며, 도 3c는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT) 및 PIR 1 돌연변이체의 표현형을 나타낸 것이며, 도 3d는 ABA 처리 조건에서 야생형 (WT) 및 PIR 1 돌연변이체의 발아율을 나타낸 것이고, 도 3e는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT) 및 PIR 1 돌연변이체의 녹색 자엽 비율을 비교한 결과이다.
도 4a는, PIR 1 단백질의 세포 내 자가 유비퀴틴화를 확인한 결과이고, 도 4b는, PIR 1에 의한 PP2CA의 세포 내 유비퀴틴화를 확인한 결과이며, 도 4c는, PP2CA에 대한 cell-free 분석을 수행한 결과이고, 도 4d는, GST-PP2CA 융합 단백질의 수준을 image J 1.46r (http://imagei.nih.gov/ij) 소프트웨어를 사용하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pp2ca, pir 1/pp2ca 및 PIR 1-OX 변이체 식물의 표현형, 도 5b는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pp2ca, pir 1/pp2ca 및 PIR 1-OX 변이체 식물의 발아율, 도 5c는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pp2ca, pir 1/pp2ca 및 PIR 1-OX 변이체 식물의 녹색 자엽 비율, 도 5d는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pp2ca, pir 1/pp2ca 및 PIR 1-OX 변이체 식물의 모종 성장 및 도 5e는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pp2ca, pir 1/pp2ca 및 PIR 1-OX 변이체 식물의 뿌리 길이를 비교한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는, AtPIR 1 단백질의 서열 정렬 및 계통수 분석을 진행한 결과를 나타낸 것이며, 도 6c는, PIR 2와 PP2CA 사이의 상호 작용에 대한 효모 이중 혼성화 분석 (Yesst two-hybrid assay, Y2H)한 결과이고, 도 6d는, PIR 2와 PP2CA 사이의 상호 작용을 이분자 형광 상보성 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 분석한 결과이고, 도 6e 및 도 6f는, 다양한 PP2CA 도메인과 PIRs의 도메인 및 다양한 PIRs의 도메인과 PP2CA간의 상호작용을 효모 이중 혼성화 분석 (Yesst two-hybrid assay, Y2H)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 6g는, PP2CA에 대한 cell-free 분해 분석을 나타낸 결과이고, 도 6h는, GST-PP2CA 융합 단백질의 수준을 image J 1.46r (http://imagei.nih.gov/ij) 소프트웨어를 사용하여 정량한 결과를 나타낸 것이며, 도 6i는, 애기장대 PIR 2 유전자 구조를 도식화한 것이며, 도 6j는, 야생형 (WT), pir 2 및 pir 2/PIR 2 식물에서 PIR 2 유전자 발현을 RT-PCR 분설을 통해 확인한 결과이며, 도 6k는, ABA에 노출된 야생형 (WT), pir2 및 PIR2-OX 식물의 표현형을 나타낸 것이며, 도 6l는, ABA에 노출 된 야생형 (WT), pir2 및 PIR2-OX 돌연변이체의 종자 발아율을 나타낸 것이며, 도 6m는, ABA에 노출된 야생형 (WT), pir 2 및 pir2/35S:pir2 돌연변이체의 표현형을 나타낸 것이며, 도 6n는, ABA에 노출된 야생형 (WT), pir 2 및 pir2/35S:pir2 돌연변이체의 녹색 자엽 비율을 나타낸 것이고, 도 6o는, ABA에 노출된 야생형 (WT), pir2 및 PIR2-OX 돌연변이체의 녹색 자엽 비율을 나타낸 것이다.
도 7a는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pir 2, pp2ca, pir 1/pir 2, pir 1/pp2ca 및 pir 2/pp2ca 변이체 식물의 표현형, 도 7b는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pir 2, pp2ca, pir 1/pir 2, pir 1/pp2ca 및 pir 2/pp2ca 변이체 식물의 모종 성장, 도 7c는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pir 2, pp2ca, pir 1/pir 2, pir 1/pp2ca 및 pir 2/pp2ca 변이체 식물의 뿌리 길이, 도 7d는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pir 2, pp2ca, pir 1/pir 2, pir 1/pp2ca 및 pir 2/pp2ca 변이체 식물의 cell-free 분해 분석 및 도 7e는, ABA 처리 조건에서 야생형 (WT), pir 1, pir 2, pp2ca, pir 1/pir 2, pir 1/pp2ca 및 pir 2/pp2ca 변이체 식물의 GST-PP2CA 융합 단백질의 수준을 image J 1.46r () 소프트웨어를 사용하여 정량한 결과를 비교한 결과이다.

본 발명자들은, 식물의 건조 스트레스에 있어 PIR 1 유전자 및 PIR 2 유전자가 PP2Cs와 상호작용하고, ABA 신호전달 기전에서 양성 조절인자 (positive regulator)로서의 역할을 규명하여, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자 (pogitive regulator) 단백질을 암호화하는 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자인 PIR은 바람직하게는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 유전자일 수 있으며,

상기 PIR 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 바람직하게는, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 단백질 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 PIR이 과발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.

본 발명자들은 모든 A형 PP2Cs (PP2CA)와 단백질-단백질 상호 작용하는 단백질을 관찰하였고, 그 결과 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자인 PP2CA와 상호 작용하는 단백질인 PIR (PP2CA interacting RING finger protein) 단백질을 동정하였고, 상기 단백질이 ABA 건조 스트레스 반응과 관련이 있는지 그 연관성을 규명하고자 하였다 (실시예 2 참조).

본 발명의 일실시예에서는, cell-free 분해 분석을 수행하여, 상기 PP2CA의 안정성은 유비퀴틴-26S 프로테아좀 경로에 의해 조절되는 것임을 확인하였다 (실시예 2 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는, 상기 PP2CA의 분해에 영향을 미치는 상호 작용 단백질을 확인하기 위해서, Y2H 스크리닝 및 이분자 형광 상보성 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 분석을 수행하여, PIR 1 및 PIR 2 단백질을 동정하였으며 (실시예 3 참조),

또한, PIR 1 및 PIR 2 형질전환 식물의 ABA 민감도를 확인한 결과, PIR 1 형질전환 식물 및 PIR 2 형질전환 식물이 야생형 (WT)보다 ABA에 더 민감하다는 것을 확인하였으며 (실시예 4 참조), in vitro ubiquitiantion assay를 수행하여, PIR 1이 PP2CA를 기질로 하여 ABA 처리시 PP2CA를 유비퀴틴화하는 것을 확인하여, PIR 단백질, 구체적으로, PIR 1 및 PIR 2 단백질과 PP2CA가 상호 작용함을 확인하였다 (실시예 5 내지 7 참조).

따라서, PIR 단백질의 발현 또는 활성을 증진시킴으로써, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 PIR 단백질의 발현 또는 활성 증진제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 증진제는 PIR 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 증진시키는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, PIR 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 항체, 또는 압타머(aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 건조 저항성이 증진된 식물체 및/또는 이의 종자를 제공한다. 이에 더하여, 본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환시켜 PIR 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

애기장대 (Arabidopsis thaliana, 생태형 Col-0) 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 식물은 배합토 (피트모스 (peat moss) : 펄라이트 (perlite) : 질석 (vermiculite) = 9 : 1 : 1, v/v/v)에서 일상적으로 재배하였다. 이후, 식물은 하루에 16 시간 낮/8 시간 밤 동안 백색 형광등 세기 130 μ㏖ photons m^-2s^{- 1} 로 하여 빛을 비춘 24 ℃, 습도 60 % 조건 하에서 성장시켰으며, 애기장대 종자를 in vitro 배양하기 위해서, 70 % 에탄올로 1 분간 표면 살균하고, 2 % 수산화나트륨 (sodium hydroxide)으로 10 분간 처리하였다. 다음으로 상기 종자를 멸균 증류수로 10 회 세척하여, 1 % 수크로즈 함유 Murashige and Skoog(1962)(MS) 한천 배지 (pH 5.7)에 파종하였으며, 4 ℃에서 2 일간 배양 한 후, 성장 챔버로 옮기고 전술한 바와 동일한 조건 하에서 성장시켰다. 이 때, pir1 및 pir2 삽입 라인의 종자, 즉 SALK 124564, SALK l34059 및 SALK 007984는 Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio State University, Columbus, OH, USA)로부터 수득하였다.

1-2. 효모 이중 혼성화 분석 ( Yesst two-hybrid assay, Y2H )

PIR1와 PP2C 단백질 사이의 상호작용을 확인하기 위해서, 제조업체의 지시 (Clontech, Mountain View, CA, USA)에 따라 Matchmaker ™ Gold Yeast Two-Hybrid System을 사용하여 효모 이중 혼성화 분석 (yeast two-hybrid, Y2H) 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, AtPP2CA 유전자의 코딩 서열로부터 57 염기쌍 (뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 57)을 제거하여, Y2H 시스템에서 자가 활성화를 제거하였으며, 절단된 AtPP2CA 유전자는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 증폭시켰다. 이 때, 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.

Primer name	Primer sequence (5`-3`)
For PCR
AtPP2CA	Forward	GGAATTCCATATGGAATTCCATGTCAACTTCTCGAGCTTCTCT
	Reverse	AACTGCAGAACCAATGCATTGGTTAAGACGACGCTTGATTAT

증폭된 유전자는 pGBKT7 벡터 (bait)에 클로닝 하였으며, A Mate and Plate Normalized Arabidopsis Universal Library (Clontech)는 사냥감 (Prey)으로서 사용하였다. 교미 후, 형질 전환된 콜로니를 Leu, Trp, 및 His가 결핍된 효모 합성 결실 (SD) 배지에서 스크리닝하고, 10 mM 3-아미노-1, 2, 4-트리아졸을 보충한 다음, 30 ℃에서 7일간 배양한 후, 성장하는 효모 콜로니는 Leu, Trp, His 및 Ade가 없고, X-a-Gal 및 Aureobasidin A (125 ㎍·㎖^-1) SD 배지에 도말하여, 양성 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고, 서열을 결정하였다.

PIR 1 및 PIR 2 단백질과 9개의 클레이드 A PP2C와의 상호작용을 확인하기 위해서, PP2C 유전자의 코딩 서열을 pGADGH 벡터에 클로닝하고, 먹이 (bait) 및 사냥감 (prey)구조체는 리튬 아세테이트-조절 전이 방법(Ito et al. 1983)을 사용하여 효모 균주 AH109에 도입되었다. 이 때, Y2H 분석은 종래 알려진 방법대로 수행하였다.

형질전환체는 Leu 및 Trp이 결핍된 SD배지에서 선택하였고, 단백질-단백질 상호작용의 지표로서, 성장률을 측정하기 위하여, Leu, Trp, His 및 Ade가 결핍된 SD 배지상으로 옮겼으며, 연속 희석을 위해서, 기하급수적으로 성장한 효모세포를 수거하여, 멸균한 이중 증류수로 OD 600값을 0.5로 조정하였다. 각각의 효모세포 4 ㎕를 전술한 바와 같이 선택 배지에서 스팟팅하였다.

1-3. 이분자 형광 상보성 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 분석

상기 효모 이중 혼성화 분석에서 확인된 단백질-단백질 상호작용을 더욱 확인하기 위해 식물세포에서 BiFC 방법을 이용하였다.

보다 구체적으로, BIFC 구조체를 제조하기 위하여, 종결코돈을 갖지 않는 PIR 1, PIR 2 및 PP2CA의 전장 cDNA를 35S-SPYNE (R)173 및 35S-SPYCE (M) 벡터내로 서브 클로닝한 다음, 일시 발현을 위해서, 각각의 구조체를 갖는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101를 p19 균주와 혼합하여 유전자 silencing을 피하고, 1 ㎖ 바늘 없는 주사기를 사용하여 5 주된 담배 (Nicotiana benthamiana) 잎의 배축면에 침윤시킨 다음, 침윤 3 일 후, 잎전편을 절단하고, 표피세포를 LSM Image Browser 소프트웨어가 설치된 공초점 현미경 (510 UV/Vis Meta; 7 Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 분석하였다.

1-4. 재조합 단백질 발현 및 정제

MBP-AtPIR 1 재조합 단백질의 발현을 위해, 상기 실시예 1-2의 Y2H 분석에서 AtPP2CA와 상호 작용하는 영역에 상응하는 절단된 AtPIR 1 서열을 pMAL-c2X 벡터 (New England Biolabs)내로 삽입하고, 상기 재조합 벡터를 대장균 균주 C+ 세포에 도입하여 MBP-AtPIR 1 융합 단백질을 제조사의 지시 (New England Biolabs)에 따라 유도 및 정제하였다.

보다 구체적으로, 세포는 OD600 0.6 내지 1.0에서 0.1 μM isopropylthio-P-galactoside를 첨가한 후, 20 ℃에서 12 시간 동안 성장시켰으며, 수확된 세포 펠릿 (pellet)을 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 200 mM NaCl 및 1 mM EDTA를 함유하는 MBP 컬럼 완중액에 재현탁시키고, Vibracell 소니케이터 (Sonics and Materials)로 아이스 상에서 초음파 처리하였다. 다음으로 AtPP2CA의 발현을 위해 AtPP2CA의 코딩 서열을 pGEX4T-3 벡터 (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)에 도입 한 다음, 대장균 균주c + 세포로 형질 전환시켰으며, GST-AtPP2CA 융합 단백질의 발현은 상기 전술한 바와 같이 수행하였다. 재조합 융합 단백질을 클루타티온-세파로스 4 패스트 플로우 (Glutathione-Sepharose 4 Fast Flow)(GE Healthcare Bio-Sciences)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 박테리아 용해물로부터 친화성 정제하였으며, 상기 정제된 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하고, 정제된 단백질은 in vitro ubiquitination assay에 사용될 때 까지 -20 ℃에서 보관하였다.

1-5. in vitro ubiquitination assay

In vitro ubiquitination assay를 위해서, MBP-AtPIR1 단백질 (500 ng)을 250 ng의 재조합 인간 UBE 1 (Boston Biochemicals, Cambridge, MA, USA), 250 ng의 인간 UbcH5b (Hig-tag; Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) 및 10 ㎍의 소 유비퀴틴 (Sigma-Aldrich)을 포함하는 유비퀴틴화 반응 (ubiquitination reaction) 완충 용액 [50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 0.05 mM ZnCl₂, 1 mM Mg-ATP, 0.2 mM dithiothreitol, 10 mM phosphocreatine, 및 0.1 unit of creatine kinase(Sigma-Aldrich)]과 혼합한 다음, 30 ℃에서 3 시간 동안 배양하였으며, AtPIR 1이 PP2CA 유비퀴틴화를 매개하는지 여부를 확인하기 위해서, GST-PP2CA 융합 단백질 (50 ng)을 유비퀴틴 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 12 시간 동안 배양하였다. 반응된 단백질은 SDS-PAGE를 사용해 분리한 후, 항-Ub (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 항-MBP (New England Biolabs) 및 항-GST 항체 (Santa Cruz Biotechnology)와 함께 immunoblotting을 통해 분석하였다.

1-6. in vitro pull-down assay

in vitro pull-down assay를 위해서, 정제된 GST-AtPP2CA 단백질 10 ㎍을 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl 및 0.1 % Triton X-100을 함유하는 바인딩 완충액에서 10 ㎍의 MBP-AtPIR 1 또는 10 ㎍의 MBP (음성대조군)과 혼합하고, 4 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후, 30 ㎕의 아밀로즈 수지를 상기 단백질 혼합물에 첨가하고, 첨가물을 4 ℃에서 추가로 배양한 다음, 샘플은 세척 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 및 0.1% Triton X-100]으로 3 회 세척하고, 2x SDS 샘플 완충액을 사용하여 용리시켰다. 반응된 샘플은 SDS-PAGE 및 웨스텃블랏팅 후 항-GST (Santa Cruz Biotechnology) 또는 항-MBP 일차 항체 (New England Biolabs)로 면역 검출을 수행하였다.

1-7. ABA 처리 및 표현형 분석

애기장대에서 PIR 1 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해서, ABA 처리를 진행하였다.

보다 구체적으로, 각 유전자형 종자를 다양한 농도의 ABA가 보충된 MS 한천 배지를 함유하는 플레이트 상에 분주하였으며, 상기 종자를 4 ℃에서 2 일 동안 배양을 진행한 다음, 성장 챔버로 옮겨 전술한 바와 같이 동일한 조건하에서 배양한 뒤, 5 일 및 7 일에 각각 방사상의 출현을 나타내는 종자와 완전 발아한 녹색 자엽의 수를 계수하였다.

다음으로 ABA에 반응하는 각 표현형의 성장을 조사하기 위해서, 종자를 ABA의 다양한 농도로 보충된 MS 한천 배지를 함유하는 수직 플레이트 상에 분주하고, 7일 후, 모종의 뿌리 길이와 자엽 녹화 (greening)를 평가하였다.

실시예 2. Cell-free 분해 분석

ABA의 존재 또는 부존재하에서 PP2CA의 안정성을 확인하기 위해서, 클루타티온 5-트랜스퍼라제 (Glutathione 5-transferase) 태그된 PP2CA (GST-PP2CA)로 in vivo cell-free degradation assay를 수행하였다.

보다 구체적으로, 2 시간 동안 25 μM의 ABA가 처리되거나, 처리되지 않은 2 주생 모종에서 총 단백질 추출물을 준비하고, 상기 추출물과 GST-PP2CA 융합 단백질을 배양하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, GST-PP2CA 융합체는 ABA 처리가 없는 식물로부터의 조 추출물과 함께 배양한 후에는 융합 단백질이 안정적인 모습을 보이나, 식물에 ABA 처리를 할 경우에는, 융합 단백질이 불안정한 것을 확인하였다.

다음으로, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 배양 2시간 후, GST-PP2CA 융합 단백질의 약 60 %가 분해되는 것을 확인할 수 있었으며, 더욱이, PP2CA 단백질이 유비퀴틴-26S 프로테아좀 경로를 통해 분해되는지에 대한 여부를 결정하기 위해서, 각 반응 혼합물을 프로테아좀 억제제 MG 132 (Joo et al., 2008)로 처리한 결과, MG 132가 처리 된 식물 추출물과 함께 배양하는 동안 PP2CA의 분해가 억제한다는 것을 확인하였으며, 이에, ABA에 의한 ABA-유도된 PP2CA 분해가 26S 프로테아좀 경로에 의존한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. PIR 1과 PP2Cs의 물리적 상호 작용 확인

PP2CA의 분해에 영향을 미치는 상호 작용 단백질을 확인하기 위해서, 상기 실시예 1-2에 나타낸 바와 같이, PP2CA 단백질을 bait로 사용하고, 잎 조직으로부터 제작된 cDNA 라이브러리를 prey로 사용하는 Y2H 스크리닝을 수행하였다.

그 결과, PIR 1 (PP2CA-interacting RING finger protein 1, AT2G35330)을 포함한 여러 상호 작용 단백질을 확인하였다.

보다 구체적으로, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 9개의 PP2CA 서브패밀리 멤버 중 4개의 멤버가 PIR 1과 상호 작용함을 확인하였으며, 또한, PP2CA와 AHG 1은 강한 상호 작용을 보였으나, HAI1 및 HAI3은 약한 상호 작용을 보였다.

또한, 식물 세포에서 PP2CA와 PIR 1 사이의 상호 작용을 확인하기 위해서, 실시예 1-3에 나타낸 바와 같이, 이분자 형광 상보성 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, PIR1:SPYNE과 PP2CA:SPYCE의 공발현은 핵 내에서 뚜렷한 황색 형광 (YFP)을 유발하였으며, 이는 주로 DAPI 염색과 일치하는 핵을 나타내었다.

실시예 4. ABA 민감성 분석 확인

ABA 반응에서 PIR 1 기능의 유전자 분석을 사용하여, PIR 1과 PP2CA 사이의 기능적 관련성을 조사하였다.

보다 구체적으로, 도 3a에 나타낸 바와 같이, PIR 1 유전자 (pir 1-1, SALK_078237; pir 1-2，SALK_139722)에서 2 개의 T-DNA 삽입 돌연변이체를 얻었으며, 상기 두 돌연변이체 모두 RT-PCR 분석법을 사용하여 분석한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, PIR 1 mRNA의 검출 가능한 수준이 결핍되었음을 확인할 수 있었다.

다음으로, ABA 신호 전달에서 PIR 1의 역할을 탐색하기 위해, PIR 돌연변이체의 표현형을 조사하였다.

보다 구체적으로, PIR 1 돌연변이체의 식물 생장 및 생식적 발육이 정상 성장 조건에서 야생형 (WT) 식물과 크게 다르지 않음을 확인하였다 (미도시).

더욱이, 돌연변이 계통의 ABA 민감도를 결정하기 위해서, 다양한 ABA 농도 (0.0 μM, 0.75 μM 또는 2.0 μM)에 노출시킨 뒤, 종자 발아율 및 녹색 자엽 비율을 측정하였다.

그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, PIR 1 돌연변이체는 종자 발아 분석에서 야생형 (WT)보다 ABA에 덜 민감한 것으로 나타났으며, 도 3d에 나타낸 바와 같이, ABA 미처리한 경우에는, 종자의 발아율은 야생형 (WT)와 돌연변이체 간에는 차이가 없었으나, ABA 처리 후, PIR 1 돌연변이체의 종자 발아율은 야생형 (WT) 종자의 발아율보다 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 또한, PIR 1 돌연변이체는 모종 단계에서 ABA에 대한 감수성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 더욱이, 도 3e에 나타낸 바와 같이, 0.75 μM의 ABA 처리 후, PIR 1 돌연변이체의 녹색 자엽 비율은 야생형 (WT) 식물의 녹색 자엽 비율 보다 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터, PIR 1 돌연변이체가 야생형 (WT)보다 ABA에 더 민감하였는바, PIR 1이 ABA의 양성조절자로서 역할함을 확인할 수 있었다.

실시예 5. E3 리가아제 활성 및 PP2CA의 유비퀴탄화에 있어 PIR 1의 기능 확인

본 발명에 따른 PIR 1이 PP2CA를 기질로하는 E3 리가아제로서 기능하는지를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 효소 분석을 수행하기 위해서, MBP (MBP::PIR1 ㅿ1-367)와 융합된 N 말단 영역이 없는 절단 된 형태의 PIR을 사용하여, UB, ATP, E 1 (인간 UBE 1) 및 E 2 (인간 UBCH5b)의 존재하에서, MBP::PIR1 ㅿ1-367을 배양한 후, MBP-PIR 1 융합 단백질과 관련된 E3 리가아제 활성을 검출하였다 (도 4a 참조).

다음으로, PIR 1과 PP2CA의 상호작용에 있어서, PIR 1이 PP2CA의 기질로서, 역할 수행하는지를 확인하기 위해서, 세균 발현된 GST1-PP2CA 및 MBP-PIR1을 사용하여 상기 실시예 1-5에 나타낸 바와 같이, in vitro ubiquitiantion assay를 수행하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 애기장대 E 1 및 E 2의 존재하에서, PP2CA가 PIR 1 단백질에 의해 폴리 유비퀴틴화되는 것을 확인할 수 있었으며, 도 4c 및 4d에 나타낸 바와 같이, PIR 1 돌연변이 식물 추출물과 배양했을 때는, ABA 처리에 관계없이 PP2CA가 더 안정적으로 유지되는 것을 확인하였는 바, 이는 PIR 1이 PP2CA의 ABA-의존성 분해에 필요하다는 것을 나타낸다.

상기와 같은 결론을 뒷받침하기 위해서, pir 1/ pp2ca 이중 돌연변이체를 만들어 ABA 반응에서 단일 돌연변이체 및 야생형 (WT) 식물과 비교하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 발아 분석에서 pp2ca 돌연변이체, pir 1/pp2ca 이중 돌연변이체 및 PIR 1-과발현 형질 전환 식물이 ABA에 민감한 반면, PIR 1 돌연변이체는 ABA에 덜 민감하다는 것을 확인하였다. 예컨대, 1.0 μM의 ABA 처리 후, pir1 돌연변이체의 발아율은 야생형 (WT) 식물에 비해 높았으나, 반면에 pp2ca 돌연변이체, pir1/pp2ca 돌연변이체 및 pir1-과발현 (OX) 식물의 발아율은 야생형 (WT) 식물보다 낮은 것을 확인하였다.

또한, ABA에 대한 자엽의 생장 및 뿌리 길이를 측정한 결과, 도 5c 내지 도 5e에 나타낸 바와 같이, 상기 종자의 발아율과 비슷하게 pir 1 돌연변이체가 ABA에 덜 민감하다는 것을 확인하였다.

상기 결과에 따라서, pir1/pp2ca 이중 돌변변이 표현형이 pp2ca 돌연변이체와 유사하기 때문에, PIR 1이 PP2CA의 상위 신호로 작용한다는 것을 나타내며, PIR 1이 ABA에 반응하여 PP2CA를 유비퀴틴화하는 것을 보여주는 생화학적 분석과 일치한다.

실시예 6. PIR 2와 PP2Cs간의 상호 작용 확인

본 발명에 일실시예에 따르면, ABA 신호 조절에 있어서, PIR 1과 함께, 애기장대 게놈에서 PIR 2 (AT1G32530, 도 6a 및 도 6b 참조)의 PIR 1 동족체 (homologue)가 PP2Cs와 상호작용하는 것을 확인하였다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 초기 Y2H 스크리닝에서 PIR 2를 확인하지는 않았지만, PIR 2도 PP2C A군과 상호작용할 것을 예상했으며, 상기와 같은 가설을 검증하기 위해서, Y2H 및 BiFC 분석법을 각각 사용하여 PIR 2와 PP2CA를 포함하는 PP2C A군의 포괄적인 상호작용 분석을 수행하였다 (도 6c 및 도 6d 참조).

그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, PIR 2가 PP2CA와 강하게 상호 작용하고, AHG 1과 AIP 2와는 약하게 상호 작용하는 것을 확인할 수 있었으며, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 담배 (Nicotiana benthamiana)식물 세포에서 BiFC 분석 결과, 담배 (Nicotiana benthamiana) 표피 세포에서 PP2CA와 PIR 2의 동시 발현이 PP2CA와 PIR 2 사이의 물리적 상호 작용을 나타내는 핵에서만 YFP 신호를 생성하는 것을 확인할 수 있었는바, 이에 Y2H 분석 결과와 일치하는 것을 확인하였다.

PP2CA 내에서 PIRs과의 상호 작용을 담당하는 도메인을 확인하기 위해서, PP2CA의 몇몇 절단된 형태를 만들어 Y2H 시스템에서 PIRs과 상호 작용을 테스트한 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이, 포스파타아제 도메인이 PIRs과 상호 작용에 충분함을 보여주었으며, A타입 PP2C를 표적으로 하는 PIRs은 최초의 E3 리가아제이므로, PP2C-E3 리가아제 상호 작용을 보다 더 특성화하기 위한 유용한 모델 시스템으로 여겨진다.

따라서, PIR 단백질 내에서 PP2CA의 포스파타아제 도메인과의 상호 작용을 담당하는 도메인을 확인하고자 하였으며, 그 결과, PIRs은 N-말단 도메인, 또꼬인나선 도메인 (coiled-cil) 및 RING zing finger 도메인의 세 가지 도메인으로 구성되며, 도 6f에 나타낸 바와 같이, RING zing finger 도메인이 PP2CA의 포스파타아제 도메인과 상호 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

PP2CA와 PIR 2 사이의 상호 작용이 PIR 2가 유비퀴틴-26S 프로테아솜 경로를 통해 PP2CA의 수준을 조절하는지를 확인하기 위해서, in vivo cell-free 분해 분석을 수행하였다.

보다 구체적으로, GSP-PP2CA 융합 단백질을 야생형 (WT)식물, pir 1 돌연변이체 및 pir 2 돌연변이체 (0 μM 또는 25 μM의 ABA로 2 시간 처리)로부터 제조된 조 추출물과 함께 30 분 동안 항온 배양하였다.

그 결과, 도 6g 및 도 6h에 나타낸 바와 같이, ABA 미처리시에는, GST-PP2CA 융합 단백질의 수준은 각각의 조 추출물 사이에 유의한 차이가 없었으나, ABA 처리 후, PP2CA의 안정성은 PIR 1 돌연변이체로부터 제조된 조 추출물과 거의 일치하지 않고, 반면에 PP2CA 수준은 야생형 (WT) 식물로부터 제조된 추출물 보다 PIR 2 돌연변이체로부터 제조된 추출물에서 덜 감소하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, ABA가 PIR 1 및 PIR 2의 활성을 조절함으로써, PP2CA 수준을 조절하는 것을 확인할 수 있었다.

PIR 2 돌연변이체의 ABA 민감도를 결정하기 위해서, 유전자 분석을 수행하였다.

보다 구체적으로, PIR 2의 in vivo 기능을 확인하기 위해서, T-DNA 삽입 돌연변이 라인 및 상보적인 라인을 획득하여 (pir2, SALK 007984; 도 6i 참조), RT-PCR 분석을 수행한 결과, 도 6j에 나타낸 바와 같이, pir 2 돌연변이체에서 PIR2 전사물이 검출되지 않은 것을 확인하였다.

또한, 발아 분석을 진행한 결과, 도 6k 및 도 6l에 나타낸 바와 같이, ABA 처리의 존재 또는 부재 하에서 야생형 (WT) 식물과 pir2 돌연변이 사이에 유의한 차이가 없음을 확인하였고, 묘목 단계에서 야생형 (WT) 식물과 pir 2 돌연변이의 표현형 사이의 녹화율 및 뿌리 길이에서 유의한 차이가 없음을 구체적으로 확인하였다 (도 6m, 도 6n, 도 6k, 도 6o 참조).

그러나, PIR 2의 과발현은 ABA-매개된 발아 및 자엽 억제에 대한 감수성 증가시키고, 상기의 결과는 PIR 1의 보완에 기인한 것일 수 있는바, 본 발명자들은 pir1 및 pir2 이중 돌연변이를 제조하였다.

실시예 7. PIRs 존재에 따른 ABA 민감도 확인

ABA에 의한 PP2CA의 분해에 있어서, PIR의 존재의 영향을 확인하기 위해서, 뿌리 길이를 측정하여 변이체들의 ABA 민감도를 확인하였다.

그 결과, 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 야생형 (WT) 식물과 비교하여, pir 1, pir 2 및 pir 1/pir 2 돌연변이체는 ABA-매개의 뿌리 성장 억제에 대한 감수성을 감소시켰으며, 이 때, pir 1/pir 2 이중 돌연변이체는 ABA에 대해 가장 무감각한 반면에, 야생형 (WT) 식물과 비교하여, pp2ca, pp2ca/pir 1 및 pp2ca/pir 2 돌연변이체는 ABA에 대해 매우 민감한 표현형을 나타내었다.

상기에 결과는 PIR 2가 ABA 신호 전달에서 종자 발아 및 발아 후 성장을 조절하는데 있어서, PIR 1과 함께 부가적으로 작용한다는 것을 보여주는 것이다.

또한, PIR 1과 PIR 2가 동시에 PP2CA 분해를 촉진시키는 ABA의 기능에 영향을 주는지 확인하기 위해서, 전술한 바와 같이 야생형 (WT), pir 1 및 pir 1/pir 2 모종에 ABA를 처리하였다.

그 결과, 도 7c 및 도 7d에 나타낸 바와 같이, 야생형 (WT) 식물에서 제조한 cell-free 추출물과 비교하여 pir 1 돌연변이체로부터 제조된 cell-free 추출물에서 PP2CA 분해가 더 느리게 일어났으나, pir 1/pir 2 돌연변이체로부터 제조된 cell-free 추출물에서는 PP2CA 분해가 더 빠르게 일어나는 것을 확인하였다.

pir 1 돌연변이 보다 pir 1/pir 2 돌연변이에서 더 높은 PP2CA 분해율은 pir 1/pir 2 돌연변이체의 ABA-민감성 표현형이 더 높다는 것을 보여주는 것이다.

상기 결과에 따라 PP2CA의 안정성이 PIR 1 및 PIR 2에 의존하고, 26S 프로테아솜 복합체에 의해 조절될 수 있음을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to drought stress using RING finger E3 ligase PIR in plants <130> MP17-036 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2136 <212> DNA <213> PP2CA interacting RING finger protein 1_PIR 1 <400> 1 atgggttgta ctgtgaggga gaagcatgtt agaccaaacc ggaagaccag atccgtgaaa 60 cccgaattcg atccgtgttg tttgctcgac aggacggctc tatcgaaatc gattgttgaa 120 tcgagtctta agcatcttgt ttatcatccg ggtcttctcg attcgtgtcc agagtcaaac 180 cctagtggca gttttgagga taataatggt tggggttatt gtacggagga gcaattagag 240 gatattttgt tgaaacattt ggagtattta tacaatgaag cgatttcgaa gcttgtgggt 300 tctggttatg atgaggatgt ggcgttgaga gctgttctta gtaatgggta ttgttatggt 360 ggaatggatg ttatgactaa tattcttcat aattcgttgg cttatcttaa gagtaatact 420 ggtgaaggta gtaatgtgaa caatgaggat caatcagaga cggtttttac ggatttgaga 480 cagttggagg agtattcact tgcgggtatg gtttatttgt tgcaacaagt taaacctaat 540 ttgagtaaag gtgatgcaat gtggtgtttg ctaatgagtg agcttcatgt tgggagggcg 600 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tcgtctgata ctattggtga tagcaaagct 960 tgtaatgatc ctgcaattgt gaagagttgt gggcagcaac cacgtaagtc agggagtgaa 1020 gaaagtgtta gtacggtgtt ggagaaattt cgtgatctga accttgatga taatctggaa 1080 tcggtgggtg tggatgataa ggattgtgtg atagtcgatc tgcttcatca ggttaaggat 1140 ttcgagaaga aagtaaagga aaggaaagag tgggctcaga agaacgcaat gcaagccgca 1200 caaaaggtca gcgaggaatt agctgagctt aaaacattga gtagtgaaag agaaggaatc 1260 caactgctga aaaaggggaa acaggctgtt gaagaatcaa ctgcgaaaag atttactgac 1320 aaggaaattg aactcagaaa agcttgcagt caaaatgaca gggccaatgt aattgtaaga 1380 aagcttgaga atcaaaatgc agagattcga gcagagcggg agggatccaa attaagtgca 1440 tcagaatcgc ttaaagcgtg catggaagca tcaaagaagg agaaaaaatg cttgaagaag 1500 cttgtggcat gggagaaaca gatattgaag ttgcaggatg agattacagc tgaaaaagaa 1560 aagattaagg ccctatataa gactttagct caaatcacag agtatgaaaa ggagattgag 1620 gcgaaatgga ggcaagagca gaaggcaaaa gaggaggctc tggctcaaat ggaggaagaa 1680 caacgctcaa aagaagcagc tgagggtcac aacaagagaa agcttgagac tttacgactc 1740 aaaattgaac tagacttcca aagacacaaa gacgatcacc aaagactgga gcaagaactc 1800 ggtcgactca aagcctcttc agatagtgac tcaagccaca tatccaacaa cgcttggaaa 1860 cccaaaaaat ctcaaggaga aaacattgct aagctgcttg aagaaattga taagcttgaa 1920 gggtcttatg acaatgaagc aaactatgat cgagaatgca taatctgtat gaaagatgaa 1980 gtctctgtgg tgtttcttcc ttgtgcgcat caagttgtgt gtggtagttg cagtgatagc 2040 ttcttcgcga gcaacaacgg cggaagcaaa gtcacttgtc cttgttgccg aggtttggtt 2100 cagcagcgaa tccgtatctt tggagcaacc tcataa 2136 <210> 3 <211> 711 <212> PRT <213> PP2CA interacting RING finger protein 1_PIR 1 <400> 3 Met Gly Cys Thr Val Arg Glu Lys His Val Arg Pro Asn Arg Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Val Lys Pro Glu Phe Asp Pro Cys Cys Leu Leu Asp Arg Thr 20 25 30 Ala Leu Ser Lys Ser Ile Val Glu Ser Ser Leu Lys His Leu Val Tyr 35 40 45 His Pro Gly Leu Leu Asp Ser Cys Pro Glu Ser Asn Pro Ser Gly Ser 50 55 60 Phe Glu Asp Asn Asn Gly Trp Gly Tyr Cys Thr Glu Glu Gln Leu Glu 65 70 75 80 Asp Ile Leu Leu Lys His Leu Glu Tyr Leu Tyr Asn Glu Ala Ile Ser 85 90 95 Lys Leu Val Gly Ser Gly Tyr Asp Glu Asp Val Ala Leu Arg Ala Val 100 105 110 Leu Ser Asn Gly Tyr Cys Tyr Gly Gly Met Asp Val Met Thr Asn Ile 115 120 125 Leu His Asn Ser Leu Ala Tyr Leu Lys Ser Asn Thr Gly Glu Gly Ser 130 135 140 Asn Val Asn Asn Glu Asp Gln Ser Glu Thr Val Phe Thr Asp Leu Arg 145 150 155 160 Gln Leu Glu Glu Tyr Ser Leu Ala Gly Met Val Tyr Leu Leu Gln Gln 165 170 175 Val Lys Pro Asn Leu Ser Lys Gly Asp Ala Met Trp Cys Leu Leu Met 180 185 190 Ser Glu Leu His Val Gly Arg Ala Ser Thr Met Asp Ile Pro Ser Ser 195 200 205 Gly Lys Gly Asp Ser Ser Asn Val Gly Val Gly Gly Ala Ser Ser Thr 210 215 220 Val Asn Gly Val Gly Gly Ala Ile Ala Pro Ala Leu Cys Arg Phe His 225 230 235 240 Gly Gly Trp Gly Phe Gly Asn Gly Lys Gly Pro Lys Phe Ser Gly Asn 245 250 255 Gly Phe Ser Leu His Ser Glu Glu Leu Thr Leu Gln Arg Glu Ile Asp 260 265 270 Cys Pro Arg Arg Phe Asn Leu Ser Pro Ser Met Lys Ser Leu Leu Arg 275 280 285 Glu Asn Val Ala Ala Phe Ala Ala Gly Tyr Arg Ala Ser Met Glu Gln 290 295 300 Lys Lys Gln Val Gln Met Gln Ser Glu Thr Ser Gly Thr Ser Leu Ser 305 310 315 320 Cys Thr Ala Ala Ala Thr His Ser Glu Lys Cys Glu Gln Pro His Val 325 330 335 Phe Gly Ser Glu Glu Cys Phe Ser Ser Val Leu Glu Lys Phe Arg Asp 340 345 350 Leu Asn Leu Asp Asp Asn Val Asp Ser Ala Pro Glu Glu Leu Lys Asp 355 360 365 Asp Ala Leu Ile Gly Leu Leu Gln Gln Val Gln Asp Leu Lys Lys Gln 370 375 380 Leu Lys Glu Arg Lys Asp Trp Ala Gln Lys Lys Ala Met Gln Ala Ala 385 390 395 400 Gln Lys Val Ser Asp Glu Leu Ser Glu Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu 405 410 415 Arg Glu Glu Ile Gln Arg Val Lys Lys Gly Lys Gln Thr Arg Glu Asp 420 425 430 Ser Thr Leu Lys Lys Leu Ser Glu Met Glu Asn Ala Leu Arg Lys Ala 435 440 445 Ser Gly Gln Val Asp Lys Ala Asn Ala Val Val Arg Ala Leu Glu Asn 450 455 460 Glu Ser Ala Glu Ile Arg Ala Glu Met Glu Ala Ser Lys Leu Ser Ala 465 470 475 480 Ser Glu Ser Leu Thr Ala Cys Met Glu Ala Ser Lys Lys Glu Lys Lys 485 490 495 Cys Leu Lys Lys Leu Leu Ala Trp Glu Lys Gln Lys Met Lys Leu Gln 500 505 510 Asp Glu Ile Thr Ala Glu Lys Glu Lys Ile Lys Ala Leu Asn Arg Ala 515 520 525 Leu Ala Gln Ile Thr Gln Glu Glu Lys Glu Tyr Glu Ala Lys Trp Arg 530 535 540 Gln Glu Gln Lys Ala Lys Glu Gln Val Leu Ala Gln Val Glu Glu Glu 545 550 555 560 Gln Arg Ser Lys Glu Ala Ile Glu Ala Ser Asn Lys Arg Lys Val Glu 565 570 575 Ser Leu Arg Leu Lys Ile Glu Ile Asp Phe Gln Arg His Lys Asp Asp 580 585 590 Leu Gln Arg Leu Glu Gln Glu Leu Ser Arg Leu Asn Lys Ala Ser Ser 595 600 605 Thr Asp Ser Ser Leu Gln Ser Asn Asn Thr Ser His Thr Lys Val Lys 610 615 620 Ser Asp Lys Ser Lys Gly Glu Thr Met Ser Lys Leu Leu Glu Glu Leu 625 630 635 640 Asn Arg Leu Asp Gly Ser Tyr Glu Lys Glu Ala Asn Tyr Asp Arg Glu 645 650 655 Cys Leu Ile Cys Met Lys Asp Glu Val Ser Val Val Phe Leu Pro Cys 660 665 670 Ala His Gln Val Val Cys Ala Ser Cys Ser Asp Ser Phe Met Gly Ser 675 680 685 Gly Lys Ala Thr Cys Pro Cys Cys Arg Ala Pro Val Gln Gln Arg Ile 690 695 700 Arg Val Phe Gly Ala Ser Ser 705 710 <210> 4 <211> 711 <212> PRT <213> PP2CA interacting RING finger protein 2_PIR 2 <400> 4 Met Gly Cys Thr Val Arg Glu Lys His Val Lys Pro Thr Arg Arg Ile 1 5 10 15 Lys Ala Ala Ala Phe Arg Ser Asp Pro Pro Leu Cys Trp Val Glu Lys 20 25 30 Ile Ala Met Ser Gln Ser Ile Val Glu Asn Leu Val Tyr His Pro Gly 35 40 45 Leu Thr Asp Ser Gly Ser Val Asn Leu Asn Ser Val Thr Glu Asn Pro 50 55 60 Glu Glu Asn Phe Trp Ala Tyr Cys Thr Glu Glu His Leu Glu Glu Ile 65 70 75 80 Leu Leu Lys His Leu Glu Phe Leu Tyr Asn Gln Ala Val Ser Lys Leu 85 90 95 Leu Glu Leu Gly Tyr Glu Glu Arg Val Ala Leu Lys Ala Val Leu Ser 100 105 110 Asn Gly His Cys Tyr Gly Glu Leu Asp Val Leu Thr Asn Ile Val Asn 115 120 125 Asn Ser Leu Ser Tyr Leu Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn 130 135 140 Gly Asn Gly Glu Asp Arg Thr Glu Thr Gly Phe Thr Asp Leu Arg Asp 145 150 155 160 Leu Glu Glu Tyr Ser Leu Ala Gly Met Ile Tyr Leu Leu Gln Gln Val 165 170 175 Lys Pro Asn Leu Ser Lys Gly Asp Ala Met Trp Cys Leu Leu Met Ser 180 185 190 Glu Leu His Val Gly Arg Ala Ser Thr Leu Asp Val Pro Thr Asn Arg 195 200 205 Ser Ser Cys Cys Thr Lys Glu Asp Ser Asn Val Glu Asp Val Gly Thr 210 215 220 Gly Gly Thr Leu Asp Ile Ala Gly Phe Met Ala Pro Ala Leu Cys Arg 225 230 235 240 Phe His Gly Gly Trp Gly Phe Gly Asn Gly Gly Gly Pro Glu Phe Ser 245 250 255 Gly Asn Gly Phe Ser Met Lys Gly Ala Glu Leu Lys Leu Gln Arg Glu 260 265 270 Ile Asp Cys Pro Lys Arg Phe Asn Leu Ser Pro Ser Met Lys Ser Leu 275 280 285 Leu Lys Arg Asn Val Ala Ala Phe Ala Ala Gly Tyr Arg Ala Ser Met 290 295 300 Lys Gln Lys Gln Ile Gln Ser Ser Asp Thr Ile Gly Asp Ser Lys Ala 305 310 315 320 Cys Asn Asp Pro Ala Ile Val Lys Ser Cys Gly Gln Gln Pro Arg Lys 325 330 335 Ser Gly Ser Glu Glu Ser Val Ser Thr Val Leu Glu Lys Phe Arg Asp 340 345 350 Leu Asn Leu Asp Asp Asn Leu Glu Ser Val Gly Val Asp Asp Lys Asp 355 360 365 Cys Val Ile Val Asp Leu Leu His Gln Val Lys Asp Phe Glu Lys Lys 370 375 380 Val Lys Glu Arg Lys Glu Trp Ala Gln Lys Asn Ala Met Gln Ala Ala 385 390 395 400 Gln Lys Val Ser Glu Glu Leu Ala Glu Leu Lys Thr Leu Ser Ser Glu 405 410 415 Arg Glu Gly Ile Gln Leu Leu Lys Lys Gly Lys Gln Ala Val Glu Glu 420 425 430 Ser Thr Ala Lys Arg Phe Thr Asp Lys Glu Ile Glu Leu Arg Lys Ala 435 440 445 Cys Ser Gln Asn Asp Arg Ala Asn Val Ile Val Arg Lys Leu Glu Asn 450 455 460 Gln Asn Ala Glu Ile Arg Ala Glu Arg Glu Gly Ser Lys Leu Ser Ala 465 470 475 480 Ser Glu Ser Leu Lys Ala Cys Met Glu Ala Ser Lys Lys Glu Lys Lys 485 490 495 Cys Leu Lys Lys Leu Val Ala Trp Glu Lys Gln Ile Leu Lys Leu Gln 500 505 510 Asp Glu Ile Thr Ala Glu Lys Glu Lys Ile Lys Ala Leu Tyr Lys Thr 515 520 525 Leu Ala Gln Ile Thr Glu Tyr Glu Lys Glu Ile Glu Ala Lys Trp Arg 530 535 540 Gln Glu Gln Lys Ala Lys Glu Glu Ala Leu Ala Gln Met Glu Glu Glu 545 550 555 560 Gln Arg Ser Lys Glu Ala Ala Glu Gly His Asn Lys Arg Lys Leu Glu 565 570 575 Thr Leu Arg Leu Lys Ile Glu Leu Asp Phe Gln Arg His Lys Asp Asp 580 585 590 His Gln Arg Leu Glu Gln Glu Leu Gly Arg Leu Lys Ala Ser Ser Asp 595 600 605 Ser Asp Ser Ser His Ile Ser Asn Asn Ala Trp Lys Pro Lys Lys Ser 610 615 620 Gln Gly Glu Asn Ile Ala Lys Leu Leu Glu Glu Ile Asp Lys Leu Glu 625 630 635 640 Gly Ser Tyr Asp Asn Glu Ala Asn Tyr Asp Arg Glu Cys Ile Ile Cys 645 650 655 Met Lys Asp Glu Val Ser Val Val Phe Leu Pro Cys Ala His Gln Val 660 665 670 Val Cys Gly Ser Cys Ser Asp Ser Phe Phe Ala Ser Asn Asn Gly Gly 675 680 685 Ser Lys Val Thr Cys Pro Cys Cys Arg Gly Leu Val Gln Gln Arg Ile 690 695 700 Arg Ile Phe Gly Ala Thr Ser 705 710

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증가방법:
   (a) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 단백질 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 단백질을 암호화하는 유전자인 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 유전자를 식물체에 형질전환시키는 단계, 및
   (b) 상기 형질전환된 식물체에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 단백질 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 단백질을 과발현시키는 단계.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 제4항에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 단백질 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 단백질을 암호화하는 유전자인 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PIR 1 (PP2CA interacting RING finger protein 1) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 PIR 2 (PP2CA interacting RING finger protein 2) 유전자는 식물세포 발현벡터를 통하여 식물체에 형질전환되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
   
8. 제4항에 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체.

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